POLITECHNIKA ŚLĄSKA Gruca/Streszczenie - A... · 3 Podziękowania Pragnę złożyć serdeczne...
Transcript of POLITECHNIKA ŚLĄSKA Gruca/Streszczenie - A... · 3 Podziękowania Pragnę złożyć serdeczne...
1
POLITECHNIKA ŚLĄSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII
AUTOREFERAT pracy doktorskiej
Aleksandra GRUCA
Syntetyczne glikozydowe pochodne genisteiny jako potencjalne
związki uwrażliwiające komórki nowotworowe na cytotoksyczne
działanie promieniowania jonizującego
Synthetic glycosidic genistein derivatives as potential sensitizers of tumour cells
to the cytotoxic effects of ionizing radiation
Promotor: prof. dr hab. Zdzisław KRAWCZYK
Promotor pomocniczy: dr Aleksandra RUSIN
Gliwice 2014
2
Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego Politechniki Śląskiej.
Praca finansowana ze środków UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01w ramach Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu
Społecznego oraz z grantu Narodowego Centrum Nauki (2012/05/N/NZ1/00022).
Praca doktorska została wykonana w Centrum Badań Translacyjnych i Biologii
Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii - Instytutu im. M. Skłodowskiej - Curie,
oddział w Gliwicach.
3
Podziękowania
Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Panu prof. dr hab. Zdzisławowi Krawczykowi
za nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania pracy doktorskiej, cierpliwość
i wyrozumiałość oraz motywację do krytycznego spojrzenia na problematykę badawczą.
Szczególne podziękowania pragnę złożyć Panu Profesorowi za pomoc w jasnym
formułowaniu myśli naukowej oraz inspirację do zgłębiania zagadnień naukowych.
Chciałam wyrazić głęboką wdzięczność Pani dr Aleksandrze Rusin, bez której moja praca
doktorska nie mogłaby powstać. Dziękuję za inspirację do badań, niezastąpioną pomoc
w planowaniu doświadczeń oraz kreatywne podejście w poszukiwaniu rozwiązań problemów
biologicznych. Pragnę również podziękować za pomoc w redagowaniu pracy oraz motywację
do opracowania samodzielnych koncepcji na tle istniejącej literatury naukowej.
Dziękuję Panu prof. dr hab. inż. Wiesławowi Szeji za udostępnienie związków do doświadczeń
oraz umożliwienie wykonywania badań w ramach współpracy pomiędzy Katedrą Chemii
Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej
w Gliwicach a Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów
w Centrum Onkologii w Gliwicach.
Pragnę podziękować Panu prof. dr hab. n. med. Leszkowi Miszczykowi, kierownikowi
Zakładu Radioterapii Centrum Onkologii w Gliwicach za udostępnienie przyspieszacza
liniowego, dzięki czemu możliwe było wykonanie doświadczeń do niniejszej pracy.
Szczególne wyrazy wdzięczności składam pracownikom Centrum Badań Translacyjnych
i Biologii Molekularnej Nowotworów oraz Katedry Chemii Organicznej, Bioorganicznej
i Biotechnologii Wydziału Chemii Politechniki Śląskiej w Gliwicach za przekazaną wiedzę,
pomoc w zakresie technik eksperymentalnych oraz prawdziwie naukową atmosferę w pracy.
W szczególności pragnę podziękować Pani dr Agnieszce Gogler-Pigłowskej,
Panu prof. dr hab. Markowi Rusinowi, Pani mgr Annie Habryce, Pani dr Iwonie Domińczyk,
Panu mgr Radosławowi Kitlowi oraz Panu dr Piotrowi Świerkowi za pomoc i życzliwość.
.
Chciałabym również podziękować rodzinie oraz przyjaciołom, za nieustanne wsparcie oraz
motywację. W szczególności dziękuję mojej Mamie za pomoc w wyborze drogi zawodowej
oraz nigdy niegasnącą wiarę we mnie.
Niniejszą pracę pragnę dedykować mojej Mamie, której wieloletnie nauki wyrażone
są słowami Jana Pawła II: „Tam, gdzie jest człowiek cierpiący, musi znaleźć się człowiek,
który otoczy cierpiącego wsparciem”.
4
SPIS TREŚCI
I. WPROWADZENIE ............................................................................................................ 5
II. CEL PRACY ....................................................................................................................... 6
III. WYNIKI ............................................................................................................................. 7
III.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz
promieniowania jonizującego ....................................................................................... 10
III.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym ...................... 11
III.3. Hamowanie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR przez
genisteinę i jej pochodne .............................................................................................. 15
III.4. Hamowanie indukowanej promieniowaniem jonizującym aktywacji EGFR .............. 17
III.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę
i jej pochodne ............................................................................................................... 19
III.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne ................. 22
III.7. Podsumowanie wyników badań ................................................................................... 24
IV. WNIOSKI ......................................................................................................................... 27
V. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................. 28
VI. DOROBEK NAUKOWY ................................................................................................. 30
5
I. WPROWADZENIE
Rozwój wiedzy w dziedzinie onkologii umożliwił scharakteryzowanie w komórkach
wielu typów nowotworów potencjalnych celów molekularnych o istotnym znaczeniu
dla skutecznej chemoterapii i radioterapii i racjonalizujących stosowanie terapii kombinowanej
[1]. Zastosowanie chemoterapii celowanej w kombinacji z radioterapią jest szczególnie
uzasadnione w przypadku pacjentów, u których niepowodzenie radioterapii związane jest
z istnieniem w masie guza komórek radioopornych, a zwiększenie dawki energii
promieniowania jonizującego (IR, ang. ionising irradiation) do wartości umożliwiającej
ich wyeliminowanie nie jest możliwe ze względu na równoczesny wzrost toksyczności terapii
względem tkanek prawidłowych. Jeśli znane są mechanizmy radiooporności komórkowej
w danym typie nowotworu, możliwe jest zastosowanie związków promieniouwrażliwiających
celujących właśnie w te, ściśle określone cele molekularne, bez dodatkowego zwiększania
toksyczności terapii [2-4].
Koncepcja pracy doktorskiej łączy ze sobą dwie strategie poszukiwania leków
do zastosowania w kombinacji z radioterapią, szeroko eksplorowane i opisane w ostatnich
latach [5-8], a mianowicie:
poszukiwanie radiouczulaczy wśród związków o znanych celach molekularnych, które
to cele zostały równocześnie określone w literaturze jako determinanty komórkowej
radiooporności;
projektowanie analogów związków pochodzenia naturalnego w oparciu o analizę SAR
(ang. structure activity relationship, związek pomiędzy strukturą chemiczną
a właściwościami biologicznymi) z nadzieją na otrzymanie pochodnych o ulepszonych
właściwościach biologicznych i farmakokinetycznych oraz równocześnie przewidywanej
niskiej toksyczności ogólnoustrojowej.
Kontrola promienioczułości komórek nowotworowych za pomocą związków
naturalnych mogłaby zwiększyć skuteczność radioterapii oraz równocześnie ograniczyć efekty
uboczne prowadząc do poprawy wyników leczenia [6]. Wśród licznych mechanizmów
molekularnych determinujących radiooporność nowotworów wymienia się często nadekspresję
genów prożyciowych oraz hiperaktywację białek prożyciowych, między innymi czynników
wzrostowych [9, 10]. Substancje radiouczulające celują w rozmaite mechanizmy
radioprotekcyjne, niektóre upośledzają również podstawowe funkcje komórkowe, takie
jak replikacja DNA, prowadząc do zablokowania podziałów komórek i w efekcie zahamowania
wzrostu guza [11, 12]. Z tego względu genisteina jako związek naturalny zdolny do hamowania
równocześnie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ang. epidermal
growth factor receptor) [13] oraz enzymu uczestniczącego w replikacji DNA –
topoizomerazy II (TOPO II) [14, 15], a jednocześnie blokujący cykl komórkowy w najbardziej
radiowrażliwej fazie G2/M [16, 17], wydaje się wyjątkowo interesująca jako naturalny związek
wyjściowy do konstruowania pochodnych mogących działać jako efektywne radiouczulacze.
Należy podkreślić, że, mimo iż genisteinę testowano w kombinacji z radioterapią w badaniach
przedklinicznych [17-19], nie są znane prace, w których pokazano by, że mechanizmem
6
odpowiedzialnym za jej właściwości radiouczulające jest zdolność do hamowania aktywności
EGFR czy TOPO II.
Ze względu na to, że hiperaktywację EGFR obserwuje się w wielu typach nowotworów
[20, 21], a ponadto aktywność EGFR pobudzana jest po zastosowaniu promieniowania
jonizującego (co uznawane jest jako jeden z nowotworowych mechanizmów radiooporności)
[21-23] receptor ten jest znanym celem dla terapii przeciwnowotworowej. Zablokowanie
funkcji EGFR skutkuje obniżeniem poziomu proliferacji i wzrostu komórek nowotworowych,
obniżeniem odporności na czynniki indukujące śmierć komórkową, spadkiem poziomu
inwazyjności komórek nowotworowych oraz ich zdolności do rozsiewu i adhezji, może
też ograniczać zdolność komórek do naprawy uszkodzeń DNA [24].
Topoizomeraza II, jako enzym regulujący topologię DNA, uczestniczy
w podstawowych procesach komórkowych takich jak replikacja DNA, transkrypcja,
rekombinacja oraz utrzymanie struktury chromatyny [25-28]. Zahamowanie jej funkcji przez
związek z grupy „trucizn” TOPO II wywołuje powstanie podwójnych pęknięć w nici DNA,
co może prowadzić do śmierci komórki [29-31].
Pomimo trwających od około 20 lat intensywnych badań skierowanych na poznawanie
funkcji i właściwości przeciwnowotworowych genisteiny, izoflawon ten nie został dotychczas
wdrożony do leczenia. Wśród głównych przeszkód wymienia się zbyt niską aktywność
genisteiny, czyli działanie w zbyt wysokich stężeniach niemożliwych do osiągnięcia w osoczu
krwi oraz niską biodostępność izoflawonu i jego słabe wchłanianie z przewodu pokarmowego
[32]. W celu poprawy właściwości farmakokinetycznych genisteiny od prawie dwóch dekad
prowadzone są badania, których celem jest uzyskanie skutecznego analogu, który
wykazywałby większą stabilność w ustroju oraz działał przeciwnowotworowo w niższych
stężeniach [33].
II. CEL PRACY
Pierwszym celem niniejszej pracy było zbadanie czy i w jakim stopniu nowe
glikozydowe pochodne genisteiny zsyntezowane w Katedrze Chemii Organicznej,
Bioorganicznej i Biotechnologii Politechniki Śląskiej wykazują zwiększoną właściwość
hamowania wzrostu komórek nowotworowych w porównaniu ze związkiem macierzystym,
genisteiną. Aby to wyjaśnić dla każdego z badanych związków określono wartość IC50.
Drugim celem było zbadanie czy i które z badanych pochodnych genisteiny
hamujących proliferację komórek nowotworowych w niższym stężeniu niż genisteina
wykazują właściwość uwrażliwiania komórek nowotworowych na działanie promieniowania
jonizującego, a zatem czy mogą być brane pod uwagę jako potencjalne radiouczulacze.
Trzecim celem pracy było określenie wybranych elementów mechanizmu hamowania
wzrostu komórek nowotworowych przez glikozydowe pochodne genisteiny. W tym celu
dla każdego z badanych związków określono:
właściwość modulowania poziomu EGFR oraz aktywności/fosforylacji EGFR;
właściwość hamowania aktywności/fosforylacji elementów szlaków zależnych
od EGFR, a mianowicie szlaku AKT oraz szlaku MAPK;
7
właściwość hamowania aktywności topoizomerazy II.
Badania niniejszej pracy miały charakter przesiewowy i w zamierzeniu powinny wskazać
pochodną/pochodne o najlepszych właściwościach radiouczulających, które w następnej
kolejności można by zakwalifikować do badań in vivo.
III. WYNIKI
W niniejszej pracy doktorskiej badaniami przesiewowymi objęto 10 pochodnych
genisteiny zsyntetyzowanych w zespole prof. Wiesława Szeji. Modyfikacja cząsteczki
genisteiny polegała na wprowadzeniu podstawników przy węglu C-7 oraz C-4’. Podstawnikami
były reszty cukrowe ramnalowe bądź laktalowe związane z aglikonem wiązaniem
O–glikozydowym lub C–glikozydowym. Pochodne genisteiny, które poddano badaniom
biologicznym w niniejszej pracy doktorskiej można zaklasyfikować do czterech grup:
Grupa I, to glikozydy genisteiny, w których reszta cukrowa połączona jest z aglikonem
w pozycji C-7. Ta grupa reprezentowana jest przez pochodną o nazwie G21. Pochodna
G21 traktowana jest w niniejszej pracy jako związek referencyjny, wybrany
na podstawie wcześniejszych badań [34, 35]. G21 w początkowych badaniach
zaklasyfikowano jako strukturę wiodącą, która mogłaby zostać wykorzystana do nowych
syntez chemicznych [35].
Grupa II to glikokoniugaty podstawione w pozycji C-7, w których reszta cukrowa jest
oddalona od cząsteczki genisteiny poprzez alkilowy łańcuch, przy czym reszta cukrowa
połączona jest z łącznikiem wiązaniem O-glikozydowym. W tej grupie znajdują
się badane pochodne o nazwie RAM-2, RAM-3 i RAM-5.
Grupa III to analogi omówionych uprzednio O-glikokoniugatów podstawione w pozycji
C-7, w których reszta cukrowa połączona jest z łącznikiem alkilowym poprzez wiązanie
C-glikozydowe. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-C-3α,
RAM-C-4α i RAM-C-5α. Zastąpienie wiązania O-glikozydowego, potencjalnie
wrażliwego na hydrolizę enzymatyczną, wiązaniem C-glikozydowym miało na celu
zwiększenie stabilności pochodnych w komórkach i/lub krwioobiegu.
Grupa IV to glikokoniugaty genisteiny, w których reszta cukrowa połączona
z łącznikiem alkilowym wiązaniem O-glikozydowym podstawiona jest w pozycji C-4’
genisteiny. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-2’, RAM-3’
i RAM-5’.
Pełne nazwy związków chemicznych wraz z podziałem na klasy, stosunkiem anomerów oraz
odnośnikami literaturowymi do opisów syntez zebrano w tabeli III-1.
8
Tabela III-1. Związki chemiczne używane w doświadczeniach. W tabeli przedstawiono pełne nazwy i wzory chemiczne związków, stosunek anomerów α/β, podział na grupy
w zależności od miejsca podstawienia i rodzaju wiązania glikozydowego w strukturze związku oraz odnośniki literaturowe, w których opisana została procedura chemicznej
syntezy każdej pochodnej.
Klasa Nazwa Nazwa wg IUPAC Struktura chemiczna Stosunek anomerów Opis syntezy
Str
uktu
ra
wio
dąc
a
Genisteina 5,7-dihydroksy-3-(4-
hydroksyfenylo)chromen-4-on
- -
Wią
zanie
O-g
lik
ozy
dow
e
po
dst
awie
nie
prz
y C
-7
G21
7–O–(2,3,4,6–tetra–O–acetylo–β–D–
galaktopiranozylo)–(14)–(6–O–
acetylo–heks–2–en–α–D–erytro–
piranozylo) genisteina
tylko α Rusin et al., 2009
RAM-2
5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–
trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–2–O–etoksy]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
α/β = 10/1
RAM-3
5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–
trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–3–O–propyloksy]–3–
(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on
α/β = 4.2/1 Rusin et al., 2011
RAM-5
5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–
trideoksy–α–L–erytro–heks––
enopiranozylo)–5–O–pentyloksy]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
α/β = 4/1
9
Wią
zanie
C-g
likozy
dow
e podst
awie
nie
prz
y
C-7
RAM-C-3α
5–hydroksy–7–O–[3–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)propylo]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
tylko α
RAM-C-4α
5–hydroksy–7–O–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)butylo]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
tylko α Rusin et al., 2014
RAM-C-5α
5–hydroksy–7–O–[5–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–
2enopiranozylo)pentylo]–3–(4–
hydroksyfenylo)chromen–4–on
tylko α
Wią
zanie
O-g
lik
ozy
do
we
po
dst
awie
nie
prz
y
C-4
’
RAM-2’
5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–β–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–2–etoksyfenylo]–
chromen–4–on
α/β = ¼
RAM-3’
5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–3–propyloksyfenylo]–
chromen–4–on
α/β = 6/1 Byczek et al., 2013
RAM-5’
5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–
2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–
enopiranozylo)–5–pentyloksyfenylo]–
chromen–4–on
α/β = 6/1
10
Doświadczenia prowadzono na komórkach dwóch linii nowotworowych: raka gruczołu
krokowego (linia DU145) oraz raka jelita grubego (linia HCT116) pochodzących
z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection) utrzymywanych w banku komórkowym
Centrum Onkologii. Komórki linii HCT116 charakteryzuje występowanie mutacji aktywujących
w genach K-RAS oraz PI3CK, które powodują konstytutywną aktywację szlaków RAF-MAPK oraz
PI3K-AKT niezależnie od poziomu aktywności EGFR [36]. Wybrane linie należą do szybko
proliferujących komórek nowotworowych, zawierających wysokie stężenie topoizomerazy II
oraz o wysokim poziomie ekspresji EGFR [37, 38]. Równocześnie komórki wybranych linii
wykazują zróżnicowaną radiooporność [39, 40]. Ponadto, dane z piśmiennictwa pokazują,
że w przypadku nowotworów gruczołu krokowego i jelita grubego obserwuje się słabsze efekty
działania inhibitorów EGFR w kombinacji z promieniowaniem w porównaniu do innych typów
nowotworów [41-43]. Wydaje się zatem racjonalne poszukiwanie związków o potencjalnie większej
skuteczności terapeutycznej w odniesieniu do wymienionych typów nowotworów.
III.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz IR
Właściwości cytotoksyczne pochodnych genisteiny oraz ich wpływ na wrażliwość komórek
nowotworowych na promieniowanie jonizujące badano stosując test klonogenności, w którym
wyznaczano wartość IC50 (takie stężenie związku, które powoduje obniżenie mierzonego efektu,
tu proliferacji komórkowej, o połowę). Wartości IC50, obliczone z zastosowaniem programu
CalcuSyn (http://www.biosoft.com/w/calcusyn.htm) opartego na algorytmach opracowanych przez
Chou-Talalaya [44, 45] dla każdego związku oraz promieniowania jonizującego przedstawiono
w tabeli III-2.
Tabela III-2. Wartości IC50 [µM] wraz z odchyleniami standardowymi wyznaczone w teście klonogenności
dla genisteiny oraz jej pochodnych, na które eksponowane były komórki linii nowotworowych jelita grubego
HCT116 oraz gruczołu krokowego DU145. Komórki inkubowano z pochodnymi przez 24 h. Wyznaczono również
IC50 dla IR. Wartości obliczone zostały na podstawie danych uzyskanych z przynajmniej 3 niezależnych
eksperymentów. Na czerwono zaznaczono pochodną o najniższej wartości IC50.(G21 – związek referencyjny)/
Czcionką pogrubioną zaznaczono wartości IC50 niższe od 5 μM, czyli, zgodnie z danymi literaturowymi, możliwe
do osiągnięcia w ustroju [46].
Badany związek IC50
(komórki HCT116)
IC50
(komórki DU145)
IR 1.97 ± 0.39 3.30 ± 0.65
GENISTEINA 31.3 ± 5.5 35.0 ± 8.8
G21 1.2 ± 0.3 3.0 ± 0.3
RAM-2 27.0 ± 8.2 43.8 ± 23.0
RAM-3 2.6 ± 1.5 11.0 ± 6.0
RAM-5 5.9 ± 0.1 11.0 ± 2.0
RAM-C-3α 19.4 ± 1.6 39.1 ± 4.4
RAM-C-4α 6.5 ± 0.8 3.8 ± 1.0
RAM-C-5α 12.5 ± 3.2 11.5 ± 4.3
RAM-2' 3.3 ± 0.9 5.1 ± 0.5
RAM-3' 13.2 ± 1.0 18.9 ± 5.1
RAM-5' 7.00 ± 0.1 6.7 ± 0.8
11
Otrzymane dane pokazały, że 8 spośród 10 badanych pochodnych genisteiny wywoływało
znacząco silniejsze działanie cytotoksyczne niż genisteina. Równocześnie żaden z badanych
związków nie obniżał potencjału klonogennego komórek silniej niż referencyjna pochodna G21.
Ogólnie, komórki HCT116 były bardziej wrażliwe na działanie badanych pochodnych i jedynie
związki RAM-C-4α i RAM-C-5α wykazywały silniejszy lub zbliżony efekt cytotoksyczny
w stosunku do komórek DU145.
W przypadku linii HCT116 najsilniej ograniczającymi potencjał klonogenny komórek były
dwie pochodne, a mianowicie RAM-3 oraz RAM-2’. W przypadku komórek DU145 najsilniej
cytotoksycznie działała pochodna RAM-C4α. Na podstawie przedstawionych powyżej wyników
do dalszych badań wybrano 8 związków, dla których wartość IC50 była istotnie niższa
niż dla genisteiny. Związki wyeliminowane z dalszych analiz to RAM-2 i RAM-C-3α. Potwierdzono
ponadto, że większą radiowrażliwością cechowała się linia nowotworowa ludzkiego raka jelita
grubego.
III.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym
W celu określenia czy badane pochodne genisteiny wykazują zdolność do zwiększania
cytotoksycznego efektu promieniowania jonizującego zastosowano test klonogenności. Porównano
efekt hamowania wzrostu komórek HCT116 i DU145 przez IR oraz badane związki pojedynczo
z efektem uzyskanym po zastosowaniu kombinacji obu tych czynników. Wyniki doświadczenia
pokazane są na rycinie III.1 (komórki HCT116) i na rycinie III.2 (komórki DU145).
Przedstawione wyniki pokazują, że połączone działanie badanych związków
i promieniowania jonizującego wywoływało silniejszy efekt cytotoksyczny, niż kiedy komórki
eksponowane były na działanie każdego z czynników (IR lub badany związek) oddzielnie. Jeżeli
odrzuci się wartości skrajne (uzyskane w wyniku ekspozycji komórek na największą dawkę
promieniowania i najwyższe zastosowanie stężenie badanego związku), to w przypadku komórek
HCT116 najsilniejszy efekt cytotoksyczny występował dla kombinacji pochodnej RAM-5
w stężeniach 2.5 oraz 5 μM z dawką IR odpowiednio 1 Gy lub 2 Gy.
Dla wszystkich pozostałych związków obserwowano poprawę efektu cytotoksycznego
kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii, jednak w stopniu słabszym niż dla RAM-5.
Najsłabszy efekt cytotoksyczny występował w przypadku pochodnej RAM-5’ stosowanej
w kombinacji z promieniowaniem. Należy zaznaczyć, że dla pochodnych RAM-5 i RAM-C-4α
w kombinacji z promieniowaniem efekt cytotoksyczny występował już przy stężeniach zbliżonych
do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt występował dla stężeń przekraczających
wartość IC50.
W przypadku komórek DU145 najsilniejszy kombinowany efekt cytotoksyczny
obserwowano dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ oraz, przeciwnie niż w komórkach
HCT116, RAM-5’. Dla pozostałych związków poza G21 oraz RAM-C-5α obserwowano poprawę
efektu cytotoksycznego kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii. Należy zaznaczyć,
że w przypadku pochodnych RAM-5 i RAM-2’ kombinowany efekt cytotoksyczny występował
już dla stężeń zbliżonych do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt występował
dla stężeń przekraczających tę wartość.
12
Rycina III.1. Przeżycie klonogenne komórek linii HCT116 po ekspozycji na genisteinę
lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub
promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były
eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze
osiągnięte efekty kombinacji.
Z porównania danych przedstawionych na rycinach III.1 i III.2 wynika,
że w badanych warunkach jedynie pochodne RAM-5 i RAM-3’ wykazywały silny kombinowany
efekt cytotoksyczny zarówno wobec komórek HCT116 jak i komórek DU145, przy czym jedynie
pochodna RAM-5 wykazywała kombinowany efekt toksyczny przy stężeniach zbliżonych
lub niższych niż wartość IC50. Należy zauważyć, że powyższe dane zaznaczają jedynie tendencję
osiąganych efektów, dlatego niezbędne było przeprowadzenie analizy uzyskanych wyników
w programie CalcuSyn.
W celu określenia jaki charakter (działanie addytywne lub synergistyczne) ma efekt łączenia
działania promieniowania jonizującego z pochodnymi genisteiny wyznaczono indeks kombinacji
metodą Chou-Talalaya korzystając z programu CalcuSyn. Wartości indeksu kombinacji (CI)
pozwalają określić rodzaj efektu kombinacji, i tak:
wartości CI powyżej 1.1 oznaczają antagonizm,
CI w zakresie 0.9-1.1 oznacza efekt addytywny,
CI w zakresie 0.7-0.9 wskazuje na słaby synergizm,
wartości CI poniżej 0.7 wskazują na istnienie synergizmu.
13
Rycina III.2. Przeżycie klonogenne komórek linii DU145 po ekspozycji na genisteinę
lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub
promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były
eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze
osiągnięte efekty kombinacji.
Wartości CI wyznaczane są w programie CalcuSyn dla poszczególnych efektów ED50, ED75,
ED90, czyli dla efektu wywołującego obniżenie potencjału klonogennego o kolejno 50%, 75% oraz
90%. Wyniki analizy efektu kombinacji dla komórek HCT116 przedstawiono w Tabeli III-3,
a dla komórek DU145 w Tabeli III-4.
Wartości indeksu kombinacji przedstawione w poniższych tabelach pokazują,
że synergistyczne, cytotoksyczne działanie promieniowania jonizującego i badanych związków
częściej występowało w odniesieniu do komórek raka gruczołu krokowego DU145 niż komórek raka
jelita grubego HCT116.
W przypadku komórek DU145 synergizm występował dla większości badanych związków
(wyjątkiem była genisteina i pochodna G21) przy wartościach dawki efektywnej ED75 i ED90.
Dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ i RAM-5’ synergizm można określić jako silny –
wartości indeksu kombinacji CI w zakresie od 0.15 (przy ED90) dla RAM-3’ do 0.36 (przy ED50)
dla RAM-5.
14
Tabela III-3. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50,
ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii HCT116. W tabeli przedstawiono średnie z co najmniej
trzech niezależnych eksperymentów wraz z odchyleniami standardowymi. Kolorem czerwonym zaznaczono
wartości wskazujące na synergizm, natomiast kolorem czarnym wartości wskazujące umiarkowany efekt
synergistyczny.
HCT116 CI ED50 ED75 ED90
GENISTEINA 1.4 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1
G21 0.7 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.18
RAM-3 1.0 ± 0.6 0.9 ± 0.5 0.8 ± 0.5
RAM-5 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.5 ± 0.2
RAM-C-4α 1.2 ± 0.04 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1
RAM-C-5α 1.2 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1
RAM-2' 1.1 ± 0.3 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2
RAM-3' 1.2 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1
RAM-5' 1.5 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1
Tabela III-4. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50,
ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii DU145. W tabeli przedstawiono dane uzyskane
na podstawie obliczeń w programie CalcuSyn wraz z odchyleniami standardowymi. Wartości obliczone
na podstawie danych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Kolorem zielonym zaznaczono wartości
wskazujące na silny synergizm, kolorem czerwonym synergizm.
DU145 CI ED50 ED75 ED90
GENISTEINA 1.2 ± 0.5 0.9 ± 0.3 0.8 ± 0.3
G21 1.1 ± 0.2 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.3
RAM-3 1.0 ± 0.5 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1
RAM-5 0.7 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.0
RAM-C-4α 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.7 ± 0.3
RAM-C-5α 0.9 ± 0.2 0.6 ± 0.3 0.5 ± 0.3
RAM-2' 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.0
RAM-3' 0.9 ± 0.3 0.3 ± 0.1 0.5 ± 0.1
RAM-5' 1.1 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1
Należy zauważyć, że w linii HCT116 (ale nie w DU145) zastosowanie kombinacji
testowanych związków z promieniowaniem jonizującym w większości przypadków powodowało
powstawanie antagonizmu przy ED50. Trzeba tutaj podkreślić, że, w przeciwieństwie to powyższej
tendencji, dwie pochodne, RAM-5 oraz G21, w niskich stężeniach nie działały antagonistycznie
w kombinacji z niskimi dawkami promieniowania, ale powodowały powstawanie efektów
addytywnych bądź słabo synergistycznych. Podkreślenia wymaga, że znaczący efekt synergistyczny
obserwowano także przy ED50 dla pochodnych RAM-2’ (CI = 0.5) i RAM-5 (CI = 0.7) w linii
DU145.
15
III.3. Hamowanie aktywności EGFR przez genisteinę i jej pochodne
Badania wstępne [47] wskazywały, że niektóre glikozydowe pochodne genisteiny mogą
hamować, w stopniu znacznie bardziej nasilonym niż genisteina, aktywność kinaz tyrozynowych,
w tym kinazy będącej przedmiotem badań niniejszej pracy doktorskiej, a mianowicie receptora
naskórkowego czynnika wzrostu, EGFR. Ponieważ najważniejszym mechanizmem aktywującym
tę kinazę, jest spowodowana jej oddziaływaniem z ligandem autofosforylacja [21], zatem kolejnym
etapem pracy doktorskiej było zbadanie czy i w jakim stopniu pochodne genisteiny mogą blokować
fosforylację EGFR.
Poziom fosforylacji EGFR badano z użyciem metody „western blot”. Otrzymane obrazy
poddano analizie densytometrycznej z zastosowaniem programu ImageJ (NIH, program pobrany
ze strony http://imagej.nih.gov/ij/, na podanej stronie internetowej znajduje się również opis
metodyki oraz zastosowania programu). Wartość intensywności sygnału odczytywano
z densytogramów, a wyniki z trzech niezależnych doświadczeń uśredniano. Wyniki analizy
przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na rycinach III.3 i III.4.
Rycina III.3. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji przez 24 godziny
na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów
z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie
oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli
nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Ramkami zaznaczono najsilniejsze efekty
(spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.
Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.
16
Rycina III.4. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji przez 24 godziny
na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów
z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie
oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli
nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami
zaznaczono najsilniejsze efekty (spadek zawartości pEGFR II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną
zaznaczono związek działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.
Dwa spośród badanych związków, a mianowicie RAM-2’ oraz RAM-3’ nie hamowały
fosforylacji EGFR przy Tyr 1068 i Tyr 1173 w linii HCT116, a genisteina i pochodna
RAM-5’ hamowały fosforylację w stopniu umiarkowanym.
Związkiem o zdecydowanie najsilniejszej zdolności hamowania aktywności EGFR okazał
się RAM-5 wywołujący w obu liniach komórkowych spadek poziomu fosforylacji białka
przy obu badanych tyrozynach o połowę w najniższym zastosowanym stężeniu (100 nM). RAM-5
szczególnie silnie obniżał poziom fosforylacji EGFR przy tyrozynie 1173 – w stężeniu 20 µM o ok.
90% (w porównaniu do komórek kontrolnych). Należy podkreślić, że efekt hamowania fosforylacji
EGFR przez RAM-5 ujawniał się w stężeniach znacznie niższych od wartości IC50.
Pozostałe związki, a mianowicie RAM-3, RAM-C-4α, RAM-C-5α oraz G21 można uznać
za hamujące fosforylację EGFR w stopniu obiecującym. Pochodne te stosowane w stężeniach
przekraczających 2-4 krotnie wartość IC50 ograniczały poziom fosforylacji Tyr 1068 oraz Tyr 1173
w zakresie od około 50% do około 20% całkowitej aktywności. Należy podkreślić, że wszystkie
badane pochodne hamowały silniej fosforylację Tyr 1173 niż Tyr 1068, przeciwnie niż związek
macierzysty, genisteina. Związkiem o zdecydowanie najsilniejszej zdolności hamowania aktywności
17
EGFR w komórkach DU145 okazała się, tak jak w przypadku komórek HCT116, pochodna RAM-5,
przy czym pochodna ta w linii DU145 hamowała fosforylację Tyr 1068 i Tyr 1173 w równym stopniu.
Stosunkowo silne zahamowanie fosforylacji EGFR obserwowano po zastosowaniu pochodnej
RAM-3, dla której efekt hamowania ujawniał się, podobnie jak w przypadku pochodnej RAM-5,
już w stężeniach niższych od wartości IC50.
W badaniach równoległych pokazano, że żaden ze związków nie zmieniał w sposób istotny
poziomu ekspresji receptora (poziomu EGFR) w żadnej z badanych linii komórkowych. Tym samym
można założyć, że najbardziej prawdopodobną przyczyną zmniejszania się poziomu pEGFR
w komórkach traktowanych pochodnymi genisteiny jest hamowanie przez te pochodne aktywności
kinazowej związanej z tym receptorem.
III.4. Hamowanie indukowanej promieniowaniem jonizującym aktywacji EGFR
Porównanie wyników uzyskanych w doświadczeniach opisanych powyżej wskazywało
na to, że pochodna RAM-5 wywołująca najsilniejszy cytotoksyczny efekt synergistyczny
w kombinacji z IR, to związek, który został wcześniej wskazany jako najwydajniej hamujący poziom
fosforylacji EGFR. Z danych z piśmiennictwa wiadomo, że promieniowanie jonizujące może być
czynnikiem zwiększającym poziom aktywności EGFR [21-23]. Można było zatem sądzić, że jednym
z elementów mechanizmu uwrażliwiania badanych komórek na działanie IR może być hamowanie
aktywności EGFR. W świetle tych danych istotne było ustalenie czy te pochodne genisteiny, które
wykazują właściwość silnego uczulania komórek na działanie IR równocześnie powodują znaczące
obniżanie poziomu fosforylacji EGFR indukowanej IR. Aby to wyjaśnić wykonałam analizę „western
blot”, której celem było oznaczenie poziomu fosforylowanych form Tyr 1173 oraz Tyr 1068 EGFR
w komórkach traktowanych przez 24 h pochodnymi genisteiny, a napromienianych. Wyniki
przedstawiono w formie wykresów słupkowych na rycinach III.5 i III.6
W komórkach HCT116 poddanych działaniu promieniowania jonizującego w dawce
2 Gy, ale nietraktowanych badanymi związkami wzrasta poziom obu fosforylowanych form EGFR
w zakresie do około 30%, a w komórkach DU145 traktowanych IR w dawce 4 Gy nawet do około
50% w porównaniu do komórek nieeksponowanych na działanie promieniowania. Otrzymane wyniki
pokazują, że tak jak opisano w literaturze dla innych linii komórek nowotworowych,
i w tym przypadku zachodzi indukowana promieniowaniem aktywacja EGFR. Jeśli jednak przed
ekspozycją na IR komórki traktowane są genisteiną lub jej pochodnymi, wtedy, w zależności od linii
komórkowej i stosowanych dawek związku, poziom fosforylowanych form EGFR ulega obniżeniu
co najmniej do poziomu występującego w komórkach nietaktownych, a w przypadku kilku
pochodnych do poziomu poniżej 50% poziomu występującego w komórkach kontrolnych.
Porównując dane pokazane na rycinach III.3 z III.5 (komórki HCT116) oraz rycinach
III.4 z III.6 (komórki DU145) można zauważyć, że te same związki, które najefektywniej obniżały
poziom form Tyr 1173 oraz Tyr 1068 EGFR w komórkach HCT116 i DU145 w doświadczalnym
wariancie, w którym nie stosowano promieniowania jonizującego, były także skuteczne
w hamowaniu aktywności EGFR w komórkach napromienianych.
Jako związki najskuteczniej hamujące fosforylację EGFR w linii HCT116 wytypowano
RAM-5, G21 oraz RAM-3, które nie tylko zmniejszały zawartość fosforylowanej formy EGFR
(pEGFR) do poziomu komórek kontrolnych (nietraktowanych), ale powodowały jego spadek
18
do połowy tej wartości w zakresie stosowanych stężeń. Podobne efekty obserwowano w linii DU145
po zastosowaniu RAM-5, przy czym należy zaznaczyć, że po 24-godzinnej ekspozycji komórek
DU145 na tę pochodną, a następnie ich napromienianiu poziom pEGFR-Tyr 1068 spadał jedynie
do poziomu komórek nienapromienianych. Spośród pozostałych pochodnych jedynie RAM-C-5α
w najwyższych zastosowanych stężeniach wywoływał obniżenie zawartości pEGFR poniżej poziomu
komórek kontrolnych. Jedynym spośród badanych związków, który efektywnie obniżał indukowaną
promieniowaniem aktywność EGFR zarówno w komórkach HCT116 jak i DU145 był RAM-5.
Wyniki omawianego doświadczenia pokazują, że jednym z mechanizmów odpowiadającym
za właściwości radiouczulające pochodnej RAM-5 może być hamowanie aktywności kinazy EGFR
w komórkach HCT116 oraz DU145.
Rycina III.5. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji
na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (2 Gy). Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane
do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR
= 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym
aktywność EGFR (spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek
działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.
19
Rycina III.6. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji
na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (4 Gy). Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot”. Z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane
do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR
= 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym
aktywność EGFR (spadek zawartości Pegfr o przynajmniej połowę). Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr
1173.
III.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę
i jej pochodne
Oddziaływanie EGFR z ligandem aktywuje kilka cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych
stymulujących procesy związane z proliferacją komórek, różnicowaniem, potencjałem migracyjnym
i przeżyciem. Szlakami sygnałowymi aktywowanymi w wyniku fosforylacji EGFR są między innymi
ścieżki sygnałowe RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT [24, 48, 49]. Jak pokazują dane literaturowe
konstytutywna aktywność ścieżek RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT spowodowana mutacjami w
genach K-RAS oraz PI3KCA może być przyczyną niepowodzenia w leczeniu z zastosowaniem
inhibitorów EGFR [50, 51]. Pożądaną właściwością pochodnych genisteiny, w kontekście ich
potencjalnego zastosowania jako inhibitorów EGFR, byłaby ich zdolność do hamowania kinaz
znajdujących się poniżej w szlaku przekazywania sygnału, w tym kinaz AKT i ERK 1/2. Należy przy
tym zauważyć, że wspomniane szlaki przekazu sygnału stanowią skomplikowaną sieć oddziaływań
20
pomiędzy ich poszczególnymi elementami, a zahamowanie aktywności EGFR jest tylko jednym
z wielu możliwych czynników modulujących aktywność kinaz AKT czy ERK 1/2.
W celu określenia czy zahamowanie fosforylacji EGFR przez testowane pochodne zmniejsza
aktywność szlaków zależnych od EGFR, zbadano poziom fosforylacji kinaz AKT oraz ERK 1/2
w komórkach inkubowanych przez 24 godziny z analizowanymi związkami. Jak w poprzednich
doświadczeniach posłużono się metodą „western blot” oraz densytometrii w programie ImageJ.
Wyniki analizy przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na rycinach III.7
dla pAKT oraz III.8 dla pERK 1/2.
Rycina III.7. Analiza poziomu fosforylacji AKT w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych ekspozycji przez
24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych
na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki
obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych
w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami zaznaczono
związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność AKT o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną
zaznaczono związek najefektywniejszy. Wszystkie stężenia podano w μM.
W przypadku komórek HCT116 tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany sposób obniżała
poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Inną pochodną, która hamowała aktywację AKT, jednak
znacznie słabiej niż RAM-5, był związek G21. Spośród innych związków, które obniżały zawartość
pEGFR (RAM-C4α oraz RAM-C5α), żaden nie powodował istotnych zmian w poziomie
fosforylowanej (aktywnej) formy AKT. Inne związki, które nie hamowały aktywacji EGFR,
21
nie powodowały także zmian w poziomie aktywnej formy kinazy AKT. Interesujące jest,
że w przypadku traktowania komórek HCT116 pochodną RAM-5’ dochodziło do pobudzenia
aktywności kinazy AKT.
W przypadku komórek DU145, również tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany sposób
obniżała poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Spośród innych związków, które
we wcześniejszych badaniach hamowały fosforylację EGFR (RAM-3, RAM-C-4α oraz RAM-C-5α)
jedynie RAM-3 i RAM-C4α hamowały aktywację kinazy AKT. Można także zauważyć, że inaczej
niż w przypadku komórek HCT116, również pochodna G21, jakkolwiek w stosunkowo wysokim
stężeniu, znacznie obniżała zawartość pAKT.
Rycina III.8. Analiza poziomu fosforylacji kinazy ERK 1/2 w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych
ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych
wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów.
Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek
kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami
zaznaczono związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność ERK 1/2 o przynajmniej połowę).
Ramką czerwoną zaznaczono związek najefektywniejszy.
Jak wynika z danych zamieszczonych na rycinie III.8 badane pochodne zasadniczo
w podobny sposób hamują aktywność kinazy ERK 1/2 (pERK 1/2) i kinazy AKT (pAKT).
I w tym przypadku związkiem najwydajniej blokującym fosforylację ERK 1/2 okazała
22
się pochodna RAM-5. Pochodna RAM-5’, która niespodziewanie zwiększała poziom fosforylowanej
formy AKT w komórkach HCT116, nie wykazywała takiego efektu w stosunku do kinazy ERK 1/2.
Otrzymane dane wskazują także, że niektóre z pochodnych zwiększają aktywność kinazy ERK 1/2.
W przypadku komórek HCT116 obserwowałam wzrost zawartości pERK 1/2 po zastosowaniu
RAM-C-4α oraz RAM-5’, w przypadku DU145: RAM-C-4α, RAM-2’ oraz w mniejszym stopniu
RAM-5’. Związek RAM-5’ powodował również wzrost zawartości pAKT w linii HCT116.
III.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne
Genisteina, jako związek o działaniu plejotropowym oddziałuje z wieloma celami
molekularnymi. Do najważniejszych celów molekularnych w kontekście blokowania proliferacji
komórek nowotworowych należy, oprócz kinaz tyrozynowych, topoizomeraza II. Genisteina,
podobnie jak etopozyd, zaliczana jest do związków określanych jako „trucizny” topoizomerazy II.
Rycina III.9. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β
w komórkach linii HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane
do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form
topoizmoerazy II = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21.
Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający
najwydajniej.
23
Rycina III.10. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β
w komórkach linii DU145 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz
densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych
eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do
poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form
topoizomerazy = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21. Ramkami
zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA
topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.
Genisteina podana komórkom przyłącza się do związanej kowalencyjnie z DNA
topoizomerazy II tworząc potrójny kompleks (ang. ternary complex). W ten sposób genisteina
blokuje etap łączenia przeciętych nici DNA (faza ligacji) prowadząc do powstania podwójnych
pęknięć w nici DNA, a to z kolei może prowadzić do śmierci komórek [52, 53].
We wcześniejszych badaniach wykazano, że pochodna G21 wykazuje właściwość inhibitora
TOPO II (Gogler-Pigłowska et al., 2012). Można było zatem oczekiwać, że także inne pochodne
badane w niniejszej pracy również mogą wykazywać właściwość trucizn topoizomerazy.
W celu określenia wpływu wprowadzonych do cząsteczki genisteiny modyfikacji
na jej zdolność do hamowania aktywności TOPO II zastosowano test „immunoband depletion”,
a otrzymane obrazy poddawano densytometrii. Wyniki opracowane jak poprzednio przedstawiono
24
na rycinach III.9 (komórki HCT116) oraz III.10 (komórki DU145). Jak wykazałam wpływ badanych
związków na aktywność TOPO II α i TOPO II β jest w komórkach HCT116 i DU145 podobny.
W obu liniach spośród związków referencyjnych najsilniejsze działanie hamujące aktywność
topoizomerazy II wykazał etopozyd, lek rutynowo stosowany w leczeniu przeciwnowotworowym.
Genisteina i G21 hamowały aktywność topoizomerazy II, jednak istotny efekt pojawiał się jedynie,
jeśli związki te były stosowane w najwyższych badanych stężeniach. Spośród testowanych
pochodnych genisteiny jedynie RAM-5 wykazywał silny efekt hamujący aktywność TOPO II, przy
czym silniejszy w odniesieniu do formy β. Stosunkowo niskie stężenia RAM-5 (5 μM), przy których
zahamowanie aktywności TOPOII jest znaczące wskazują, że pochodna ta może być rozważana jako
interesujący obiekt dalszych badań przedklinicznych. Inne badane pochodne genisteiny nie wpływały
na aktywność żadnej z form topoizomerazy II lub obserwowany efekt hamujący był nieznaczny.
III.7. Podsumowanie wyników badań
Pochodnymi najsłabiej działającymi na wybrane do badań cele molekularne była grupa
związków O-glikozydowych podstawionych grupą ramnalową przy węglu C-4’. W przypadku
związków tej serii obserwowano ponadto pogarszanie się właściwości cytotoksycznych wraz z
wydłużaniem łącznika węglowego w cząsteczce. Pochodne te nie hamowały aktywności ani EGFR,
ani zależnych od niego szlaków sygnałowych, jak również TOPO II. Mimo to w przypadku komórek
linii DU145 działały synergistyczne z promieniowaniem jonizującym. Efekt ten musiał zatem zależeć
od działania tych pochodnych na inne cele molekularne niż badane w niniejszej pracy doktorskiej.
Pochodne O-glikozydowe podstawione przy węglu C-7 modulowały aktywność EGFR
zarówno samodzielnie, jaki i w kombinacji z IR znacząco efektywniej w komórkach linii HCT116
niż w komórkach linii DU145. Z drugiej strony to w linii DU145 po zastosowaniu pochodnych
genisteiny osiągnięto efekty silnie synergistyczne, podczas gdy w linii HCT116 jedynie
synergistyczne. Efekt działania pochodnych C-glikozydowych (RAM-C-4α, RAM-C-5α) można
ocenić jako umiarkowany, jednak słabszy niż ich analogów O-glikozydowych (RAM-3, RAM-5).
Spośród pochodnych obniżających aktywność EGFR w obu liniach komórkowych (RAM-3, RAM-
5, RAM-C-4α, RAM-C-5α) jednie RAM-5 hamował także aktywność kinaz znajdujących się poniżej
w szlaku sygnałowym zależnym od EGFR, również w linii HCT116, w której szlaki sygnałowe AKT
oraz MAPK są konstytutywnie aktywne ze względu na występowanie mutacji w genach K-RAS oraz
PI3KCA. Najważniejsze wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej zostały
podsumowane w tabelach IV-5 (komórki HCT116) oraz IV-6 (komórki DU145).
Szczególnie ważnym wynikiem niniejszej pracy jest informacja, że RAM-5 pozwala na
uzyskanie istotnego efektu synergistycznego w kombinacji z promieniowaniem jonizującym już w
stężeniu 5 μM, które jest możliwe do osiągnięcia w osoczu krwi, przy założeniu, że cząsteczka RAM-
5 jest stabilna i nie ulega degradacji podczas obiegu w układzie krążenia. Dane literaturowe pokazują,
że cytotoksyczność związków radiouczulających wobec komórek nowotworowych in vitro jest
zróżnicowana i ujawnia się w zakresie stężeń od nanomolarnych do mikromolarnych [54-59].
Stężenia efektywne RAM-5 mieszczą się w zakresie stężeń mikromolarnych, co pozwala
zaklasyfikować związek do kandydatów na leki o umiarkowanych właściwościach cytotoksycznych.
25
Tabela III-1. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek HCT116. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka
zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość
plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek
napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby
synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).
*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach
nietraktowanych (brak efektu „-”))
+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości
w komórkach kontrolnych „0”)
ZWIĄZEK IC50 EGFR pEGFR-
Tyr 1068 pEGFR-
Tyr 1173 pEGFR-Tyr
1068 + IR pEGFR-Tyr
1173 + IR pAKT pERK 1/2 TOPO II α TOPO II β
EFEKT Z IR
ED50/ED75/ED90
GENISTEIN 31.30 ± 5.47 0 + 0 + / 0 + / 0 0 0 + + + - / 0 / 0
G21 1.24 ± 0.34 0 + + + + + + /
+ + +
+ + + /
+ + + + + + + + + + + + + / + + / + +
RAM-3 2.63 ± 1.52 0 + + + + + + + + + /
+ + +
+ + + /
+ + 0 0 0 słaby + 0 / 0 / +
RAM-5 5.89 ± 0.07 0 + + + + + + + + + + + + /
+ + +
+ + + + /
+ + + + + + + + + + + + + + 0 / + + / + +
RAM-2’ 3.32 ± 0.88 0 0 0 0 / - 0 / - 0 0 0 0 0 / 0 / + +
RAM-3’ 13.17 ± 0.94 0 0 0 0 / - + / 0 0 0 0 0 - / 0 / +
RAM-5’ 7.00 ± 0.06 0 0 0 0 / - 0 / - - 0 - 0 - / - / 0
RAM-C-4α 6.52 ± 0.79 0 + + + + / słaby + +/słaby + 0 + 0 0 - / + / + +
RAM-C-5α 12.54 ± 3.16 0 + + + + + + / słaby + +/słaby + 0 0 - 0 - / + / + +
26
Tabela III-2. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek DU145. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka
zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość
plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek
napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby
synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).
*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach
nietraktowanych (brak efektu „-”))
+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości
w komórkach kontrolnych „0”)
ZWIĄZEK IC50 EGFR pEGFR-
Tyr 1068 pEGFR-
Tyr 1173 pEGFR-Tyr
1068 + IR pEGFR-Tyr
1173 + IR pAKT pERK ½ TOPO II α TOPO II β
EFEKT Z IR
ED50/ED75/ED90
GENISTEINA 35.02 ± 8.77 0 0 Słaby + + / 0 * + / 0 0 0 + + + + - / 0 /+
G21 2.96 ± 0.28 0 + + Słaby + 0 / - * + / 0 + + + + + + - / 0 / +
RAM-3 10.97 ± 5.92 0 + + + + + + 0 / - + + / + + 0 0 słaby + 0 / + + / + +
RAM-5 10.95 ± 2.03 0 + + + + + + + + + / 0 + + / + + + + + + + + + + + + + / + + + / + + +
RAM-2’ 5.08 ± 0.45 0 0 - + / 0 0 / - 0 - 0 0 + + / + + + / + + +
RAM-3’ 18.86 ± 5.14 0 0 0 0 / - + / 0 0 0 0 0 0 / + + + / + + +
RAM-5’ 6.70 ± 0.81 0 0 0 0 / - 0 / - - 0 - 0 0 / + + + / + + +
RAM-C-4α 3.82 ± 1.00 0 + + + + / 0 + + / + + - 0 0 + / + + / + +
RAM-C-5α 11.49 ± 4.27 0 + + + + / 0 + / 0 0 0 - 0 0 / + / + +
27
Jeśli brak toksyczności ogólnoustrojowej zostanie potwierdzony w badaniach in vivo,
pochodna ta może być brana pod uwagę jako związek korzystniejszy niż większość stosowanych
chemoterapeutyków o wysokiej toksyczności systemowej, których aplikowanie odbywa
się z przerwami, co wydłuża okres terapii. Podkreślenia wymaga, że równolegle prowadzone
badania w Katedrze Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego
Politechniki Śląskiej pozwoliły na opracowanie nowej, prostszej syntezy związku RAM-5
(prof. Wiesław Szeja, dr Piotr Świerk, informacja ustna).
W podsumowaniu należy podkreślić, że w przypadku pochodnych testowanych w niniejszej
pracy nie udało się dotychczas określić zależności struktura-aktywność, czyli przypisać
określonych właściwości biologicznych konkretnemu, pojedynczemu parametrowi w strukturze
chemicznej związków. Nawet niewielkie różnice w budowie związku, na przykład długość
łącznika, czy wystąpienie różnych atomów mogą powodować powstanie odmiennych efektów
biologicznych o różnym nasileniu. Złożoność problemu rośnie również w wyniku obserwacji,
że efekt biologiczny wywoływany przez pochodne jest specyficzny względem linii komórkowych.
Podobne trudności w określeniu SAR zdarzały się już uprzednio dla rozmaitych związków [60, 61].
Jednak, pomimo powyższych trudności, badania poniższej pracy pozwoliły na wytypowanie
związku o potencjalnej przydatności klinicznej. Powyżej przedstawione wyniki badań dają również
podstawy do rozpoczęcia badań in vivo pochodnej RAM-5.
IV. WNIOSKI
1. Stosowanie pochodnych genisteiny w kombinacji z promieniowaniem jonizującym jest strategią
racjonalną umożliwiającą osiągnięcie efektów synergistycznych w liniach komórkowych
HCT116 i DU145.
2. Pochodna RAM-5 jest najskuteczniejszym związkiem promieniouwrażliwiającym komórki
nowotworowe linii HCT116 oraz linii DU145. RAM-5 działa plejotropowo, wywołuje
zahamowanie aktywności EGFR, kinazy AKT, kinazy ERK1/2, oraz topoizomerazy II.
Wszystkie obserwowane efekty RAM-5 wywołuje przy najniższych wartościach stężeń
w porównaniu do pozostałych pochodnych: 5 μM.
3. Dla pochodnych podstawionych przy węglu C-7 istnieje zależność pomiędzy zdolnością
do hamowania aktywności EGFR a zwiększaniem cytotoksycznego wpływu promieniowania
jonizującego na komórki nowotworowe w komórkach linii HCT116. Silniejszy synergizm
obserwuje się dla związków wydajniej hamujących fosforylację EGFR. Podobnej korelacji nie
obserwuje się w komórkach linii DU145.
4. Dla pochodnych cukrowych podstawionych przy węglu C-4’ nie obserwuje się zdolności
do hamowania aktywności EGFR. Uzyskane efekty silnie synergistyczne w kombinacji
z promieniowaniem jonizującym w komórkach linii DU145 muszą zależeć od innych
mechanizmów.
5. Tylko dwie pochodne hamują aktywność topoizomerazy II indukując kowalencyjne kompleksy
enzymu z DNA: G21 oraz RAM-5 w obu badanych liniach komórkowych.
6. Pochodna wytypowana do dalszych badań in vivo jako najskuteczniejsza substancje
o potencjalnym zastosowaniu jak lek radiouwrażliwiający to RAM-5.
28
V. BIBLIOGRAFIA
1. Seiwert, T.Y., J.K. Salama, and E.E. Vokes, The concurrent chemoradiation paradigm--general principles. Nat Clin Pract
Oncol, 2007. 4(2): p. 86-100.
2. Li, F., C. Zhao, and L. Wang, Molecular-targeted agents combination therapy for cancer: developments and potentials. Int J
Cancer, 2014. 134(6): p. 1257-69.
3. Ravaud, A., M. Gross-Goupil, and J. Bellmunt, Combination therapy in metastatic renal cell cancer. Semin Oncol, 2013.
40(4): p. 472-81.
4. Uzoigwe, J. and E.R. Sauter, Cancer prevention and treatment using combination therapy with plant- and animal-derived
compounds. Expert Rev Clin Pharmacol, 2012. 5(6): p. 701-9.
5. Hao, F., et al., Neem components as potential agents for cancer prevention and treatment. Biochim Biophys Acta, 2014.
1846(1): p. 247-257.
6. Hazra, B., et al., The prospective role of plant products in radiotherapy of cancer: a current overview. Front Pharmacol, 2011.
2: p. 94.
7. Gupta, C. and D. Prakash, Phytonutrients as therapeutic agents. J Complement Integr Med, 2014.
8. Vinod, B.S., T.T. Maliekal, and R.J. Anto, Phytochemicals as chemosensitizers: from molecular mechanism to clinical
significance. Antioxid Redox Signal, 2013. 18(11): p. 1307-48.
9. Eke, I., et al., EGFR/JIP-4/JNK2 signaling attenuates cetuximab-mediated radiosensitization of squamous cell carcinoma
cells. Cancer Res, 2013. 73(1): p. 297-306.
10. Perri, F., et al., Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications.
Head Neck, 2014.
11. Miura, K., et al., The combination of olaparib and camptothecin for effective radiosensitization. Radiat Oncol, 2012. 7: p. 62.
12. Zhang, Y., et al., Synergistic effect of combination topotecan and chronomodulated radiation therapy on xenografted human
nasopharyngeal carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2013. 87(2): p. 356-62.
13. Messing, E., et al., A phase 2 cancer chemoprevention biomarker trial of isoflavone G-2535 (genistein) in presurgical bladder
cancer patients. Cancer Prev Res (Phila), 2012. 5(4): p. 621-30.
14. Bandele, O.J. and N. Osheroff, The efficacy of topoisomerase II-targeted anticancer agents reflects the persistence of drug-
induced cleavage complexes in cells. Biochemistry, 2008. 47(45): p. 11900-8.
15. Mizushina, Y., et al., Inhibitory effects of a major soy isoflavone, genistein, on human DNA topoisomerase II activity and
cancer cell proliferation. Int J Oncol, 2013. 43(4): p. 1117-24.
16. Cui, S., N. Wienhoefer, and U. Bilitewski, Genistein induces morphology change and G2/M cell cycle arrest by inducing p38
MAPK activation in macrophages. Int Immunopharmacol, 2014. 18(1): p. 142-50.
17. Liu, X., et al., Genistein enhances the radiosensitivity of breast cancer cells via G(2)/M cell cycle arrest and apoptosis.
Molecules, 2013. 18(11): p. 13200-17.
18. Hillman, G.G., et al., Differential effect of soy isoflavones in enhancing high intensity radiotherapy and protecting lung tissue
in a pre-clinical model of lung carcinoma. Radiother Oncol, 2013. 109(1): p. 117-25.
19. Aravindan, S., et al., Molecular basis of 'hypoxic' breast cancer cell radio-sensitization: phytochemicals converge on radiation
induced Rel signaling. Radiat Oncol, 2013. 8: p. 46.
20. Hwangbo, W., et al., EGFR Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Ductal Carcinoma of the Breast. Korean
J Pathol, 2013. 47(2): p. 107-15.
21. Nijkamp, M.M., et al., Interaction of EGFR with the tumour microenvironment: implications for radiation treatment.
Radiother Oncol, 2013. 108(1): p. 17-23.
22. Bai, J., X.G. Guo, and X.P. Bai, Epidermal growth factor receptor-related DNA repair and radiation-resistance regulatory
mechanisms: a mini-review. Asian Pac J Cancer Prev, 2012. 13(10): p. 4879-81.
23. Baumann, M., et al., EGFR-targeted anti-cancer drugs in radiotherapy: preclinical evaluation of mechanisms. Radiother
Oncol, 2007. 83(3): p. 238-48.
24. Roskoski, R., Jr., ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacol Res, 2014. 87c:
p. 42-59.
25. Baldwin, E.L. and N. Osheroff, Etoposide, topoisomerase II and cancer. Curr Med Chem Anticancer Agents, 2005. 5(4): p.
363-72.
26. Chikamori, K., et al., DNA topoisomerase II enzymes as molecular targets for cancer chemotherapy. Curr Cancer Drug
Targets, 2010. 10(7): p. 758-71.
27. Fortune, J.M. and N. Osheroff, Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice. Prog Nucleic
Acid Res Mol Biol, 2000. 64: p. 221-53.
28. McClendon, A.K. and N. Osheroff, DNA topoisomerase II, genotoxicity, and cancer. Mutat Res, 2007. 623(1-2): p. 83-97.
29. Bailly, C., Contemporary challenges in the design of topoisomerase II inhibitors for cancer chemotherapy. Chem Rev, 2012.
112(7): p. 3611-40.
30. Pogorelcnik, B., A. Perdih, and T. Solmajer, Recent developments of DNA poisons--human DNA topoisomerase IIalpha
inhibitors--as anticancer agents. Curr Pharm Des, 2013. 19(13): p. 2474-88.
31. Pogorelcnik, B., A. Perdih, and T. Solmajer, Recent advances in the development of catalytic inhibitors of human DNA
topoisomerase IIalpha as novel anticancer agents. Curr Med Chem, 2013. 20(5): p. 694-709.
29
32. Simons, A.L., et al., Greater apparent absorption of flavonoids is associated with lesser human fecal flavonoid disappearance
rates. J Agric Food Chem, 2010. 58(1): p. 141-147. .
33. Rusin, A. and Z. Krawczyk, Genistein Derivatization - From a Dietary Supplement to a Pharmaceutical Agent. 2011: INTECH
Open Access Publisher.
34. Rusin, A., et al., Unsaturated genistein disaccharide glycoside as a novel agent affecting microtubules. Bioorg Med Chem
Lett, 2009. 19(17): p. 4939-43.
35. Gogler-Piglowska, A., et al., Aneugenic effects of the genistein glycosidic derivative substituted at C7 with the unsaturated
disaccharide. Cell Biol Toxicol, 2012. 28(5): p. 331-42.
36. Jhawer, M., et al., PIK3CA Mutation/PTEN Expression Status Predicts Response of Colon Cancer Cells to the Epidermal
Growth Factor Receptor Inhibitor Cetuximab. Cancer Research, 2008. 68(6): p. 1953-1961.
37. Sahlberg, S.H., et al., Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and
radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One, 2014. 9(4): p. e94621.
38. Pignon, J.-C., et al., Androgen Receptor Controls EGFR and ERBB2 Gene Expression at Different Levels in Prostate Cancer
Cell Lines. Cancer Research, 2009. 69(7): p. 2941-2949.
39. Kobunai, T., T. Watanabe, and T. Fukusato, REG4, NEIL2, and BIRC5 gene expression correlates with gamma-radiation
sensitivity in patients with rectal cancer receiving radiotherapy. Anticancer Res, 2011. 31(12): p. 4147-53.
40. Jayakumar, S., et al., Differential response of DU145 and PC3 prostate cancer cells to ionizing radiation: role of reactive
oxygen species, GSH and Nrf2 in radiosensitivity. Biochim Biophys Acta, 2014. 1840(1): p. 485-94.
41. Antonarakis, E.S., M.A. Carducci, and M.A. Eisenberger, Novel targeted therapeutics for metastatic castration-resistant
prostate cancer. Cancer Lett, 2010. 291(1): p. 1-13.
42. Glynne-Jones, R., S. Mawdsley, and M. Harrison, Cetuximab and chemoradiation for rectal cancer--is the water getting
muddy? Acta Oncol, 2010. 49(3): p. 278-86.
43. Li, Z., et al., Heterogeneity in primary colorectal cancer and its corresponding metastases: a potential reason of EGFR-
targeted therapy failure? Hepatogastroenterology, 2011. 58(106): p. 411-6.
44. Chou, T.C., Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res, 2010.
70(2): p. 440-6.
45. Chou, T.C. and P. Talalay, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme
inhibitors. Adv Enzyme Regul, 1984. 22: p. 27-55.
46. Duffy, C., K. Perez, and A. Partridge, Implications of phytoestrogen intake for breast cancer. CA Cancer J Clin, 2007. 57(5):
p. 260-77.
47. Gruca, A., Zmiana poziomu fosforylacji kinazy tyrozynowej EGFR w komórkach nowotworowych poddanych działaniu
pochodnych genisteiny i promieniowania jonizującego. Uniwersytet Śląski. Wydział Biologii i Ochrony Środowiska. Praca
magisterska, 2009.
48. Kalman, B., et al., Epidermal growth factor receptor as a therapeutic target in glioblastoma. Neuromolecular Med, 2013.
15(2): p. 420-34.
49. Okamoto, I., Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR-targeted anticancer therapy. Febs j,
2010. 277(2): p. 309-15.
50. Sartore-Bianchi, A., et al., Frattini M, Siena S, Bardelli A. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical
resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res, 2009. 69(5): p. 1851-1857.
51. Berg, M. and K. Soreide, EGFR and downstream genetic alterations in KRAS/BRAF and PI3K/AKT pathways in colorectal
cancer: implications for targeted therapy. Discov Med, 2012. 14(76): p. 207-214.
52. Pommier, Y., et al., DNA Topoisomerases and Their Poisoning by Anticancer and Antibacterial Drugs. Chemistry & Biology.
17(5): p. 421-433.
53. Ketron, A. and N. Osheroff, Phytochemicals as anticancer and chemopreventive topoisomerase II poisons. Phytochemistry
Reviews, 2014. 13(1): p. 19-35.
54. Brassesco, M.S., et al., Activator Protein-1 Inhibition by 3-[(Dodecylthiocarbonyl)Methyl]-Glutamaride Impairs Invasion and
Radiosensitizes Osteosarcoma Cells In Vitro. Cancer Biother Radiopharm, 2013.
55. Bridges, K.A., et al., Niraparib (MK-4827), a novel poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitor, radiosensitizes human lung and
breast cancer cells. Oncotarget, 2014. 5(13): p. 5076-86.
56. Merle, P., et al., Telomere targeting with a new G4 ligand enhances radiation-induced killing of human glioblastoma cells.
Mol Cancer Ther, 2011. 10(10): p. 1784-95.
57. Song, C.W., et al., Metformin kills and radiosensitizes cancer cells and preferentially kills cancer stem cells. Sci Rep, 2012.
2: p. 362.
58. Zaidi, S., et al., The HSP90 inhibitor NVP-AUY922 radiosensitizes by abrogation of homologous recombination resulting in
mitotic entry with unresolved DNA damage. PLoS One, 2012. 7(4): p. e35436.
59. Zhou, Y., et al., Histone deacetylase inhibitor, valproic acid, radiosensitizes the C6 glioma cell line. Oncol Lett, 2014. 7(1):
p. 203-208.
60. Soobrattee, M.A., et al., Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions. Mutat Res, 2005.
579(1-2): p. 200-13.
61. Romier, B., et al., Modulation of signalling nuclear factor-kappaB activation pathway by polyphenols in human intestinal
Caco-2 cells. Br J Nutr, 2008. 100(3): p. 542-51.
30
VI. DOROBEK NAUKOWY
Publikacje
1. Gruca A, Krawczyk Z, Szeja, W, Grynkiewicz G, Rusin A. 2014. Synthetic genistein glycosides inhibiting EGFR
phosphorylation enhance the effect of radiation in HCT 116 colon cancer cells. Molecules, 19(11):18558-73.
2. Byczek A, Zawisza-Puchalka J, Gruca A, Papaj K, Grynkiewicz G, Rusin M, Szeja W, Rusin A. 2013. Genistein
derivatives regioisomerically substituted at 7-O- and 4-O- have different effect on the cell cycle. Journal of Chemistry,
2013, ID 191563.
3. Rusin A, Zawisza-Puchałka J, Kujawa K, Gogler-Pigłowska A, Wietrzyk J, Switalska M, Głowala-Kosińska M,
Gruca A, Szeja W, Krawczyk Z, Grynkiewicz G. 2011. Synthetic conjugates of genistein affecting proliferation and
mitosis
of cancer cells. Bioorg Med Chem 19: 295-305.
4. Rusin A, Gogler A, Głowala-Kosińska M, Bochenek D, Gruca A, Grynkiewicz G, Zawisza J, Szeja W, Krawczyk Z.
2009. Unsaturated genistein disaccharide glycoside as a novel agent affecting microtubules. Bioorg Med Chem Lett
19: 4939-43.
Doniesienia konferencyjne
1. Gruca A. Genistein derivatives as radiosensitizers of tumor cells. Projekt „Śląska BIO-FARMA. Centrum
Biotechnologii, Bioinżynierii i Bioinformatyki”. Szczyrk, Poland, March, October 17-19, 2014.
2. Gruca A, Mucha A, Miczka A, Szeja W, Krawczyk Z, Aleksandra Rusin. Genistein derivative RAM-5 acts
as radiosensitizer in cancer cel lines through EGFR and topoisomerase II activation inhibition. 16th Gliwice Scientific
Meetings, Gliwice, Poland, November 15-17, 2013.
3. Mucha A, Gruca A, Szeja W, Krawczyk Z, Rusin A. The influence of genistein glycoconjugates
on signalling pathawys dependent on EGFR. 17th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice, Poland, November 15-16,
2013
4. Gruca A. Analysis of the modulation of intracellular pathways by genistein and its derivatives. Projekt „Śląska
BIO-FARMA. Centrum Biotechnologii, Bioinżynierii i Bioinformatyki” Bochnia, Poland, March, 8-10, 2013.
5. Gruca A, Zawisza-Puchalka J, Szeja W, Krawczyk Z, Rusin A. Genistein derivatives decrease EGFR
autophosphorylation elicited by ionizing irradiation. 15th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice, Poland, November
18-19, 2011.
6. Byczek A, Zawisza-Puchalka J, Gruca A, Siepetowska K, Ludwik K, Szeja W, Krawczyk Z, Rusin A. Substitution
of genistein at C4’ vs. C7 position renders different effect on cell cycle. 15th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice,
Poland, November 18-19, 2011.
7. Gruca A, Rusin A, Gogler-Pigłowska A, Zawisza-Puchałka J, Szeja W, Krawczyk Z. Prevention
of EGFR autophosphorylation by new genistein derivatives in HCT 116 and DU 145 cells treated with ionizing
radiation. 14th International Congress of Radiation Research, Warsaw, Poland, August-September 28-1, 2011.
8. Gogler A, Rusin A, , Głowala-Kosińska M, Kędzior K., Gruca A, Zawisza J, Szeja W, Grynkiewicz G, Krawczyk Z.
In vitro antiproliferative activity of a series of novel genistein glycoconjugates against humar cancer cell lines. 34th
FEBS Congress, Prague, Czech Republic July 4-9, 2009.
9. Rusin A, Gogler A, Gruca A, Bochenek D, Zawisza J, Szeja W, Grynkiewicz G, Krawczyk Z. Genistein derivatives
potentiate inhibition of cancer cells growth by irradiation. 34th FEBS Congress Prague, Czech Republic, July 4-9,
2009.
10. Rusin A, Gogler A, Głowala-Kosińska M, Kędzior K, Gruca A, Grynkiewicz G, Zawisza J, Szeja W, Krawczyk Z.
Synthesis and antitumor potential of glycoconiugates. XLIV Annual Meeting of the Polish Biochemical Society, Lodz,
Poland, September 16-19, 2009.
Udział w grantach
1. Wykonawca w grancie PBZ MNiL-/1/2005.
Nagrody i wyróżnienia
1. Stypendium finansowane z funduszy European Union under European Social Fund - "DoktoRIS – Program
stypendialny na rzecz innowacyjnego Śląska".
2. Stypendium kofinansowane z European Union under European Social Fund - UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01.