Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w ...

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie

przedmiot: Biochemia i biofizyka, kierunek: Pielęgniarstwo

Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 1

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa

im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie

Biochemia

ćwiczenia laboratoryjne dla kierunku: Pielęgniarstwo

Prowadząca: dr Beata Dudzińska-Bajorek

Spis treści:

1. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium biochemicznym

2. Część praktyczna

Ćwiczenie 1 - Biocząsteczki – aminokwasy, peptydy i białka

Ćwiczenie 2 - Biocząsteczki – węglowodany proste i złożone

Ćwiczenie 3 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – chromatografia

cienkowarstwowa (TLC)

Ćwiczenie 4 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – elektroforeza

w żelu agarozowym

3. Literatura




1. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium biochemicznym

Aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu oraz uniknąć zranień lub oparzeń w trakcie

wykonywania poszczególnych czynności w laboratorium wymaga się stosowania właściwych

warunków pracy. W tym celu przed rozpoczęciem ćwiczeń studenci są zobowiązani do zapoznania

się z następującymi zasadami bezpiecznej pracy:

1. W laboratorium biochemicznym należy przebywać w fartuchu ochronnym uszytym

z naturalnego materiału oraz okularach ochronnych. Ubrania wierzchnie (płaszcze) zostawiać

w szatni uczelni.

2. Na sali ćwiczeń nie wolno pić, jeść, palić, a także żuć gumy.

3. Przed przystąpieniem do ćwiczeń należy zapoznać się z metodyką ćwiczeń oraz przestrzegać

wskazówek dotyczących ich wykonania.

4. Wszystkie czynności, przy których następuje wydzielanie się trujących (szkodliwych) par

i gazów, należy wykonywać pod wyciągiem.

5. Nie zostawiać bez nadzoru palących się palników, włączonych przyrządów grzejnych

i zwracać uwagę, czy w laboratorium nie ulatnia się gaz. W tym ostatnim przypadku należy

zamknąć dopływ gazu, zgasić wszystkie palniki, uruchomić wentylację i otworzyć okna.

6. Nie zasysać ustami do pipet jakichkolwiek roztworów odczynników. Czynność tę należy

wykonywać przy pomocy specjalnych końcówek do pipet lub gumowych gruszek.

7. Roztwory stężonych kwasów lub stężonych zasad pobierać do swoich probówek lub innych

naczyń w miejscu ustawienia tych stężonych roztworów, nad szklanymi, porcelanowymi lub

plastikowymi tacami.

8. Zabrania się przenoszenia naczyń ze stężonymi kwasami i zasadami na inne miejsca niż dla

nich przewidziano.

9. Do probówek których zawartość ma być ogrzewana nad płomieniem palnika wlewać jedynie

kilka cm3 roztworu i ogrzewać je, trzymając probówki w drewnianych szczypcach. Podczas

ogrzewania stale wstrząsać zawartością probówek, a ich wyloty kierować w miejsce, gdzie nie

przebywa żadna osoba.

10. Przy wszystkich czynnościach laboratoryjnych zachować ostrożność i pamiętać, że brak

dokładności, nieuwaga, niedostateczne zaznajomienie się ze sprzętem i odczynnikami – może

spowodować nieszczęśliwy wypadek.

11. Po wykonaniu doświadczeń zawartość probówek wlać do pojemników do tego

przeznaczonych , odpowiednio opisanych. Nie wolno niczego wlewać do zlewu!

12. Używane szkło, szkiełka, pipety odkładać do wyznaczonych przez prowadzącego pojemników.

13. Przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy dokładnie przemyć środkiem

dezynfekcyjnym.

14. Kilkakrotnie w czasie pracy i po jej zakończeniu myć ręce, stosując do ich mycia środki

dezynfekcyjne.

15. Po zakończeniu zajęć uporządkować stoły, sprawdzić czy zostały zgaszone palniki. Schować

używane przedmioty do szafek. Przemyć stoły środkiem odkażającym, umyć ręce.




2. Część praktyczna

Ćwiczenie 1 - Biocząsteczki – aminokwasy, peptydy i białka

1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów – wykrywanie obecności aminokwasów

Aminokwasy są związkami chemicznymi budującymi peptydy i białka. W swojej cząsteczce

mają co najmniej dwie grupy funkcyjne: grupę aminową NH2 i grupę karboksylową COOH. Wzór

ogólny aminokwasów to:

1.1. Reakcja z ninhydryną

Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu, dekarboksylacji, a później

deaminacji. Przejściowo powstaje iminokwas i zredukowana ninhydryna. Następnie iminokwas

przekształca się w aldehyd uboższy o jeden atom węgla, uwalnia się CO2 oraz amoniak.

W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryny ulega reakcji kondensacji

z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje fioletowo niebieski produkt kondensacji zwany

purpurą Ruhemanna.

Zależnie od rodzaju aminokwasu różna jest intensywność i odcień powstającego

zabarwienia. Reakcja ninhydrynowa jest czuła i dokładna - dodatni jej wynik dają wszystkie wolne

iminokwas

ninhydryna zredukowana ninhydryna

aldehyd

purpura Ruhemanna

(fioletowo niebieska)




aminokwasy w środowisku o pH>4. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia

-aminokwasów. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę

-aminową, czyli sole amonowe, aminocukry, amoniak. Peptydy i białka również mogą dawać

dodatni odczyn ninhydrynowy, jednak tylko w nieznacznym stopniu.

Iminokwasy, prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy -aminowej, dają w reakcji

z ninhydryną produkt o barwie żółtej lub różowej.

1.2. Reakcja z kwasem azotowym

Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się wg reakcji pierwszej,

ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie

gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. Deaminacja -aminokwasu przebiega zgodnie z drugą

reakcją:

Reakcja 1: NaNO2 + HCl HNO2 + NaCl

Reakcja 2:

1.3. Reakcja z siarczanem miedzi (II)

Jony metali dwuwartościowych tworzą z -aminokwasami związki kompleksowe. Dotyczy

to głównie jonu miedzi (II), który reagując z dwiema cząsteczkami aminokwasu daje barwny

(niebieski), chelatowy związek kompleksowy. Jon miedzi (II) łączy się wiązaniami jonowymi

z grupami karboksylowymi oraz wiązaniami koordynacyjnymi z atomami azotu grup -aminowych

dwóch cząsteczek aminokwasu.

2 H2N-CH2-COOH + CuSO4

prolina

kwas azotowy (III)

hydroksykwas

związek kompleksowy (niebieski)




Wykonanie doświadczenia:

Przygotować 3 serie po 3 probówki, każdą serię napełnić odpowiednio 3 cm3:

- 1% roztworu glicyny

- 1% roztworu fenyloalaniny

- 0,2% roztworu tryptofanu.

Podziałać na nie odpowiednio roztworami ninhydryny, kwasu azotowego (III) i siarczanu miedzi (II),

do każdej probówki dodać tylko jeden odczynnik.

Zaobserwować i opisać w tabeli zmiany zachodzące w probówkach po dodaniu odczynników.

Odczynnik Aminokwas

Ninhydryna (3cm3 2% roztworu

alkoholowego)

Kwas azotowy (III) (3cm3 10% roztworu NaNO2

i kilka kropli 5% HCl)

Siarczan miedzi (II) (3cm3 5% roztworu w buforze octanowym)

Glicyna*

Fenyloalanina

Tryptofan

Narysować wzory strukturalne użytych aminokwasów i na ich podstawie napisać wnioski

z przeprowadzonych reakcji.

Glicyna Fenyloalanina Tryptofan




2. Reakcje charakterystyczne dla białek - wykrywanie obecności białka

2.1. Test biuretowy – charakterystyczny dla wszystkich substancji zawierających dwa

wiązania peptydowe

Nazwa metody pochodzi od biuretu (bimocznika), najprostszego związku zawierającego

dwa wiązania peptydowe, a powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180°C.

Reakcja biuretowa polega na tworzeniu barwnego kompleksu z jonami miedzi(II)

w środowisku zasadowym, w którym zachodzi tautomeryzacja ugrupowania przy wiązaniu

peptydowym, z utworzeniem formy enolowej, w której grupa hydroksylowa zdolna jest

do dysocjacji. Z sąsiadującymi ze sobą wiązaniami tego typu jon miedzi (II) tworzy dwa wiązania

jonowe (z grupami enolowymi) oraz cztery wiązania koordynacyjne (z atomami azotu). Stężenie

powstającego kompleksu barwnego (nasilenie barwy fioletowo niebieskiej) jest proporcjonalne

do liczby wiązań peptydowych zawartych w badanym roztworze.


Do 2cm3 roztworu białka dodać 5cm3 10% roztworu NaOH i 2-3 krople 1% roztworu CuSO4.

Dokładnie wstrząsnąć probówką. Zapisać zaobserwowane zmiany.

mocznik biuret (bimocznik)

forma ketonowe forma enolowa

związek kompleksowy (fioletowo niebieski)




2.2. Reakcja ksantoproteinowa – reakcja charakterystyczna białek zawierających

aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi

Aminokwasy aromatyczne – zarówno wolne, jak i związane w białku – podczas ogrzewania

ze stężonym HNO3 ulegają nitrowaniu, tworząc nitrowe pochodne o barwie żółtej. Czynnikiem

nitrującym jest jon nitroniowy NO2+, powstający w wyniku katalitycznego uprotonowania kwasu

azotowego kwasem siarkowym, a następnie odszczepienia cząsteczki wody.

Mieszanina nitrująca, zawierająca stężone kwasy azotowy (V) i siarkowy (VI) (w stosunku

objętościowym 1:3), nitruje wszystkie aminokwasy, natomiast stężony kwas azotowy na zdolność

nitrowanie związków zawierających aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz

fenyloalaninę.


Do 2cm3 1% roztworu białka dodać 1cm3 stężonego HNO3 i ogrzać. Zapisać zaobserwowane

zmiany.

tyrozyna dinitrotyrozyna (żółta)




2.3. Próba Millona - reakcja charakterystyczna białek zawierających aminokwasy

z grupą fenolową

Reakcja charakterystyczna dla fenoli, o co najmniej jednej niepodstawionej pozycji orto.

Monofenole z odczynnikiem Millona ulegają reakcji nitrozowania w pozycji orto, której produkt –

o-nitrozopochodna – tworzy barwny (czerwony) kompleks z jonami Hg2+. Odczynnik Millona –

1g rtęci w 1cm3 dymiącego HNO3 rozcienczony 2cm3 H2O.


Do 5cm3 1% roztworu białka dodać 6-8 kropli odczynnika Millona i ogrzać do wrzenia. Zapisać

zaobserwowane zmiany.

3. Reakcje denaturacji białka

Koagulacja to proces, w którym białka przechodzą ze stanu rozpuszczalnego do stanu

nierozpuszczalnego. Koagulacja może być procesem odwracalnym, jeśli jednak podczas

koagulacji białka utraciły nieodwracalnie swoje specyficzne właściwości wtedy proces ten nazywa

się denaturacją. Białka są związkami wrażliwymi na wpływ wielu czynników, które mogą

spowodować nieodwracalne zmiany w ich strukturze i utratę właściwości biologicznych czyli

denaturację cząsteczki. W wyniku denaturacji zniszczona zostaje drugo-, trzecio- i czwartorzędowa

struktura białka, natomiast pierwszorzędowa struktura nie ulega zmianie. Zachowane pozostają

mocne wiązania peptydowe, a zniszczeniu ulegają słabe wiązania wodorowe, oddziaływania

elektrostatyczne, hydrofobowe oraz mostki dwusiarczkowe.

fenol o-nitrofenol

związek kompleksowy (czerwony)




Denaturacja białka może nastąpić pod wpływem podwyższonej temperatury, działania

kwasów i zasad, wysokich stężeń soli metali ciężkich, rozpuszczalników organicznych, takich jak

alkohol lub aceton. W wyniku denaturacji białko wytrąca się z roztworu w postaci osadu.

3.1. Denaturacja termiczna


Ogrzewać 5cm3 1% roztworu białka przez kilka minut. Zapisać zaobserwowane zmiany.

3.2. Denaturacja alkoholem


Do 5cm3 1% roztworu białka dodać 5 cm3 alkoholu etylowego. Zapisać zaobserwowane zmiany.

3.3. Test Hellera (denaturacja stężonym kwasem)


Do 5cm3 1% roztworu białka dodać ostrożnie po ściance probówki 3cm3 stężonego HNO3. Zapisać

zaobserwowane zmiany.




Ćwiczenie 2 - Biocząsteczki – węglowodany proste i złożone

1. Wykrywanie obecności węglowodanów

W cząsteczkach cukrów występują grupy funkcyjne aldehydowa ( ) i ketonowa

( ) jako grupy główne oraz grupy hydroksylowe (-OH). Wszystkie monosacharydy możemy

podzielić: ze względu na obecność grupy funkcyjnej na aldozy (grupa aldehydowa) lub ketozy

(grupa ketonowa) oraz ze względu na liczę atomów węgla w cząsteczce: triozy, tetrozy, pentozy,

heksozy.


Dla otrzymanych roztworów cukrów należy wykonać testy Molischa, Fehlinga, Benedicta, Tollensa,

próbę jodową i próbę zasadową.

Węglowodan Próba Molischa

Próba Fehlinga

Próba Tollensa

Próba Benedicta

Próba zasadowa

Próba jodowa

Glukoza

Sacharoza

Skrobia

1.1. Próba Molischa

Najbardziej ogólna reakcja charakterystyczna służąca do wykrywania cukrów wolnych

i związanych oraz ich pochodnych: aldehydów, acetonu, kwasu szczawiowego, kwasu

cytrynowego - ujemny jej wynik wyklucza obecność cukrowca, dodatni natomiast nie wystarcza do

stwierdzenia jego obecności.

W wyniku działania stężonego kwasu siarkowego (VI) na cukry powstaje furfural

(w przypadku pentoz), hydroksymetylofurfural (w przypadku heksoz) lub inne pochodne furfuralu,

w zależności od rodzaju cukru.

D-glukoza 5-hydroksymetylofurfural




Grupa aldehydowa powstałego furfuralu reaguje z dwiema cząsteczkami -naftolu

z odczynnika Molischa (roztwór -naftolu w etanolu), tworząc wielopierścieniowe produkty o

barwie czerwono fioletowej.


Do probówki zawierającej 2cm3 wody dodać 5 kropli roztworu badanego cukru i 2 krople reagentu

Molischa, wymieszać i dodać 2cm3 stężonego H2SO4 wlewając go ostrożnie po ściance probówki,

tak aby warstwy się nie mieszały. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące

w probówkach po przeprowadzeniu testów.

1.2. Próba Fehlinga

Reakcja chemiczna, stosowana do jakościowego oznaczania aldehydów. Przeprowadza się

ją przy użyciu odczynnika Fehlinga (alkaliczny roztwór jonów miedzi (II) skompleksowanych jonami

winianowymi o zabarwieniu ciemnoniebieskim). Pozytywny wynik próby uwidacznia się przez

pojawienie się czerwonego osadu tlenku miedzi (I) (Cu2O). Próba Fehlinga to reakcja redoks.

Aldehydy ulegają utlenieniu do kwasów karboksylowych, miedź ze stopnia utlenienia II redukuje

się do I, zgodnie z zapisem:

2Cu2+ + R-CHO + NaOH + H2O → Cu2O↓ + R-COONa + 4H+

Wytrącający się tlenek miedzi (I) Cu2O jest produktem szybkiej reakcji powstających jonów Cu+ z

jonami hydroksylowymi:

2Cu+ + 2OH− → Cu2O + H2O

5-hydroksymetylofurfural

naftol

związek wielopierścieniowy

(czerwono fioletowy)

roztwór Fehlinga

aldehyd tlenek miedzi (I) (czerwony)




Nie jest możliwe odróżnienie aldoz, które zawierają aldehydową grupę funkcyjną od ketoz,

które zawierają grupę ketonową. Niektóre ketozy, jak np. fruktoza, ulegają bowiem tautomerii keto-

enolowej, a wynikiem tej izomeryzacji jest forma aldehydowa cukru.

Monosacharydy i disacharydy (np. maltoza, celobioza lub laktoza) w większości dają

pozytywny wynik próby, ponieważ są cukrami redukującymi, tzn. takimi, które nie mają związanego

(np. wiązaniem glikozydowym) anomerycznego atomu węgla (pierwszy atom węgla w cząsteczce

cukru). Do wyjątków należy sacharoza, która anomeryczny atom węgla ma związany wiązaniem

glikozydowym z drugą cząsteczką węglowodanu i jest cukrem nierudukującym. Negatywny wynik

próby dają też polisacharydy ze względu na zbyt małą liczbę reszt redukujących (jedna grupa

aldehydowa w całym polimerze).


W probówce zmieszać po 1cm3 roztworu Fehlinga A i roztworu Fehlinga B i dodać 5 kropli

badanego cukru. Próbkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej. Zaobserwować i opisać w tabeli

powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów.

1.3. Próba Tollensa (próba lustra srebrowego)

Reakcja chemiczna służąca do wykrywania aldehydów. Próba Tollensa jest prowadzona w

lekko zasadowym środowisku, w którym ketozy ulegają epimeryzacji do aldoz, dzięki czemu

metodą tą można wykrywać też cukry nie zawierające początkowo grup aldehydowych.

Przykładem jest fruktoza (ketoza), przekształcająca się w trakcie próby w aldozy: glukozę i

mannozę. Jednym z niewielu cukrów, które nie dają pozytywnego wyniku próby Tollensa jest

sacharoza (cukier nieredukujący).

Do wykonania próby Tollensa wykorzystuje się odczynnik Tollensa, czyli roztwór

zawierający jony diaminosrebra (I) [Ag(NH3)2]+. Odczynnik Tollensa otrzymuje się dodając wody

amoniakalnej do roztworu azotanu srebra. W pierwszym etapie wytrąca się brunatny osad tlenku

srebra (I):

2 AgNO3 + 2 NH3 + H2O → Ag2O↓ + 2 NH4NO3

Osad ten rozpuszcza się w nadmiarze amoniaku:

Ag2O + 4 NH3 + H2O → 2 [Ag(NH3)2]+ + 2 OH−

Powstaje jon kompleksowy diaminosrebra (I) ([Ag(NH3)2]+). Roztworu tego nie wolno

przechowywać, ze względu na powstawanie tzw. srebra piorunującego o właściwościach

wybuchowych.




Po wprowadzeniu do odczynnika Tollensa aldehydu, jon diaminosrebra (I) redukuje się do

metalicznego srebra. Jeżeli reakcja przeprowadzana jest w czystej probówce (najlepiej

odtłuszczonej wodorotlenkiem sodu) na jej ściankach powstanie "lustro srebrowe". Jeżeli

probówka będzie brudna wytrąci się czarny osad srebra.

2 [Ag(NH3)2]+ + RCHO + 3 OH− → 2 Ag↓ + RCOO− + 2 H2O + 4 NH3


Do probówki wlać 1cm3 odczynnika Tollensa A i 1cm3 odczynnika Tollensa B, wymieszać

i dodawać rozcieńczony roztwór amoniaku, aż do rozpuszczenia powstającego w pierwszym

momencie tlenku srebra. Do tak przygotowanego roztworu dodać 5 kropli badanego cukru

i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany

zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów.

1.4. Próba Benedicta

Reakcja chemiczna, która służy do wykrywania większości cukrów (oprócz cukrów

nieredukujących, np. sacharozy) i aldehydów. Odczynnik Benedicta to ciemnoniebieski

cytrynianowy kompleks miedzi (II) sporządzany przez rozpuszczenie w wodzie siarczanu miedzi

(II), cytrynianu sodu i węglanu sodu. Po dodaniu odczynnika do badanej próby i doprowadzeniu do

wrzenia duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu

tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu.

2 Cu2+ + RCHO + OH− → Cu2O↓ + RCOO− + 3 H2O


Do probówki zawierającej 2cm3 roztworu Benedicta, dodać 5 kropli badanego cukru. Probówkę

umieścić we wrzącej łaźni wodnej. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w

probówkach po przeprowadzeniu testów.

1.5. Próba zasadowa

Wszystkie cukry redukujące w czasie ogrzewania w środowisku zasadowym ulegają

rozpadowi na szereg związków o różnych właściwościach. Tworzą się dwu- i trójwęglowe

fragmenty o właściwościach silnie redukujących oraz produkty ich polimeryzacji (ciała żywicowate).

odczynnik Tollensa

aldehyd srebro metaliczne

odczynnik Benedicta

aldehyd tlenek miedzi (I) (czerwony)




Oligo- i polisacharydy, w których grupy aldehydowe są zablokowane wiązaniami glikozydowymi

charakteryzują się dużą opornością na działanie zasad.


Do probówki zawierającej 5cm3 badanego roztworu cukru dodać 1cm3 25% roztworu wodnego

NaOH i umieścić probówkę we wrzącej łaźni wodnej na około 5 min. Zaobserwować i opisać w

tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów.

1.6. Próba jodowa (odróżniająca polisacharydy od innych cukrów)

Reakcja polisacharydu z jodem polega na adsorpcji jodu, który wnika do struktury spiralnie

skręconego łańcucha polisacharydowego i zostaje uwięziony przez tlen przy pierwszym i czwartym

atomie węgla każdej cząsteczki glukozy. Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu, wzdłuż którego

mogą przemieszczać się elektrony, co powoduje pochłanianie światła przez układ. Skrobia po

adsorpcji cząsteczek jodu barwi się na kolor ciemnoniebiesko fioletowy. Obserwowana barwa

zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu: reakcja jodu z amylozą

powoduje powstanie niebieskiego produktu, z amylopektyną – fioletowo czerwonego, a glikogen

barwi się z jodem na czerwono.


W probówce umieścić 1cm3 badanego roztworu cukru, dodać kroplę roztworu jodu

(J2 w KJ w wodzie). W razie potrzeby intensywnie zabarwiony roztwór można rozcieńczyć wodą

3-10-krotnie. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po

przeprowadzeniu testów.




Ćwiczenie 3 – Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – chromatografia

cienkowarstwowa (TLC)

1. Rozdział chromatograficzny mieszaniny produktów

Chromatografia jest metodą służącą do rozdzielania mieszanin substancji, w której

wykorzystywane są różne fizykochemiczne oddziaływania rozdzielanych substancji z dwoma

fazami: ruchomą i nieruchomą. Fazą nieruchomą może być ciało stałe (w chromatografii

adsorpcyjnej) lub ciecz, unieruchomiona w stałym nośniku (w chromatografii podziałowej), fazą

ruchomą bywa ciecz lub gaz. Technikę chromatografii cienkowarstwowej (TLC) wyróżnia kształt

i rodzaj fazy stacjonarnej, uformowanej w postaci cienkiej warstwy nałożonej na płaskie podłoże,

zapewniające dostateczną wytrzymałość mechaniczną. Płaskim podłożem zwykle są płytki

szklane, płytki z folii aluminiowej lub plastykowej. Cienką warstwę złoża mogą stanowić: żel

krzemionkowy, ziemia okrzemkowa, niezmodyfikowana lub zmodyfikowana chemicznie celuloza,

tlenek glinu (Al2O3), podłoża jonowymienne lub inne. Technikę chromatografii cienkowarstwowej

stosuje się do rozdziału niemal wszystkich grup związków ważnych biologicznie.

Technika chromatografii cienkowarstwowej polega na poruszaniu się substancji

chromatografowanych z różną prędkością wraz z ciekłą fazą ruchomą przez cienką warstwę

stałego adsorbenta naniesionego na płytkę. Towarzyszą temu procesy adsorpcji i desorpcji oraz

podział między ciekłą fazą organiczną i wodą, która w niewielkich ilościach znajduje się na

nośniku. Rozdzielenie mieszaniny substancji odbywa się głównie dzięki różnicom w ich adsorpcji

przez adsorbent. Substancje słabiej adsorbowane przez adsorbent są wymywane przez

rozpuszczalnik wcześniej. Natomiast silniej adsorbowane przez adsorbent pozostają z nim

związane.

Proces separacji składników próbki naniesionej na płytkę TLC nazywa się rozwijaniem.

Oddziaływanie substancji znajdujących się w próbce z adsorbentem oraz z poruszającym się

rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie się składników próbki na płytce i poszczególne składniki

tworzą oddzielne plamki. Plami rozdzielanych składników należy z kolei uwidocznić, czyli wywołać.

faza stacjonarna

linia startu

faza ruchoma

czoło fazy ruchomej

rozdzielone związki




Chromatogramy wywołuje się najczęściej odczynnikami chemicznymi, które tworzą barwne związki

z analitami. Często ogląda się chromatogramy oświetlane lampą wytwarzającą promieniowanie

UV, aby zobaczyć substancji wykazujące właściwości fluorescencyjne pod wpływem

promieniowania UV. Fluorescencja jest to zjawisko emitowania przez niektóre związki chemiczne

światła pod wpływem naświetlania zewnętrznym promieniowaniem.

Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, który określa położenie

substancji na chromatografie, jest współczynnik opóźnienia RF. Jest to stosunek drogi migracji

substancji (a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (b):

RF = a/b

Współczynnik opóźnienia przyjmuje wartości od 0 do 1. Jeśli RF = 0 oznacza to,

że chromatografowana substancja w danym układzie chromatograficznym pozostaje na starcie,

gdyż zbyt silnie oddziałuje z fazą stacjonarną i nie ma oddziaływań z fazą ruchomą. Z kolej RF = 1

świadczy o tym, że substancja nie oddziałuje z fazą stacjonarną i wędruje z czołem

rozpuszczalnika. Optymalna wartość współczynnika RF powinna zawierać się w przedziale

0,2 – 0,8. Wówczas warunki chromatograficzne są najbardziej stabilne. Współczynnik opóźnienia

jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach chromatograficznych i może

służyć do jej identyfikacji. Wartość współczynnika RF, podobnie jak innych parametrów retencji,

zależy od rodzaju analitu, rodzaju fazy ruchomej i fazy stacjonarnej, a także nasycenia komory

i temperatury.

Jeżeli dana substancja ma tą samą wartość współczynnika opóźnienia, jaką ma wzorzec,

wyznaczoną w takich samych warunkach chromatograficznych, to prawdopodobnie jest identyczna

ze wzorcem. Najczęściej analizę jakościową wykonuje się w ten sposób, że na jedną płytkę TLC

linia startu

czoło fazy ruchomej




nanosi się badaną próbkę oraz obok nanosi się również wzorzec. Po rozwinięciu płytki sprawdza

się, która plamka badanej próbki ma taką samą wartość współczynnika opóźnienia jak wzorzec.


Roztarte w moździerzu tabletki o znanym składzie i otrzymaną od prowadzącego substancję

o nieznanym składzie rozpuścić każdą z osobna w etanolu w kolbkach miarowych 25 ml.

Zawartość kolbek przesączyć przez bibułę na lejku do fiolek. Przesączone roztwory nanieść przy

pomocy kapilary na dwie płytki chromatograficzne z żelem krzemionkowym. Przygotować eluent A

o składzie: octan etylu : heksan : kwas octowy (8 : 2 : 0,1 ml) oraz eleunt B o składzie: octan etylu :

heksan : kwas octowy (5 : 5 : 0,1 ml).

Wlać eluent A i eluent B do dwóch komór chromatograficznych i zamknąć je na chwilę, aby komora

równomiernie wysyciła się parami rozpuszczalnika. Płytki z naniesionymi substancjami wstawić do

komór chromatograficznych (każdą płytkę do innej komory) i poczekać aż czoło rozpuszczalnika

dojdzie do wyznaczonej linii końcowej. Wysuszoną płytkę obserwować w świetle UV. Narysować

poniżej wzór plamek substancji wzorcowych i analizowanych, wyznaczyć RF, opisać skład

substancji analizowanej na podstawie przeprowadzonego doświadczenia.




Ćwiczenie 4 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – elektroforeza w żelu

agarozowym

1. Rozdział elektroforetyczny substancji biologicznie aktywnych

Elektroforeza jest techniką rozdzielania związków obdarzonych ładunkiem, która

wykorzystuje zjawisko ruchu cząstek w polu elektrycznym. Pod wpływem pola elektrycznego

cząstki obdarzone ładunkiem dodatnim, czyli kationy, wędrują do katody, tzn. elektrody ujemnej.

Cząstki obdarzone ładunkiem ujemnym – aniony – wędrują w polu elektrycznym do anody,

tj. elektrody dodatniej. Podstawą rozdziału elektroforetycznego cząstek jest ich zróżnicowana

szybkość wędrówki w polu elektrycznym, tzn. w jednakowym czasie odmienne cząstki przewędrują

różne odległości. Szybkość przemieszczania cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym

zależy od trzech zasadniczych grup czynników: 1) własności cząstek wędrujących; 2) własności

środowiska, w którym cząstki wędrują; 3) od parametrów charakteryzujących przepływający prąd.

Własności cząstek wędrujących w polu elektrycznym, które mają największy wpływ na szybkość

przemieszczania, to wielkość wypadkowego ładunku elektrycznego, masa i kształt cząstek.

Wielkość masy i wypadkowego ładunku cząstek działają przeciwstawnie na szybkość wędrówki.

Im większy wypadkowy ładunek cząstek, tym szybciej się poruszają, ale im większa masa, tym

wolniejsza wędrówka cząstek. Zatem szybkość migracji cząstek w polu elektrycznym zależy

od stosunku ładunek/masa. Kształt cząstek wpływa na szybkość ich przemieszczania, dzięki

obniżaniu lub wzmaganiu oporu środowiska, który przeciwdziała ruchowi cząstek. Opór środowiska

dla cząstek o kształcie bliskim kuli (globularnym) będzie mniejszy (dzięki czemu ruch tych cząstek

jest szybszy) niż tych o rozpostartej konformacji przestrzennej. Środowisko, w którym cząstki

wędrują, rodzaj użytego buforu i jego właściwości, takie jak lepkość, siła jonowa, pH i temperatura,

wpływają na rozdział elektroforetyczny. Im większa lepkość, tym większy opór środowiska

ma do pokonania przemieszczająca się cząstka. Natomiast od siły jonowej i pH buforu

elektroforetycznego może zależeć wielkość ładunku rozdzielanej cząstki.

Zastosowanie buforu o wartości pH odpowiadającej wartości pI (punkt izoelektryczny (pI) -

wartość pH, w którym suma ładunków elektrostatycznych cząsteczki wynosi zero) rozdzielanych

cząstek uniemożliwi ich rozdział, ponieważ w tych warunkach cząstki występują w formie jonu

obojnaczego i nie poruszają się w polu elektrycznym. Dla cząstek rozpuszczalnych w środowisku

zasadowym najwłaściwszy będzie bufor o pH wyższym od pI każdej rozdzielanej cząstki

mieszaniny.

Nośnikiem do elektroforezy może być bibuła, inny nośnik celulozowy, w tym octan celulozy

oraz obecnie powszechnie stosowane różne żele obojętne (agarozowy, poliakrylamidowy)

w przypadku elektroforezy żelowej. Bibuła jest nośnikiem o dużej oporności, natomiast żele

cechuje mała oporność oraz niska adsorpcja cząstek. Dodatkowo, żele są sitami molekularnymi,

w związku z tym przez kanaliki w żelu małe cząstki przechodzą swobodnie, natomiast większe




są zatrzymywane. Usieciowanie żelu decydujące o wielkości kanalików w żelu, które można

kontrolować przez wybór odpowiednich stężeń substancji tworzących żel. W żelu będą tym

mniejsze kanaliki, im większe zastosuje się stężenie substancji sieciujących.

Rozdział substancji podczas elektroforezy zależy od przepływającego prądu, czyli wielkości

przyłożonego napięcia. Przyłożenie niskiego napięcia prądu sprawia, że niskie jest jego natężenie

i wydzielanie ciepła, a szybkość wędrówki cząstek wolna. W takich warunkach wydłuża się czas

potrzebny do osiągnięcia rozdziału elektroforetycznego. Zbyt długi czas trwania rozdziału może

być niepożądany ze względu na towarzyszące niekorzystne procesy, m.in. dyfuzję, która powoduje

rozmycie brzegów rozdzielonych stref. Przyłożenie za wysokiego napięcia prądu może

spowodować zbyt szybką migrację rozdzielanych składników i ich niecałkowity rozdział oraz

podwyższenie temperatury i denaturację badanych cząsteczek.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) charakteryzuje się szczególnie dużą

rozdzielczością, która w połączeniu z wysoką czułością metod detekcji rozdzielanych substancji

pozwala na analizowanie mikrogramowych ilości rozdzielanych mieszanin. Powszechnie stosuje

się ją do rozdzielania i oczyszczania białek oraz kwasów nukleinowych.

Żel agarozowy jako nośnik w elektroforezie charakteryzuje się dużą zdolnością rozdzielczą,

nieznaczną adsorpcją i niskim efektem elektroosmozy. Elektroforeza agarozowa jest powszechnie

stosowana w metodyce izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych, identyfikacji produktów

amplifikacji (reakcji łańcuchowej polimerazy PCR), jak również w specyficznych technikach analizy

DNA, np. w SSCP (polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów) i w RLFP (polimorfizm

długości fragmentów restrykcyjnych). Optymalne stężenie agarozy dopasowuje się do wielkości

rozdzielanych fragmentów DNA. Rozdział DNA przeprowadza się w żelu, zazwyczaj o grubości

około 5 mm w specjalnym aparacie do elektroforezy agarozowej. W celu określenia wielkości

mieszanina

makrocząsteczek

pory z żelu

elektroforeza




rozdzielanych fragmentów DNA, obok analizowanych próbek na żelu, umieszcza się wzorzec

masowy. Dla uwidocznienia rozdzielonych frakcji można dodać bromku etydyny podczas

sporządzania żelu lub dopiero po zakończeniu elektroforezy żel wybarwić roztworem tego bromku.

Bromek etydyny wnika pomiędzy zasady azotowe w DNA i pod wpływem ultrafioletu emituje

światło o zabarwieniu pomarańczowym. Po umieszczeniu wybarwionego żelu w transiluminatorze

w świetle UV można oglądać świecące prążki.


W celu wykonania 1% żelu agarozowego należy 2g agarozy rozpuścić w 200ml buforu TBE

(45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA) i podgrzewać do wysokiej temp. ciągle mieszając.

Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 5l bromku etydyny. Tak przygotowany żel wylać do formy

(20 x 20 cm), włożyć grzebień i pozostawić do zastygnięcia. Po spolimeryzowaniu żelu umieścić

go w temp. +4°C na 30 min. Schłodzoną formę z żelem włożyć do aparatu do elektroforezy

z buforem. Na gotowy żel nakładać próbki kwasów nukleinowych wraz z barwnikiem obciążającym.

Prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu ok. 100V w obecności markera wielkości,

aż do rozdziału produktów reakcji. Po zakończonej elektroforezie żel obejrzeć w świetle UV

w zestawie do wizualizacjo zdjęć i opisać wnioski z przeprowadzonego eksperymentu.




3. Literatura

1. Żak I. (red): Chemia medyczna. Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001

2. Żak I. (red): Praktikum z chemii medycznej. Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001

3. Skrypt „Techniki separacyjne” UG

4. Z. Witkiewicz, „Podstawy chromatografii:, WNT, Warszawa 2000

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w ...

Documents

Transcript of Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w ...