1

PODŁOśA MIKROBIOLOGICZNE

podstawowe cechy podłoŜy:

• źródło pierwiastków biogennych• o odpowiednim pH, izotoniczne• klarowne• STERYLNE

poŜywka mikrobiologiczna moŜe być:

• uniwersalna• wybiórcza• róŜnicująca

• płynna• półpłynna (0.6% agar-agar)• stała (2% agar-agar)

Escherichia colii Micrococcus luteus

Wzrost mikroorganizmów na uniwersalnym podłoŜu stałym

MoŜemy odróŜnić te bakterie na uniwersalnym podłoŜu, gdyŜ jedna z nich,

Micrococcus luteus, wytwarza Ŝółty barwnik

PodłoŜa róŜnicujące – podłoŜe MacConkey’a

Escherichia colii Salmonella enteritidis

Na tym podłoŜu bakterie fermentujące laktozę (Escherichia

coli) produkuj ą kwasy organiczne, indykator pH zmienia kolor i

bakterie te rosną w postaci

czerwonychkolonii

Bakterie nie fermentujące laktozy(Salmonella enteritidis) rozkładają pepton obecny w podłoŜu bez zmiany pH i rosną w postaci

białychkolonii

hodowla bakterii

zbyt duŜobakterii dopoliczenia

liczba kolonii

9 ml bulionu

rozcieńczenie

1 ml próbki na płytki

Określanie ilości mikroorganizmów –posiew na podłoŜe stałe

Trzeba jednak pamiętać, Ŝe

• w skład mikroflory dorosłego człowieka

wchodzi ponad 400 gatunków mikroorganizmów,

z których 60% nie umiemy hodować w laboratorium

• w laboratorium umiemy hodować tylko około

5% mikroorganizmów obecnych w środowisku

Zalety bycia niewielkim

• szybsza wymiana substancji odŜywczych

i szkodliwych produktów metabolizmu• większe tempo wzrostu

• większe rozmiary populacji• większa zdolność akumulacji mutacji –

szybsza adaptacja do zmieniającego się środowiska

Istnieje jednak dolna granica wielkości komórki

około 0.2 µµµµm

2

UKŁADY KOMÓREKpseudogrzybnia substratowa

pseudogrzybniapowietrzna

przegrody ze sporami

spora

Przemiana pokoleń –Streptomyces coelicolor

Przemiana pokoleń –Myxobacteriae

myksospory

kiełkowanie

głodzenie

agregacja

tworzenie ciałaowocowego

Quorum sensing(wyczuwanie liczebności)

Przemiana pokoleń – Caulobacter sp.

komórka ruchliwa

komórka osiadła

Przemiana pokoleń –Bdelovibrio sp.

błona (CM)

przestrzeń peryplazmatyczna

CM

uwolnienie nowych komórek potomnych

CM

CM

Przemiana pokoleń–Anabena sp.

• komórki wegetatywnewiąŜą CO2dostarczają organiczne źródło węgla

• heterocystywiąŜą N2dostarczają NH3 jakoglutaminy

zróŜnicowanie komórekjak u organizmów wielokomórkowych

3

Budowa komórki prokariotycznej

błona cytoplazmatyczna

ściana komórkowa

nukleoid

cytoplazmai rybosomy

Lipidy błonowe u bakterii

• kwasy tłuszczowe nierozgałęzione,• rzadko wielonasycone• brak steroli, są hopanoidy

• brak kwasów tłuszczowych• są alkohole poliizoalkilowe,często rozgałęzione

• czasem obecne sterole

i archae

wiązanie estrowe

wiązanie ETEROWE

hopanoid

cholesterol

monowarstwa

Lipidy u archae

dwuwarstwadwuetery glicerolu

czteroetery diglicerolu

Peptydoglikan (mureina) u bakterii

N-acetylo-glukozamina

kw.N-acetylomuraminowy

L-alanina

kw. D-glutaminowy

kw. mezo-diaminopimelinowy

D-alanina

(ββββ1,4)

Archae:pseudomureina

• wiązanie (ββββ1,3)

• brak form D aa

Tworzy rodzaj siatkiwokół komórki

Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich

peptydoglikan

błona cytoplazmatyczna

błona cytoplazmatyczna

peptydoglikan

kwasylipotejchojowe

kwasy tejchojowebiałka związane ześcianą komórkową

Struktura i funkcje kwasów tejchojowych

• polisacharydy o negatywnym ładunku

• nadają komórce negatywny ładunek(ochrona przed toksycznymi związkami hydrofobowymi)

• wiąŜą dwuwartościowe jony(Ca2+ i Mg2+)

4

Ściana komórkowa bakterii gramujemnych

błona cytoplazmatyczna

peptydoglikanbłona zewnętrzna

błonawewnętrzna

błonazewnętrzna

LPS

poryna

lipoproteina

peptydoglikan

przestrzeńperyplazma-tyczna

Lipopolisacharyd (LPS)

lipid Ałańcuch O-specyficzny rdzeń

Błona zewnętrzna bakterii gramujemnych jest asymetryczna

• wewnętrzna warstwa składa się z fosfolipidow

• zewnętrzna warstwa zbudowana jest głównie

z lipopolisacharydu (LPS)

lipopolisacharyd

fosfolipidy

fosfolipidy

Escherichia coli (G-) i Staphylococcus aureus (G+)

zalewamy utrwalony preparat fioletemkrystalicznym na 1 minutę

dodajemy płynu Lugolana 1 minutę

odbarwiamyetanolem

dobarwiamy fuksynąprzez 30 sekund

Barwienie Grama

Zmiana kierunku ruchu – urz ęsienie peritrichalne

obrót rzęsek w leworuch komórki

obrót rzęsek w prawo„koziołkowanie”

obrót rzęsek w leworuch komórki

nowy kierunek ruchu jest przypadkowy

Chemotaksjakierunek ruchu losowy

ukierunkowany ruch• czas ruchu w kierunku atraktanta dłuŜszy• czas ruchu w kierunku przeciwnym do atraktanta krótszy

ATRAKTANT

5

Synteza rzęski bakteryjnej

flagelina

Typy urzęsienia

Gram + Gram - Powstawanie endospory

komórkawegetatywna

sporulująca komórka

dojrzała endospora

Replikacja DNA u Eukaryota- wielopunktowa

miejsca inicjacji replikacji

bąbelki replikacyjne

Replikacja DNA u Prokaryota–jednopunktowa (struktura theta)

Archae

• niektóre posiadają 2 aktywne

• miejsca inicjacji replikacji

widełkireplikacyjne

nowo syntezowany DNA

miejsceinicjacjireplikacji

6

Podział komórkibakteryjnej

• z jednej komórki powstają dwie identyczne

(jedno pokolenie)

• czas podziału róŜny -

minimum 20 minut dlaE. coli

przegroda

Fazy wzrostu populacji bakteryjnej

wzrost – zwiększenie liczby komórek w populacji

stacjonarnazamieranialag

wykładnicza

czas

gęsto ść optyczna

liczba Ŝywychkomórek

• faza lag– czas potrzebny komórkom na adaptację do nowych warunków środowiska; bardzo wolny wzrost populacji

• faza wykładnicza– większość komórek w populacji dzieli się

dając początek dwóm komórkom; faza najszybszego, równomiernego wzrostu

• faza stacjonarna– wzrost spowalnia się w miarę wyczerpania ilości składników odŜywczych i nagromadzenia toksycznych

produktów przemiany materii; niektóre komórki gin ą, więc ilośćkomórek w populacji jest stała

• faza zamierania– wzrost ustaje; coraz więcej komórek

w populacji obumiera

Hodowla okresowa – fazy wzrostuFaza stacjonarna

• najczęściej występuje w środowisku

• komórki znajduj ą się w odmiennym stanie fizjologicznym

podobnym do stanu komórek rosnących pod postacią BIOFILMU(wolne tempo wzrostu, duŜa odporność na niekorzystne warunki środowiska)

FtsZ – homolog tubuliny

• homologia 10-18% na poziomie sekwencji aminokwasów• podobieństwo struktury trzeciorzędowej• polimeryzacja zaleŜna od GTP• występuje:

• u większości bakterii i archae• u eukaryota w plastydach • w mitochondriach niektórych eukaryota

MreB, Mbl, ParM – homologi aktyny

• homologia ok.15% na poziomie sekwencji aminokwasów

• podobieństwo struktury trzeciorzędowej

• polimeryzacja zaleŜna od ATP

• rola:rozdział DNA plazmidowego i chromosomowegodeterminacja kształtu komórki

7

Wielkość genomu

Eukaryota• 3 000 kb (2000)mikrosporidia

• 12 000 (6000)Saccharomyces cerevisiae

• 3 000 000 kb (30-35 tys)człowiek

Prokaryota

• 600 kb(500)Mycoplasma sp.

• 4700 kb(4000)Escherichia coli

• 8000 kb(8000)Mezorhizobium loti

• maksymalnie 12 000 kb

ok. 40% OFR o funkcji nieznanejMycobacterium tuberculosis

zawartość GC26% 76%

Mycoplasma sp. Micrococcus sp.

Ilość róŜnych chromosomów w komórce•Vibrio sp. 2•Agrobacterium sp. 3

Borelia burgdorferii1 chromosom liniowy5 plazmidów• 3 liniowe (160-500 kb)• 2 koliste (270 i 300 kb)

Rhodobacter sphaeroideschromosom I (3 045 kb)chromosom II (914 kb)4 plazmidy po 100 kb1 plazmid 42 kb

Ilość kopii chromosomu w komórce•Escherichia coli maks. 4•Azotobacter vinelandii 4-40, maks. 80•Methanococcus sp. 3-15

Eukaryota1n, 2n do 500 w niektórych tkankach roślin

otwarte koło

superskręcone

białka

superskręconadomena

Chromosom bakteryjny –kolisty

liniowe:•Borelia sp.

•Streptomyces sp.

•Agrobacterium sp.

(1 liniowy i 1 kolisty)

Chromosom Eukaryota

u Archae

•homologi histonów H1, H3 i H4

• tetramery histonowe tworzą nukleosom

• brak „ogonków” histonowych

• występują warianty histonów

3 drogi wymiany informacji genetycznej u Prokaryota:

• transdukcja – bakteriofagi

• koniugacja – plazmidy koniugacyjne

• transformacja – bezpośrednio ze środowiska

3% genów wolno Ŝyjących bakterii pochodzi od Archae lub Eukaryota

nawet do 24% genów u bakterii hypertermofilnych pochodzi od hypertermofilnych Archae

Liczenie bakteriofagów

łysinki

wylewamy mieszankębakterii i bakteriofaga na plytk ęz poŜywką dla bakterii

na murawie rosnącychbakterii obserwujemy„łysinki”

inkubujemy w cieplarceprzez noc

8

Cykl lityczny – bakteriofag T4

cząstka transdukuj ąca

cząstka transdukuj ąca

homologiczna rekombinacja integracja DNA dogenomu biorcy

cząstka fagowa

do komórek biorcy przekazywany jest dowolny fragment genomu dawcy

transdukcja ogólna

Cykl lizogenny (infekcja) – bakteriofag λλλλ

cząstka fagowa

cykl lityczny cykl lizogennyy

integracja faga dogenomu biorcy

profag

podział komórki lizogennej

Cykl lizogenny (indukcja) –bakteriofag λλλλ

komórka lizogenna

INDUKCJA

często rzadko

• część DNA dawcy (czerwony)wydziela się wraz z DNA faga

• namnaŜanie cząsteczek transdukuj ących

• do następnych komórek przekazywane zawsze te samefragmenty DNA dawcy

transdukcja specyficzna

Koniugacja

• plazmid wbudowany w chromosom

tzw. szczepy Hfr

• przekazywany DNA chromosomu bakterii

• plazmid wolny w cytoplazmie

• przekazywany DNA plazmidu

Koniugacja

chromosom

DAWCA BIORCApilus

plazmid

• jedna nić DNA plazmidunacinana i przekazywanado biorcy

• komplementarna nić DNA dosyntezowywana zarównou biorcy jak i dawcy

• po transferze OBIE komórkizawierają cząsteczkę plazmidu

Gen C przekazywany pierwszy CW

Gen L przekazywany pierwszy CCW

Gen X przekazywany pierwszy CW

Gen C przekazywany pierwszy CCW

• plazmid wbudowanyw chromosom tzw. szczepy Hfr

• do dawcy przekazywane sągeny chromosomowe

• geny plazmidowe przechodząna końcu

9

Koniugacyjna mapa chromosomu E.coliTransformacja

• komórka dawcy DNA obumiera

• DNA uwalniany jest do środowiska

• komórka kompetentna pobiera DNAdo swego wnętrza

geny z jednej komórki są przekazywanedo drugiej bez kontaktu komórek

i bez pośrednictwa wirusów

• nie wszystkie gatunki bakterii mogą pobierać DNA ze środowiska

• stan kompetencji moŜna wywołać sztucznie w laboratorium

Transformacja - Bacillus subtilis

•kompetencja indukowanaprzez dwa feromony

9-10 aa oligopeptydpentapeptyd

•pobierana jedna nić DNA,druga degradowana

Quorum sensing – wykrywanie liczebności

peptydylaktony homoserynowe

produkcja autoinduktora

wykrywanie autoinduktora

indukcja transkrypcjiwydzielanie efektorów• enzymów, • antybiotyków, • sideroforów

Trends in Microb.(2002) 10: 365

• ruch i chemotaksja• wydzielanie enzymów degradacyjnych• wydzielanie antybiotyków• stan kompetencji, pobieranie DNA• sporulacja

Adaptacja komórek Bacillus sp.do zmiennych warunków środowiskaProkaryota Eukaryota

NIERESTRYKCYJNY RESTRYKCYJNY

stan aktywny

stan przygotowania

STANPODSTAWOWY

stan represowany

stan wyciszenia

Pro-• promotory silne• regulacja przez represję

Eu-• promotory słabe• regulacja przez aktywację(zmiana struktury chromatyny)

10

Naprawa DNA

przed rozpoczęciem replikacji DNA• naprawa bezpośrednia (np. fotoreaktywacja)• wycięcie nukleotydu• wycięcie odcinka DNA

po rozpoczęciu replikacji DNA• rekombinacja homologiczna• niehomologiczne łączenie końców• mismatch

uszkodzenia DNA często powodują zaburzenie struktury helisy

kompleks polimerazy nie jest w stanie ominąć takiego miejsca i oddysocjowuje od tak odkształconej matrycy

replikacja zostaje wznowiona kilkanascie nukleotydów dalej – w nowej nici powstają przerwy

Homologiczna rekombinacja a naprawa DNA

wymiana nici

pojedyncza nić łączy się z siostrzaną chromatydą

rozszerzanie się połączenia

Naprawa DNA na drodze homologicznej rekombinacji

• resekcja końców

• tworzenie nukleofilamentuprzez Rad51 (RecA)

• poszukiwanie homologii

• tworzenie pętli D

• synteza DNA

• rozdział produktów rekombinacji

Gen. Dev.(2004) 18: 602

PNAS(2001) 98: 8419

Rola mediatorów

usuwanie białek wiąŜącychjednoniciowy DNA

• Rhp52• Rhp55 i Rhp57

mediator

rekombinaza(Rhp51,RecA)

PNAS(2001) 98: 8411

PNAS(1999) 96: 10684

Naprawa DNA poprzez uszkodzenie - mutagenna

polVkompleks UmuD’2C

Regulon SOS

aktywny

represowany

LexA

RecA

• naprawa DNA

wycięcie nukleotydów, homologiczna - wiernapoprzez uszkodzenie – mutagenna

• zahamowanie podziałów komórkowych• apoptoza (kolicyny A, E1)

11

Antybiotyki – spektrum działania

tetracykliny

penicyliny

polimyksynyny

tobramycyna

sulfonamidycefalosporyny

streptomycyna

izonazid

prątki Gram - Gram + chlamydie riketsje

Antybiotyki – mechanizm działania

ściana komórkowabłona komórkowa

hamowanie syntezyściany komórkowejpenicylina, wankomycyna

zakłócenie funkcjibłony komórkowejpolimyksyny

hamowanie syntezy białkastreptomycyna,erytromycyna,tetracyklina, chloramfenikol

hamowanie syntezykwasów nukleinowychchinolowe (replikacja)

rifamycyna (transkrypcja)

antymetabolitysulfonamidy,trimetoprim

fermentacje

oddychanie

Degradacja polimerów -zewnątrzkomórkowa

proteazy – Bacillus, Clostridium, Proteus, Pseudomonas spp.

alkaliczne, neutralne, kwaśne

specyficzne (np. typu reniny) i niespecyficzne

nukleazy

deoksyrybonukleazy –Clostridium sp., Staphylococcus aureus,hemolityczne paciorkowce

rybonukleazy –Bacillus subtilis, Penicillium citrinum(RNazaP)

lipazy

enzymy degradującepolisacharydy

Rola:• patogenność• biotechnologia

enzymy lub produkty ich działania

Fosforylacja oksydacyjna – łańcuch oddechowy

• w wyniku transportu elektronow na łańcuchu oddechowymi wyrzucaniu H+ na zewnatrz komórki powstaje potencjał w poprzek błony

• zredukowany NADH zostaje zregenerowany do NAD+

• ATP powstaje pośrednio, w wyniku działania ATP-az błonowych, wnikanie H+ do wnętrza komórki dostarcza energii

Fosforylacja oksydacyjna –róŜnice w potencjale oksydoredukcyjnym

para red-ox

fumaran bursztynian

12

rozmieszczenie elementów łańcuchaw błonie cytoplazmatycznej

mitochondria E.coli Paracoccus Micrococcus denitryficans luteus

ODDYCHANIE AZOTANOWE(dysymilacyjna redukcja azotanów)

1. denitryfikacja - Bacillus, Pseudomonas spp., Paracoccus denitrificans

glu + 4.8 NO3- + 4.8 H+ → 6 CO2 + 2.4 N2 + 8.4 H2O

Go’ = -2669 kJ(-638 kcal)

dla porównania:

glu + 6O2 → 6 CO2 + 6H2O Go’ = -2870 kJ(-686 kcal)

2. Escherichia coli, Klebsiella sp., Staphylococcus sp.

glu + 12 NO3- → 6 CO2 + 12 NO2

- + 6 H2O

Go’ = -1766 kJ(-422 kcal)

u niektórych mikroorganizmów z tej grupy zachodzi proces:

glu + 3 NO3- + 3 H+ → 6 CO2 + 3 NH3 + 3 H2O

Go’ = -1796 kJ(-429 kcal)

Fosforylacja substratowa

• ATP powstaje bezpośrednio, sprzęŜone jest z utlenianiem substratu

• powstaje zredukowany NADH

część wykorzystywana do biosyntezy

część musi być zregenerowana by odnowić pulę NAD+ do utleniania następnych cząsteczek substratu

• brak energizacji błony komórkowej

HMP EMP ED

Rozkładglukozy do pirogronianu DEKARBOKSYLACJA PIROGRONIANU

1. Eukaryota, bakterie tlenowepirogronian + CoA + NAD+ →→→→ acetylo-CoA + NADH + H+ + CO2

(kompleks dehydrogenazy pirogronianu)

2. Archebakterie, bakterie beztlenowepirogronian + CoA + 2Fd →→→→ acetylo-CoA + 2FdH + CO2 (oksydoreduktaza

pirogronianu )

U Archaebacteriae zamiast ferredoksyny (Fd) występuje koenzym F420.

3. Fermentacja mieszana pałeczek jelitowychpirogronian + CoA →→→→ acetylo-CoA + mrówczan (liaza pirogronianowa)

4. Fermentacja alkoholowa droŜdŜy i Zygomonas sp.pirogronian →→→→ acetaldehyd + CO2 (dekarboksylaza pirogronianu)

5. Bacillus sp., Enterobacteriaceae

2 cz. pirogronianu →→→→ acetomleczam + CO2 (syntaza acetomleczanu)

13

Znaczenia słowa FERMENTACJA

1. KaŜdy proces, tlenowy lub beztlenowy, w którym na duŜą skalę wykorzystuje się hodowlę mikroorganizmów.

2. KaŜdy proces biologiczny zachodzący pod nieobecność tlenu.

3. Psucie się poŜywienia.

4. Produkcja napojów alkoholowych.

5. UŜywanie organicznego substratu jako dawcy i akceptora elektronów.

6. UŜywanie organicznego substratu jako czynnika redukującego i tego samego, częściowo rozłoŜonego organicznego substratu jako czynnika utleniającego (akceptora elektronów).

7. Wzrost zaleŜny od fosforylacji na poziomie substratu.

Homofermentacja mlekowa

FERMENTACJA MLEKOWA

homofermentacja

glukoza →→→→ 2 cz. mleczanu

(Lactobacillus lactis, L.delbrueckii, L. bulgaricus, L.casei,Streptococcus faecalis, S.cremoris, S.lactis, Pediococcus damnosus)

heterofermentacja

glukoza →→→→ mleczan + etanol + CO2

(Lactobacillus brevis, L.fermentum, Leuconostoc mesenteroides,

L.dextranicum)

szlak bifidum

2 glukoza →→→→ 3 cz. octanu + 2 cz. mleczanu

(Bifidobacterium bifidum)

Udział mikroorganizmów w przetwarzaniu mleka

kefir Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Saccharomyces spp.

jogurt Streptococcus thermophilus, L.bulgaricus

masło Lactococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris

sery

Roquefort L.lactis, L.cremoris, Penicillium roqueforti

Camembert L.lactis, L.cremoris, Penicillium camamberti,

Brevibacterium linens

Gouda L.lactis, L.diacetylactis, L.cremoris

Ementaler S. thermophilus, L.lactis, Propionibacterium shermani

L.helveticus, P.freudenreichii

Fermentacja alkoholowa

dekarboksylaza pirogronian/aldehyd octowyrzadka u bakterii

ENTEROBACTERIACEAE

Escherichia coli komensal przewodu pokarmowego ssaków Salmonella sp.Shigella sp. patogeny człowieka

Enterobacter sp. występują w glebie i wodzieSerratia sp.Proteus sp.Erwinia sp. patogeny roślin

Yersinia sp. patogeny człowieka

Vibrio sp. występują w wodzie, niektóre patogenneAeromonas sp.Photobacterium sp.

14

Fermentacja mieszana -produkty kwa śne

Fermentacja mieszana -produkty oboj ętne

IMViC

+ + - - - - + +

Fermentacja masłowa

ATP

ATP

CO2

CO2

H2

etanol

aceton

butanol

octan

maślan

Fermentacja masłowa Toksyczność tlenu

wynika z obecności w komórce :

enzymów flawinowych

oksydaz (np. oksydaza NADPH)barwników uczulających na światło (np. chlorofil, cytochromy)

funkcj ę ochronna pełnią:

dysmutazy ponadtlenkowe O2- + 2H+ →→→→ H2O2

katalazy 2H2O2 →→→→ 2H2O + O2

karotenoidy

15

Enegrizacja błony.

• dekarboksylacje sprzęŜone z transkolacją Na+

• symport z produktem fermentacji

• hydroliza ATPMetabolity prekursorowe

12

REAKCJE ANAPLEUROTYCZNEglukoza

1. karboksylaza PEP

PEP+ HCO3- → szczawiooctan+ Pi

(pałeczki jelitowe,Bacillus anthracis, Acetobacter xylinum, Azotobacter vinelandii)

2. karboksylaza pirogronianu

pirogronian+ HCO3- + ATP → szczawiooctan+ ADP + Pi

(enzym obecny u ssaków i bakterii, zawiera biotynę)

pirogronian, jabłczan

1. karboksykinaza PEP

szczawiooctan+ ATP → PEP+ ADP + CO2

2. syntetaza PEP

pirogronian+ ATP → PEP+ AMP + Pi

3. enzym jabłczanowy

jabłczan+ NAD+ (NADP+) → pirogronian+ NADH (NADPH) + H+ + CO2

octan

1. karboksykinaza PEP

szczawiooctan+ ATP → PEP+ ADP + CO2

2. cykl glioksalowy

Cykl glioksalowy

Rozkład związków aromatycznych

• aktywacja pierścienia przez wprowadzenie grup hydroksylowych –

powstaje katechollub protokatechol

• rozerwanie pierścieniaw pozycji ORTO lub META –udział dioksygenazy

• przekształcenie alifatycznych produktówpośrednich

i włączenie ich do metabolizmu centralnego

Bezwzględne tlenowce(Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Azotobacter sp., Agrobacterium sp.,Caulobacter sp., Spiryllum sp.,bakterie octowe –Acetobacter sp., Gluconobacter sp.)

wszystkie związki przekształcane do dwóch kluczowych struktur

protokatecholan

katechol

OH

OH

OHOH

16

ORTO

META

dioksygenaza

O2 O2

O2 O2

Rozkład węglowodorów

• metan –metanotrofy

• do C8 –niewiele bakterii (Nocardia sp., Mycobacterium sp.)specjalna struktura ściany komórkowej

• C10-C18 –wiele mikroorganizmów (Pseudomonas sp., Nocardia sp., Mycobacterium sp., Corynebacrium sp., droŜdŜe np. Candida sp., Torulopsis sp.)

oksydacja subterminalna

oksydacja terminalna

O2 O2

O2

monooksygenaza metylotrofy

CH4 + NADH + H+ + O2 →→→→ CH3OH + NAD+ + H2O monooksygenaza

CH3OH + PQQ →→→→ CH2O + PQQH2

dehydrogenaza

CH2O + NAD+ + H2O →→→→ HCOOH + NADH + H+

HCOOH + NAD+ →→→→ CO2 + NADH + H+

u droŜdŜy brak PQQ

CH3OH + O2 →→→→ CH2O + H2O2

oksydaza

2 H2O2 →→→→ 2 H2O + O2

katalaza

CH2O punktem wyjścia do biosyntezy

PQQ

3 drogi asymilacji aldehydu mrówkowego (CH2O)

• cykl serynowy CH2O + CO2 →→→→ acetyloCoA

3 drogi asymilacji aldehydu mrówkowego (CH2O)

• cykl rybulozomonofosforanu →→→→ fruktozo-6-fosforan

• cykl ksylulozomonofosforanu →→→→ dihydroksyaceton

tylko u droŜdŜy

17

Niepełne utlenianie substratu – bakterie octowe

Acetobacter sp.Gluconobacter sp.

Niepełne utlenianie-produkcja acetoiny i butandiolu

Bacillus spp.

Oddychanie beztlenowe

mrówczan + fumaran →→→→ bursztynian + CO2

H2 + fumaran →→→→ bursztynian

oddychanie azotanowe lub fumaranowe

brak akceptora elektronów – uwalnianie H2

H2dawcą energii

5H2 + 2NO3- + 2H+ →→→→ N2 + 6H2O

Oddychanie beztlenowe – dysymilacyjna redukcja siarczanów

oddychanie biosynteza (asymilacjyjna redukcja siarczanów)

3 grupy mikroorganizmów

• niepełne utlenianie substratuDesulfovibrio sp.(gram-), Desulfotomaculum sp.(gram+)

• pełne utlenianie substratuzmodyfikowany CKTK Desulfobacter sp. (gram-)

oksydatywnej dehydrogenazy CODesulfobacterium sp.(gram-), Desulfotomaculum sp. (gram+)

Arechaeglobus sp.(Archae)

jako źródło węgla mogą słuŜyć:cukry aminokwasyalkohole kw. organicznezw. aromatyczne węglowodory (C12-C20)

tlen włączany do cząsteczki substratu pochodzi z H2O -hydroksylazy nie będące oksydazami

Rozmieszczenie elementów łańcucha oddechowego w błonie

niepełne utlenienie substratu

Desulfovibrio sp.

mleczan+ SO42- + 8H+ →→→→ octan + CO2 + H2S

mleczan pirogronian

octan

18

Pełne utlenianie substratu – zmodyfikowany CKTK

Desulfobacter sp.

• dehydrogenaza kw. αααα-ketoglutarowego zaleŜna od Fd a nie NAD+

• dehydrogenaza jabłczanu niezaleŜna od NAD+,związana z błoną

• liaza a nie syntaza cytrynianu, CoA przenoszone na octan z bursztynylo-CoA, powstaje ATP

Pełne utlenianie substratu – oksydatywna dehydrogenaza CO

Desulfobacterium sp. Arechaeglobus sp.(Archae) Desulfotomaculun sp. (inne koenzymy)

Bakterie homoacetogenne – oddychanie węglanowe

Clostridium aceticum, Acetobacterium woodi

CO2 CO2

fruktoza →→→→ 3 cz. octanu

4H2 +2CO2 →→→→ octan- +2H2O + H+

redukcyjna dehydrogenaza CO

H2dawcą energii

CO2 akceptorem elektronów

CO2 jako końcowy akceptor elektronów:oddychanie węglanowe

dwie grupy organizmów:

acetogeny- redukcja CO2 do octanu

dawcy elektronów:• głównie H2• cukry, kwasy organiczne, aa, alkohole

metanogeny-redukcja CO2 do metanu

formylo-

metylo-

CO2

metylo-

acetylo-OCTAN

Szlak redukcyjnej dehydrogenazy CO

4H2 +2CO2 →→→→ octan- + 2H2O + H+

Bakterie metanogennne (Archae)

4H2 + CO2 →→→→ CH4 + 2H2O

Methanobacterium thermoautotrophicum

CO2 akceptorem elektronów –oddychanie węglanoweH2 dawcą energii

CH3COOH →→→→ CH4 + CO2

Methanosarcina sp. Methanothrix sp.

3CH3OH →→→→ 3CH4 + CO2 + 2H2O

4(CH3)3N + 6H2O →→→→ 9CH4 + 3CO2 + 4NH3

Methanolobus sp., Methanococcoides sp.

Methanosarcina barkeri- modelowy organizm

ograniczona ilość substratów dla metanogenezy

19

Metanogeneza z CO2

formylo-

metyleno-

metylo-

METAN

CO2

Metanogeneza z octanu

METAN

OCTAN

biosynteza

Typy troficzne – źródła energii

Typy troficzne – źródła węgla

CO2 – autotrofy zwiazki organiczne - heterotrofy

CHEMOLITOTROFY

• bakterie wodorowe

H2 + 0.5O2 →→→→ H2O Nocardia, Alcaligenes, Pseudomonas spp.

5H2 + 2NO3- + 2H+ →→→→ N2 + 6H2O Paracoccus denitryficans

4H2 + CO2 →→→→ CH4 + 2H2O Methanobacterium sp.

4H2 +2CO2 →→→→ octan- + 2H2O + H+ Clostridium aceticum, Acetobacterium woodi

• bakterie siarkowe

S2- + 2O2 →→→→ SO42- Beggiatoa, Thiothrix spp.

S0 + 1.5O2 + H2O →→→→ SO42- + 2H+ Thiobacillus, Sulfolobus spp.

S2O32- + 2O2 + H2O →→→→ 2SO4

2- + 2H+ Thiobacillus thiooxidans

5S2O32- + 8NO3

- + H2O →→→→ 10SO42- + 2H+ +4N2 Thiobacillus denitryficans

• bakterie Ŝelazowe

2Fe2+ + 2H+ + 0.5O2 →→→→ 2Fe3+ + H2O Gallionella sp., Thiobacillus ferroxidans

• bakterie nitryfikacyjne

utleniające amoniak

NH4+ + 1.5O2 →→→→ NO2

- + H2O + 2H+ Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus spp.

utleniająceazotyny

NO2- + 0.5O2 →→→→ NO3

- Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus spp.

Odwrotny transport elektronów

siła redukcyjna ATPodwrotny transport

bakterie nitryfikacyjne

potencjał dawcy elektronów nie jest dostatecznie ujemny by zapewnić redukcję NAD+ (wyjątek H2)

Figure 20.27b

Odwrotny transport elektronów –bakterie siarkowe

wiele z nich to autotrofy – bardzo wolny wzrost

20

CO2

CO2

Obligatoryjna autotrofia

brak dehydrogenazy kw. αααα-ketoglutarowego

Fosforylacja cykliczna – bakterie purpurowe

odwrotny transportelektronów

zewnętrzne źródło elektronów, np. H2S

Fosforylacja cykliczna – bakterie zielone

bakterie purpurowe bakterie zielone

Fotoasymilacja związków organicznych przez bakterie purpurowe

octan

2nCH3COOH + 2nH+ →→→→ (C4H6O2)n + 2nH2O

CH3COOH + H2O →→→→ 2CO2 + 8H+ (CKTK - źródło siły redukcyjnej)

razem:

9nCH3COOH →→→→ 4 (C4H6O2)n + 2CO2 + 6nH2O

maślan

2nC4H8O2 + nCO2 →→→→ 2 (C4H6O2)n + (CH2O)n + nH2O

związki aromatyczne

Wiązanie CO2 – cykl Calvina

cykl Calvina- 9ATP na jedną fosfotriozę

• wiązanie CO2

• redukcja CO2

• regeneracja akceptora CO2

Wiązanie CO2 – redukcyjny CKTK

5 ATP na fosfotriozęmateriał komórkowy

bakterie zielone(Chlorobiaceae),niektóre redukujące siarczany

21

Wiązanie CO2 – szlak redukcyjnej dehydrogenazy CO

metanogeny, acetogeny, niektóre redukujące siarczany3 ATP na fosfotriozę

formylo-

metylo-

CO2

metylo-

acetylo-CoA

fosfotrioza3ATP

Dodatkowe karboksylacje

1. karboksylaza PEP

PEP + CO2 → szczawiooctan+ Pi

(pałeczki jelitowe,Bacillus sp.)

2. karboksylaza pirogronianu

pirogronian + CO2 + ATP → szczawiooctan+ ADP + Pi

(Pseudomonas sp., Bacillus sp.)

3. cykl glioksalowy

4. acetylo-CoA + CO2 + FdH2 → pirogronian+ Fd + CoA

UmoŜliwiaj ą wzrost na octanie, u niektórych (np. Clostridium sp.)

aŜ 30% węgla komórkowego pochodzi z CO2

polimery(polisacharydy,bia łka)

monomery(cukry, aminokwasy)

octan

CH4+CO2

propionian, ma ślan,bursztynian, alkohole

H2+CO2 octan

H2+CO2

octan

fermentacja I

fermentacja II

metanogeneza

acetogeneza

hydroliza

Fermentacje II rzędu

1. 3 mleczan →→→→ 2 kw. propionowy + octan + CO2(Propionibacterium sp., Clostridium sp.)

2. etanol + H2O →→→→ octan + 2H2Go’ = +9.6 kJ

3. kw. masłowy+ 2H2O →→→→ 2octan + 2H2Go’ = +48.1 kJ

(Syntrophomonas wolfei)

4. kw. propionowy + 3H2O →→→→ octan + + CO2 + 3H2Go’ = +76.1 kJ

(Syntrophobacter wolfinii)

syntropiamiędzygatunkowe przekazywanie wodoru

przełyk

odbyt

Układ pokarmowy

Enterococcus faecalis, pałeczki jelitoweBacteroides sp.Bifidobacterium sp.Peptococcus sp.Peptostreptococcus sp.Ruminococcus sp.Closrtidium sp.Streptococcus sp.Staphylococcus sp.Lactobacillus sp.

Lactobacillus sp.Enterococcus sp.

Główne grupy mikroorganizmów1010 – 1011 kom./g

układ moczowyEscherichia coli, Proteus mirabilis– patogeny oportunistyczne(zmiana pH, spadek oporności)

układ płciowyniskie pH utrzymywane przezLactobacillus acidophilusinne organizmy to:Escherichia coli,Streptococcus sp. droŜdŜaki:Candidai Torulopsis spp.

22

OBECNOŚĆ patogenów

ADHEZJA

WZROST i KOLONIZACJAlokalna

TOKSYCZNO ŚĆefekt lokalny lub systemowy

INWAZYJNO ŚĆwzrost lokalny lub

w miejscach oddalonych

USZKODZENIE TKANEKCHOROBA

Czynniki adhezyjne:

glycocalyx enterotoksyczna Escherichia coli(ETEC)Streptococcus mutans

białka adhezyjne Streptococcus pyogenes białkoMNeiseria gonorrhoeae białko Opa

kwas lipotejchojowy Streptococcus pyogenes

fimbrie (pili) Neiseria gonorrhoeae enterotoksyczna Escherichia coli(ETEC)

Wnikanie do wnętrza komórki

• namnaŜanie się, wzrost, wywoływanie choroby ściśle związane

z inwazją cytoplazmy komórek gospodarzariketsie, chlamydie– pasoŜyty wewnątrzkomórkowe

• ucieczka przed układem immunologicznym, moŜliwość rozprzestrzeniania się po całym organizmie

Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae,

Shigella sp., Salmonella sp., patogenne szczepyEscherichia coli

Neutrofil – fagocytoza komórek bakteryjnych

lizosomy

bakterie

fagosom

fagolizosom

adhezja

wydzie-lanie

wchła-nianie

trawienie

pseudo-podium

cytoplazma

błonacytoplazmatyczna

1. repelenty, toksyny –brak chemotaksji

2. otoczki, śluzy, biofilm –brak adhezji i pochłaniania

3. blokowanie fuzji lizosomów z fagosomem

4. wydzielanie katalazy

5. nieprzepuszczalne osłony

komórkowe

6. blokowanie odpowiedzi makrofagów na czynniki stymulujące

7. utrata zdolności do prezentacji antygenów

8. ucieczka patogenu z fagosomu

Unikanie fagocytozy Inwazja przez wymuszoną fagocytozę – Shigella sp.

komórka M

makrofag

komórkanabłonkajelita

aktyna-ruch

23

Dopełniacz

liza chemotaksja opsonizacja

bakterie bakteriefagocyt

komplement

IgA toksyny neutralizacja fagocytoza

IgG bakterie między opsonizacja fagocytoza komórkami

IgM bakterie w kompleksy liza iplazmie immunologiczne fagocytoza

fagocyt opsonizacja wiązanie

dopełniacz

dopełniaczi przeciwciała

przeciwciała

Systemy sekrecyjne dla toksyn bakteryjnych

toksyna Bor. pertusis(PT),

Legionella sp., Helicobacter sp. IV

białka Yop Yersinia sp.

białka Ipa Shigella sp.III

pullulanaza Klebsiella oxytoca

elastaza, fosfolipaza Ps. aeruginosaII

αααα-hemolizyna E.colicyklaza adenylowa Bor. pertusis

proteaza Ps. aeruginosa

I

IgA proteaza N.gonorrhoeae

hemaglutynina Bor. pertusisautotransportery

przykładowe toksynytyp systemu

sekrecyjnego

Autotransportery

peryplazma

cytoplazma

peryplazma

Typ I

24

Typ II

pili typu IV

Typ IIIkomórka eukariotyczna

rzęska

do komórki eukariotycznej

Typ IV

Curr Op Cell Biol (2000) 12:420

Podział toksyn bakteryjnych

endotoksyny

• składniki LPS, głównie lipid A• bardzo podobne, działają w taki sam sposób, objawy ogólne (gorączka, wymioty, biegunka)

• ciepłostałe

• mało toksyczne LD50 300 mikrogramów

egzotoksyny

• białka, wydzielane do środowiska przez bakterie G+ i G-• bardzo róŜnorodna grupa, specyficzne działanie (niepyrogenne)

• ciepłochwiejne (są wyjątki np. toksyna S.aureus)

• bardzo toksyczne LD50 25 pikogramów (botulina)

Podział toksyn bakteryjnych

neurotoksyny

zakłócają normalne przekazywanie impulsów nerwowychClostridium tetani, Clostridium botulinum

cytotoksynyzabijają komórki gospodarzaCorynebacterium diphteriae– hamuje elongację białka

Streptococcus pyogenes– uszkadza błonę lizosomów

enterotoksyny

stymulują komórki układu pokarmowego do wydzielania wodyi elektrolitów do światła jelita

Vibrio cholerae, Escherichia coli,Shigella dysenteriae(hamuje syntezę białka w kom. nabłonka jelita)

Bakterie chorobotwórcze

Staphylococcus aureus

• obecny na skórze i w nosogardzieli

• powoduje zatrucia pokarmowe (50% szczepów produkuje enterotoksynę)• choroby związane z produkcją ropy (zapalenia skóry, wrzody)

• produkuje kolagenazę oraz cytotoksyny (hemolizyna, leukocydyna)

Diplococcus pneumoniae

• typowa flora górnych dróg oddechowych

• powoduje zapalenie płuc, opon mózgowych, ucha środkowego• 30% śmiertelność, duŜy naciek limfocytów, cytokin,

zapalenie systemowe, uszkodzenie tkanek gospodarza• oporność warunkowana przez przeciwciała przeciwko

cukrowej otoczce – duŜa zmienność patogenu

25

Streptococcus pyogenes

• rzadko występuje u zdrowych ludzi• powoduje ropne zapalenie gardła oraz zapalenie skóry

• produkuje cytotoksyny (ββββ-hemoliza) oraz enzymy (nukleazy,lipazy, proteazy)

• białka powierzchniowe A i M to tzw. superantygeny• liczne powikłania (zapalenie kłębuszków nerkowych,

reumatyczne zapalenie mięśnia sercowego) spowodowane osadzaniem się w tkankach kompleksów immunologicznych

Corynebacterium difteriae

• powoduje infekcje gardła, nekrozę komórek epitelialnych,

toksyna ma efekt systemowy (serce, układ nerwoway, nerki)• produkuje toksynę dyfterytu (hamuje syntezę białka)

Corynebacterium difteriae – transformacja lizogenna

W.J.H. Kunicki – Goldfingerśycie Bakterii PWN 1998

Helicobacter pylori

• bardzo często występuje u zdrowych ludzi• powoduje powstawanie wrzodów oraz nowotworów Ŝołądka

• czynniki wirulencji: system sekrecyjny IV oraz cytotoksynę indukuj ącą procesy zapalne i apoptotyczne w komórkach

Bacillus anthracis

• powoduje wąglik, tzw. zoonozę, chorobę odzwierzęcą

• powoduje skórne i płucne infekcje, obrzęki, nekroza tkanek,wysoka śmiertelność

• czynniki wirulecji: otoczka uniemoŜliwiaj ąca fagocytozę, wytwarzanie egzotoksyn (zaburzenie równowagi jonowej,

zakłócenie przekazywania sygnałów w obrębie układuimmunologicznego)

Porównanie cech Bacteria, Archaeai Eukarya

taktaknieczynniki transkrypcyjne

TATATATA-10 i -35promotory

nietaktakoperony

trzy (12-14 podj. kaŜda)

kilka (8-12 podj. kaŜda)

jedna (4podj)polimeraza RNA

taktaknieintrony

MetMetf-Metinicjacyjny tRNA

80S70S70Srybosomy

estryeteryestrylipidy błonowe

róŜny składróŜny składmureinaściana komórkowa

taktakniebiałka histonowe

nietaktakDNA w postaci CCC

nietaktakkomórka prokariotyczna

EukaryaArchaeaBacteriacecha

Porównanie cechBacteria, Archaeai Eukarya

nietaktakwzrost powyŜej 80oC

nietaktakchemolitotrofia

nietaktakwiązanie azotu

tak (chloroplasty)

nietakfotosynteza (chlorofil)

nietaktakdysymilacyjna redukcja siarczanów

nietaktakdenitryfikacja

nienietaknitryfikacja

nietaktakredukcja So do H2S

nietakniemetanogeneza

EukaryaArchaeaBacteriacecha

Nature (1998) 392: 38

The hydrogen hypothesis for the first eukaryote

William Martin, Miklos Muller