Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Ochrona przed zwyrodnieniem układu nerwowego: rola peptydów endogennych, L-argininy i kwasów tłuszczowych jako

potencjalnych czynników modulujących czynność mitochondriów, zwiększających

żywotność mózgu poddanegodziałaniu bodźców stresowych.

PNRF-104-AI-1/07

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Jednostki realizujące projekt:

Uniwersytet Jagielloński, Colegium Medicum, Wydział LekarskiTeam Leader: Prof. Aldona Dembinska-Kieć

School of Pharmacy, University of OsloTeam leader: Prof. Arild C. Rustan

Department of Nutrition Institute of Basic Medical Sciences University of OsloTeam leader: Prof. Rune Blomhoff

Institute of Medicine, Section of Medical Biochemistry, University of BergenTeam leader: Prof. Rolf K. Berge

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Wstęp

Choroba Alzheimera jest jedną z najbardziej powszechnych chorób neurodegeneracyjnych, dotykającą starzejące się społeczeństwo. Jest to forma demencji o złożonej etiologii, prowadząca do postępującej utraty zdolności poznawczych oraz umiejętności uczenia się. Jedną z głównych neuropatologicznych cech choroby Alzheimera jest degeneracja mitochondrów i apoptoza komórek na skutek akumulacji białka beta-amyloidu.

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Cel projektu

Celem projektu jest badanie nowych potencjalnych możliwości terapii i mechanizmów neuroprotekcji, przy użyciu peptydów humaninowych, L-argininy i substratów energetycznych, mających zdolność modulowania i podtrzymywania funkcji mitochondriów.

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Przeprowadzenie badań

Naukowcy wchodzący w skład konsorcjum badali metaboliczne mechanizmy działania antyapoptotycznego i neuroprotekcyjnego peptydów humaninowych, oraz innych związków bioaktywnych, takich jak L-arginina i kwasy tłuszczowe na modelach komórek (gleju, śródbłonka) narażonych na czynniki prozapalne i proapoptotyczne.

Badania były prowadzone również na modelach zwierzęcych, obejmujących myszy reporterowe NF-kappa beta-lucyferaza, oraz myszy transgeniczne o zwiększonej ekspresji TNF-alfa.

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Metody badawczeBadania metabolizmu komórkowego:

- metabolizm mitochondrialny (substraty: glukoza i kwas palmitynowy)

- potencjał błony mitochondrialnej Bioimiger (BD), cytometria

- potencjał energetyczny mitochondriów – elektroda tlenowa

- generacja ATP w mitochondriach

Badania ekspresji genów metodą mikromacierzy:

- badania przesiewowe na macierzach Affimetrix i Agilent

- badania wybranego szlaku (apoptozy) na macierzy TLDA (w oparciu o real-time PCR 7900 HT TaqMan Applied Biosystems

Badania czynnościowe na zwierzętach

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

WynikiPomiar potencjału błony mitochondrialnej (BD Bioimager 855 microscopy)

Pomiar potencjału błony mitochondrialnej (fluocytometr przepływowy BD Canto II)

Pomiar funkcji energetycznej mitochondriów (elektroda tlenowrażliwa Oxygraph-2k OROBOROS )

Pomiar generacji ATP (metoda luminescencji z wykorzystaniem kitu: ATP Lite,Parkin Elmer Kit)

■ ß-amyloid istotnie statystycznie obniża w komórkach LN-18, Daoy oraz w mysich astrocytach C8-D1A

■ TNF-α obniża w ludzkich komórkach endotelialnych wyizolowanych z żyły pępowinowej HUVEC ■ Peptydy humaniny nie wpływają na toksyczny efekt wywołany ß-amyloidem z wyjątkiem HNMi 13IleHN10b, które obniżają we wszystkich analizowanych typach komórek.

■ Wybrane peptydy humaniny, kwasy tłuszczowe oraz L-arginina nie wpływają znacząco na proces oddychania mitochondrialnego w komórkach LN18, Daoy, C8-D1A oraz HUVEC.

■ ß-amyloid obniża generację ATP w kom. LN-18, Daoy oraz w C8-D1A.

■ TNF-α nie wplywa na generację ATP w kom. HUVEC. ■ peptydy humaniny nie wykazują protekcyjnego działania w procesie generacji ATP we wszystkich analizowanych liniach komórkowych.

■ Zaobserwowano obniżenie generacji ATP po inkubacji z EPA and TTA w kom. HUVEC poddanych działaniuTNF-α L-arginina nie wplywa na generację ATP w analizowanych typach komórek

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Regulacja genów apoptozy na modelach komórkowych

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

Regulacja genów apoptozy na modelu myszy reporterowych NF-kappa - beta-lucyferaza

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50ContrHum AHum BL-Arg

4 6 8

Week

New

ton

Testy czynnościowe

Współpraca akademicka – stypendia, badania, rozwój

PodsumowanieNa modelach komórkowych wykazano, że badane peptydy humaninowe

oraz inne badane związki bioaktywne (kwasy tłuszczowe) mają znaczenie neuroprotekcyjne uczestnicząc w regulacji nie tylko procesu apoptozy ale również procesu zapalnego.

Wstępna analiza wyników ekspresji genów metodą mikromacierzy, uzyskanych w doświadczeniach na zwierzętach, prowadzonych we współpracy z partnerami z Norwegii wydaje się potwierdzać te wyniki.

W wyniku realizacji projektu opublikowano 4 publikacje, 32 streszczenia na konferencje międzynarodowe. Przygotowywane są kolejne manuskrypty prac do druku.