Podwyższona aktywność peroksydazy glutationowej u dzieci z astmą

Increased activity of glutathione peroxidase in children with asthma

Agnieszka Szlagatys-Sidorkiewicz1, Teresa Małaczyńska2, Joanna Renke1, Stefan Popadiuk1, Maria Korzon1

1Klinika Pediatrii, Gastroenterologii i Onkologii Dziecięcej Akademii Medycznej w GdańskuKierownik: prof. dr hab. med. Maria Korzon2Oddział Chorób Przewlekłych Płuc i Astmy, Szpitala Dziecięcego w Gdańsku Ordynator: dr med. Teresa Małaczyńska

Wstęp. W przebiegu astmy dochodzi do nasilenia stresu oksydacyjnego, który wynika ze wzrostu wytwarzania reaktywnych form tlenu (RFT). Fizjologiczną rolą peroksydazy glutationowej, kluczowego enzymu antyoksydacyjnego, jest dezaktywa-cja RFT. Celem pracy była ocena aktywności peroksydazy glutationowej (GPx) u dzieci chorujących na astmę. Materiał i metody. Badaniami objęto 91 dzieci (36 dziewcząt, 55 chłopców) (średnia wieku 9,41 lat; SD = 3,12) z astmą oskrzelową. Rozpoznanie astmy zostało postawione zgodnie z kryteriami NHLBI/WHO (2002). Badania objęły dzieci z astmą przewlekłą łagodną (n = 56) i umiarkowaną (n = 35). Kryteria rozpoznania astmy przewlekłej umiarkowanej i łagodnej wg cytowa-nego raportu. Grupę kontrolną stanowiło 30 dzieci zdrowych. Aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) określono za pomocą metody Paglia i Valentine. Wyniki. Aktywność GPx w erytrocytach u dzieci z astmą wyniosła średnio 34,92 U/g Hb (SD = 16,84) i była wyższa niż u dzieci zdrowych (26,58 U/g Hb; SD = 14,88) (test U, p < 0,002). Aktywność GPx erytrocytów u dzieci z astmą łagodną (34,360 U/g Hb) i umiarkowaną (35,867 U/g Hb) była znamiennie wyższa niż w grupie kontrolnej. Aktywność GPx u dzieci z astmą umiarkowaną była wyższa niż u dzieci z astmą łagodną, różnica nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej. Aktywność GPx erytrocytów była wyższa u 69 dzieci otrzymujących leczenie (35,81 U/g Hb; SD = 16,80), niż u 22 dzieci, u których terapia nie została jeszcze rozpoczęta (32,4 U/g Hb, SD = 17,05). Różnica nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej. Wnioski. Aktywność peroksydazy glutationowej u dzieci z astmą jest podwyższona, co wydaje się być efektem reakcji organizmu na nasilenie stresu oksydacyjnego w przebiegu procesu zapalnego.

Słowa kluczowe: stres oksydacyjny, reaktywne formy tlenu, bariera antyoksydacyjna

Introduction. Oxidative stress, as a result of increased reactive oxygen species (ROS) production, is present in asthma. Glutathione peroxidase (GPx), a key antioxidative enzyme, inactivates ROS. The aim of the study was to assess the activity of erythrocytes` GPx in children with asthma. Material and methods. 91 children were included in the study (36 female, 55 male) (mean age 9,41 yrs; SD = 3,12) with asthma diagnosed according to NHLBI/WHO (2002), 56 with mild asthma, 35 with moderate. Control group consisted of 30 healthy children. GPx activity was assessed according to Paglia and Valen-tine method. Results. GPx activity in children with asthma (34,92 U/g Hb; SD = 16,84) was higher as compared to healthy controls (26,58 U/g Hb; SD = 14,88) (p < 0.002). GPx activity in children with mild (34,360 U/g Hb) and moderate asthma (35,867 U/g Hb) was significantly higher as compared to controls. GPx activity in 69 children who were treated (35,81 U/g Hb; SD = 16,80) was higher than in newly diagnosed children (32,4 U/g Hb, SD = 17,05). However the difference was not significant. Conclusion. Increased activity of glutathione peroxidase in children with asthma seems to be a respond to increased oxidative stress in course of inflammation.

Key words: oxidative stress, reactive oxygen species, antioxidative barrier

Pediatr Pol 2007; 82 (5–6): 441–445© 2007 by Polskie Towarzystwo Pediatryczne

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów

441

P R A C A O R Y G I N A L N A

Coraz więcej doniesień potwierdza udział reaktyw-nych form tlenu (RFT) w patogenezie astmy. Reaktyw-ne formy tlenu, odpowiedzialne za reakcje oksydacji, wytwarzane są przez liczne komórki biorące udział w procesie zapalnym, takie jak mastocyty, eozynofi-le, neutrofile, makrofagi i monocyty [1]. Do nasilenia wytwarzania RFT dochodzi pod wpływem leukotrienu B4 i D4, interleukin [1, 4–6], GM-CSF, INFg, PAF i TNFa [1]. Potwierdzony jest udział RFT w procesach charakterystycznych dla astmy, takich jak skurcz mię-śni gładkich oskrzeli, nadreaktywność oskrzeli, dys-funkcja receptorów b-adrenergicznych, hipersekrecja śluzu, uruchomienie kaskady kwasu arachidonowego,

zwiększona przepuszczalność naczyń oraz uszkodze-nie nabłonka dróg oddechowych [1, 2].

Bariera antyoksydacyjna, w której skład wcho-dzą enzymy oraz elementy nieenzymatyczne, stanowi ochronę organizmu przed niekorzystnym działaniem RFT. Dzięki sprawnej barierze antyoksydacyjnej w warunkach fizjologicznych utrzymywana jest równo-waga antyoksydacyjno-prooksydacyjna. Zaburzenie równowagi, w wyniku nasilenia wytwarzania RFT z jednej strony, bądź też osłabienie wydolności bariery antyoksydacyjnej prowadzi do powstania stresu oksy-dacyjnego. Liczne doniesienia potwierdzają obecność stresu oksydacyjnego w astmie [3–5]. Wydolność ba-

P E D I AT R I A P O L S K Atom 82, nr 5–6, maj–czerwiec 2007

442

riery antyoksydacyjnej oraz wpływ jej sprawności na przebieg procesów zapalnych jest przedmiotem in-tensywnych badań. W warunkach ekspozycji na RFT dochodzi do zwiększenia aktywności enzymów anty-oksydacyjnych [6, 7]. Z drugiej zaś strony, RFT mogą unieczynniać enzymy antyoksydacyjne [8, 9]. Dlatego też w niniejszej pracy podjęliśmy próbę odpowiedzi na pytanie, jaki jest wpływ nasilenia stresu oksyda-cyjnego w przebiegu astmy na aktywność jednego z głównych enzymów antyoksydacyjnych, peroksydazy glutationowej [E.C.1.11.1.9-GPx] w erytrocytach. Pe-roksydaza glutationowa katalizuje reakcje unieczyn-niania RFT, przez co zabezpiecza m.in. lipidy błon komórkowych przed utlenianiem.

Celem pracy była ocena aktywności peroksydazy glutationowej w erytrocytach u dzieci chorujących na astmę.

Materiał i metodyBadaniami objęto 91 dzieci w wieku od 4 do 17 lat z rozpoznaną astmą oskrzelową, hospitalizowanych na Oddziale Chorób Przewlekłych Płuc i Astmy Zespo-łu Opieki nad Matką i Dzieckiem w Gdańsku oraz w Klinice Pediatrii, Gastroenterologii i Onkologii Dzie-cięcej Akademii Medycznej w Gdańsku. Rozpoznanie astmy zostało postawione zgodnie z kryteriami ustalo-nymi w 1998 r. przez NHLBI/WHO i opublikowanymi w raporcie pt. „Światowa inicjatywa dla astmy” [10]. Badania objęły dzieci z astmą przewlekłą łagodną (n = 56) i umiarkowaną (n = 35). Kryteria rozpoznania astmy przewlekłej umiarkowanej i łagodnej wg cyto-wanego raportu. U żadnego pacjenta nie stwierdzano objawów zaostrzenia choroby ani cech infekcji dróg oddechowych w ciągu 4 tygodni poprzedzających włą-czenie do badania. U dzieci badanych nie stwierdzo-no żadnych innych chorób przewlekłych o podłożu zapalnym i nowotworowym. 69 dzieci spośród grupy badanej było leczone wziewnymi kortykosteroidami i

długo działającymi b2-mimetykami. U 22 pacjentów, u których dopiero rozpoznano astmę, badanie wykona-no przed włączeniem leczenia. Grupę kontrolną sta-nowiło 30 zdrowych dzieci.

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Bio-etyczną. U wszystkich pacjentów uzyskano zgodę ro-dziców bądź opiekunów prawnych oraz zgodę dziecka (powyżej 14 r.ż.) na udział w badaniu.

Aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) określana była za pomocą metody typu PAGLIA i VA-LENTINE [11]. GPx katalizuje oksydację glutationu przez wodorotlenek kumenu. W obecności reduktazy glutationu i NADPH oksydowany glutation jest na-tychmiast przekształcany w formę zredukowaną z na-stępowym utlenieniem NADPH do NADP+. Spadek absorbancji mierzono na fali 340 nm. W tej metodzie używano próbek krwi heparynizowanej. Jako rozcień-czalnik używany był odczynnik Drabkina, dezaktywu-jący inne peroksydazy. Aktywność enzymów wyrażo-no w U/g Hb.

Krew do badania pobierana była jednocześnie, przy okazji wykonywania innych badań laboratoryj-nych. Oznaczenia rozpoczynano nie później niż w 2 godziny po pobraniu. Warunki techniczne pobierania krwi i wykonywania kolejnych oznaczeń były jedna-kowe.

WynikiLiczebność grup, wiek i płeć badanych przedstawiono w tab. 1.

Aktywność GPx w erytrocytach u dzieci z astmą (łagodną i umiarkowaną) wyniosła średnio 34,92 U/g Hb (SD = 16,84) i była wyższa niż u dzieci zdrowych (26,58 U/g Hb; SD = 14,88) (p < 0,002). Aktywność GPx erytrocytów u dzieci z astmą łagodną (34,360 U/g Hb) i umiarkowaną (35,867 U/g Hb) była zna-miennie wyższa niż u zdrowych (26,58 U/g Hb; SD = 14,88). Aktywność GPx u dzieci z astmą umiarkowa-

Tabela 1. Analiza badanych grupTable 1. Analysis of studied groups

Dzieci z astmą łagodną Children with mild asthma

Dzieci z astmą umiarkowaną Children with moderate asthma

Ogółem dzieci z astmą Children with asthma in total

Dzieci zdrowe Healthy controls

Liczebność Count

56 35 96 30

Średni wiek Mean age

9,27 (SD=3,06)

9,66 (SD=4,1)

9,41 (SD=3,12)

10,2 (SD=4,5)

Płeć Sex

Żeńska Female

29 7 36 16

Męska Male

27 28 55 14

ną była wyższa niż u dzieci z astmą łagodną, różnica nie osiągnęła jednak poziomu istotności statystycznej (tab. 2).

Aktywność GPx erytrocytów była wyższa u 69 dzieci otrzymujących leczenie (35,81 U/g Hb; SD = 16,80), niż u 22 dzieci, u których terapia nie została jeszcze rozpoczęta (32,4 U/g Hb, SD = 17,05). Różni-ca nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej.

DyskusjaW warunkach nasilonego stresu oksydacyjnego, nie-zależnie od przyczyny jego powstania, dochodzi do wzrostu aktywności enzymów antyoksydacyjnych [6]. Aktywność GPx w komórkach wzrasta po ekspozycji na RFT w warunkach laboratoryjnych [7, 11]. W wy-niku stresu oksydacyjnego dochodzi w komórce do aktywowania czynników transkrypcyjnych (NF-kB, AP-1), które z kolei aktywować mogą geny odpowie-dzi antyoksydacyjnej [12]. Potwierdzeniem istnienia mechanizmów regulacji ekspresji genów antyoksyda-cyjnych poprzez reaktywne formy tlenu są badania przeprowadzone przez COMHAIR i wsp. Stwierdzili oni podwyższenie stężenia mRNA zewnątrzkomórkowej peroksydazy glutationowej (eGPx) w komórkach na-błonka pochodzącego z dróg oddechowych w odpo-wiedzi na zwiększoną obecność reaktywnych form tlenu w ich otoczeniu [13].

Stwierdzone w niniejszych badaniach podwyż-szenie aktywności peroksydazy glutationowej erytro-cytów u dzieci chorujących na astmę, znajdują po-twierdzenie w doniesieniach innych autorów [15–17]. Wzrost aktywności GPx w odpowiedzi na nasilony stres oksydacyjny nie jest jednak zjawiskiem charak-terystycznym tylko dla astmy, ponieważ podobne za-leżności obserwuje się w innych przewlekłych choro-bach zapalnych, np. kości i stawów [18].

Dostępne są jednak publikacje, w których nie stwierdzano różnic w aktywności GPx u chorych na astmę w stosunku do aktywności oznaczanej u zdro-wych [19–21], a nawet zmniejszenie aktywności en-zymu u chorych na astmę [22–24]. Wyniki badań są

443

P R A C A O R Y G I N A L N AAgnieszka Szlagatys-Sidorkiewicz i inni Podwyższona aktywność peroksydazy glutationowej u dzieci z astmą

jednak trudne do porównania, ponieważ dotyczyły różnych populacji pod względem wieku, diety, prze-biegu choroby oraz sposobu leczenia.

Analiza aktywności peroksydazy glutationowej często poszerzana jest o ocenę stężenia selenu (Se), który jest kofaktorem tego enzymu. Badania FLATT i wsp. przeprowadzone zostały w Nowej Zelandii. Kraj ten charakteryzuje się wysoką zapadalnością na ast-mę, a dieta jego mieszkańców jest wyjątkowo uboga w selen. Stwierdzono związek pomiędzy obniżonym stężeniem selenu we krwi i zmniejszoną aktywnością peroksydazy glutationowej a wysoką zapadalnością na astmę oskrzelową [25]. Wyższe stężenia selenu w surowicy krwi wiążą się z niższą częstością wystę-powania astmy [26]. Inni autorzy również zauważali związek pomiędzy niskim stężeniem selenu we krwi a obniżoną aktywnością peroksydzy glutationowej u chorych na astmę [22, 23]. Nie potwierdzają jednak tego zjawiska badania WOOD i wsp. Obniżeniu stęże-nia selenu we krwi pacjentów z astmą towarzyszyła bowiem prawidłowa aktywność peroksydazy gluta-tionowej. Dodatkowo zaobserwowano, że im niższe były stężenia selenu, tym więcej produktów peroksy-dacji lipidów znajdowano we krwi [21]. Sugerować to może inne niż związane z peroksydazą glutationową antyoksydacyjne właściwości selenu, gdyż tylko 10% selenu zawartego w erytrocytach związanych jest z peroksydazą glutationową, reszta natomiast z inny-mi selenoproteinami, z których większość wykazuje działanie antyoksydacyjne [21]. Jeszcze inne światło na to zagadnienie rzucają badania FENECH i wsp., do-tyczące mieszkańców Malty, gdzie stężenie selenu w glebie jest wysokie. Nie stwierdzono w tych badaniach różnic w stężeniu selenu i peroksydazy glutationowej we krwi pomiędzy grupą pacjentów chorujących na astmę a ludźmi zdrowymi [27]. Wydaje się więc, że zaburzenia gospodarki selenem w przebiegu astmy dotyczą organizmów o niskim wyjściowym stężeniu tego pierwiastka we krwi.

Interesującym zatem uzupełnieniem niniejszych badań byłoby poszerzenie przeprowadzanych ozna-

Tabela 2. Aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) w erytrocytach u dzieci z astmą i u zdrowychTabela 2. Activity of erythrocytes` glutathione peroxidase in children with asthma and healthy controls

Dzieci z astmą łagodną (n=56) Children with mild asthma (n=56)

Dzieci z astmą umiarkowaną (n=35) Children with moderate asthma (n=35)

Dzieci zdrowe (n=35) Healthy controls (n=30)

(1) (2) (3)

Aktywność GPx (U/g Hb) Activity of GPx (U/g Hb)

34,36 (SD=15,64)

35,86 (SD=18,92)

26,58 (SD=14,88)

(1) vs (3) p<0,04; (2) vs (3) p<0,05; (1) vs (2) różnica nieznamienna statystycznie

czeń o ocenę stężenia selenu we krwi dzieci chorują-cych na astmę.

Reasumując, wzrost aktywności peroksydazy glu-tationowej u dzieci chorych na astmę należałoby inter-pretować jako mechanizm obronny organizmu, który w ten sposób broni się przed konsekwencjami nadpro-dukcji reaktywnych form tlenu powstałych w wyniku toczącego się przewlekłego procesu zapalnego. Erytro-cyty, bogato wyposażone w enzymy antyoksydacyjne, odgrywają prawdopodobnie istotną rolę w ochronie układu oddechowego przed niekorzystnym działaniem reaktywnych form tlenu, dostarczając do mikrokrąże-nia płucnego znaczne ilości antyoksydantów. Zwięk-szają w ten sposób wydolność bariery antyoksydacyj-nej w obszarze nasilonej produkcji reaktywnych form tlenu [28].

Mechanizmy regulujące syntezę enzymów antyok-sydacyjnych są niezwykle skomplikowane i niewiele jeszcze wiadomo na ten temat. Wyniki obecnej pracy potwierdzają jednak zwiększone wytwarzanie enzy-mów antyoksydacyjnych w odpowiedzi na stres oksy-dacyjny organizmu.

WniosekAktywność peroksydazy glutationowej u dzieci z ast-mą jest podwyższona, co wydaje się być efektem re-akcji organizmu na nasilenie stresu oksydacyjnego w przebiegu procesu zapalnego.

P I Ś M I E N N I C T W O

1. Rahman I, Biswas SK, Kode A. Oxidant and antioxidant balan-

ce in the airways and airway diseases. Eur J Pharmacol 2006;

533: 222–239.

2. Barnes PJ. Reactive oxygen species and airway inflammation.

Free Rad Biol Med 1990; 9: 235–243.

3. Dworski R. Oxidant stress in asthma. Thorax 2000; 55(Suppl

2): S51–S53.

4. Nadeem A, Chhabra SK, Masood A, Raj HG. Increased oxidati-

ve stress and altered levels of antioxidants in asthma. J Allergy

Clin Immunol 2003; 111: 72–78.

5. Szlagatys-Sidorkiewicz A, Korzon M, Małaczyńska T, Renke

J, Popadiuk S, Woźniak M. Równowaga antyoksydacyjno-pro-

oksydacyjna u dzieci leczonych kortykosteroidami wziewnymi

i długo działającymi beta-mimetykami. Pneumonol Alergol Pol

2005; 73: 178–181.

6. Ikediobi CO, Badisa VL, Ayuk-Takem LT, Latinwo LM, West

J. Response of antioxidant enzymes and redox metabolites to

cadmium-induced oxidative stress in CRL-1439 normal rat liver

cells. Int J Mol Med 2004; 14: 87–92.

7. Otto-Knapp R, Jurgovsky K, Schierhorn K, Kunkel G. Antioxi-

dative enzymes in human nasal mucosa after exposure to ozo-

ne. Possible role of GSTM1 deficiency. Inflamm Res 2003; 52:

51–55.

8. DeRaeve HR, Thunnissen FB, Kaneko FT, Guo FH, Lewis M,

Kavuru MS, i wsp. Decreased Cu,Zn-SOD activity in asthmatic

airway epithelium correction by inhaled corticosteroid in vivo.

Am J Physiol 1997; 272(1 Pt 1): L148–154.

9. Smith LJ, Shamsuddin M, Sporn PHS, Denenberg M, Anderson

J. Reduced superoxide dismutase in lung cells of patients with

asthma. Free Rad Biol Med 1997; 22: 1301–1307.

10. National Heart, Lung, Blood Institute, National Institute of He-

alth: Global Strategy for Asthma Management and Prevention

2002: 02-3659.

11. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitive and guali-

tative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase.

J Lab Clin Med 1967; 70: 158–169.

12. Morcillo EJ, Estrela J, Cortijo J. Oxidative stress and pulmonary

inflammation: pharmacological intervention with antioxidants.

Pharmacol Res 1999; 40: 393–404.

13. Comhair SA, Bhathena PR, Farver C, Thunnissen FBJM, Erzu-

rum SC. Extracellular glutathione peroxides induction in asth-

matic lungs: evidence for redox regulation of expression in hu-

man airway epithelial cells. FASEB J 2001; 15: 70–78.

14. Wijeratne SS, Cuppett SL, Schlegel V. Hydrogen peroxide in-

duced oxidative stress damage and antioxidant enzyme respon-

se in Caco-2 human colon cells. J Agric Food Chem 2005; 53:

8768–8774.

15. Hassan AM. Glutathione peroxidase activity in blood cells from

aspirin-induced asthma patients. Ann Clin Biochem 2003; 40(Pt

4): 369–373.

16. Tho LL, Candlish JK. Superoxide dismutase and glutathione pe-

roxidase acitivities in erythrocytes as indicies of oxygen loading

in disease: a survey of one hundred cases. Biochem Med Metab

Biol 1987; 38: 74–80.

17. Ward KP, Arthur JR, Russell G, Aggett PJ. Blood selenium con-

tent and glutathione peroxidase activity in children with cystic

fibrosis, coeliac disease, asthma and epilepsy. Eur J Pediatr

1984; 142: 21–24.

18. Surapaneni KM, Venkataramana G. Status of lipid peroxidation,

glutathione, ascorbic acid, vitamin E and antioxidant enzymes in

patients with osteoarthritis. Indian J Med Sci 2007; 61: 9–14.

19. Postępski J. Ocena wybranych parametrów równowagi oksyda-

cyjno-antyoksydacyjnej w zaostrzeniach astmy oskrzelowej u

dzieci. Pol Merkuriusz Lek 2001; 11: 385–388.

20. Tekin D, Sin BA, Mungan D, Misirligil Z, Yavuzer S. The antio-

xidant defense in asthma. J Asthma 2000; 37: 59–63.

21. Wood LG, Fitzgerald DA, Gibson PG, Cooper DM, Garg ML.

Lipid peroxidation as determined by plasma isoprostanes is re-

lated to disease severity in mild asthma. Lipids 2000; 35: 967-

–974.

22. Kadrabova J, Madaric A, Kovacikova Z, Podivinsky F, Ginter E,

Gazdik F. Selenium status is decreased in patients with intrinsic

asthma. Biol Trace Elem Res 1996; 52: 241–248.

23. Malvy DJ-M, Lebranchu Y, Richard M-J, Arnaud J, Favier A.

P E D I AT R I A P O L S K Atom 82, nr 5–6, maj–czerwiec 2007

444

Oxidative metabolism and severe asthma in children. Clin Chim

Acta 1993; 218: 117–120.

24. Shanmugasundaram KR, Kumar SS, Rajajee S. Excessive free

radical generation in the blood of children suffering from asth-

ma. Clin Chim Acta 2001; 305: 107–114.

25. Flatt A, Pearce N, Thomson CD, Sears MR, Robinson MF, Be-

asley R. Reduced selenium in asthmatic subjects in New Ze-

aland. Thorax 1990; 45: 95–99.

26. Rubin RN, Navon L, Cassano PA. Relationship of serum antioxi-

dants to asthma prevalence in youth. Am J Respir Crit Care Med

2004; 169: 393–398.

27. Fenech AG, Ellul-Micallef R. Selenium, glutathione peroxidase

and superoxide dismutase in Maltese asthmatic patients: effect

of glucocorticoid administration. Pulm Pharmacol Ther 1998;

11: 301–308.

28. Heffner JE, Repine JE. Pulmonary strategies of antioxidant de-

fense. Am Rev Respir Dis 1989; 140: 531–554.

Adres do korespondencji :

dr med. Agnieszka Szlagatys-SidorkiewiczKlinika Pediatrii, Gastroenterologii i Onkologii DziecięcejAkademia Medyczna w Gdańskuul. Nowe Ogrody 1-680-803 Gdańske-mail: aga1amg@gda.plPracę nadesłano: 19.03.2007 r.

445

P R A C A O R Y G I N A L N AAgnieszka Szlagatys-Sidorkiewicz i inni Podwyższona aktywność peroksydazy glutationowej u dzieci z astmą