(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202536 RZECZPOSPOLITA

POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

(21) Numer zgłoszenia: 343375 (22) Data zgłoszenia: 26.02.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

26.02.1999, PCT/IB99/00337 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

02.09.1999, WO99/43344 PCT Gazette nr 35/99

(13) B1 (51) Int.Cl. A61K 38/39 (2006.01) A61P 7/04 (2006.01)

(54) Zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa

(30) Pierwszeństwo:

27.02.1998,DK,PA199800270 13.04.1998,US,60/081,551

16.10.1998,DK,PA199801328

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

13.08.2001 BUP 17/01

(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.07.2009 WUP 07/09

(73) Uprawniony z patentu:

INSTITUT STRAUMAN AG,Basel,CH

(72) Twórca(y) wynalazku:

Stina Gestrelius,Lund,SE Lars Hammaström,Djursholm,SE Petter Lyngstadaas,Nesoddtangen,NO Christer Andersson,Vellinge,SE Ivan Slaby,Malmö,SE Tomas Hammargren,Malmö,SE

(74) Pełnomocnik:

Kossowska Janina, PATPOL Sp.z o.o.

PL 2

0253

6 B

1

PL 202 536 B1 2

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa. Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowań macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub

białek macierzy szkliwa jako czynników terapeutycznych lub profilaktycznych. Substancje wykazują aktywność leczenia zranień.

Białka macierzy szkliwa, takie jak obecne w macierzy szkliwa są dobrze znane jako prekursory szkliwa. Białka szkliwa i pochodne macierzy szkliwa zostały wcześniej opisane w literaturze patento-wej jako zdolne do indukowania powstawania tkanki twardej (tj. szkliwa, patent USA nr 4,672,032 (Slavkin) oraz wiązania pomiędzy twardymi tkankami (EP-B-0 337 967 oraz EP-B-0 263 086). Według znanego stanu techniki aktywne substancje szkliwa były wykorzystywane jedynie do regeneracji tka-nek twardych, podczas gdy niniejszy wynalazek dotyczy korzystnego działania na gojenie zranień tkanek miękkich.

Stwierdzono, że macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i białka macierzy szkliwa (termin "aktywna substancja szkliwa" stosowany w dalszej części obejmuje macierz szkliwa, pochodne macie-rzy szkliwa oraz białka macierzy szkliwa) mają własności przeciwbakteryjne i/lub przeciwzapalne, są korzystnymi czynnikami wzmagającymi lub poprawiającymi gojenie się ran w obrębie tkanek miękkich (tj. niezmineralizowanych), takich jak tkanki zawierające kolagen lub nabłonki, w tym skórę i błonę śluzową, mięśnie, naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne, tkanki nerwowe, gruczoły, ścięgna, oczy i chrząstkę. Jak wykazano w części doświadczalnej, macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa wywierają szczególnie korzystne działanie w gojeniu lub profilaktyce ran tkanek miękkich.

Wynalazek obejmuje zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania far-maceutycznych lub kosmetycznych kompozycji do leczenia ran w skórze lub błonie śluzowej, korzyst-nie do poprawy gojenia się ran w skórze lub błonie śluzowej w tym do regeneracji lub reparacji skóry lub błony śluzowej.

Korzystnie kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowaniem jest odpowiednia do leczenia, ran występujących w błonie śluzowej jamy ustnej, a także ran, które są uszkodzeniem cielesnym lub urazem związanym z chirurgią jamy ustnej, w tym chirurgią okołozębową, usunięciem zęba(ów), le-czeniem endodontycznym, umieszczaniem implantów zębowych, zastosowaniem i używaniem protez zębowych.

Rana szczególnie nadająca się do leczenia kompozycją wytworzoną zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest wybrana z grupy składającej się z ran aseptycznych, ran tłuczonych, ran cię-tych, ran szarpanych, ran niedrążących, ran otwartych, ran drążących, ran przebijających na wylot, ran kłutych, ran zakażonych, zawałów i ran podskórnych, albo jest wybrana z grupy składającej się z owrzodzeń niedokrwiennych, ran uciskowych, przetok, ciężkich pogryzień, ran oparzeniowych oraz zranień spowodowanych pobraniem narządu do przeszczepienia, zwłaszcza raną jest pleśniawka, rana urazowa, lub rana związana z opryszczką.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku aktywną substancją szkliwa jest macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa.

Korzystnie aktywna substancja szkliwa jest wybrana z grupy składającej się z enamelin, amelo-genin, białek innych niż amelogeniny, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, amelin (ame-loblastyna, szeatlina), tuftelin oraz ich pochodnych i ich mieszanin.

Korzystnie czynna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy najwyżej około 120x 103 u, jak np. 100x 103 u, 90x 103 u, 80x 103 u, 70x 103 u lub 60x 103 u określony metodą elektroforetyczną SDS Page.

Korzystnie preparat aktywnej substancji szkliwa zawiera mieszaninę aktywnych substancji szkliwa o różnych ciężarach cząsteczkowych.

Korzystnie preparat aktywnej substancji szkliwa składa się co najmniej z dwóch substancji wy-branych z grupy składającej się z amelogenin, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, tu-fteliny, białek tuft, białek surowicy, białek śliny, ameliny, ameloblastyny, szeatliny oraz ich pochodnych.

Korzystnie aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy do około 40000 u. Bardziej ko-rzystnie aktywna substancja szkliwa ma ciężar cząsteczkowy pomiędzy 5000 u a około 25000 u.

Korzystnie główna część aktywnej substancji szkliwa ma ciężar cząsteczkowy około 20 x103 u i co najmniej część aktywnej substancji szkliwa jest w postaci agregatów lub po zastosowaniu in vivo jest zdolna do tworzenia agregatów.

Korzystnie agregaty mają wielkość cząstek od około 20 nm do około 1 mikrometra.

PL 202 536 B1 3

Korzystnie zawartość białka w aktywnej substancji szkliwa w preparacie jest w zakresie od 0,05% wag. do 100% wag., jak np. około 5-99% wag. około 10-95% wag., około 15-90% wag., około 20-90% wag., około 30-90% wag., około 40-85% wag., około 50-80% wag., około 60-70% wag., około 70-90% wag., lub około 80-90% wag.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalną sub-stancję pomocniczą, którą korzystnie jest alginian glikolu propylenowego lub kwas hialuronowy lub jego sole lub pochodne.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera 30 mg białka macierzy szkliwa i 1 mg alginianu glikolu propylenowego.

Korzystnie kompozycja nanoszona na rany dostarcza aktywną substancję szkliwa w ilości cał-kowitego białka na cm2 odpowiadającej od 0,01 mg/cm2 do około 20 mg/cm2, tak jak np. od około 0,1 mg/cm2 do około 15 mg/cm2.

Gojenie się ran Rany i/lub owrzodzenia zwykle przebijają powierzchnię skóry lub błonę śluzową lub też są wy-

nikiem zawału (niedokrwienia) narządu ("udar"). Rana może być następstwem ubytku lub uszkodzenia w obrębie tkanek miękkich lub leżących pod nimi. Regeneracja ran okołozębowych, wywołanych do-świadczalnie, była wcześniej opisana przez twórców wynalazku i nie wchodzi to w zakres niniejszego wynalazku. W niniejszym kontekście termin "skóra" odnosi się do najbardziej zewnętrznej powierzchni ciała zwierzęcia, w tym człowieka i obejmuje nienaruszoną lub prawie nienaruszoną skórę jak również uszkodzoną powierzchnię skóry. Termin "błona śluzowa" dotyczy nieuszkodzonej lub uszkodzonej błony śluzowej zwierząt, jak i ludzi i może być śluzówką jamy ustnej, policzków, ucha wewnętrznego, nosa, płuc, oczu, żołądkowo-jelitową, pochwy i odbytnicy.

W niniejszym kontekście termin "rana" oznacza uszkodzenie ciała z przerwaniem integralności zdrowych struktur tkankowych. Termin ten zawiera w sobie także pojęcia: "owrzodzenie", "uszkodze-nie", "martwica" i "wrzód". Zwykle termin "owrzodzenie" jest popularnym określeniem dowolnego uszkodzenia skóry lub błon śluzowych, natomiast "wrzód" jest ubytkiem miejscowym lub wydrążeniem powierzchni narządu lub tkanki, wytworzonym przez oddzielenie się martwiczej tkanki. Uszkodzenie odnosi się ogólnie do każdego ubytku tkankowego. Martwica odnosi się do martwej tkanki, powstałej w wyniku zapalenia, urazu, zakażenia lub zawału.

Stosowane tu pojęcie "rana", oznacza wszelkie rany (patrz niżej klasyfikacja ran) i w każdym etapie procesu gojenia, obejmującym stadium przed rozpoczęciem gojenia, a nawet przed szczegól-nym zranieniem, jak nacięcie chirurgiczne (leczenie profilaktyczne).

Przykłady ran, którym można zapobiec i/lub leczyć kompozycją wytworzoną zgodnie z zastoso-waniem według wynalazku są np. rany aseptyczne, stłuczenia, rany cięte, rany szarpane, rany niedrą-żące (tj. rany, w których nie ma przerwania skóry lecz uszkodzone są struktury pod nią leżące), rany otwarte, rany drążące, rany drążące, rany przebijające na wylot, rany kłute, rany septyczne, rany pod-skórne itp. Przykładami owrzodzeń są odleżyny, owrzodzenia rakowe, rany wywołane chromem, od-mrożenia, rany wywołane uciskiem itp. Przykładami owrzodzeń są np. wrzód trawienny, wrzód dwu-nastnicy, wrzód żołądka, wrzód dnawy, wrzód cukrzycowy, wrzód zastoinowy, wrzód żylny (ulcus cru-ris), wrzód podjęzykowy, wrzód podśluzówkowy, wrzód objawowy, wrzód troficzny, wrzód tropikalny, wrzód weneryczny, np. wywołany rzeżączką (w tym zapalenie cewki moczowej, zapalenie szyjki maci-cy i zapalenie odbytnicy). Patologie związane z ranami lub wrzodami, które mogą być skutecznie le-czone kompozycją wytworzoną zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, obejmują oparzenia, wąglika (antrax), tężec, gangrenę gazową, płonicę, zapalenie mieszków włosowych brody, erysipesi-pelas, trądzik bliznowcowy, pęcherzycę zakaźną, liszajec pęcherzowy, itp.

Często terminy "rana" i "wrzód", "rana" i "owrzodzenie" nakładają się i dalej pojęcia te używane są zamiennie. Dlatego, jak wspomniano powyżej, w niniejszym kontekście pojęcie "rana" obejmuje pojęcie "wrzód", "zranienie", "owrzodzenie" i "zawał i pojęcia te są używane zamiennie, chyba że wy-raźnie wskazano.

Rodzaje ran leczonych kompozycją wytworzoną zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują także i) rany ogólne jak np. rany chirurgiczne, rany urazowe, rany zakażone, rany niedo-krwienne, rany termiczne, rany chemiczne i rany pęcherzycowe; ii) rany specyficzne dla jamy ustnej, jak rany poekstrakcyjne, rany endodontyczne, szczególnie w powiązaniu z leceniem cyst oraz ropni, wrzody i uszkodzenia bakteryjne, wirusowe lub na tle autoimmunizacyjnym, mechaniczne, chemiczne, termiczne, infekcyjne i liszajowate; przy czym owrzodzenia opryszczkowe, zapalenia aftowe (ple-śniawkowe), ostre martwiczo-wrzodziejące zapalenie dziąseł i zespół palących ust są przykładami

PL 202 536 B1 4

szczególnymi; i iii) rany skóry jak nowotwory, oparzenia (np. chemiczne, termiczne), uszkodzenia (bakteryjne, wirusowe, na tle autoimmunizacyjnym), pogryzienia i nacięcia chirurgiczne. Innym sposo-bem klasyfikacji ran jest i) mały ubytek tkanki spowodowany nacięciem chirurgicznym, małe otarcia lub małe pogryzienia, lub ii) znaczny ubytek tkanek. Ostatnia grupa obejmuje owrzodzenia niedokrwienne, przetoki, odleżyny, rany szarpane, ciężkie pogryzienia, oparzenia termiczne i rany po pobraniu tkanek do przeszczepu (w tkankach miękkich i twardych) oraz zawały.

Lecznicze działanie aktywnej substancji szkliwa stało się przedmiotem zainteresowania w związku z ranami w obrębie jamy ustnej. Rany takie mogą być wynikiem uszkodzenia ciała lub ob-rażeniami związanymi z chirurgią w obrębie jamy ustnej, w tym chirurgią przyzębia, ekstrakcją zęba (zębów), leczeniem kanałowym, wstawieniem implantów zębowych, zakładaniem i stosowaniem pro-tez zębowych itp. W części doświadczalnej niniejszego zgłoszenia przedstawiono korzystny wpływ aktywnej substancji szkliwa w leczeniu takich ran. Ponadto, stwierdzono efekt gojenia się tkanek miękkich.

Po zastosowaniu aktywnej substancji szkliwa poprawia się również gojenie się ran w obrębie jamy ustnej, takich jak rany aftyczne (pleśniawkowe), urazowe lub opryszczkowe. Rany urazowe i opryszczkowe mogą oczywiście występować w innych, niż jama ustna, częściach ciała.

Innym aspektem wynalazku jest możliwość zapobiegania i/lub leczenia ran aseptycznych, za-wałowych, skórnych, ciętych, niedrążących, otwartych, drążących, ran przebijających na wylot, kłu-tych, septycznych oraz podskórnych.

Inne rany mające znaczenie w związku z zastosowaniem według niniejszego wynalazku są to rany, takie jak: wrzody niedokrwienne, odleżyny, przetoki, ciężkie pogryzienia, oparzenia oraz zranie-nia po pobraniu narządów do przeszczepiania.

Wrzody niedokrwienne oraz odleżyny są ranami zwykle bardzo wolno gojącymi się i zwłaszcza w tych przypadkach poprawa oraz przyspieszenie gojenia się mają szczególne znaczenie dla pacjen-ta. Ponadto, koszty związane z leczeniem pacjentów cierpiących z powodu takich ran ulegają znacz-nemu obniżeniu, gdy gojenie się jest lepsze i przebiega szybciej.

Rany dawców to takie, które pojawiają się w związku z usunięciem, twardych tkanek z jednej części ciała dla celów transplantacji ich w inne miejsce. Rany powstałe w wyniku takich operacji są bardzo bolesne, dlatego najbardziej cenne jest polepszenie ich gojenia się.

Pojęcie "skóra" używane jest w szerokim znaczeniu, obejmującym warstwę naskórka skóry oraz - w tych przypadkach gdzie powierzchnia skóry jest mniej lub bardziej uszkodzona - także warstwę właściwą skóry. Oprócz warstwy rogowej warstwa naskórkowa skóry składa się z warstwy nabłonko-wej (epitelium), a głębiej położona warstwa tkanki łącznej skóry nazywa się skórą właściwą (dermis). Ponieważ skóra jest najbardziej wyeksponowaną częścią ciała, jest szczególnie podatna na wszelkie-go rodzaju uszkodzenia, takie jak przerwania, cięcia, otarcia, oparzenia, odmrożenia oraz uszkodze-nia powstałe w przebiegu różnych schorzeń. Ponadto, duża powierzchnia skóry jest często uszkadza-na w wypadkach. Jednak, z powodu fizjologicznej funkcji skóry oraz jej działania jako bariery nienaru-szalność skóry jest ważna dla dobrego samopoczucia osobnika i każde jej naruszenie lub przerwanie jest zagrożeniem, na które organizm musi zareagować, by chronić swe istnienie.

Oprócz zranień na skórze zranienia mogą być również obecne we wszystkich rodzajach tkanek (tj. tkankach miękkich i tkankach twardych). Zranienia tkanek miękkich, tym zranienia błon śluzowych i/lub skóry, są szczególnie ważne w związku z niniejszym wynalazkiem

Gojenie się ran skóry lub błon śluzowych zachodzi w kilku etapach, które doprowadzają do re-paracji lub regeneracji skóry lub błony śluzowej. W ostatnich latach rozróżniono reparację i regenera-cję jako dwa odrębne rodzaje gojenia. Regenerację można zdefiniować jako proces biologiczny, gdzie struktura oraz funkcja zniszczonej tkanki zostaje całkowicie odnowiona. Reparacja natomiast jest pro-cesem biologicznym, podczas którego przywracana jest ciągłość uszkodzonej tkanki przez inne tkanki, które nie odtwarzają struktury i funkcji tkanki uszkodzonej. Większość ran goi się przez reparację, co oznacza, że nowopowstała tkanka jest pod względem strukturalnym i chemicznym niepodobna do oryginalnej tkanki uszkodzonej (tkanka bliznowata). We wczesnym stadium reparacji tkanki procesem stale występującym jest tworzenie się w miejscu zranienia przejściowej tkanki łącznej. Ten proces rozpoczyna się wytwarzaniem przez fibroblasty nowej pozakomórkowej macierzy kolagenowej. Ta nowa zewnątrzkomórkowa macierz kolagenowa staje się potem podporą dla tkanki łącznej w przebie-gu końcowego etapu gojenia. W większości tkanek to ostateczne wygojenie się rany jest wytworze-niem blizny, zawierającej tkankę łączną. W tkankach, posiadających zdolności regeneracyjne, takich

PL 202 536 B1 5

jak np. skóra i kość, w ostateczne wygajanie się włączona jest regeneracja oryginalnej tkanki. Ta zre-generowana tkanka często posiada cechy tkanki bliznowatej, np. pogrubienie wygojonego złamania kości.

W normalnych warunkach organizm zapewnia mechanizmy gojenia uszkodzonej skóry lub błon śluzowych w celu przywrócenia integralności bariery skórnej lub śluzówki. Proces reparacji nawet małych przerwań lub ran może trwać od kilku godzin do dni a nawet tygodni. Jednak w owrzo-dzeniach proces gojenia się jest bardzo powolny i może trwać miesiące, a nawet lata.

Etapy gojenia zazwyczaj obejmują zapalenie (zwykle 1-3 dni), migrację (zwykle 1-6 dni), prolife-rację (zwykle 3-24 dni) oraz dojrzewanie (zwykle 1-12 miesięcy). Proces gojenia się jest złożonym i dobrze zgranym zespołem procesów fizjologicznych, które obejmują migrację, proliferację i różnico-wanie różnych rodzajów komórek jak również syntezę składników macierzy. Proces gojenia można podzielić na trzy następujące etapy:

i) Hemostaza i zapalenie Gdy płytki krwi znajdą się poza układem krążenia i są wyeksponowane na trombinę i kolagen,

ulegają aktywacji i agregują. Tak więc płytki krwi rozpoczynają proces reparacji przez agregację i two-rzenie tymczasowego skrzepu, zapewniającego hemostazie oraz zapobiegającego wnikaniu bakterii. Aktywowane płytki krwi pobudzają układ krzepnięcia i uwalniają czynniki wzrostu, takie jak płytkopo-chodny czynnik wzrostu (PDGF) i naskórkowe czynniki wzrostu (EGF) i transformujące czynniki wzro-stu (TGF).

Pierwszymi komórkami naciekającymi obszar rany są neutrofile, potem wnikają monocyty, ak-tywowane przez makrofagi.

Główną funkcja neutrofili wydaje się być oczyszczanie rany lub obrona rany przed zanieczysz-czeniem bakteriami oraz poprawa gojenia się rany przez usuwanie martwych komórek oraz płytek krwi. Infiltracja neutrofili ustaje po około 48 godzinach, zakładając, że nie było zanieczyszczenia rany bakteriami. Nadmiar neutrofili jest fagocytowany przez makrofagi tkankowe, wywodzące się z puli krążących we krwi monocytów. Makrofagi uważa się za istotne dla skutecznego gojenia ran także dlatego, że są odpowiedzialne za fagocytozę organizmów patogennych i za usuwanie resztek tkanko-wych. Ponadto uwalniają one liczne czynniki włączone w kolejne wydarzenia procesu gojenia. Makro-fagi przyciągają fibroblasty, które rozpoczynają syntezę kolagenu.

ii) Powstawanie tkanki ziarninowej i odtwarzanie nabłonka W ciągu 48 godzin po zranieniu fibroblasty zaczynają proliferować i migrują do obszaru rany

z tkanki łącznej przy brzegach zranienia. Fibroblasty produkują kolageny oraz glikozaminoglikany i między innymi niskie ciśnienie parcjalne tlenu w ranie pobudza proliferację komórek śródbłonka. Komórki śródbłonka przyczyniają się do tworzenia sieci nowych naczyń włosowatych.

Kolagenazy oraz aktywatory plazminogenu wydzielane są przez keratynocyty. Jeżeli rana po-zostawiona jest w spokoju i dobrze zaopatrzona w tlen i w składniki odżywcze, keratynocyty migrują do rany. Uważa się, że keratynocyty migrują tylko do tkanek żywych i odpowiednio do obszarów poni-żej martwej tkanki i strupa rany.

Obszar rany następnie zmniejsza się przez obkurczanie. iii) Przebudowa skóry właściwej Natychmiast po zakończeniu odtwarzania nabłonka rozpoczyna się przebudowa tkanki. Etap

ten, trwający kilka lat, przywraca moc zranionej tkance. Wszystkie wyżej wymienione procesy gojenia wymagają znacznego czasu. Na szybkość goje-

nia wpływa sterylność rany, ogólny stan zdrowia osobnika, obecność ciał obcych etc. Niektóre stany patologiczne, jak infekcja, maceracja, odwodnienie, ogólny zły stan zdrowia oraz niedożywienie mogą doprowadzić do przewlekłych owrzodzeń, jak np. wrzody niedokrwienne.

Aż do chociażby powierzchniowego wygojenia, rana jest narażona na ryzyko dotychczasowego lub nowego zakażenia. Zatem im szybciej można wygoić ranę, tym prędzej oddala się ryzyko infekcji.

Tak więc każda procedura mająca wpływ na przyspieszenie gojenia lub korzystnie wpływająca na przebieg gojenia się ran jest bardzo wartościowa.

Ponadto, ponieważ wszystkie procesy reparacyjne tkanek obejmują wytwarzanie wczesnej tkanki łącznej, jej stymulacja i procesy następujące po niej uznawane są jako poprawiające gojenie się tkanek.

W niniejszym kontekście termin "gojenie kliniczne" jest używany dla oznaczenia sytuacji, w któ-rej nie udaje się zaobserwować przerwania tkanki, a jedynie obecne są nieznaczne objawy zapalenia, takie jak lekkie zaczerwienienie lub niewielki obrzęk tkanki. Ponadto nie ma skarg na obecność bólu, gdy narząd jest w spoczynku lub nie jest dotykany.

PL 202 536 B1 6

Jak wspomniano powyżej, wynalazek dotyczy zastosowania macierzy szkliwa, pochodnych ma-cierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa jako czynnika gojącego rany, tj. jako czynnika który przy-spiesza, pobudza lub ułatwia gojenie się ran skórnych lub śluzówkowych. Odpowiednio ważnym za-stosowaniem jest także zastosowanie jako czynnika regenerującego tkanki i/lub jako czynnika repara-cyjnego. Ponadto ze względu na wpływ na gojenie ran, macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa dają efekt zmniejszania bólu.

Tradycyjnie najczęściej stosowanymi opatrunkami w zaopatrzeniu ran są: suchy lub mokry-do-suchego. Są one stopniowo zastępowane przez środowiska wilgotne z zastosowaniem opatrunku okluzyjnego. Aby skutecznie zreperować lub zastąpić uszkodzoną część ciała, należy utrzymać w stanie wzajemnej równowagi procesy gojenia się rany, włóknienia oraz inwazji mikrobów. Dostęp-nych jest wiele metod pozwalających odeprzeć infekcję utrudniającą gojenie. Opóźnione gojenie rany lub proces zapalny mogą nasilić zwłóknienie. Ponadto, uprzednio sugerowano, że czynniki wzrostu jak czynnik wzrostu naskórka (EGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (TGF-α), (TGF-β), płytkopo-chodny czynnik wzrostu (PDGF), czynniki wzrostu fibroblastów (FGF) w tym kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów (α-FGF) oraz zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (β-FGF), transformujący czynnik wzrost beta (TGF-β) a także insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF-1 i IGF-2) są dyrygentami procesu gojenia ran i często są wymieniane jako promotory gojenia się ran; jednak faktycznie ułatwiają one zwłóknienie, które może przeszkadzać skutecznemu gojeniu. Choć przyspieszone gojenie zmniejsza ryzyko infekcji oraz będące jej następstwem zapalenie, które może prowadzić do wytworzenia blizny, próby terapeutycznego przyspieszania normalnych procesów gojenia ran były stosunkowo mało sku-teczne. Prawdopodobnie jest to wywołane tym, że proces reparacyjny wymaga zgranego współdziała-nia wielu czynników, wymienionych powyżej.

W tym celu niniejsi twórcy zaobserwowali, że w różnych hodowlach fibroblastów (zarodkowych, skórnych, wyprowadzonych z więzadła okołozębowego, ryb lub ptaków) produkowanych jest dwukrot-nie więcej TGFβ1 w hodowlach pobudzanych preparatem EMDOGAIN® w porównaniu do hodowli nie stymulowanych (pomiar testem ELISA w próbce pożywki hodowlanej (patrz przykład 1 poniżej). Ten wzrost obserwuje się po 24 godzinach hodowli, lecz jest bardziej wyraźny w następnych dniach (dzień 2 i 3). Po drugim dniu w hodowlach stymulowanych EMDOGAIN® obserwuje się także zwięk-szenie proliferacji komórek. Podobny, lecz mniej nasilony wzrost produkcji TGFβ1 obserwowano w ludzkich komórkach nabłonkowych. Ponieważ TGFβ1 wydaje się odgrywać istotną rolę w epitelizacji powierzchni ran, obserwacje te podbudowują koncepcję niniejszego wynalazku.

Stosowanie opatrunków w jamie ustnej jest powszechną praktyką. Opatrunki takie są klasycz-ne, n.p. Surgipads przy zatrzymywaniu krwawienia i opatrunek okołozębowy Coe-Pack (Coe Labora-tories, the GC Group, Chicago, USA), stosowany na otwarte rany. Gazę nasączoną roztworem anty-biotyku i wymagającą usunięcia po kilku dniach, gdy rozpoczyna się gojenie, umieszcza się w zębodo-łach po ekstrakcji zębów. Płukanie antyseptykami, jak chlorheksydyna, jest powszechnie stosowaną praktyką po chirurgii w obrębie jamy ustnej. Niekiedy stosuje się antybiotyki podawane ogólnoustrojo-wo lub podawane miejscowo.

W zasadzie w związku z leczeniem ran muszą być rozważane szczególne środki ostrożności, takie jak np. problem sterylności, problem zanieczyszczeń, właściwe zastosowanie banda-ży/opatrunków itp, które zwykle wymagają, aby leczenie/podawanie było przeprowadzone przez od-powiednio przygotowany personel pielęgniarski itp. Zatem leczenie ran często staje się bardzo kosz-townym działaniem, gdy czynnik gojący rany musi być stosowany kilka razy dziennie. Pożądana re-dukcja kosztów leczenia ran może być uzyskana jeżeli zmniejszy się częstotliwość podawania środka, albo jeżeli proces gojenia się rany zostanie skrócony.

Obecni twórcy stwierdzili teraz, że macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka ma-cierzy szkliwa mają właściwość gojenia ran. Ponadto są wskazania, że takie stosowanie macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa doprowadza do poprawy gojenia się ran. W szczególności twórcy stwierdzili, że po zastosowaniu białek macierzy szkliwa i/albo po-chodnych macierzy szkliwa skraca się etap reakcji zapalnej i typowe jego objawy jak ciepłota, zaczer-wienienie, obrzęk oraz ból są mniej nasilone, a nowe tkanki wytwarzane są znacznie prędzej. Obser-wowany czas gojenia się rany (np. po zabiegu chirurgicznym) jest znacznie skrócony, w stosunku do chirurgii bez zastosowania macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa.

Aktywność terapeutyczna i/lub profilaktyczna macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa może być oczywiście udowodniona w testach in vivo na ludziach lub na

PL 202 536 B1 7

zwierzętach doświadczalnych (patrz sekcja doświadczalna niniejszego opracowania). Jednak wska-zówki skuteczności i/lub aktywności macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek ma-cierzy szkliwa można otrzymać przez przeprowadzenie stosunkowo prostych testów in vitro, takich jak np. testy z zastosowaniem hodowli komórkowych.

Ponadto istnieje szereg parametrów, które mogą być zastosowane w celu oceny efektu gojenia ran. Są to:

- Planimetria komputerowa (ocena szybkości gojenia rany otwartej) - Obrazowanie dopplerowskie laserem (ocena perfuzji rany) - Tensiometria (ocena wytrzymałości rany) - Histopatologia/cytologia (ocena mikroskopowa tkanek rany oraz płynów tkankowych, - Biochemia (HPLCRIA) (ocena różnych leków i biochemicznych składników gojenia tkanek) - Elektrodiagnostyka (ocena związku gojenia się rany z unerwieniem) - Scyntygrafia (obrazowanie tkanek rany przy pomocy izotopów promieniotwórczych). W leczeniu ran/owrzodzeń szczególne znaczenie ma usunięcie resztek martwiczych tkanek

oraz oczyszczenie rany. Zakłada się, że oczyszczanie i usuwanie martwiczych tkanek jest warunkiem wstępnym procesu gojenia i dalej, gdy stosowane są czynniki gojenia ran, czynniki takie wywierają działanie na świeżą oraz żywą tkankę, a nie na tkanki martwe lub zanieczyszczone. Usuwanie nekro-tycznych resztek można przeprowadzić za pomocą co najmniej czterech różnych metod: i) ostrej (skalpelem), ii) mechanicznego usunięcia, iii) enzymatycznego usunięcia iiii) autolitycznego usunięcia.

Gdy rana poddana zostaje procedurze usunięcia resztek, macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mogą być zastosowane albo bezpośrednio na ranę albo do rany, albo też mogą być zaaplikowane w dogodnej postaci składników farmaceutycznych, jak np. suchego lub wilgotnego czystego opatrunku, do którego wprowadzono macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mogą być oczywiście stosowane w połączeniu z czyszczeniem ran.

Jak zostanie przedstawione dalej, macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka ma-cierzy szkliwa mogą być stosowane jako takie, lub też w postaci odpowiednich preparatów lub kompo-zycji farmaceutycznych.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa oraz białka macierzy Macierz szkliwa jest prekursorem szkliwa i może być pozyskana z każdego, odpowiedniego na-

turalnego źródła, tj. od ssaków, u których rozwijają się zęby. Odpowiednim źródłem są rozwijające się zęby zwierząt rzeźnych, takich jak np. cielęta, świnie, jagnięta. Innym źródłem jest na przykład skóra ryb.

Macierz szkliwa może być sporządzona z rozwijających się zębów, jak opisano uprzednio (EP-B-0 337 967 i EP-B-0 263 086). Macierz szkliwa zdrapuje się i sporządza się pochodne macierzy szkliwa, np. przez ekstrakcję wodnymi roztworami, takimi jak bufor, rozcieńczony kwas lub zasada lub mieszaniną woda/rozpuszczalnik, następnie filtruje, pozbywając się większych elementów, odsala lub stosuje inne etapy oczyszczania, ewentualnie kończąc liofilizacją. Enzymy można unieczynniać za pomocą ogrzewania lub stosując rozpuszczalniki, w tym przypadku pochodne można przechowywać w stanie ciekłym, bez liofilizacji.

W niniejszym kontekście pochodne macierzy szkliwa są pochodnymi, zawierającymi jedno lub kilka białek macierzy szkliwa lub część tych białek, produkowanych naturalnie przez alternatywne składanie lub obróbkę, lub na drodze enzymatycznego lub chemicznego cięcia naturalnej długości białka, lub uzyskanych na drodze syntezy polipeptydów in vitro lub in vivo (metody rekombinowanego DNA lub hodowla komórek diploidalnych). Pochodne białek macierzy szkliwa obejmują również poli-peptydy lub białka związane z macierzą szkliwa. Polipeptydy lub białka mogą być związane z biode-gradowalną cząsteczką nośnikową taką jak poliaminokwasy lub polisacharydy lub ich kombinacje. Ponadto termin „pochodne macierzy szkliwa" obejmuje także analogiczne substancje syntetyczne.

Białka są biologicznymi makrocząsteczkami zbudowanymi z reszt aminokwasów, połączonych wiązaniami peptydowymi. Białka, jako łańcuchowe polimery aminokwasów, zwane są także polipepty-dami. Zwykle białka składają się z 50-800 reszt aminokwasowych i w związku z tym ich ciężar czą-steczkowy jest w zakresie od około 6000 do około kilkuset tysięcy, lub więcej, Daltonów. Małe białka zwie się peptydami lub oligopeptydami.

Białka macierzy szkliwa są normalnie obecne w macierzy szkliwa, tj. prekursorze szkliwa (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-291), lub są białkami, które można otrzymać na drodze rozcięcia tych białek. Ogólnie biorąc ciężar cząsteczkowy

PL 202 536 B1 8

tych białek wynosi poniżej 120 000 Daltonów i w ich skład wchodzą amelogeniny, nie-amelogeniny, bogate w prolinę nie-amelogeniny, ameliny (ameloblastyna, sheatlina) oraz tufteliny.

Przykładami białek, których zastosowanie jest przedmiotem wynalazku są amelogeniny, bogate w prolinę białka inne niż amelogeniny, tuftelina, białka tuft, białka surowicy, białka śliny, amelina, ame-loblastyna, szeatlina, ich pochodne oraz ich mieszaniny. Preparaty, zawierające aktywną substancję szkliwa zastosowane według wynalazku, mogą także zawierać co najmniej dwie z wymienionych sub-stancji białkowych. Handlowy produkt, zawierający amelogeniny oraz prawdopodobnie inne białka macierzy szkliwa występuje na rynku pod nazwą EMDOGAIN® (Biora AB).

Na ogół główne białka macierzy szkliwa znane są jako amelogeniny. Stanowią one około 90% wagowych białek macierzy. Pozostałe 10% wagowych stanowią bogate w prolinę białka inne niż ame-logeniny, tuftelina, białka tuft, białka surowicy oraz co najmniej jedno białko śliny; mogą jednak wystę-pować inne białka, związane z macierzą szkliwa, takie jak np. amelina (ameloblastyna, sheatlina). Ponadto mogą być syntetyzowane i/lub obrabiane białka różnej wielkości (tj. różniące się ciężarem cząsteczkowym). I tak dominujące białka macierzy szkliwa - amelogeniny - występują jako cząsteczki o różnym ciężarze, tworząc razem wielkocząsteczkowe agregaty. Są to wyraźnie hydrofobowe sub-stancje, tworzące w warunkach fizjologicznych agregaty. Mogą przenosić, lub być nośnikami dla in-nych białek lub peptydów.

W zastosowaniu według wynalazku brane są pod uwagę także inne substancje białkowe. Przy-kładem mogą być takie białka jak białka bogate w prolinę oraz poliprolina. Innymi przykładami sub-stancji, rozpatrywanych jako odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem są agregaty takich białek, agregaty pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa, jak również metabolity macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa oraz białek macierzy szkliwa. Metabolity mogą być różnej wielkości - od wielkości białek do krótkich peptydów.

Jak wyżej wspomniano, białka, polipeptydy lub peptydy do zastosowania według wynalazku zwykle mają ciężar cząsteczkowy najwyżej około 120 kDa (120x103 u), jak np. najwyżej 100 kDa (100x103 u), 90 kDa (90x103 u), 80 kDa (80x 103 u), 70 kDa (70x103 u) lub 60 kDa (60x 103 u), ozna-czony metodą elektroforetyczną SDS Page.

Białka do zastosowania według wynalazku normalnie są w postaci preparatów, przy czym za-wartość białka w aktywnej substancji szkliwa w preparatach jest w zakresie od około 0,05% wag. do 100% wag., jak np. około 5-99% wag., około 10-95% wag., około 15-90% wag., około 20-90% wag., około 30-90% wag., około 40-85% wag., około 50-80% wag., około 60-70% wag., około 70-90% wag., lub około 80-90% wag.

Preparat aktywnej substancji szkliwa do zastosowania według wynalazku może również zawie-rać mieszaninę aktywnych substancji szkliwa o różnym ciężarze cząsteczkowym.

Białka macierzy szkliwa można podzielić na mające wysoki ciężar cząsteczkowy oraz niski cię-żar cząsteczkowy, i stwierdzono, że dokładnie scharakteryzowana frakcja białek macierzy szkliwa ma cenne właściwości w leczeniu ubytków okołozębowych (np. rany okołozębowe). Frakcja ta zawiera białka dające się ekstrahować kwasem octowym, ogólnie określane jako amelogeniny, i stanowi część macierzy szkliwa o niskim ciężarze cząsteczkowym (według EP-B-0 337 967 i EP-B-0 263 086).

Jak omówiono powyżej, część macierzy szkliwa o niskim ciężarze cząsteczkowym wykazuje odpowiednią aktywność wywoływania w ubytkach okołozębowych połączeń pomiędzy twardymi tkan-kami. Jednak w niniejszym kontekście, aktywne białka nie są ograniczone do frakcji macierzy szkliwa o niskim ciężarze cząsteczkowym. Obecnie korzystne białka obejmują białka macierzy szkliwa takie jak amelogenina, amelina, tuftelina itp. o ciężarach cząsteczkowych (określanych in vitro metodą SDS-PAGE) poniżej 60000 Daltonów, lecz białka mające ciężar cząsteczkowy powyżej 60000 Dalto-nów mają także obiecujące własności jako kandydaci do gojenia ran, czynniki antybakteryjne i/lub czynniki przeciwzapalne.

Wobec powyższego uważa się, że aktywna substancja szkliwa do zastosowania zgodnie z wy-nalazkiem ma ciężar cząsteczkowy do około 40000, taki jak np. ciężar cząsteczkowy w zakresie od około 5000 do około 25000.

Niniejszym przedstawiono również zastosowanie peptydów jak opisane w WO 97/02730, tj. peptydów mających co najmniej jeden element sekwencji wybrany z grupy złożonej z tetrapeptydów DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) oraz DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) i które dalej obejmują sekwencję aminokwasową, w której łańcuch 20 aminokwasów jest identyczny w co najmniej 80% z łańcuchem aminokwasów mających tę samą długość wybranych

PL 202 536 B1 9

z aminokwasów sekwencji przedstawionej w SEK ID Nr: 1 oraz z sekwencji składającej się z amino-kwasów 1 do 103 według SEK ID Nr: 1 oraz aminokwasów 6 do 324 wg SEK ID Nr: 2.

Przez pojęcie „identyczność sekwencji" rozumie się identyczność kolejności aminokwasów pa-sujących pod względem tożsamości i pozycji aminokwasów w peptydach. Przerwa jest uważana jako brak identyczności dla odpowiednio jednego lub więcej aminokwasów.

Takie peptydy mogą składać się z 6 do 300 aminokwasów, np. przynajmniej 20 aminokwasów, przynajmniej 30 aminokwasów, przynajmniej 90 aminokwasów, przynajmniej 120 aminokwasów, przy-najmniej 150 aminokwasów lub przynajmniej 200 aminokwasów.

Sposób izolacji białek macierzy szkliwa obejmuje ekstrakcję białek oraz usunięcie jonów wapnia i fosforu z rozpuszczonych hydroksyapatytów przy zastosowaniu odpowiednich metod, np. filtracji żelowej, dializy albo ultrafiltracji (patrz np. Janson, J-C & Ryden, L. (Eds.) Protein purification, VCH Publishers 1989 i Harris, ELV & Angal, S., Protein purification methods - A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).

Typowy preparat liofilizowanego białka może zawierać głównie lub wyłącznie do 70-90% ame-logenin o ciężarze cząsteczkowym pomiędzy 40000 a 5000 Daltonów, pozostałe 10-30% stanowią mniejsze peptydy, sole oraz resztki wody. Główne prążki białka są na poziomie 20 x kDa, 12-14 kDa oraz około 5 kDa.

Rozdzielając białka, np. metodą precypitacji, chromatografii jonowymiennej, chromatografii z odwróconymi fazami lub chromatografii powinowactwa można oczyścić amelogeniny o różnych cię-żarach cząsteczkowych.

Kombinacja amelogenin o różnych ciężarach cząsteczkowych może ulegać zmianom, od domi-nującego związek o ciężarze 20 kDa aż po agregaty amelogenin o różnych ciężarach cząsteczkowych pomiędzy 40 a 5 kDa i do dominującego związku o ciężarze 5 kDa. Inne białka macierzy szkliwa, takie jak amelina, tuftelina lub enzymy proteolityczne, normalnie występujące w macierzy szkliwa mogą być dodane i osadzone na agregatach amelogeniny.

Alternatywnym źródłem pochodnych macierzy szkliwa lub białek może być ich synteza dobrze znana w technice lub wykorzystanie komórek hodowanych in vitro lub bakterii modyfikowanych meto-dami rekombinacji DNA (patrz np. Sambrook, J. et al.: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Labora-tory Press, 1989).

Właściwości fizykochemiczne macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa

Na ogół macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa oraz białka macierzy szkliwa są substan-cjami hydrofobowymi, tj. gorzej rozpuszczalnymi w wodzie, szczególnie w podwyższonej temperaturze. W zasadzie białka te rozpuszczają się przy nie fizjologicznych wartościach pH i w niższej temperaturze, takiej jak około 4-20° C, natomiast ulegają agregacji i precypitacji w temperaturze ciała (35-37°C) i w obojętnym pH.

Macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa do zastosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują również aktywną substancję szkliwa, przy czym co najmniej część aktywnej substancji występuje w postaci agregatów lub jest zdolna do tworzenia agregatów po zasto-sowaniu in vivo. Korzystnie wielkość cząstek agregatów jest w zakresie od około 20 nm do około 1 μm.

Uważa się, że rozpuszczalność macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa ma ważne znaczenie dla aktywności terapeutycznej i profilaktycznej substancji. Gdy kompozycja zawierająca macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa (dalej określane jako „aktywna substancja szkliwa" jako pojęcie ogólne) zostanie podana np. człowie-kowi, białkopodobne substancje ulegną precypitacji w warunkach normalnego, fizjologicznego pH. Zatem w miejscu nałożenia wytwarza się warstwa macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa i warstwa ta (która może być również warstwą molekularną w przypad-kach powstawania agregatów) trudno wypłukuje się w warunkach fizjologicznych. Ponadto dzięki wła-snościom bioadhezyjnym substancji (patrz niżej) warstwa precypitująca jest mocno związana z tkanką, także na brzegu pomiędzy precypitującą warstwą a tkanką. Zatem białkopodobna warstwa pokrywa tkankę, na którą nałożono macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa, a aktywne substancje szkliwa utrzymywane są in situ przez dłuższy czas, tj. nie ma potrzeby podawa-nia aktywnych substancji szkliwa zbyt często. Ponadto warstwę utworzoną in situ można porównać z opatrunkiem okluzyjnym, tj. wytworzona warstwa chroni tkankę, na której została wytworzona, przed otoczeniem. W przypadku zranionej tkanki, tkanki zakażonej lub tkanki zapalnej taka warstwa chroni tkankę przed dalszym zakażeniem przez mikroorganizmy obecne w otoczeniu. Ponadto warstwa biał-

PL 202 536 B1 10

kowa może wywierać działanie przez bezpośredni kontakt z tkanką lub z mikroorganizmami obecnymi w/na/w pobliżu tkanek.

W celu umożliwienia utworzenia się in situ białko-podobnej warstwy po zastosowaniu korzystne może być włączenie do kompozycji farmaceutycznej lub kosmetycznej macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa odpowiedniej substancji buforującej, której celem bę-dzie uniknięcie rozpuszczenia aktywnej substancji szkliwa w miejscu aplikacji.

Stwierdzono, że macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mają własności bioadhezyjne, tj. mają zdolność przylegania do powierzchni skóry lub powierzchni błon ślu-zowych. Te właściwości są najcenniejsze dla postępowania terapeutycznego i/lub zapobiegawczego co najmniej z następujących powodów:

- substancje aktywne mogą być zapobiegawczo i/lub terapeutycznie utrzymywane przez dłuż-szy czas w miejscu przyłożenia (tj. i) można ograniczyć częstotliwość podawania, ii) można uzyskać efekt kontrolowanego uwalniania substancji aktywnej i/lub iii) usprawnione jest miejscowe leczenie w miejscu przyłożenia);

- substancje mogą same służyć jako nośniki dla innych profilaktycznie lub terapeutycznie ak-tywnych substancji, ponieważ nośnik zawierający macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa można uformować jako bioadhezyjne nośniki (tj. nowy system dostarczania leków bioadhezyjnych, oparty na bioadhezyjnych własnościach macierzy szkliwa, pochodnych macie-rzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa).

Teorie w odniesieniu do mechanizmu działania Macierz szkliwa stanowi przykład zewnątrzkomórkowej macierzy białkowej, która przylega do

powierzchni minerałów jak też do powierzchni białkowych. W fizjologicznej temperaturze i w fizjolo-gicznym pH białka tworzą nierozpuszczalne wielkocząsteczkowe agregaty (Fincham et al. w J Struct. Biol. 1994 March-April; 112 (2): 103-109 oraz w J. Struct. Biol. 1995 July-August; 115 (1): 50-59), któ-re są stopniowo degradowane przez enzymy proteolityczne (występujące zarówno in vivo, jak i in vitro, pod warunkiem że proteazy nie były poddane procesowi inaktywacji).

Ostatnia obserwacja, że macierz szkliwa tworzy się i przejściowo jest obecna podczas formo-wania się korzenia i cementu korzeniowego, może wyjaśnić, jak stosowanie macierzy szkliwa, po-chodnych macierzy szkliwa i/lub białek macierzy szkliwa ułatwia regenerację tkanki okołozębowej. Jednakże nieoczekiwana jest obserwacja leżąca u podstaw niniejszego wynalazku, że macierz szkli-wa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mają również dodatnie działanie na go-jenie się tkanek miękkich takich jak rany.

Według obecnego wynalazku macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa mogą być stosowane w celach leczniczych, jak i zapobiegawczych. Ponadto, macierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa, i/lub białka macierzy szkliwa mogą być stosowane razem z innymi sub-stancjami aktywnymi leków, takimi jak np. przeciwbakteryjne, przeciwzapalne, przeciwwirusowe, prze-ciwgrzybicze, lub też w kombinacji z czynnikami wzrostu, takimi jak np. TGFβ, PDGF, IGF, FGF, czynnik wzrostu keratynocytów lub ich peptydowe analogi (przyjmuje się, że EGF ułatwia gojenie przez zwiększanie migracji i podział komórek nabłonkowych; ponadto EGF zwiększa w ranie liczbę fibroblastów, powodując zwiększoną syntezę kolagenu). W kombinacji z macierzą szkliwa, pochodny-mi macierzy szkliwa, i/lub białka macierzy szkliwa mogą również być użyte enzymy albo nieodłącznie obecne w macierzy szkliwa lub ich preparaty albo dodane, w kombinacji z macierzą szkliwa, pochod-nymi macierzy szkliwa, i/lub białka macierzy szkliwa.

Preparat aktywnej substancji szkliwa jest zwykle formułowany jako kompozycja farmaceutyczna lub kosmetyczna. Taka kompozycja według zastosowania zgodnie z wynalazkiem zawiera preparat białkopodobny lub może jeszcze zawierać substancję pomocniczą. Szczególnie korzystnymi substan-cjami pomocniczymi do farmaceutycznych kompozycji wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem we-dług wynalazku są alginian glikolu propylenowego, albo kwas hialuronowy albo jego sole lub pochodne.

Kompozycje farmaceutyczne i/lub kosmetyczne Poniżej podano przykłady odpowiednich kompozycji, zawierających aktywną(e) substancję(e)

szkliwa. W zależności od użycia aktywnej substancji szkliwa, kompozycja może być kompozycją far-maceutyczną lub kosmetyczną. W dalszej części tekstu termin „kompozycja farmaceutyczna" obejmu-je także kompozycję kosmetyczną, jak też kompozycje należące do tak zwanej szarej strefy pomiędzy farmaceutykami a kosmetykami, mianowicie kosmeceutyki.

W celu podawania osobnikom (ludziom lub zwierzętom) macierzy szkliwa, pochodnych macie-rzy szkliwa, i/lub białek macierzy szkliwa (dalej również oznaczanej jako „aktywna substancja szkliwa")

PL 202 536 B1 11

i/lub ich preparatów korzystnie przeprowadza się je w postać kompozycji farmaceutycznej zawierają-cej aktywną substancję szkliwa i, ewentualnie jedną lub kilka farmaceutycznie dopuszczalnych sub-stancji pomocniczych.

Kompozycje mogą występować w postaci np. stałej, półstałej lub ciekłej, takiej jak np., bioab-sorbowalne plasterki, przymoczki, opatrunki, opatrunki żelowe, opatrunki hydrokoloidalne, błony, pian-ki, płatki, bandaże, plastry, kompozycje z aplikatorem, wszczepy; pudry, granulki, kapsułki, perełki z agarozy chitozanu,, tabletki, pigułki, peletki, mikrokapsułki, mikrokuleczki, nanocząstki; spray'e, ae-rozole, przyrządy inhalacyjne; żele, hydrożele, pasty, maści, kremy, mydła, czopki, gałki dopochwowe, pasty do zębów; roztwory, dyspersje, zawiesiny, emulsje, mieszaniny, lotiony, płyny do płukania ust, szampony, lewatywy; zestawy składające się np. z dwóch oddzielnych pojemników, gdzie pierwszy pojemnik zawiera aktywną substancję szkliwa ewentualnie zmieszaną z inną substancją aktywną leczniczo /lub dopuszczalną farmaceutycznie substancją pomocniczą, a drugi pojemnik zawiera od-powiednie podłoże, które ma być dodane do pierwszego pojemnika przed zastosowaniem, celem otrzymania gotowej do użycia kompozycji; oraz w innych stosownych postaciach, jak np. wszczepy lub pokrycia wszczepów, lub w stosownej postaci do użycia w implantacji lub transplantacji.

Kompozycja wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczona do stosowania na skórę lub na błony śluzowe. Zatem kompozycję zawierającą aktywną substancję szkli-wa do podawania można zaadaptować do podawania dowolną, właściwą drogą, np. lokalnie (skórna), doustnie, dopoliczkowo, donosowo, na małżowinę uszną, doodbytniczo lub dopochwowo, albo poda-jąc do jam ciała, takich jak np. korzeń zęba lub kanał korzenia zęba. Ponadto, kompozycja może być zaadaptowana do podawania w połączeniu z zabiegiem chirurgicznym, np. w związku z nacięciem ciała w celu usprawnienia gojenia się ran wewnętrznych oraz uszkodzeń tkanek miękkich.

Jak wspomniano wyżej, kompozycja aktywnej substancji szkliwa może być przydatna do stoso-wania podczas zabiegu chirurgicznego, np. do stosowania miejscowego (np. w obrębie jamy ustnej) w postaci żelu, błony lub suchej peletki, lub jako roztwór do płukania lub leczenia przez nanoszenie pasty lub kremu na tkankę lub powierzchnię celem zapobieżenia inwazji bakteryjnej. W połączeniu z chirurgią lub wszczepianiem w okolicy kanału korzenia zęba, można stosować pastę do zaklejenia jamy.

Kompozycje można sporządzić zgodnie z ogólnie przyjętymi zasadami farmaceutycznymi, patrz np. „Remington' s Pharmaceutical Sciences" i „Encyclopedia of Pharmaceutical Technology" wydana przez Swarbrick, J.& J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.

Jak wyżej wspomniano, kompozycja zawierająca aktywną substancję szkliwa jest przeznaczona do nanoszenia na skórę i błony śluzowe. Oczywiście odpowiednie mogą być też inne zastosowania, takie jak np. na protezy zębowe, mostki, wszczepy, i stosowanie w obrębie jam ciała, takich jak jama ustna, jama nosowa, jama pochwy. Korzystnie błoną śluzową jest błona jamy ustnej, policzków, nosa, uszu oraz pochwy.

Ponadto bardzo duże znaczenie ma stosowanie w okolice zębowe i okołozębowe. Ważnymi przykładami są zastosowania do kieszonek okołozębowych (zębowych), na dziąsła, lub na rany dzią-seł lub na inne rany w obrębie jamy ustnej, albo w związku z chirurgią w obrębie jamy ustnej.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające aktywną substancję szkliwa służą jako system do-starczania leków. W niniejszym tekście pojęcie „system dostarczania leku" oznacza kompozycję far-maceutyczną (formulację farmaceutyczną lub postać dawkowania), która po podaniu prezentuje orga-nizmowi ludzkiemu lub zwierzęcemu aktywną substancję. Tak więc termin „system dostarczania leku" obejmuje czyste kompozycje farmaceutyczne, takie jak np. kremy, maści, płyny, pudry, tabletki itp. jak również bardziej złożone formulację jak spray'e, plastry, bandaże, opatrunki, kompozycje w aplikato-rze, etc.

Oprócz aktywnej substancji szkliwa, kompozycje farmaceutyczne wytwarzane zgodnie z zasto-sowaniem według wynalazku mogą zawierać dopuszczalne farmaceutycznie i kosmetycznie substan-cje pomocnicze.

Dopuszczalna farmaceutycznie lub kosmetycznie substancja pomocnicza jest substancją nie-szkodliwą dla osobnika, któremu się ją podaje. Taka substancja pomocnicza spełnia zwykle wymaga-nia narodowych władz zdrowia. Urzędowe farmakopeje, takie jak np. the British Pharmacopoeia, the United States of America Pharmacopoeia oraz The European Pharmacopoeia przedstawiają standar-dy farmaceutycznie dopuszczalnych substancji pomocniczych.

To czy farmaceutycznie dopuszczalna substancja pomocnicza jest odpowiednia do zastosowa-nia w kompozycji farmaceutycznej na ogół zależy od doboru postaci dawkowania do konkretnej rany.

PL 202 536 B1 12

Poniżej podane zostaną przykłady właściwie dobranych farmaceutycznie dopuszczalnych substancji pomocniczych do zastosowania w różnych rodzajach kompozycji.

Poniżej podano przegląd odpowiednich kompozycji farmaceutycznych wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku. Przegląd opiera się na konkretnych drogach podania. Korzystnie jednak w przypadkach, gdy farmaceutycznie dopuszczalna substancja pomocnicza może być użyta w różnych postaciach dawkowania lub w różnych kompozycjach, zastosowanie określonej dopusz-czalnej farmaceutycznie substancji pomocniczej nie jest ograniczone do określonej postaci dawkowa-nia lub do określonej funkcji.

Wyboru dopuszczalnej (ch) o farmakologicznie substancji pomocniczej (ch) w kompozycji wy-tworzonej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku oraz jej (ich) optymalnego stężenia nie można na ogół przewidzieć i musi być określony na podstawie eksperymentalnej oceny końcowego składu. Jednak specjalista w dziedzinie może znaleźć wskazówki m.in. w „Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Kompozycje do stosowania miejscowego Do stosowania na błony śluzowe lub na skórę, kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowa-

niem według wynalazku może zawierać typowe, farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki i substancje pomocnicze, w tym mikrokuleczki i liposomy.

Kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują wszelkie ro-dzaje stałych, półstałych oraz płynnych składników. Kompozycjami szczególnie istotnymi są np. pasty, maści, maści hydrofilowe, kremy, żele, hydrożele, roztwory, emulsje, zawiesiny, lotiony, mazidła, szampony, galaretki, mydła, pałeczki, spray'e, pudry, błony, pianki, tampony, gąbki np. gąbki kolage-nowe), duże opatrunki (takie jak np. opatrunek absorpcyjny), dreny, bandaże, plastry oraz systemy dostarczania przezskórnego.

Farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze mogą obejmować rozpuszczalniki, czynniki buforujące, konserwanty, środki nawilżające, środki chelatujące, antyoksydanty, stabilizatory, czynniki emulgujące, środki zawieszające, czynniki tworzące żel, podłoża do maści, środki zwiększa-jące penetrację, substancje zapachowe oraz środki ochraniające skórę.

Przykładami rozpuszczalników są np. woda, alkohole, oleje roślinne lub od zwierząt morskich (np. oleje jadalne jak olej migdałowy, olej rycynowy, masło kakaowe, olej kokosowy, olej kukurydziany, olej z nasion bawełny, olej lniany, olej oliwkowy, olej palmowy, olej z orzeszków ziemnych, olej mako-wy, olej sezamowy, olej sojowy, olej słonecznikowy oraz olej z nasion herbaty), oleje mineralne, płyn-na parafina, glikole polietylenowe, glikole propylenowe, glicerol, płynne polialkilosiloksany, oraz ich mieszaniny.

Przykładami czynników buforujących są np. kwas cytrynowy, kwas octowy, kwas winowy, kwas mlekowy, kwas wodorofosforowy, dietyloamina, etc.

Przykładami środków konserwujących odpowiednich do stosowania w kompozycjach są para-beny, takie jak para-hydroksybenzoesan metylu, etylu, propylu, butyloparaben, izobutyloparaben, izopropyloparaben, sorbinian potasu, kwas sorbowy, kwas benzoesowy, benzoesan metylu, fenoksy-etanol, bronopol, bronidoks, hydantoina MDM, butylokarbaminian jodopropynylu, EDTA, chlorek ben-zalkonium i alkohol benzylowy, lub mieszaniny środków konserwujących.

Przykładami środków nawilżających są gliceryna, glikol propylenowy, sorbitol, kwas mlekowy, mocznik, oraz ich mieszaniny

Przykładami substancji chelatujących są sól sodowa EDTA oraz kwas cytrynowy. Przykładami antyoksydantów są butylowany hydroksyanizol (BHA), kwas askorbinowy i jego

pochodne, tokoferol i jego pochodne, cysteina, oraz ich mieszaniny. Przykładami czynników emulgujących są występujące naturalnie żywice, np. guma arabska lub

guma tragakantowa; występujące naturalnie fosfatydy, np. lecytyna sojowa; pochodne monooleinianu sorbitanu; tłuszcze z wełny; alkohole z wełny; estry sorbitanu; monoglicerydy; alkohole tłuszczowe; estry kwasów tłuszczowych (np. triglicerydy kwasów tłuszczowych); oraz ich mieszaniny

Przykładami środków zawieszających są np. celuloza oraz pochodne celulozy, takie jak np. karboksymetyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylomety-loceluloza, karagenina, guma arabska, tragakanta, oraz ich mieszaniny.

Przykładami podłoży do żelu, czynników zwiększających lepkość lub składników zdolnych do usuwania wysięku z ran są: płynna parafina, polietylen, oleje tłuszczowe, koloidalna krzemionka lub glin, mydła cynkowe, glicerol, glikol propylenowy, tragakanta, polimery karboksywinylowe, krzemiany magnezowo-glinowe, Carbopol, polimery hydrofilne takie jak np. skrobia lub pochodne celulozy, takie

PL 202 536 B1 13

jak karboksymetyloceluloza, hydroksyetyloceluloza i inne pochodne celulozy, hydrokoloidy pęcznieją-ce w wodzie, karageniny, hialuroniany (np. żel hialuronowy ewentualnie zawierający chlorek sodu) oraz alginiany, w tym alginian glikolu propylenowego.

Przykładami podłoży do sporządzania maści są np. wosk pszczeli, parafina, cetanol, palmity-nian cetylu, oleje roślinne, estry sorbitanu i kwasów tłuszczowych (Span), glikole polietylenowe oraz produkty kondensacji między sorbitanowymi estrami kwasów tłuszczowych i tlenkiem etylenu, np. polioksyetylenowany monooleinian sorbitanu (Tween).

Przykładami hydrofobowych lub emulgujących w wodzie podłoży do sporządzania maści są pa-rafiny, oleje roślinne, tłuszcze zwierzęce, syntetyczne glicerydy, woski, lanolina oraz ciekłe polialkilosi-loksany.

Przykładami podłoży do sporządzania maści hydrofilowych są stałe makrogole (glikole poliety-lenowe).

Innymi przykładami podłoży do sporządzania maści są mydła trietanoloaminowe, sulfonowane alkohole tłuszczowe i polisorbaty.

Przykładami składników sproszkowanych są: alginian, kolagen, laktoza, proszek zdolny do utworzenia po nałożeniu na ranę żelu (absorbuje płyn/wysięk z rany). Zwykle proszki, przeznaczone do stosowania na duże, otwarte rany, muszą być sterylne, a cząstki muszą być rozdrobnione do wiel-kości mikrometrów.

Przykładami innych substancji pomocniczych są polimery, takie jak karmeloza, karmeloza so-dowa, hydroksypropylometyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, pektyna, guma ksantanowa, karob, guma arabska, żelatyna, carbomer, emulgatory takie jak witamina E, ste-arynian glicerolu, glukozyd cetanylu, kolagen, karagenina, hialuroniany i alginiany i chitozany.

Opatrunki i/lub bandaże również są ważnymi systemami dostarczania aktywnej substancji szkliwa. Gdy opatrunek stanowić ma postać dawkowania, aktywna substancja szkliwa może być zmieszana z innym materiałem/składnikami zanim, albo podczas procesu produkowania opatrunku, lub aktywną substancję szkliwa można w jakiś sposób nanieść na opatrunek, np. przez zanurzenie opatrunku w roztworze lub dyspersji aktywnej substancji szkliwa lub przez rozpylenie roztworu lub dyspersję aktywnej substancji szkliwa na opatrunek. Ewentualnie aktywna substancja szkliwa może być nanoszona w postaci proszku na opatrunek. Opatrunki mogą mieć formę opatrunku absorbcyjne-go w ranach wysiękowych. Opatrunki mogą mieć także postać opatrunków hydrożelowych (np. usie-ciowane polimery takie, jak np. Intrasite®, które zawierają karboksymetylocelulozę, glikol propylenowy albo polisacharydy, disacharydy i białka) lub formie opatrunków okluzyjnych, takich jak np. alginiany, chitozan, hydrofilowe błony poliuretanowe, listki kolagenowe, płytki, proszki, pianki albo gąbki (np. poliuretanowe lub silikonowe), hydrokoloidy (np. karboksymetyloceluloza, CMC), opatrunki oparte na kolagenie i kwasie hialuronowym, w tym kombinację powyższych.

Alginian, chitosan oraz opatrunki hydrokoloidowe, nałożone na ranę pobierają płyn wysiękowy. W ten sposób wytwarzają wodny żel na powierzchni rany i uznaje się, że żel ten jest korzystny dla procesu gojenia się rany dzięki utrzymywaniu wilgotności rany.

Rozważa się także, że aktywna substancja szkliwa może być wbudowana do kleju tkankowego, zawierającego również np. fibrynogen i trombinę, i ewentualnie Czynnik XIII lub inny czynnik koagulu-jący osocze w celu zatrzymania krwawienia.

Kleje tkankowe mogą być sporządzane albo jako mieszanina wstępna aktywnej substancji szkliwa, fibrynogenu i Czynnika XIII, a trombina dodawana jest dopiero potem, bezpośrednio przed zastosowaniem kleju tkankowego na ranę. Alternatywnie, wstępną mieszaninę fibrynogenu i aktywnej substancji szkliwa, i ewentualnie Czynnika XIII można stosować na ranę przed dołączeniem trombiny. W warunkach in situ trombina przekształca fibrynogen we włóknik, powodując w ten sposób zjawisko koagulacji, występujące normalnie w procesie gojenia ran. Obecność aktywnej substancji szkliwa w kleju tkankowym może służyć przyspieszeniu procesu gojenia, jak omówiono wyżej. Dostępnym w handlu produktem nadającym się do włączenia do niego aktywnej substancji szkliwa jest Tisseel®, dwuskładnikowy uszczelniacz włóknikowy, produkowany przez Immuno, AG, Wiedeń, Austria.

W paście do zębów lub w składzie płynu do płukania ust, lub w innych preparatach do stosowa-nia na zęby lub na korzenie zębów, aktywna substancja szkliwa może występować albo w postaci rozpuszczonej w podłożu o lekko kwaśnym pH, lub jako dyspersja w podłożu o obojętnym pH. Zakła-da się, że w trakcie stosowania aktywna substancja szkliwa może wytworzyć warstewkę ochronną na powierzchni zębów.

PL 202 536 B1 14

Wymienione wyżej kompozycje do stosowania miejscowego najbardziej nadają się do stosowa-nia bezpośrednio na rany lub mogą być odpowiednie do podawania na lub do odpowiednich otworów ciała, np. odbytu, cewki moczowej, pochwy, ucha, nosa lub przedsionka jamy ustnej. Kompozycje mogą po prostu być nałożone bezpośrednio na powierzchnię leczoną, lub podane w inny, wygodny sposób.

Kompozycje, które okazały się odpowiednie do stosowania miejscowego to takie, które wykazu-ją właściwości tiksotropowe, tj. lepkość kompozycji zmienia się pod wpływem wstrząsania lub miesza-nia, tak że lepkość kompozycji można zmniejszyć podczas podawania, a lepkość kompozycji po nało-żeniu na ranę wzrasta, tak że kompozycja utrzymuje się w miejscu podania.

Kompozycje do stosowania doustnego lub do nakładania na skórę lub na błony śluzowe Odpowiednie kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku mogą wy-

stępować w postaci zawiesin, emulsji lub dyspersji. Takie kompozycje zawierają aktywną substancję szkliwa w połączeniu odpowiednio z czynnikiem dyspergującym lub nawilżającym lub zawieszającym i/lub jednym lub kilkoma czynnikami konserwującymi i innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi sub-stancjami pomocniczymi. Kompozycje takie mogą również być odpowiednie do stosowania w dostar-czaniu aktywnej substancji szkliwa do np. niezmienionej lub uszkodzonej błony śluzowej takich narzą-dów jak usta, policzki, nos, odbytnica, pochwa, lub też do podawania na nieuszkodzoną lub uszko-dzoną skórę, lub rany.

Odpowiednimi czynnikami dyspergującymi lub nawilżającymi są, na przykład, naturalnie wystę-pujące fosfatydy, np. lecytyna, lub lecytyna sojowa; produkty kondensacji tlenku etylenu z np. kwasem tłuszczowym, alkoholem alifatycznym o długim łańcuchu, lub częściowym estrem otrzymanym z kwa-sów tłuszczowych i heksytolu lub bezwodnika heksytolu, np. stearynian polioksyetylenu, monooleinian polioksytylenosorbitolu, monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, etc.

Odpowiednimi czynnikami do sporządzania zawiesin są np. występujące naturalnie żywice, ta-kie jak np. guma arabska, guma ksantanowa, lub guma tragakantowa; celulozy takie jak np. sól sodo-wa karboksymetylocelulozy, celuloza mikrokrystaliczna (np. Avicel® RC 591, metyloceluloza); alginia-ny i chitozany, takie jak np. alginian sodu, itp.

Odpowiednimi przykładami konserwantów do stosowania w kompozycjach wytwarzanych zgod-nie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku są te same konserwanty, które zostały wymienio-ne powyżej.

Kompozycje wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku mogą także być poda-wane doustnie. Kompozycje nadające się do stosowania doustnego mogą być sporządzane w postaci proszku lub mogą występować w postaci stałej, półstałej, lub płynnej.

Kompozycje do stosowania doustnego obejmują stałe postacie dawkowania takie jak np. prosz-ki, granulki, granulaty, saszetki, tabletki, kapsułki, tabletki musujące, tabletki do żucia, pastylki do ssa-nia, tabletki o natychmiastowym uwalnianiu i tabletki o zmodyfikowanym uwalnianiu oraz ciekłe lub płynne formulacje, takie jak roztwory, zawiesiny, emulsje, dyspersje i mikstury. Ponadto kompozycje mogą występować w postaci proszku, proszków do dyspergowania lub w postaci granulek do sporzą-dzania wodnej zawiesiny po dodaniu ciekłego środka, np. środka wodnego.

W odniesieniu do stałej postaci dawkowania do stosowania doustnego (albo miejscowego), kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zwykle zawiera aktywne sub-stancje szkliwa oraz ewentualnie jedną lub kilka dopuszczalnych farmakologicznie substancji pomoc-niczych. Takimi substancjami pomocniczymi mogą być, na przykład obojętne rozcieńczalniki lub wy-pełniacze, takie jak sacharoza, sorbitol, cukier, mannitol, celuloza mikrokrystaliczna, skrobie, łącznie ze skrobią ziemniaczaną, węglan wapnia, chlorek sodu, laktoza, fosforan wapnia, siarczan wapnia lub fosforan sodu; czynniki powodujące granulację i czynniki dezintegrujące, np. pochodne celulozy, łącz-nie z celulozą mikrokrystaliczną, skrobie łącznie ze skrobią ziemniaczaną, sól sodowa kroskarmelozy, alginiany lub kwas alginowy i chitozany; czynniki wiążące, na przykład sacharoza, glukoza, sorbitol, guma arabska, kwas alginowy, alginian sodu, żelatyna, skrobia, skrobia preżelatynizowana, celuloza mikrokrystaliczna, krzemian magnezowo-glinowy, sól sodowa karboksymetylocelulozy, metylocelulo-za, hydroksypropylometyloceluloza, etyloceluloza, poliwinylopirolidon, polioctan winylu lub glikol pro-pylenowy oraz chitozany; czynniki smarujące, łącznie z substancjami poślizgowymi i przeciwprzylep-nymi, np. stearynian magnezu, stearynian cynku, kwas stearynowy, krzemiany, uwodornione oleje roślinne lub talk.

Innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi mogą być barwniki, czyn-niki zapachowe, plastyfikatory, czynniki nawilżające, czynniki buforujące, itd.

PL 202 536 B1 15

W tych przypadkach, gdy kompozycja farmaceutyczna występuje w formie stałej postaci daw-kowania w jednostkach dawkowania (np. tabletkach lub kapsułkach), postać jednostki dawkowania może być pokryta jedną lub kilkoma powłoczkami, wymienionymi poniżej.

W tych przypadkach, gdy kompozycja jest w postaci tabletki, kapsułki lub w wielojednostkowych kompozycjach, kompozycja lub pojedyncze jednostki lub tabletka lub kapsułka zawierająca pojedyn-cze jednostki mogą być pokryte, np. powłoczką cukrową, powłoczką błonową (np. opartą na hydrok-sypropylometylocelulozie, metylocelulozie, metylohydroksyetylocelulozie, hydroksypropylcelulozie, karboksymetylocelulozie, kopolimerach akrylanowych (Eudragit), glikolach polietylenowych i/lub poli-winylopirolidonie), lub pokryte powłoczkami dojelitowymi (np. opartymi na kopolimerze kwasu metakry-lowego (Eudragit), octano-ftalanie celulozy, ftalanie hydroksypropylometylocelulozy, octanio- burszty-nianie hydroksypropylometylocelulozy, polioctano-ftalanie winylu, szelaku i/lub etylocelulozie).

Ponadto mogą być stosowane materiały opóźniające, jak np. monostearynian gliceryny lub di-stearynian gliceryny.

Mieszaniny do stosowania doodbytniczego i/lub dopochwowego Do stosowania na błony śluzowe odbytnicy lub pochwy, odpowiednie kompozycje wytwarzane

zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują czopki (typu emulsji lub zawiesiny), lewatywy oraz doodbytnicze kapsułki żelatynowe (roztwory lub zawiesiny). Odpowiednie, dopuszczalne farma-ceutycznie podłoża czopkowe obejmują masło kakaowe, zestryfikowane kwasy tłuszczowe, gliceryni-zowaną żelatynę oraz różne rozpuszczalne w wodzie lub dyspergujące się podłoża jak glikole poliety-lenowe oraz polioksyetylenowane estry kwasów tłuszczowych i sorbitanu. Dołączone mogą być różne dodatki, np. wzmacniacze lub surfaktanty.

Kompozycje do stosowania donosowego Do stosowania na błonę śluzową nosa (jak również błonę śluzową jamy ustnej) odpowiednimi

kompozycjami wytwarzanymi zgodnie z zastosowaniem według wynalazku są spray'e i aerozole do inhalacji. Typowa kompozycja donosowa zawiera aktywną substancję szkliwa w postaci cząsteczko-wej, ewentualnie zdyspergowanej w odpowiednim nośniku. Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze i ewentualnie inne farmaceutycznie dopuszczalne materiały obecne w kom-pozycji, takie jak rozcieńczalniki, wzmacniacze, czynniki zapachowe, konserwanty, itp. wybrane są zgodnie z przyjętą praktyką farmaceutyczną w sposób zrozumiały dla specjalistów z dziedziny sporzą-dzania farmaceutyków. Dawkowanie macierzy szkliwa, pochodnych macierzy szkliwa oraz białek ma-cierzy szkliwa

W kompozycjach farmaceutycznych wytwarzanych zgodnie z zastosowaniem według wynalaz-ku na skórę lub na błony śluzowe aktywna substancja szkliwa w zasadzie występuje w stężeniach w zakresie od około 0,01% do około 99,9% wagowego. Ilość stosowanej kompozycji zwykle wynika z ilości całkowitego białka przypadającej na cm2 powierzchni rany/skóry/tkanki, odpowiadającej w zakresie od około 0,01 mg/cm2 do około 20 mg/cm2, tak jak od około 0,1 mg/cm2 do około 15 mg/cm2.

Ilość stosowanej kompozycji zależy od stężenia aktywnej substancji szkliwa w kompozycji oraz od stopnia uwalniania z kompozycji aktywnej substancji szkliwa, lecz zwykle mieści się w zakresie najwyżej około 15-20 mg/cm2.

W tych przypadkach, gdy aktywna substancja szkliwa podawana jest w postaci ciekłej kompo-zycji, stężenie aktywnej substancji szkliwa w takiej kompozycji jest w zakresie odpowiadającym zwykle od około 0,1 do około 50 mg/ml. W niektórych przypadkach potrzebne są wyższe stężenia, można zatem otrzymywać stężenia co najmniej około 100 mg/ml.

Gdy mieszanina ma być stosowana w jamie ustnej, odpowiednie są następujące dawki. Doświadczalnie wykonane pole ubytku (u małp) w obrębie jamy ustnej ma zwykle wymiary około

4 x 2 x 5-6 mm, co odpowiada około 50 μl lub od około 0,025 do około 0,15 mg całkowitego białka/ mm2, lub około 2,5 - 15 mg/cm2. Zwykle stosuje się do 0,5, np. 0,4, 0,3, 0,2 lub 0,1 ml kompozycji o stężeniu około 1-40 mg/ml, np. 5-30 mg/ml.

Powierzchnie ubytków w jamie ustnej u ludzi oraz spowodowane chorobami przyzębia mają wymiar około 5-10 x 2-4 x 5-10 mm, co odpowiada około 200 μl kompozycji i zwykle podaje się najwy-żej około 0,5 - 1 ml, 0,2 - 0,3 ml na ząb, kompozycji mającej stężenie około 1-40 mg całkowitego biał-ka/ml, tak jak np. 5-30 mg/ml. Stężenie 0,2- 0,3 mg/ml odpowiada około 6 mg białka na 25-100 mm2 lub około 0,1 mg/mm2, jeżeli obliczone jest jedynie dla powierzchni korzenia. Zwykle podaje się nad-mierną objętość, aby pokryta została cała powierzchnia. Nawet do wielowarstwowego podawania potrzebna jest tylko niewielka część wyżej wymienionych ilości.

PL 202 536 B1 16

Ogólnie około 0,1-0,5 ml, jak np. 0,15 - 0,3 ml lub około 0,25-0,35 ml kompozycji, zawierającej aktywną substancję szkliwa stosuje się w objętościach odpowiadających ubytkom w zapaleniu zębo-dołów (dziury po ekstrakcji zęba).

Stężenie aktywnej substancji szkliwa w kompozycji wynosi zwykle około 1-40 mg całkowitego białka/ml, tak jak np. 5-30 mg/ml. Gdy podaje się 0,3-0,4 ml takiej kompozycji na ząb mądrości, objętość ta odpowiada około 0,1 mg/cm2 (zębodół obliczony jako cylinder o promieniu 5 mm i wysokości 20 mm).

Stężenie aktywnej substancji szkliwa w kompozycji farmaceutycznej zależy od rodzaju substan-cji szkliwa, jej aktywności, zaawansowania schorzenia wymagającego leczenia lub zapobiegania, wieku oraz stanu ogólnego pacjenta. Przydatne sposoby określania odpowiedniego stężenia aktywnej substancji szkliwa są dobrze znane specjalistom i mogą być ustalane zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej (GCP) lub wytycznymi Badania Nad Nowymi Lekami („IND"), zawartymi np. w In-ternational Standard ISO/DIS 14155 Clinical Investigation of medical devices, 1994, oraz ICH (Interna-tional Cometee for Harmonisation): Harmonised tripartite guideline for good clonical practice, Brokwo-od Medical Publications, Ltd, Surrey, UK, 1996).

Specjalista wykorzystując techniki opisane w dostępnych podręcznikach, wytycznych i rozpo-rządzeniach opisanych powyżej jak również w oparciu o swoją wiedzę jest w stanie ustalić dokładny reżim dawkowania, który można wdrożyć dla dowolnej aktywnej substancji szkliwa i/lub wybrać inne aktywne substancje i dawkowanie stosując zaledwie rutynową procedurę doświadczalną.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Wynalazek jest dalej ujawniony przy pomocy dołączonych rysunków. Fig. 1 przedstawia syntezę DNA w ludzkich komórkach PDL pobudzanych EMD lub w komór-

kach niepobudzanych; Fig. 2 przedstawia produkcję TGF-B1 przez ludzkie komórki PDL pobudzane EMD i przez ko-

mórki niepobudzane; Fig. 3A jest zdjęciem rentgenowskim ukazującym uszkodzenia pooperacyjne po usunięciu zęba

mądrości; i Fig. 3B jest zdjęciem rentgenowskim pokazującym regenerację więzadła okołozębowego po le-

czeniu EMD, jak opisano w przykładzie 12 poniżej.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Materiały i Metody Pochodną macierzy szkliwa, EMDOGAIN®, z BIORA AB, S-205 12, Malmö, Szwecja, zawiera-

jącą 30 mg liofilizowanego białka macierzy szkliwa(dalej w skrócie EMD) oraz 1 ml roztworu nośnika (alginian glikolu propylenowego), zmieszano przed użyciem, o ile białko oraz nośnik nie były badane od-dzielnie. Stosunek wagowy białek o pikach odpowiadających 20, 14 i 5 kDa wynosił odpowiednio 85/5/10.

Termicznie traktowany EMD to taki, który był ogrzewany przez 3 godziny w temperaturze około 80°C w celu inaktywacji resztkowych proteaz.

Białko amelogenina 20 kDa i peptyd amelogenina bogaty w tyrozynę (TRAP) 5 kDa izolowano z EMD przy zastosowaniu chromatografii HPLC (TSK G-2000 SW, zrównoważono 30% acetonitrylem w 0,9% NaCl) i oczyszczano na drodze chromatografii z odwróconymi fazami (Pro-RPC, HR 5/10, Pharmacia-Upjohn, Szwecja), stosując gradient acetonitrylu. Wyizolowane białko/polipeptydy dodano następnie w różnych ilościach do roztworu nośnika EMDOGAIN®, o ile nie testowano ich oddzielnie.

Kwas hialuronowy był HMT-0028 (ciężar cząsteczkowy 990 000) od Seikagaku Corporation, Tokio, Japonia;

Wszystkie bakterie oraz drożdże przede wszystkim izolowano od pacjentów, klasyfikowano te-stami metabolicznymi i typowano pod względem antygenowym zgodnie ze standardowymi procedu-rami. Gatunki bakterii i drożdży stosowane do badań wymieniono w tabeli poniżej.

Albuminę surowicy (bydlęca) oraz kolagen typu I (bydlęcy) otrzymano z Sigmy, St. Louis, USA. Płytki agarowe „Brain Hart Infusion agar" (tj. zawierające wyciąg z mózgu i serca), produkcji

Difco, wzbogacono ludzkimi erytrocytami (100 ml na litr agaru). PRZYKŁADY P r z y k ł a d 1 Proliferacja komórek oraz produkcja TGF-β1 przez komórki PDL, traktowane EMDOGAIN® Roztwór podstawowy EMD sporządzano rozpuszczając zawartość ampułki (zawierającej 30 mg EMD)

w 3 ml wyjałowionego przez filtrację 0,1% roztworu kwasu hialuronowego (HAc). 60 μl roztworu pod-

PL 202 536 B1 17

stawowego EMD dodawano do 6000 μl pożywki Dulbecco Modified Eagle's Medium, zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 1% roztworu penicyliny-streptomycyny. 300 μl mieszaniny doda-wano do każdej studzienki w płytkach 96-studzienkowych (NUNC A/S, Dania, nr katalogowy 167008), 1000 ludzkich komórek PDL z więzadła okołozębowego (otrzymanych ze zdrowej ludzkiej tkanki oko-łozębowej od osobników, którym usunięto przedtrzonowce ze wskazań ortodontycznych, i hodowa-nych jak opisano w Somerman i wsp.., J. Dental Res. 67, 1988, str. 66-70) dodawano do każdej stu-dzienki i inkubowano przez 5 dni w 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla.

Komórki PDL używane jako kontrola hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's jak podano powyżej, lecz przy braku EMD.

Po inkubacji przeprowadzono test immunologiczny na proliferację komórek przez pomiar wbu-dowania 5-bromo-2-deoksyurydyny (BrdU) zgodnie z instrukcją wytwórcy testu (Boehringer Mannhe-im, nr katalogowy 1647 229). W procedurze tej BrdU jest wbudowywany w miejsce tymidyny w DNA rosnących komórek. Wbudowanie BrdU wykrywane jest testem ELISA, a ilość BrdU mierzona tym testem jest miarą syntezy DNA, i w konsekwencji miarą proliferacji komórek PDL.

Wyniki przedstawione na fig. 1 wskazują, że komórki PDL hodowane w obecności EMD wyka-zują znacznie szybszą proliferację niż komórki PDL hodowane bez EMD.

Do 100 μl supernatantu z hodowli w studzienkach dodano 20 μl 1 N HC1, a później inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę inkubacyjną zobojętniano dodaniem 20 μl 1 N NaOH/0,5 M HEPES. 100 μl tej mieszaniny dodawano do 400 μl buforu rozcieńczającego. 200 μl roz-tworu poddawano testowi ELISA stosując zestaw Quantikines™ (nr katalogowy DB100), dostępny z R&D Systems, UK, według instrukcji producenta.

Wyniki przedstawione na Fig. 2 wykazują znaczny wzrost produkcji TGF-β1 w komórkach PDL inkubowanych z EMD w stosunku do komórek PDL nieinkubowanych z EMD.

P r z y k ł a d 2 Badanie poprawionego gojenia ran tkanek miękkich pod wpływem EMDOGAIN® po zabiegu

chirurgicznym na przyzębiu Celem tego przykładu jest pokazanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i/lub białek macie-

rzy szkliwa na poprawę gojenia się ran tkanek miękkich po chirurgicznych zabiegach periodontolo-gicznych.

Eksperymentalne uszkodzenia przyzębia brzeżnego w ponad 50 zębach małp Macaca wykona-no wiertłem dentystycznym przez usunięcie cementu korzeniowego, błony ozębnowej i brzegu kości wyrostka zębodołowego na około 5 mm odległości szyjkowo-wierzchołkowej. Następnie na ekspery-mentalne uszkodzenie nie aplikowano nic: (kontrola) lub aplikowano pochodne macierzy szkliwa (EMDOGAIN® zarówno jako niekonstytuowany liofilizowany proszek, jak też jako zawiesinę. Stężenie białek w zawiesinie wynosiło około 5-30 mg/ml, a aplikowana ilość wynosiła około 0,1 - 0,2 ml na uszkodzenie.

Gojenie rany było oceniane wizualnie przez następne 8 tygodni. W uszkodzeniach, w których zastosowano EMDOGAIN® gojenie przebiegało dobrze (bez zaczerwienienia czy obrzęku) i nieistot-nej płytki po 2 tygodniach gdy usunięto szwy, dobre gojenie i niewielkie zapalenie dziąsła obserwowa-no po 5 tygodniach, a gojenie bez komplikacji po 8 tygodniach, kiedy kończono eksperyment. W prze-ciwieństwie do ubytków w kontroli, gdzie występowała reakcja zapalna z odsłonięciem dziąsła i obfitą płytką po 2 tygodniach, z poważnym odsłonięciem i zapaleniem dziąseł zarówno po 5 tygodniach jak i po 8 tygodniach.

P r z y k ł a d 3 Badanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie się ran po-

wstałych podczas zabiegów na przyzębiu Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy

szkliwa na szybkie gojenie się ran u pacjentów po chirurgii periodontalnej. Pięćdziesięciu pięciu (55) pacjentów, wymagających zabiegów chirurgicznych na przyzębiu, zostało podzielonych na dwie grupy - jedną, leczoną klasyczną metodą nakładania płatków w modyfikacji Widmana (20 pacjentów), oraz drugą, poddaną tej samej procedurze plus zastosowanie EMDOGAIN® (35 pacjentów) (stężenie wy-nosiło 30 mg białka/ml i około 0,3 ml podawano na ząb). Żaden z pacjentów nie otrzymał antybiotyków podczas zabiegu, ale wszyscy zostali poinstruowani o stosowaniu płynu aseptycznego (chlorheksydy-ny) do codziennego płukania jamy ustnej.

PL 202 536 B1 18

Wywiad z pacjentami przeprowadzano podczas usuwania szwów (1-3 tygodnie po zabiegu). Podczas gdy 3 (15%) pacjentów z grupy kontrolnej wymagało zastosowania terapii antybiotykowej, tylko jeden pacjent z grupy (3%), której podawano EMDOGAIN®, wymagał takiego leczenia.

P r z y k ł a d 4 Badania wpływu pochodnych macierzy szkliwa oraz białek macierzy szkliwa na gojenie się ran

po usunięciu zęba Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu białek szkliwa/pochodnych macierzy szkliwa na

gojenie się ran po usunięciu trzeciego trzonowca. Pacjentom w wieku 30 lat, lub starszymi, z symetrycznym wklinowaniem lub niepełnym wklino-

waniem trzeciego trzonowca, usuwano trzeci trzonowiec według klasycznej metody wymagającej pod-niesienia pionowego płatu celem przeprowadzenia niezbędnej osteotomii i cięcia, drugi był usuwany analogicznie, ale jego wyrostek zębodołowy przed zaszyciem był wypełniany EMDOGAIN®. Wszyscy pacjenci otrzymywali antybiotyki ( 3 g amoksycyliny lub 1 g erytromycyny) na 1-2 godziny przed zabie-giem, a po zabiegu otrzymywali Ibuprofen (600 mg x 3). Zostali pouczeni, żeby jamę ustną płukać chlorheksydyną (0,1%, 10 ml x 2) przez 4 tygodnie.

Szwy zdejmowano po 2 tygodniach. Gojenie miejsc traktowanych EMDOGAIN® i kontrolnych oceniali zarówno pacjenci, jak i dentysta. W jednym ośrodku, 9 pacjentów miało obustronną ekstrakcję z/bez EMDOGAIN®. Jeden pacjent skarżył się na lekkie podrażnienie od szwów po obu stronach, natomiast inny pacjent skarżył się na silny ból po stronie kontrolnej, lecz nie miał kłopotu ze stroną traktowaną EMDOGAIN®. W drugim ośrodku, trzech spośród 6 pacjentów miało bóle jedynie po stro-nie kontrolnej. Wreszcie, w trzecim ośrodku jeden pacjent miał poważną komplikację - suchy zębodół - zdiagnozowany po stronie kontrolnej. Miejsce traktowane EMDAGAIN® goiło się bez problemów. Inny pacjent miał lekkie podrażnienie od szwów po obu stronach usunięcia, ale tylko strona kontrolna była w stanie zapalnym i bolesna i wymagała wielokrotnego płukania solą i przyjmowania środków prze-ciwbólowych. Te wyniki kliniczne wskazują, że stosowanie EMDOGAIN® do wyrostków zębodołowych po usuwaniu zębów mądrości może ułatwić gojenie i zmniejszyć częste skądinąd bolesne obrzęknięcia.

P r z y k ł a d 5 Badanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie tzw. suche-

go zębodołu Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu białek szkliwa/pochodnych macierzy szkliwa na

gojenie się suchego zębodołu "suchego dołu") Po usunięciu 35 zakażonego pozostawionego korzenia (radix relicta) pacjent (mężczyzna)

w wieku 70 lat uskarżał się na silny ból oraz obrzęk w miejscu zębodołu poekstrakcyjnego. W czasie badania przez swego dentystę okazało się, że rozwinął się stan zapalenia kości zębodołu, w którym początkowo powstały skrzep został rozpuszczony i ściana kostna wyrostka zębodołowego uległa mar-twicy. Kość przylegająca oraz tkanki miękkie były w stanie zapalnym. Pacjent miał w wywiadzie nie-wydolność serca i leczony był antykoagulantem Marevan. W wyniku tego stanu miał zmniejszony ob-wodowy przepływ krwi. Także regularnie palił kilka papierosów dziennie.

Zapalenie kości zębodołu leczono w sposób tradycyjny, usunięto martwą kość i sprowokowano nowe krwawienie. Uruchomiono także dziąsła i nałożono szew dla zamknięcia zębodołu. Celem zwal-czenia zakażenia pacjent otrzymywał penicylinę (apocylinę 660 mg, 2 tabletki rano i wieczorem, przez 7 dni) i został również pouczony o płukaniu jamy ustnej dwa razy dziennie roztworem chlorheksydyny. Po pięciu dniach, po zakończeniu leczenia antybiotykiem, pacjent badany w klinice dentystycznej nadal uskarżał się na silny ból. Przeprowadzone badanie pola operacyjnego - wzrokowe, palpacyjne i zgłębnikowe wykazało, że stan zapalny kości zębodołu trwa nadal oraz że jest więcej martwiczej tkanki kostnej. Badanie rentgenowskie wykazało uszkodzenie kości i martwicę na całej głębokości, aż po część szczytową korzenia. Pole operacyjne raz jeszcze oczyszczono i powstałą zmianę kostną wypełniono EMDOGAIN® (podano 30 mg/ml, maksymalnie 0,5 ml) i nałożono nowy szew na dziąsło, by zakryć zębodół. Nie zastosowano dodatkowego leczenia, lecz pacjenta poproszono o dalsze prze-mywanie jamy ustnej roztworem chlorheksydyny. Po dwóch dniach pacjent poinformował klinikę, że ból oraz obrzęk ustąpiły. Badanie kliniczne oraz usunięcie szwu w tydzień po podaniu EMDOGA-IN® wykazało dobre gojenie się bez martwiczych tkanek lub zapalenia oraz nieuszkodzone dziąsła bez zaczerwienienia lub obrzęku, pokrywające pole rany. Nie było krwawienia ani bolesności w bada-niu palpacyjnym lub zgłębnikowym. Nie obserwowano brzydkiego zapachu, smaku ani wysięku. Pacjent nie zgłaszał żadnego bólu ani innych objawów.

PL 202 536 B1 19

P r z y k ł a d 6 Badania profilaktycznego działania pochodnych macierzy szkliwa i białka macierzy szkliwa na

powstanie suchego zębodołu Celem tego przykładu jest wykazanie profilaktycznego działania pochodnych macierzy szkliwa

oraz białek macierzy szkliwa na przeciwdziałanie suchemu zębodołowi (alveolitis sicca). 82-letnia pacjentka doznała podłużnego złamania korzenia zęba 44. Ząb ten stanowił filar mo-

stu między zębem 35 do 46 i leczony był endodontycznie wiele lat wcześniej. Klinicznie dziąsła ota-czające ząb były w stanie zapalnym i stwierdzono kieszonkę dziąsłową na całej długości korzenia zęba, aż po szczyt, po stronie językowej. Badanie rentgenowskie wykazało silny miejscowy stan za-palny przyzębia 44.

Stan higieniczny jamy ustnej był zadawalający, lecz z uwagi na stan serca, leczonego Mareva-nem (antykoagulant), krwawienie z dziąseł było łatwo prowokowane przez zgłębnikowanie. Sześć miesięcy wcześniej pacjentce usunięto chirurgicznie ząb 35 ze względu na ciężkie zapalenie przyzę-bia. Po tej operacji doświadczyła długotrwałego stanu suchego zębodołu. Pacjentka była bardzo za-niepokojona, że usunięcie zęba 44 mogłoby spowodować taką samą komplikację pooperacyjną, jakiej doświadczyła uprzednio. Poinformowano ją, że połączenie jej wieku i leczenia Marevanem, oraz za-każony korzeń i kieszonka dziąsłowa dramatycznie zwiększają ryzyko wystąpienia pooperacyjnych komplikacji, jak zapalenie kości zębodołu, ale też, że nie ma alternatywy dla chirurgicznego usunięcia fragmentów korzenia.

Pacjentka wyraziła zgodę na usunięcie zęba 44 oraz, w drodze eksperymentu, poddana została profilaktycznemu leczeniu EMDOGAIN® w celu zapobieżenia rozwinięciu się suchego zębodołu. Pa-cjentkę znieczulono, nacięto i usunięto kość policzkową, by umożliwić usunięcie fragmentu korzenia bez rozluźnienia mostu. Po usunięciu, pusty zębodół oczyszczono mechanicznie i wypełniono EMDOGAIN® (podano 30 mg/ml, maksymalnie 0,5 ml), dokonano repozycji płatka jednym szwem. Tego samego wieczora pacjentka poinformowała telefonicznie o utrzymującym się krwawieniu z miej-sca zabiegu (nie zaprzestano leczenia Meravanem przed zabiegiem), lecz innych objawów nie było. Gdy usuwano po pięciu dniach szew, tkanki miękkie rany operacyjnej były całkowicie wygojone. Pa-cjentka nie zgłaszała innych objawów, jak ból czy obrzęk i ogólnie była bardzo zadowolona z leczenia.

P r z y k ł a d 7 Badanie wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie się powikłań

pourazowych Celem tego przykładu jest wykazanie wpływu białek szkliwa/ pochodnych macierzy szkliwa na

gojenie się powikłań pourazowych u pacjentów. Po wypadku pacjentowi na pogotowiu podwiązano górne przednie zęby. Dentysta stwierdził

martwicę zębów 11 i 21, zęby 12 i 22 miały boczno-siekaczowe złamania klasy I lub II. Brzeżne dzią-sła były w stanie ciężkiego zapalenia i słabo przylegały do powierzchni zębów. Pacjent skarżył się na ból, drętwienie, obrzęk, brzydki zapach i smak. Były także dowody na uszkodzenie więzadła okołozę-bowego w okolicy szczytowej zębów 11 i 21. Oba środkowe siekacze oczyszczono i wypełniono kana-ły świeżo zmieszanym wodorotlenkiem wapnia Ca(OH)2.

Po 4 tygodniach gojenie się rany uznano za niezadawalające. Powstał przewlekły stan zapalny i zęby uznano za stracone. Standardowym postępowaniem w takich przypadkach byłoby usunięcie wszystkich czterech siekaczy i zastąpienie ich mostem lub implantami. Pacjent jednak stanowczo się nie zgadzał na takie postępowanie i jako ostateczną próbę uratowania zębów przeprowadzono chirur-gię płatków dziąsłowych na wszystkich czterech zębach (11, 12, 21, 22). Zużyto dwie ampułki EMDOGAIN® (60 mg w 3 ml). Najwyżej 0,2 ml EMDOGAIN (30 mg/ml) podano strzykawką na każdy ząb przed nałożeniem płatów, które przyszyto siedmioma szwami. Cztery szwy zdjęto po 5 dniach. Stwierdzono wtedy znaczną poprawę, subiektywną i kliniczną. Pacjent nie uskarżał się już na ból, minęło uczucie drętwienia, a z zaatakowanej powierzchni nie wydzielał się przykry zapach, ani nie było odczucia nieprzyjemnego smaku. Po upływie 2 tygodni usunięto pozostałe szwy. Dziąsła nie wy-kazywały żadnych objawów zapalenia i pacjent nie zgłaszał żadnych skarg. Dziąsła były dźwięczne i bez śladu zapalenia; były mocno przytwierdzone do zębów i/lub do kości wyrostka zębodołowego, miały zabarwienie różowe (a nie wyraźnie czerwone, jak to obserwowane w miejscach zapalenia), z normalnymi (nieobrzękniętymi) brodawkami międzyzębowymi. Ponadto stwierdzono znaczną po-prawę, jak odtworzenie więzadła zębowego w uszkodzonych częściach zębów oraz odkładanie się nowej tkanki kostnej zębodołu, jak wykazało badanie rentgenowskie.

PL 202 536 B1 20

P r z y k ł a d 8 Gojenie ran urazowych w sąsiedztwie zębów i nerwów Przypadek kliniczny 39-letnia pacjentka doznała poważnego zapalenia wokół korony wyrzynającego się dolnego le-

wego zęba mądrości (38) W państwowej klinice dentystycznej ząb został częściowo usunięty, pozo-stawiono część wierzchołkową korzenia w żuchwie, będącą następstwem jatrogennego złamania ko-rzenia W bólu pacjentkę przyjęto następnego dnia na specjalistyczny oddział chirurgii szczękowej w celu chirurgicznego usunięcia fragmentu korzenia.

W dwa dni po zabiegu pacjentka zgłosiła się do swego dentysty na kontrolę. Miała spuchniętą lewą stronę i wykazywała całkowity blok nerwu żuchwowego. Badaniem klinicznym i radiologicznym stwierdzono, że w trakcie dłutowania podczas zabiegu chirurgicznego została poważnie uszkodzona kość żuchwy, dolna trzecia część przywierzchołkowa tylnego korzenia zęba 37 oraz kanał nerwu żu-chwowego (patrz zdjęcie rentgenowskie, fig. 1A). Mierzona zgłębnikiem głębokość kieszonki tylnej zęba 37 wynosiła 25 mm od szczytu wierzchołka korony zęba do koniuszka tylnego korzenia.

W celu pobudzenia gojenia kości i nerwu oraz regeneracji utraconego więzadła zęba 37, ranę operacyjną otworzono i starannie oczyszczono. Po usunięciu resztek solą eksponowaną kość, po-wierzchnię tylnego korzenia oraz nerw żuchwowy pokryto EMDOGAIN® (30 mg/ml, nakładano w nadmiarze; około 1 ml) i ranę ponownie zeszyto trzema szwami. Pacjentkę pouczono, by płukała jamę ustną roztworem chlorheksydyny (Corsodyl) dwa razy dziennie przez kolejne pięć dni, a ze względów profilaktycznych podawano przez 5 dni penicylinę (Ampicilinę, 660 mg x 4).

Po dziesięciu dniach pacjentka zgłosiła się do kontroli i na zdjęcie szwów. W tym czasie obrzęk cofnął się i gojenie tkanek miękkich było bardzo dobre. Utrzymywało się jednak całkowite znieczulenie nerwu żuchwowego i pacjentkę poinformowano, że prognoza dla przerwanego nerwu jest, w najlep-szym przypadku, niepewna. W tym stanie, z powodu znieczulenia nie można było ocenić żywotności zęba 37. Normalnie uszkodzenie korzenia, jak w opisanym przypadku, prowadzi do martwicy miazgi i ankylozy zęba. Celem zapobieżenia takim powikłaniom zaleca się leczenie endodontyczne. Jednak, aby sprawdzić czy eksperymentalne leczenie może przyczynić się do gojenia więzadła zębowego, pacjentka zgodziła się na pozostawienie zęba bez leczenia przez dłuższy czas. Została zapisana na comiesięczne badania.

Po dwóch miesiącach pacjentka zgłosiła miejscowe przeczulenie w lewej części dolnej wargi, oznakę gojenia się nerwu. Tkanki miękkie w regionie 37-38 były całkowicie wygojone, bez blizny. Tak-że badanie rentgenowskie ujawniło powstawanie nowej kości w zębodole poekstrakcyjnym. Ząb 37 oraz tkanki go otaczające pozostawały nadal znieczulone.

W cztery miesiące od leczenia znieczulenie cofnęło się i testowany ząb 37 okazał się żywy, lecz nadwrażliwy w teście termicznym i elektrycznym. Badanie rentgenowskie wykazało znaczne wypeł-nienie zębodołu poekstrakcyjnego tkanką kostną oraz oznaki regeneracji przyzębia na tylnym korzeniu zęba 37.

Pięć miesięcy od rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® żywotność zęba 37 była prawidłowa. Ba-danie rentgenowskie wykazało całkowitą regenerację więzadła zębowego (fig. 1B) i nowoutworzona kość wyrostka zębowego, o prawidłowym rysunku, wypełniała ubytki kostne oraz zębodół. Nie było oznak ankylozy.

Głębokość kieszonki tylnej zęba 37, mierzona zgłębnikiem, wynosiła teraz 10 mm, co było około 1 mm poniżej połączenia cementowo-szkliwnego. Po tej kontroli pacjentkę uznano za całkowicie wyle-czoną i zapisano na planowe coroczne wizyty.

Komentarze: Całkowite i szybkie wygojenie ran urazowych w sąsiedztwie zębów i nerwów po chirurgicznym

usunięciu zęba mądrości jest rzadkością. Zwykle powikłania, tak poważne jak opisane powyżej, koń-czą się usunięciem uszkodzonego zęba, lub przynajmniej endodontycznym usunięciem miazgi zęba i wypełnieniem korzenia, kończącym się ankylozą. Przerwany nerw normalnie potrzebuje 8-12 miesię-cy do wygojenia, o ile w ogóle ono nastąpi, a często niedowład w pewnych regionach trwa przez wiele lat. Szybkie i dobrej jakości wygojenie powyżej przedstawionego przypadku jest bardzo niezwykłe i powinno być uznane jako objaw zdolności gojących EMDOGAIN®.

Promienie rentgenowskie (promienie X): A: Pacjent dwa dni po usunięciu zęba 38. Zwraca uwagę duży ubytek tylny na zębie 37 i zajęcie

kanału żuchwowego. Podczas zabiegu została usunięta także kość wyrostka zębodołowego od strony tylno-policzkowej zęba 37.

PL 202 536 B1 21

B: Pacjent w pięć miesięcy po zabiegu. Zwraca uwagę objaw całkowicie funkcjonalnego więza-dła zębowego (blaszka twarda, lamina dura) w ubytku na tylnej części korzenia zęba 37. Nie ma oznak ankylozy. Zarys kanału żuchwowego jest teraz widoczny, a jama zębodołu jest całkowicie wy-pełniona kością. Zwraca także uwagę tworzenie się nowej kości wyrostka zębodołowego w części tylno-policzkowej wokół zęba 37.

P r z y k ł a d 9 Badania wpływu pochodnych macierzy szkliwa i białek macierzy szkliwa na gojenie się owrzo-

dzeń podudzi (wrzody żylne) Pacjent 1 Pacjentem był mężczyzna, urodzony w 1926 r i z historią powtarzających się zakrzepów z bar-

dzo złym zespołem pozakrzepowym oraz nawracającymi owrzodzeniami żylaków. Był ogólnoustrojo-wo leczony przeciwzakrzepowymi pochodnymi kumaryny, a owrzodzenia były leczone miejscowo Crupodeksem (monomer dekstranu) BIOGAL oraz 3% roztworem kwasu bornego.

W momencie rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® pacjent miał owrzodzenie żylne kształtu owalnego o wymiarach 5 x 4 cm i głębokości 0,5 mm, które było w stanie ziarninowania z bardzo nikłą epitelizacją.

Ranę odkażono 3% wodą utlenioną i nakroplono 500 μl EMDOGAIN®, a następnie rozprowa-dzono równomiernie sterylnym patyczkiem na całą powierzchnię rany. EMDOGAIN® pozostawiono przez 10 minut na powietrzu, a następnie ranę pokryto opatrunkiem Inadine (Johnson & Johnson) Rayon nasyconym maścią 10% jodku powidonu.

Po pięciu dniach stwierdzono epitelizację bliższej części owrzodzenia, a owrzodzenie zmniej-szyło się do rozmiaru 1,8 x 2,2 cm, nie było reakcji ubocznych (zapalenia). Nie podano EMDOGAIN®. Po 12 dniach miała miejsce dalsza epitelizacja w bliższej części oraz nowa epitelizacja w bocznych częściach owrzodzenia na obszarze około 2 x 2 cm. Prawie połowa owrzodzenia była wygojona. Podano 400 μl EMDOGAIN®.

Po 19 dniach miała miejsce dalsza epitelizacją w bliższych i bocznych częściach owrzodzenia, lecz nie występowała w części dalszej, gdzie owrzodzenie było raczej głębokie (około 1 mm). Więcej niż połowa owrzodzenia była wygojona. Zastosowano 300 μl EMDOGAIN®. Od momentu rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® pacjent nie odczuwał żadnej bolesności owrzodzenia, w przeciwieństwie do okresu przed początkiem leczenia. Następnie EMDOGAIN® podawano raz w tygodniu aż do 40 dnia (po 200 μl), a wrzód uznano za w pełni zagojony po 47 dniach.

Pacjent 2 Pacjentką była kobieta, urodzona w 1949 r z żylakami, przewlekłą niewydolnością żył oraz na-

wracającym owrzodzeniem żylnym. Wykazywała wielorakie uczulenie na leki i środki farmaceutyczne, miała również krwawienia żylaków. Leczona była uprzednio miejscowo kroplami Otosporin (siarczan polimyksyny B + siarczan neomycyny + hydrokortyzon) i kompresami z hydrokortyzonem.

W chwili rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® średnica jej owrzodzenia żylakowego wynosiła 1 cm a głębokość 2 mm. Podano 300 μl EMDOGAIN®.

Po 5 dniach na całym obwodzie zranienia stwierdzono epitelizację o szerokości 2 mm (obwo-dowo), i nie stwierdzano objawów ubocznych (reakcja zapalna). Nie podano EMDOGAIN®. Po 12 dniach rana zmniejszyła się do średnicy 2 mm, podano 100 μl EMDOGAIN®.

Po 19 dniach owrzodzenie miało nadal średnicę 2 mm, ale dno ładnie ziarninowało i owrzodze-nie nie było głębokie (około 0,2 mm). Podano 100 μl EMDOGAIN®.

Ta sama pacjentka miała inne owrzodzenie na drugim podudziu, około 0,3 x 1 cm. Podano 200 μl EMDOGAIN®. Po 7 dniach pojawiła się nowa epitelizacja oraz ładne ziarninowanie dna rany, a rana zmniejszyła się do około 0,2 x 0,5 cm.

Wtedy znowu podano 100 mikrolitrów EMDOGAIN® na każde owrzodzenie raz w tygodniu, aż do dnia 40, i po 47 dniach owrzodzenia uznano za w pełni wygojone. Nie zaobserwowano reakcji alergicznych na EMDOGAIN®.

Na tej samej nodze powstało jeszcze inne owrzodzenie o wymiarach około 0,5 x 0,3 cm, na któ-re nałożono 100 μl EMDOGAIN®.

Pacjent 3 Pacjentką była kobieta, urodzona w 1929 roku z głębokimi zakrzepami żylnymi po przebyciu róży,

i w momencie rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® miała bardzo duże owrzodzenie o wymiarach około 15 x 19 cm, w stadium progresji w kierunku bliższym, które uznano po wielu próbach leczenia jako stan beznadziejny. Podano 700 μl EMDOGAIN® na powierzchnię około 3 cm od górnego brzegu rany.

PL 202 536 B1 22

Po upływie 7 dni nie stwierdzono epitelizacji, lecz leczona powierzchnia była bardziej przezro-czysta (bardziej strukturopodobna) z małymi rozproszonymi obszarami ziarniny oraz miejsce to było niebo-lesne, nie było też oznak postępu patologii. Na tę samą powierzchnię podano 700 μl EMDOGAIN®. Po upływie 4 tygodni, w dalszej części owrzodzenia, nieleczonej EMDOGAIN®, rozwinęła się infekcja, prawdopodobnie wywołana Pseudomonas. Podano 700 μl EMDOGAIN®. Infekcja zniknęła po 7 dniach.

Pacjent 4 Pacjentką była kobieta, urodzona w 1947 r., mająca żylaki z powierzchniowym zakrzepowym

zapaleniem żył po przebytej róży, i w momencie rozpoczęcia leczenia EMDOGAIN® miała wrzód pod-udzia wielkości około 2 x 0,8 cm z czystym, lecz nie ziarninującym dnem. Podano 300 ul EMDOGAIN®.

Po upływie 7 dni owrzodzenie zmniejszyło się do około 0,7 x 0,3 cm, pojawiła się epitelizacja oraz ziarnina na dnie owrzodzenia. Podano 200 μl EMDOGAIN®, a następnie po 100 μl EMDOGAIN® raz na tydzień, przez pięć tygodni. Po pięciu tygodniach owrzodzenie uznano za w pełni zagojone.

P r z y k ł a d 10 EMDOGAIN® jako środek wspomagający przy niechirurgicznym leczeniu przyzębia w miej-

scach o płaskich powierzchniach Przedmiot Przedmiotem tych badań była ocena, czy stosowanie EMDOGAIN® może poprawić gojenie

spowodowane niechirurgicznym leczeniem przyzębia. Szczególnie celem tych badań była ocena wpływu na miejsca o płaskich powierzchniach.

Projekt badań Badania przeprowadzono jako długoterminowy test wewnątrzosobniczy, trwający 6 miesięcy.

Badania były z podwójną ślepą próbą, metodą „split-mouth", kontrolowane placebo i z rozkładem przypadkowym.

Obiekty badań 14 pacjentów zgłoszonych do Kliniki Chorób Przyzębia, Zakład Periodontologii, Uniwersytet

w Goteborgu do leczenia średnio zaawansowanych chorób przyzębia Kryteria włączenia • Przynajmniej trzy miejsca płaskiej powierzchni zębów w każdym z dwóch przeciwległych kwa-

drantów z kieszonkami wysondowanymi na głębokość ≥ 5 mm, oraz przynajmniej jedna para miejsc z wysondowanymi kieszonkami o głębokości ≥ 6 mm

• Wybrany ząb musi posiadać żywą miazgę, co stwierdzono bodźcem termicznym lub elek-trycznym lub, jeżeli poddany był leczeniu kanałowemu, jest bezobjawowy i bez technicznych uwag

Postępowanie (leczenie) Po przeprowadzeniu badania podstawowego, wszystkim pacjentom prezentowano przypadki

i pacjenci zostali poinstruowani o prawidłowym pomiarze kontrolnym naddziąsłowych płytek. Przepro-wadzono usunięcie kamienia nazębnego i oczyszczono korzenie.

Gdy ustało krwawienie z kieszonek, 24% żel EDTA (otrzymany z Biora AB, Szwecja) nałożono do kieszonek na 2 minuty. Następnie kieszonki delikatnie przepłukano solą, a następnie nałożono albo substancję testowaną (EMDOGAIN®) albo kontrolną (żel PGA)

Oceny Badania podstawowe przeprowadzane w 1, 2, 3, 8 i 24 tygodniu obejmowały następujące

zmienne: 1. Stan higieny jamy ustnej - obecność/brak płytek nazębnych 2. Stan dziąseł (indeks dziąsłowy, Löe 1967) 3. Głębokość kieszonki oceniana zgłębnikiem 4. Poziom przywierania oceniany zgłębnikiem 5. Krwawienie po badaniu zgłębnikiem - obecność lub brak (15 sekund) 6. Nadwrażliwość zębów - po dmuchnięciu powietrzem (tak/nie) 7. Stopień dyskomfortu - oceniany w 1-, 2- i 3-cim tygodniu według 10 cm << wzrokowej skali

analogowej (VAS).

PL 202 536 B1 23

PŁYTKI NAZĘBNE; wartości średnie (odchylenia standardowe)

KONTROLA EMDOGAIN®

Linia odniesienia 0,10 (0,30) 0,19 (0,40)

1 tydzień 0,08 (0,27) 0,05 (0,22)

2 tygodnie 0,05 (0,22) 0,22 (0,15)

3 tygodnie 0,05 (0,22) 0,10 (0,30)

4 tygodnie 0,14 (0,35) 0,19 (0,40)

26 tygodni 0,12 (0,33) 0,07 (0,34)

INDEKS DZIĄSŁOWY; wartości średnie (sd)

KONTROLA EMDOGAIN®

Linia odniesienia 0,14 (0,50) 0,40 (0,50)

1 tydzień 1,00 (0,32) 0,87 (0,52)

2 tygodnie 0,83 (0,44) 0,74 (0,45)

3 tygodnie 0,69 (0,60) 0,60 (0,50)

6 tygodni 0,67 (0,53) 0,64 (0,58)

26 tygodni 0,62 (0,54) 0,62 (0,49)

KRWAWIENIE PO ZGŁĘBNIKOWANIU; %

KONTROLA EMDOGAIN®

Linia odniesienia 100 100

1 tydzień 67 44

2 tygodnie 43 33

3 tygodnie 29 26

6 tygodni 33 31

26 tygodni 19 24

SUBIEKTYWNA OCENA PACJENTA; skala VAS Pierwszy tydzień

skala VAS

KONTROLA EMDOGAIN®

Skala VAS

0-20 8% 0%

21-40 15% 8%

41-60 31% 30%

61-80 8% 0%

81-100 38% 62%

Trzeci tydzień

KONTROLA EMDOGAIN®

Skala VAS

0-20 14% 7%

21-40 0% 7%

41-60 3% 0%

61-80 21% 22%

81-100 57% 64%

PL 202 536 B1 24

Wniosek Pacjenci mieli mniej kłopotów pooperacyjnych, mniej krwawili, mieli mniej płytek nazębnych

i poprawiony indeks dziąsłowy. Wyniki te potwierdzają korzystny wpływ EMDOGAIN® na gojenie ran P r z y k ł a d 11 Badania pilotowe nad leczeniem zranień u świń Wprowadzenie Cel Celem tych pilotowych badań jest ocena PROCESU GOJENIA ran warstwowych u świń, oraz

ocena wpływu EMD na te rany. Powód wyboru gatunku zwierzęcia Świnia została wybrana jako modelowe zwierzę do badań, ponieważ udowodniono, że ten ga-

tunek jest wygodnym modelem dla oceny gojenia się ran u ludzi. Materiały i metody Zwierzęta Doświadczenie zostanie przeprowadzone na 4 świniach SPF (krzyżówki z Danii, Yorkshire i Du-

roc). Na początku okresu aklimatyzacji waga ciała zwierząt wynosiła około 35 kg. Okres adaptacji trwający jeden tydzień, podczas którego zwierzęta będą codziennie obserwo-

wane w celu odrzucenia zwierząt w złym stanie. Wszelkie obserwacje będą notowane. Przetrzymywanie zwierząt Badania będą prowadzone w zwierzętarni zaopatrzonej w filtrowane powietrze w temperatu-

rze 21°C± 3°C), przy względnej wilgotności 55% - 15% i z wymianą powietrza 10 razy/godzinę. Po-mieszczenie będzie oświetlone w cyklu 12 godzin światło i 12 godzin ciemność. Światło będzie włą-czone od godziny 6 do 18.

Zwierzęta będą trzymane osobno w boksach Ściółka Ściółkę będą stanowiły trociny „LIGNOCEL H 3/4'' z Hahn & Co, D-24796, Bredenbek-

-Kronsburg. Przeprowadza się regularnie ocenę zanieczyszczeń tej ściółki. Dieta Użyta będzie dostępna w handlu dieta dla świń, „Altromin 9033" z Chr Petersen A/S, DK-4100

Ringsted (około 800 g dwa razy dziennie). Regularnie dokonuje się analizy głównych składników od-żywczych i odpowiednich, możliwych zanieczyszczeń.

Woda pitna Dwa razy dziennie zwierzęta otrzymają domowa wodę pitną. Regularnie dokonuje się analizy jej

możliwych zanieczyszczeń. Okaleczenia Rany będą zadane 1 dnia. Zwierzęta zostaną znieczulone Strensil® Vet. Janssen, Belgia (40 mg

azoperonu/ml, 1 ml/10 kg) oraz Atropiną DAK, Dania (1 mg atropiny/ml, 0,5 ml/10 kg), podane w poje-dynczej dawce domięśniowo, a następnie podany zostanie dożylnie Hypnodil® Janssen, Belgia (50 mg metomidat/ml, około 2 ml).

Pole grzbietowo-boczne po każdej stronie grzbietu zwierząt zostanie ogolone, umyte wodą z mydłem, zdezynfekowane 70% etanolem, który zostanie zmyty sterylnym roztworem soli fizjologicz-nej i wreszcie wysuszone jałową gazą.

Na tak przygotowanym polu zostanie zadanych osiem ran warstwowych (25 x 25 x 0,4 mm), po cztery po każdej stronie kręgosłupa, używając dermatomu ACCU (GA 630, Aesculap®). Rany zo-staną ponumerowane 1 (najbardziej dogłowowo) do 4 (najbardziej doogonowo) po stronie lewej, i 5 (najbardziej dogłowowo) do 8 (najbardziej doogonowo) po prawej stronie zwierzęcia. Skrzepniętą krew usunie się jałową gazą. Tuż przed wykonaniem zabiegu, około 8 godzin po zabiegu, i później kiedykolwiek zajdzie potrzeba, zwierzęta otrzymają domięśniowo iniekcję Anorfin®, A/S GEA, Dania (0,3 mg buprenorfiny/ml, 0,04 ml/kg).

PL 202 536 B1 25

Dawkowanie Po dokonaniu zranienia rany będą traktowane następująco:

Zwierzę numer

1 2

Lokalizacja Lewa Prawa Lewa Prawa

Dogłowowa A B

B A

B A

Doogonowa B A

Zwierzę numer

3 4

Lokalizacja Lewa Prawa Lewa Prawa

Dogłowowa A B

B A

Doogonowa B A

B A

A - Kontrola B- EMD Około 15 minut przed podaniem sporządzona zostanie formulacja EMD według instrukcji pro-

ducenta. Formulacja EMD zostanie zużyta w ciągu 2 godzin od sporządzenia. Dla leczenia ran B, EMD zostanie nałożone jako cienka warstwa na powierzchnię rany. Jedna fiolka EMD zostanie wyko-rzystana do 4 ran.

Opatrywanie ran Rany będą przykryte opatrunkiem Tegaderm®. Opatrunek będzie pokryty bandażem z gazy,

przymocowany Fixomul®'em. Opatrunki, gaza oraz Fixomul® będą utrzymane za pomocą siatki Bend- -a-rete® (Tesval, Włochy). Opatrunek będzie obserwowany codziennie.

Opatrunek zostanie zmieniony na drugi dzień (wszystkie zwierzęta) i na trzeci dzień (zwierzęta nr 3 i 4).

Przed każdą zmianą opatrunku zwierzęta będą znieczulane domięśniowo podaną w grzbiet (1,0 ml/10 kg wagi ciała) mieszaniną Zoletilu 50® Vet, Virbac, Francja (125 mg tiletaminy i 125 mg zolazepamu w 5 ml rozpuszczalnika) Rompun® Vet., Bayer, Niemcy (20 mg ksylazyny/ml, 6,5 ml) i Methadon® DAK, Nycomed DAK, Dania (10 mg metadonu, 2,5 ml).

Obserwacja ran Każda rana zostanie poddana obserwacji i będzie fotografowana w drugim dniu (wszystkie

zwierzęta), w 3 dniu (wszystkie zwierzęta) oraz w 4 dniu (zwierzęta nr 3 i 4). Oceniany będzie stopień wysięku i zapalenia. Pojawienie się przeszczepionego naskórka zostanie szczegółowo opisane.

Oznaki kliniczne Wszelkie widoczne oznaki choroby oraz każde zmiany w zachowaniu się będą zapisywane co-

dziennie. Każde odchylenie od normy zostanie opisane w odniesieniu do czasu nastania, długości trwania i stopnia nasilenia.

Waga ciała Zwierzęta zostaną zważone po przyjeździe, w dniu dokonania zranienia i po zakończeniu badań. Obserwacje końcowe W dniu 3 (po około 56 godzinach od zranienia) zwierzęta nr 1 i 2 zostaną zabite przecięciem ży-

ły i tętnicy podobojczykowej po ogłuszeniu pociskiem z pistoletu. W dniu 4 (około 72 godzin po zranieniu), zwierzęta nr 3 i 4 zostaną zabite przecięciem żyły

i tętnicy podobojczykowej po ogłuszeniu pistoletem kulowym.

PL 202 536 B1 26

Pobranie tkanek Każdą ranę wytnie się jako całość oddzieloną od tkanki mięśni szkieletowych. Jeżeli jakaś przy-

ległość do mięśni szkieletowych zostanie stwierdzona, część mięśni także zostanie objęta materiałem do utrwalania. Każdy blok zostanie utrwalony w zbuforowanym obojętnym 4% formaldehydzie.

Procedura histologiczna Po utrwaleniu czterech reprezentatywnych próbek ze wszystkich ran zostaną one zatopione

w parafinie, skrawane na grubość 5 μm i barwione hematoksyliną i eozyną. Po wybarwieniu skrawki będą oglądane pod mikroskopem świetlnym z zastosowaniem siatki. To pozwoli na pomiar całkowitej długości rany oraz długości powierzchni epitelizującej. Ten stosunek zostanie wyrażony w procentach rany pokrytej komórkami nabłonka na skrawek. Pobrane zostaną średnie wartości dla każdej rany, z tego zostaną obliczone średnie wartości dla grupy.

Statystyka Gdzie będzie to stosowne dane zostaną opracowane tak, by otrzymać średnie wartości dla gru-

py oraz odchylenia standardowe. Ewentualne wartości odbiegające od przeciętnej będą również iden-tyfikowane. Następnie każda zmienna ciągła zostanie zbadana na homogenność wariancji testem Bartletta. Jeżeli wariancja jest homogenna, przeprowadzona zostanie analiza wariancji zmiennych. Jeżeli wykryte zostaną istotne różnice, możliwe różnice wewnątrzgrupowe zostaną ocenione testem Dunetta. Jeżeli wariancja jest heterogenna, każda zmienna zostanie zbadana na normalność metodą Shapiro-Wilk. W przypadku rozkładu normalnego, możliwe różnice wewnątrz grup zostaną zidentyfi-kowane testem t-Studenta. W przeciwnym przypadku możliwe różnice wewnątrz grup zostaną osza-cowane testem Kruskal-Wallis. Jeżeli nie wystąpią istotne różnice w obrębie grup, identyfikacja grup zostanie sprawdzona testem Wilcoxon Rank-Surn.

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona za pomocą programu SAS® (wersja 6.12), opi-sanego w „SAS/STAT® User Guide, Version 6, 4-te wydanie, tom 1+2", 1989, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina 27513, USA.

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie preparatu aktywnej substancji szkliwa do wytwarzania farmaceutycznych lub kosmetycznych kompozycji do leczenia ran w skórze lub błonie śluzowej.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycje są przeznaczone do po-prawy gojenia się ran w skórze lub błonie śluzowej.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że kompozycje są przeznaczone do regeneracji lub reparacji skóry lub błony śluzowej.

4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że rana występuje w błonie śluzowej jamy ustnej.

5. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że rana jest uszkodzeniem cielesnym lub urazem związanym z chirurgią jamy ustnej, w tym chirurgią okołozębową, usunięciem zęba(ów), leczeniem endodontycznym, umieszczaniem implantów zębowych, zastosowaniem i używaniem pro-tez zębowych.

6. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że rana jest wybrana z grupy składają-cej się z ran aseptycznych, ran tłuczonych, ran ciętych, ran szarpanych, ran niedrążących, ran otwar-tych, ran drążących, ran przebijających na wylot, ran kłutych, ran zakażonych, zawałów i ran podskórnych.

7. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że rana jest wybrana z grupy składają-cej się z owrzodzeń niedokrwiennych, ran uciskowych, przetok, ciężkich pogryzień, ran oparzeniowych oraz zranień spowodowanych pobraniem narządu do przeszczepienia.

8. Zastosowanie według zastrz. 1-4, znamienne tym, że raną jest pleśniawka, rana urazowa, lub rana związana z opryszczką.

9. Zastosowanie według zastrz. 1-8, znamienne tym, że aktywną substancją szkliwa jest ma-cierz szkliwa, pochodne macierzy szkliwa i/lub białka macierzy szkliwa.

10. Zastosowanie według zastrz 1-9, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa jest wy-brana z grupy składającej się z enamelin, amelogenin, białek innych niż amelogeniny, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, amelin (ameloblastyna, szeatlina), tuftelin oraz ich pochodnych i ich mieszanin.

PL 202 536 B1 27

11. Zastosowanie według zastrz. 1-10, znamienne tym, że czynna substancja szkliwa ma cię-żar cząsteczkowy najwyżej około 120x103 u, jak na przykład 100x103 u, 90x 103 u, 80x103 u, 70x103 u lub 60x 103 u określony metodą elektroforetyczną SDS Page.

12. Zastosowanie według zastrz. 1-11, znamienne tym, że preparat aktywnej substancji szkli-wa zawiera mieszaninę aktywnych substancji szkliwa o różnych ciężarach cząsteczkowych.

13. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że preparat aktywnej substancji szkli-wa składa się co najmniej z dwóch substancji wybranych z grupy składającej się z amelogenin, białek innych niż amelogeniny bogatych w prolinę, tufteliny, białek tuft, białek surowicy, białek śliny, ameliny, ameloblastyny, szeatliny oraz ich pochodnych.

14. Zastosowanie według zastrz. 1-13, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa ma cię-żar cząsteczkowy do około 40000 u.

15. Zastosowanie według zastrz. 1-14, znamienne tym, że aktywna substancja szkliwa ma cię-żar cząsteczkowy pomiędzy 5000 a około 25000 u.

16. Zastosowanie według zastrz. 1-15, znamienne tym, że główna część aktywnej substancji szkliwa ma ciężar cząsteczkowy około 20x103 u.

17. Zastosowanie według zastrz. 1-16, znamienne tym, że co najmniej część aktywnej substancji szkliwa jest w postaci agregatów lub po zastosowaniu in vivo jest zdolna do tworzenia agregatów.

18. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że agregaty mają wielkość cząstek od około 20 nm do około 1 μm.

19. Zastosowanie według zastrz. 1-18, znamienne tym, że zawartość białka w aktywnej sub-stancji szkliwa w preparacie jest w zakresie od 0,05% wag. do 100% wag,, jak np. około 5-99% wag., około 10-95% wag., około 15-90% wag. około 20-90% wag, około 30-90% wag, około 40-85% wag., około 50-80% wag., około 60-70% wag., około 70-90% wag, lub około 80-90% wag.

20. Zastosowanie według zastrz. 1-19, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna zawie-ra ponadto farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że farmaceutycznie dopuszczalną sub-stancją pomocniczą jest alginian glikolu propylenowego.

22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że farmaceutycznie dopuszczalną sub-stancją pomocniczą jest kwas hialuronowy lub jego sole lub pochodne.

23. Zastosowanie według zastrz. 1-22, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna zawie-ra 30 mg białka macierzy szkliwa i 1 mg alginianu glikolu propylenowego.

24. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że kompozycja nanoszona na rany dostarcza aktywną substancję szkliwa w ilości całkowitego białka na cm2 odpowiadającej od 0,01 mg/cm2 do około 20 mg/cm2, tak jak np. od około 0,1 mg/cm2 do około 15 mg/cm2.

PL 202 536 B1 28

Rysunki

PL 202 536 B1 29

PL 202 536 B1 30

PL 202 536 B1 31

PL 202 536 B1 32

Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 zł.