RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217019

(21) Numer zgłoszenia: 396080

(22) Data zgłoszenia: 25.08.2011

(13) B1

(51) Int.Cl.

C12N 7/00 (2006.01)

A61K 35/76 (2006.01)

A61K 35/66 (2006.01)

A61K 39/112 (2006.01)

C12R 1/42 (2006.01)

(54) Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga, specyficzne szczepy bakteriofagowe

oraz ich zastosowanie

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

04.03.2013 BUP 05/13

(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.06.2014 WUP 06/14

(73) Uprawniony z patentu:

PROTEON PHARMACEUTICALS SPÓŁKA AKCYJNA, Łódź, PL

(72) Twórca(y) wynalazku:

JAROSŁAW DASTYCH, Łódź, PL

JAROSŁAW DZIADEK, Łódź, PL

ELŻBIETA FORNAL, Łódź, PL

ANNA RUMIJOWSKA-GALEWICZ, Łódź, PL

ARKADIUSZ WOJTASIK, Łódź, PL

EWELINA WÓJCIK, Majków Mały, PL

(74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Andrzej Witek

PL

21701

9

B1

PL 217 019 B1

2

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga specyficznego wobec

wybranego szczepu bakterii i szczepy bakteriofagowe uzyskane tym sposobem oraz zastosowanie

bakteriofagów do wytwarzania preparatu do zapobiegania i zwalczania zakażeń zwierząt hodowla-

nych, zwłaszcza drobiu, patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów.

Celem wynalazku jest dostarczenie technologii produkcji preparatu przeciwbakteryjnego nada-

jącego się do stosowania jako dodatek paszowy dla drobiu i trzody chlewnej, który jednocześnie byłby

specyficzny wobec patogennych szczepów Salmonella ssp. wywołujących zachorowania na salmonel-

lozę, zwłaszcza u ludzi. Preparat powinien spełniać rygorystyczne wymogi bezpieczeństwa określone

dla dodatków paszowych. Obowiązujący od 1 stycznia 2006 w krajach Unii Europejskiej zakaz stoso-

wania antybiotyków w paszach dla zwierząt wytworzył ogromne zapotrzebowanie na niezawierające

antybiotyków dodatki paszowe o działaniu przeciwbakteryjnym.

Celem wynalazku jest dostarczenie preparatu, który mógłby zastąpić stosowane dotychczas an-

tybiotyki.

Nieoczekiwanie preparat taki udało uzyskać się w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga specyficznego wobec

wybranego szczepu bakterii, charakteryzujący się tym, że

a) uzyskuje się kolekcję szczepów bakteriofagowych zawierającą szczep bakteriofaga specy-

ficzny wobec wybranego szczepu bakterii,

b) prowadzi się hodowlę wybranego szczepu bakterii na jałowym medium hodowlanym,

c) próbki hodowli nanosi się na specjalną wielodołkową płytkę pomiarową, dodaje się zawiesi-

ny badanego szczepu bakteriofaga w różnych stężeniach i inkubuje się w temperaturze

37°C przez co najmniej 4 godziny,

d) do próbek hodowli dodaje się rezaurynę i kontynuuje się inkubację bez dostępu światła

w temperaturze 37°C przez co najmniej 3 godziny,

e) kontroluje się barwę lub fluorescencję hodowli i szczep bakteriofagowy zawarty w hodowli

która zachowała barwę niebieską lub nie wykazała istotnego wzrostu fluorescencji w po-

równaniu z próbą kontrolną identyfikuje się jako szczep bakteriofaga specyficzny wobec

wybranego szczepu bakterii, przy czym jako próbę kontrolną stosuje się jałową próbę pod-

daną takiej samej inkubacji,

f) namnaża się zidentyfikowany szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego szczepu

bakterii.

Korzystnie wybranym szczepem bakteryjnym jest szczep S. enterica serovar Enteritidis.

Ujawniony sposób nadaje się do łatwego i szybkiego skriningu dużych kolekcji bakteriofago-

wych oraz pozwala na łatwe określanie miana (siły litycznej) testowanych fagów co ma istotne zna-

czenie w zastosowaniach przemysłowych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu

do zapobiegania i zwalczania zakażeń zwierząt hodowlanych, zwłaszcza drobiu, patogennymi szcze-

pami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów, przy czym wytwarzany preparat jest prze-

znaczony do podawania zagrożonym zwierzętom wraz pokarmem lub wodą w odstępach od jednego

do siedmiu dni.

Korzystnie, wytwarzany preparat zapewnia co najmniej 200-krotne zmniejszenie poziomu zaka-

żenia przez tydzień po zaprzestaniu podawania.

Korzystnie, zwalczanym zakażeniem jest zakażenie drobiu patogennymi szczepami Salmonella sp.,

a do wytwarzania preparatu stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej ujawnione

w niniejszym zgłoszeniu szczepy zdeponowane dnia 7 czerwca 2011 roku w Polskiej Kolekcji Mikroor-

ganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM

F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep bakteriofaga nadający się do zapobiegania lub

zwalczania zakażeń patogennymi szczepami Salmonella sp. wybrany z grupy obejmującej: PCM

F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1).

Preparat według wynalazku opiera się na naturalnych składnikach ekosystemu i nie działa

w niekorzystny sposób na organizmy inne niż ściśle określone bakterie patogenne. Podczas gdy do-

stępne na rynku substytuty antybiotyków opierają się na substancjach, które tak jak np. kwasy orga-

niczne, modulują niespecyficznie florę bakteryjną, zapobiegając do pewnego stopnia wzrostowi niepo-

PL 217 019 B1 3

żądanych mikroorganizmów, to preparat według wynalazku gwarantuje, iż selektywnie ograniczane są

wyłącznie patogenne szczepy Salmonella ssp. Nieoczekiwanie okazało się również, że preparat we-

dług wynalazku nie utrzymuje się w organizmie człowieka lub zwierzęcia jeśli nie występuje Salmonel-

la ssp. W szczególnej realizacji preparat nadaje się do stosowania w produkcji zwierzęcej, zwłaszcza

do zwalczania zakażenia Salmonellą u drobiu.

Ujawnione w niniejszym zgłoszeniu szczepy bakteriofagowe zostały zidentyfikowane dzięki

sposobowi według wynalazku. Nieoczekiwanie posiadają one szeroką swoistość polegającą na lizie

co najmniej 4 określonych serotypów Salmonella, jak również są stabilne w chłodniczych warunkach

przechowywania co najmniej przez 3 miesiące. Ponadto mogą być one z sukcesem namnażane

w skali przemysłowej bez utraty aktywności i nie są specyficzne wobec probiotycznych bakterii

Lactobacillus.

W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku został on zilustrowany na załączonych figurach przed-

stawiających:

Figura 1: profile restrykcyjne dla wybranych bakteriofagów;

Figura 2: wykresy monitorowanych parametrów przeprowadzonych doświadczeń;

Figura 3: przykładowy obraz płytek ELISA tuż po dodaniu mieszaniny reakcyjnej oraz po trzech

godzinach inkubacji. Gęstość optyczna OD600 użytej zawiesiny szczepu S. enterica ser. Enteritidis

ATCC 13076 wynosząca 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 i 2.0 odpowiadała odpowiednio gęstości komórek 8 x 105,

1.05 x 106, 7.0 x 10

6, 3.5 x 10

7, 1.4 x 10

8 i 3.8 x 10

8;

Figura 4: wyniki badania stabilności temperaturowej wybranych bakteriofagów prowadzone

w ciągu trzech miesięcy w trzech różnych warunkach temperaturowych;

Figura 5: wyniki badania cytotoksyczności preparatu bakteriofagowego metodą czerwieni obo-

jętnej. Preparat zawierający sterylną mieszaninę bakteriofagów dodawano na 24 h do hodowli mysich

fibroblastów 3T3, po czym oceniano żywotność komórek za pomocą testu wychwytu czerwieni obojętnej;

Figura 6: wykrywanie pałeczek Salmonella w przeprowadzanym eksperymencie;

Figura 7: poziom CFU Salmonella w narządach wewnętrznych i jelitach 21-dnowych kurcząt.

Niniejszy opis został uzupełniony również o poniższe przykłady, które służą lepszemu zilustro-

waniu istoty przedmiotowego wynalazku. Przykłady te nie powinny być jednak utożsamiane

z pełnym zakresem wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Izolacja i charakterystyka bakteriofagów

Stworzenie banku szczepów (serowarów) Salmonella najczęściej izolowanych od ludzi i zwie-

rząt hodowlanych

Na wstępie przygotowano kolekcję 108 szczepów Salmonella ssp. składającą się z najczęściej

izolowanych serowarów (Tabela 1). Szczepy te są wykorzystywane w badaniach specyficzności

oczyszczonych bakteriofagów. Kolekcja obejmuje zarówno szczepy wzorcowe dostępne w publicz-

nych repozytoriach jak też izolaty pozyskane dzięki współpracy z firmą VETLAB, Brudzew

i z Sanepidem.

T a b e l a 1. Serowary Salmonella enterica i ich źródło.

Lp. Serowar Liczba szczepów Źródło

1 2 3 4

1 Berta 1 VetLab

2 Brandenburg 1 Sanepid

3 Coeln 1 VetLab

4 Colindale 1 VetLab

5 Derby 1 VetLab

6 Enteritidis 1

1 58

ATCC

Sanepid VetLab

7 Gallimarum Pullorum VetLab

8 Hadar 2 1

VetLab Sanepid

PL 217 019 B1

4

cd. tabeli 1

1 2 3 4

9 Heidelberg 1 VetLab

10 Infantis 6

1

VetLab

Sanepid

11 Mbandaka 1 VetLab

12 Moscow 1 VetLab

13 Newport 5 VetLab

14 Paratyphi 1 ATCC

15 Senfenberg 1 VetLab

16 Typhi 1 ATCC

17 Typhimurium 1 ATCC

1 Sanepid

10 VetLab

18 Virchow 9 Vetlab

Izolacja z próbek środowiskowych bakteriofagów aktywnych względem wybranych serowarów

wzorcowych szczepów Salmonella ssp.

Bakteriofagi zostały wyizolowane z próbek otrzymanych z Głównej Oczyszczalni Ścieków

w Łodzi oraz oczyszczalni ścieków w Tuszynie. Badania potwierdziły, że najbogatszym źródłem wiru-

sów są próbki pobrane z etapu separacji piasków (piaskownik), jednego z procesów oczyszczania

ścieków. Ponadto, bakteriofagi pozyskano z odchodów kurzych, dostarczonych przez prywatnego

hodowcę oraz firmę VetLab, specjalizującą się w badaniu czystości mikrobiologicznej ferm. Izolację

przeprowadzono z wykorzystaniem szczepów wzorcowych Salmonella enterica serowary: Typhimu-

rium, Enteritidis i Typhi oraz kilku szczepów środowiskowych. Do tej pory najlepiej scharakteryzowano

kilkanaście wybranych bakteriofagów (Tabela 2.).

T a b e l a 2. Otrzymane bakteriofagi i ich gospodarze.

Lp. Bakteriofag Źródło Gospodarz

1 1st1 oczyszczalnia S. enterica ser. Typhimurium LT2

2 1sent3 oczyszczalnia

S. enterica ser. Enteritidis ATCC 13076

3 1sent4 oczyszczalnia

4 3sent1 oczyszczalnia

5 4sent1 Prywatna ferma

6 6sent1 Prywatna ferma

7 5senti VetLab S. enterica ser. Enteritidis 65/S/10

8 8sent65 VetLab

9 8sent1748 VetLab S. enterica ser. Enteritidis 1748

10 2styp4 VetLab S. enterica ser. Enteritidis 13311 11 2styp5 VetLab

12 6styp1 Prywatna ferma

Wszystkie bakteriofagi wykorzystywane do dalszych eksperymentów zostały oczyszczone me-

todą pasaży do pojedynczej łysinki na płytkach z podłożem Luria-Bertani (LB). Procedura ta wymagała

przynajmniej 5-krotnego pasażowania.

PL 217 019 B1 5

Dla wyizolowanych wirusów, metodą płytkową, wstępnie określono specyficzność determinując

zdolność lityczną wyizolowanych bakteriofagów wobec 17 wybranych szczepów S. enterica, w tym 7

wybranych różnych serowarów, 9 szczepów serowaru Enteritidis izolowanych od ludzi lub zwierząt

hodowlanych oraz szczepów będących gospodarzami pozyskanych bakteriofagów (Tabela 3.). Dla

potwierdzenia wyników, badanie specyficzności wyizolowanych bakteriofagów powtórzono 3-krotnie.

T a b e l a 3.

Specyficzność wybranych bakteriofagów na wybranych szczepach wzorcowych i środowiskowych.

Bakteriofag

Serowary

S. enterica

1st1

1se

nt3

1se

nt4

3se

nt1

4se

nt1

5se

nt1

6se

nt1

8se

nt6

5

8se

nt1

74

8

2sty

p4

2sty

p1

6sty

p1

Typhimurium LT2 + - - + - + - + + - - +

Typhimurium 1751 - - + - - - - + - - - -

Typhi ATCC 13311 + - - + - + - + + + + +

Paratyphi A ATCC 19150 - - + - - - - + - - - +

Infantis 789 - - - - - - - - - - + -

Brandenburg 584 + - + + - + - + + - - -

Hadar 817 + - - + - - - + + - - -

Enteritidis D ATCC 13076 + + + + + + + + + - - +

Enteritidis 1748 + + + + - + - + + - - -

Enteritidis 65/S/10 + - + + - + + + + + + -

Enteritidis 249 + + + + + + nb + + - - nb

Enteritidis 1014/S/09 K-1 + + + + - + nb + + - - nb

Enteritidis 1192/S/09 K-8 + - + + - + nb + - - - nb

Enteritidis 1250/S/09 + - + + - + nb + + - - nb

Enteritidis 1446/S/09 K-31 + + + + - + nb + + - - nb

Enteritidis 1535/S/09 + + + + + + nb + + - - nb

Enteritidis 2050/S/09 K-4 + + + + + + nb + + - - nb

nb – nie badane

Otrzymane bakteriofagi, namnożone na szczepie gospodarza, zatężono za pomocą PEG8000.

Tak przygotowane próbki poddano procesowi izolacji genomowego DNA badanych bakteriofagów -

jest to procedura z wykorzystaniem cyrkoniowych kuleczek o średnicy 0,1 mm, a także z zastosowa-

niem ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi oraz komercyjnych systemów do izolacji genomowe-

go DNA.

Uzyskane DNA wykorzystywane jest w celu (1) analizy restrykcyjnej (trzy niezależne ekspery-

menty przy użyciu enzymu EcoRI) generującej różne profile restrykcyjne dla różnych bakteriofagów co

stanowi wstępną charakterystykę genetyczną bakteriofagów (Fig. 1). Dokładniejsza charakterystyka

genetyczna uzyskiwana jest na podstawie sekwencjonowania genomów bakteriofagów z naszej ko-

lekcji, wykonywanego z użyciem technik sekwencjonowania nowej generacji, zleconego firmie Macro-

gen. Analiza wyników takiego sekwencjonowania przeprowadzana jest przez nasz zespół naukowy.

Udało się ustalić, że pozyskane do tej pory sekwencje genomowego DNA wykazują wysoką homolo-

gię względem bakteriofagów z bardzo dobrze poznanej rodziny T5 i są bakteriofagami litycznymi.

P r z y k ł a d 2. Produkcja preparatu

Ustalenie i optymalizacja warunków namnażania bakteriofagów w hodowli komórek bakteryj-

nych Salmonella ssp. w skali laboratoryjnej

Optymalizację przeprowadzono z wykorzystaniem szczepu Salmonella enterica ser. Enteritidis

ATCC 13076. Optymalizacji poddano następujące parametry hodowli: objętość inoculum hodowli bak-

PL 217 019 B1

6

teryjnej i bakteriofagów, czas czystej hodowli i inkubacji hodowli zainfekowanej, temperaturę hodowli,

stopień napowietrzania, pH podłoża, oraz warunki indukcji cyklu litycznego.

Optymalną objętość inoculum hodowli bakteryjnej oceniono na 2 x 109 CFU na 0,5 l podłoża

hodowlanego. Zoptymalizowaną hodowlę prowadzono do gęstości optycznej OD600 = 0,5, co osiągano

w czasie 3 godzin. Optymalną temperaturą wzrostu hodowli bakteryjnej okazało się 37°C. Zoptymali-

zowany stopień napowietrzania hodowli osiągnięto przy 220 rpm w wytrząsarce firmy New Brunswick.

Optymalny wzrost hodowli obserwowano na podłożu LB o pH = 7,0. W prowadzonym procesie opty-

malizacji zaobserwowano, że optymalnym inoculum bakteriofagowym jest dodatek 10% objętości faga

o mianie 109 (50 ml na 500 ml hodowli), a optymalny wyjściowy stosunek bakteriofagów do komórek

bakteryjnych oceniono na 25 do 1. Przeprowadzone badania wykazały także, że wyizolowane bakte-

riofagi mają charakter lityczny i nie ma konieczności indukcji u nich cyklu litycznego. Odzysk iwanie

bakteriofagów prowadzono z wykorzystaniem ultrawirowania na ultrawirówce typu Beckman L-80.

Hodowle bakteryjne zainfekowane bakteriofagami po odpowiedniej inkubacji (patrz powyżej) wstępnie

odwirowywano przy obrotach 3700 g przez 30 min. Następnie supernatant przenoszono do probówek

wirowniczych typu Beckman i wirowano przez 2 godz. przy obrotach 200 000 g. Procedura ta pozwoli-

ła na równoczesne oczyszczenie i zagęszczenie preparatów fagowych.

Optymalizacja hodowli wzorcowych szczepów Salmonella spp w skali 10 litrów

W kolejnym etapie badań opracowano metodę namnażania bakteriofagów z wykorzystaniem 10

litrowego fermentera (robocza objętość 8 litrów). W tym celu przygotowywano 8 litrów podłoża LB,

które następnie sterylizowano przez 20 min w 120°C. Przed zaszczepieniem podłoże napowietrzano

do momentu uzyskania natlenia na poziomie 90% - 100%; temperatura podłoża: 37°C. Tak przygoto-

wane podłoże zaszczepiano 200 ml inoculum szczepu Salmonella Enteritidis 65. Inoculum stanowiła

16-godzinna hodowla bakteryjna o gęstości optycznej około OD600 = 5 (4,5-5 x 109 CFU/ml). Po za-

szczepieniu pobierano próbkę w celu pomiaru gęstości optycznej wyjściowej hodowli Salmonella Ente-

ritidis 65 (OD600). Dokonano pomiaru podstawowych parametrów hodowli oraz uzyskiwanej ilości

namnażanych cząstek fagowych (Tabela 4 i 5). Hodowlę prowadzono w fermentorze ze stałym napo-

wietrzaniem 1,3 lpm (objętość powietrza dostarczonego do pożywki w ciągu 1 minuty) i mieszaniem

50 rpm. Po 40 minutach zwiększano szybkość mieszania z 50 do 100 rpm. W trakcie namnażania

bakterii co 30 minut pobierano próby w celu określenia wartości gęstości optycznej hodowli (OD600).

PO uzyskaniu przez hodowlę bakteryjną gęstości optycznej o wartości OD600 = 0,48-0,55 do podłoża

dodawano zawiesiny fagowej - bakteriofag 3sent1, o znanym mianie w następujących ilościach:

- 800 ml w przypadku pierwszego doświadczenia,

- 700 ml w przypadku drugiego doświadczenia oraz

- 200 ml w przypadku trzeciego i czwartego.

Od tego momentu hodowlę prowadzono przez 4 h, przy stałym napowietrzaniu i mieszaniu

(j.w.); w celu śledzenia zmian gęstości optycznej hodowli oraz kinetyki namnażania bakteriofagów

próby pobierano co godzinę. Podczas procesu monitorowano następujące parametry hodowli: pH, pO2

(stopień natlenienia podłoża mierzony w %) i temperaturę podłoża oraz obroty mieszadła. Wyko-

rzystując oprogramowanie rejestrujące przebieg procesu odnotowano wszystkie monitorowane

parametry (Fig. 2), z wyjątkiem pierwszego doświadczenia, w którym z powodów technicznych nie

udało się uruchomić oprogramowania rejestrującego przebieg procesu. Podczas prowadzonych

doświadczeń obserwowano postępujący spadek poziomu rozpuszczonego tlenu w podłożu

(wzrost zużycia tlenu przez komórki bakteryjne był wynikiem namnażania się bakterii) oraz nie-

wielkie wahania pH w zakresie 7,2-6,7.

Bez względu na użytą objętość zawiesiny fagowej (od 200 do 800 ml, miano 1,3-2,3 x 109

PFU/ml) uzyskiwano wysokie miana namnożonego bakteriofaga na poziomie 109 PFU/ml.

T a b e l a 4. Parametry namnażania bakteriofaga 3sent1 w 10 litrowej hodowli szczepu Salmonella Enteritidis 65.

Stosowane objętości [ml]

Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3 Doświadczenie 4

Inokulum bakteryjne 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml

Zawiesina fagowa 800 ml 700 ml 200 ml 200 ml

OD600

PL 217 019 B1 7

Początek procesu 0,097 0,089 0,070 0,070

Przed dodaniem zawiesiny fagowej 0,488 0,501 0,501 0,535

1 h namnażania bakteriofaga 0,589 0,720 0,856 0,477

2 h namnażania bakteriofaga 0,150 0,286 0,632 0,198

3 h namnażania bakteriofaga 0,110 0,210 0,372 0,160

4 h namnażania bakteriofaga 0,068 0,182 0,320 0,166

T a b e l a 5. Liczba namnożonych cząstek fagowych 3sent1.

Gęstość zawiesiny fagowej [PFU/ml]

Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3 Doświadczenie 4

Wyjściowa zawiesina fagowa 2,32x109 PFU/ml 1,17x10

9 PFU/ml 1,33x10

9 PFU/ml 1,44x10

9 PFU/ml

1 h namnażania bakteriofaga 6,20x109 PFU/ml 1,05x10

9 PFU/ml 1,42x10

9 PFU/ml 4,94x10

9 PFU/ml

2 h namnażania bakteriofaga 5,54x109 PFU/ml 4,32x10

9 PFU/ml 5,98x10

9 PFU/ml 3,90x10

9 PFU/ml

3 h namnażania bakteriofaga 6,26x109 PFU/ml 3,84x10

9 PFU/ml 5,72x10

9 PFU/ml 5,80x10

9 PFU/ml

4 h namnażania bakteriofa-

ga

7,94x109 PFU/ml 4,16x10

9 PFU/ml 4,26x10

9 PFU/ml 3,16x10

9 PFU/ml

Podczas prowadzonych doświadczeń obserwowano postępujący spadek poziomu rozpuszczo-

nego tlenu w podłożu (wzrost zużycia tlenu przez komórki bakteryjne był wynikiem namnażania się

bakterii) oraz niewielkie wahania pH w zakresie 7,2-6,7. Po 4 h namnażania bakteriofaga wsad fer-

mentora wirowano 30 minut w 4°C przy 4500 rpm/min. Ponieważ zastosowane parametry nie pozwa-

lają na dokładne oddzielenie biomasy od cieczy pohodowlanej w następnym etapie supernatant za-

wierający cząstki fagowe poddawano dwukrotnej mikrofiltracji z zastosowaniem sytemu membranowego

do filtracji stycznej w celu oddzielenia pozostałej nie odwirowanej biomasy i sterylizacji preparatu.

WNIOSKI: Przeprowadzone procesy biotechnologiczne pozwoliły na opracowanie wstępnych

parametrów namnażania cząstek bakteriofagowych z wykorzystaniem bioreaktora w skali 10 litrów:

– Objętość podłoża - 8 litrów;

– Objętość inoculum Salmonella Enteritidis 65 (OD600=5; 4,5-5 x 109 CFU/ml) - 200 ml;

– Objętość zawiesiny fagowej (rzędu 109 PFU/ml) - 200 ml;

– Czas namnażania cząstek bakteriofagowych - 3 godziny;

– Wirowanie - 30 minut w 4°C przy 4500 rpm/min;

– Dwukrotna mikrofiltracja (membrana o wielkości por 0,22 (m);

– Mianowanie uzyskanego preparatu bakteriofagowego;

Opracowanie technologii procesu produkcji i oczyszczania zawiesiny bakteriofagowej

Etapy produkcji

1. Hodowla w bioreaktorze

Pierwszym etapem linii produkcyjnej jest namnożenie liczby cząstek bakteriofagowych specy-

ficznie niszczących komórki bakteryjne szczepów Salmonella ssp.. Dokonuje się to poprzez zaszcze-

pienie hodowli bakteryjnej w bioreaktorze (warunki omówione wcześniej) zawiesiną cząstek bakterio-

fagowych, które w trakcie procesu hodowli namnażają się w komórkach bakteryjnych doprowadzając

do ich lizy. Każdy z trzech bakteriofagów namnażany jest w osobnej hodowli. W naszych badaniach

do tej pory stosowany był klasyczny bioreaktor 10-litrowy (8 litrów objętości roboczej). W celu prze-

prowadzenia takiej hodowli stosuje się wcześniej przygotowane: (1) inoculum oraz (2) zawiesinę bak-

teriofagów dodawane po uzyskaniu przez hodowlę bakteryjną gęstość optyczną OD600. PO dodaniu

zawiesiny bakteriofagowej hodowlę prowadzi się 3 h do 4 h, a proces ten pozwala na uzyskanie wy-

sokiego miana namnożonego bakteriofaga na poziomie 109 PFU/ml. Po zakończonym procesie

namnożenia hodowla przenoszona jest w sposób sterylny za pomocą pompy perystaltycznej do

dalszego etapu procesu produkcji. W linii produkcyjnej planuje się wykorzystanie bioreaktorów

100-litrowych lub nowoczesnych jednorazowych toreb hodowlanych (do 15 litrów), które coraz częściej

z powodzeniem zastępują klasyczne bioreaktory.

PL 217 019 B1

8

2. Usuwanie biomasy

Hodowla bakteryjna podczas procesu w bioreaktorze nie ulega całkowitej lizie dlatego wymaga-

ny jest etap oddzielenia biomasy od cieczy pohodowlanej zawierającej cząstki bakteriofagowe.

W tym celu hodowla trafia w pierwszym etapie do wirówki, a następnie poddawana jest dwukrotnie

mikrofiltracji za pomocą systemu do filtracji stycznej z użyciem membrany o wielkości por 0,22 m.

Taka procedura zapewnia uzyskanie sterylnej zawiesiny bakteriofagów przy bardzo niewielkim spadku

miana cząstek fagów. Po zakończonym procesie filtracji hodowla przenoszona jest w sposób sterylny

za pomocą pompy perystaltycznej do dalszego etapu procesu produkcji. W przyszłości planuje się

rozbudowę tego etapu procesu poprzez zakupienie dodatkowych systemów co pozwoliłoby na prze-

prowadzenie obróbki materiału uzyskanego z jednej hodowli w bioreaktorze bez potrzeby czyszczenia

i sterylizacji używanego sprzętu w trakcie tego etapu.

3. Zatężanie produktu (opcjonalnie)

W zależności od zapotrzebowania na produkt, zawiesina bakteriofagowa może być zatężana

10-krotnie co pozwala na zwiększenie stężenia cząstek fagowych w danej objętości. Do tego celu

używany jest system do filtracji stycznej z zastosowaniem membrany ultrafiltracyjnej 30 lub 50 kDa

(w zależności od użytego faga). Proces ten pozwalana na 7,5-krotne zatężenie miana cząstek bakte-

riofagowych.

4. Usuwanie ewentualnych zanieczyszczeń endotoksyną

W celu wyeliminowania obecności pozostałości endotoksyny będącej efektem lizy komórek bak-

teryjnych zaindukowanej przez bakteriofagi w trakcie procesu biotechnologicznego, planuje się wyko-

rzystanie specjalnych kolumn z odpowiednim złożem do wyłapywania endotoksyn o wielkości i prze-

pustowości odpowiedniej do objętości preparatu zawierającej cząstki bakteriofagowe.

5. Przygotowanie produktu w fazie płynnej

Na tym etapie przeprowadza się łączenie uzyskanych w opisanych powyżej etapach różnych

bakteriofagów poprzez wymieszanie zawiesin tak aby każdy z nich w końcowym produkcie charakte-

ryzował się zbliżoną wartością miana. Do preparatu wybierane są bakteriofagi charakteryzujące się

zdolnością lizy największego spektrum szczepów bakteryjnych Salmonella spp. z posiadanej kolekcji.

Preparat taki następnie jest porcjowany. Proces przeprowadza się w ścisłych warunkach jałowych

i dodatkowo podczas porcjowania uzyskaną ostatecznie zawiesinę poddaje ponownej sterylizacji po-

przez jednorazowe filtry do mikrofiltracji (0,22 m).

6. Mikroenkapsulacja (opcjonalnie)

W zależności od tego czy wymagany jest produkt w postaci płynnej czy stałej planuje się wpro-

wadzenie technologii mikroenkapsulacji mającej na celu zamknięcie cząstek bakteriofagowych w kap-

sułkach alginianowych. Celem tego etapu jest stworzenie łatwo przyswajalnych kapsułek bezpiecznie

przechodzących przez układ pokarmowy i stopniowe uwalnianie zamkniętych bakteriofagów w miejscu

docelowym bez podrażniania całego organizmu.

P r z y k ł a d. 3. Badania efektywności i bezpieczeństwa preparatu

Badania in vitro

Opracowanie i optymalizacja wysokowydajnej, zautomatyzowanej kolorymetrycznej metody

pomiarowej aktywności preparatu bakteriofagów

W celu opracowania metody pomiarowej siły litycznej bakteriofagów wykorzystano dostępny

komercyjnie odczynnik pod nazwą alamarBlue®. Jest to barwnik wskaźnikowy, który pozwala na szyb-

ki i dokładny, ilościowy pomiar proliferacji oraz cytotoksyczności za pomocą reakcji barwnej. Łatwy

w użyciu odczynnik, wykorzystuje metodę opartą na zjawisku reakcji redukcji-oksydacji (REDOX),

podczas której rezazuryna zmienia barwę z niebieskiej (niefluorescencyjnej) na czerwoną (fluorescen-

cyjną) pod wpływem utleniania, spowodowanego metaboliczną aktywnością w komórkach. Zmiana

barwy jest łatwo dostrzegalna gołym okiem. Zmianę barwy można też zmierzyć spektrofotometrycznie

lub fluorymetrycznie. Nietoksyczny dla komórek, jest wyjątkowo przydatny w obserwacji różnicowania

między innymi komórek w hodowlach bakteryjnych. Test ten przystosowano do wykonywania na

96-dołkowych płytkach ELISA. Opracowano dwie metody pomiarowe z zastosowaniem alamarBlue.

W pierwszej metodzie oceniano siłę lityczną bakteriofagów. W pomiarach wykorzystywano tzw. roz-

twór mieszaniny roboczej (przygotowywanej tuż przed dodaniem do dołków na płytce ELISA) alamar-

Blue® + 20% jałowy roztwór Tween™80 (3 części alamarBlue

® + 1 część 20% jałowego r-ru Twe-

en™80) dodawanej do dołków zawierających zawiesinę badanych szczepów Salmonella o odpowied-

niej gęstości komórek oraz do dołków zawierających zarówno zawiesinę szczepu Salmonella o odpo-

wiedniej gęstości komórek z dodatkiem zawiesiny badanych bakteriofagów o odpowiednim mianie.

PL 217 019 B1 9

Pozwoliło to na wizualne określenie zdolności litycznej cząstek bakteriofagów względem badanych

szczepów Salmonella. Niebieskie zabarwienie dodanego do hodowli mieszaniny reakcyjnej alamar-

Blue® + 20% jałowy roztwór Tween™80 (3 części alamarBlue

® + 1 część 20% jałowego r-ru Twe-

en™80) świadczy o braku wzrostu badanego szczepu Salmonella i wysokiej zdolności litycznej bakte-

riofaga dodanego w odpowiednim stężeniu. Zmiana barwy niebieskiej na czerwoną mieszaniny reak-

cyjnej alamarBlue® + 20% jałowy roztwór Tween™80 (3 części alamarBlue

® + 1 część 20% jałowego

r-ru Tween™80), zachodząca pod wpływem utleniania, spowodowanego metaboliczną aktywnością w

komórkach świadczy o wzroście komórek Salmonella i o braku lub niskiej zdolności litycznej badanego

bakteriofaga w stosunku do danego szczepu Salmonella.

Poniżej zamieszczony jest szczegółowy protokół eksperymentalny umożliwiający ilościową oce-

nę siły litycznej bakteriofagów oraz rysunek przedstawiających wynik wybranego takiego eksperymen-

tu przeprowadzonego dla bakteriofaga 3sent1 względem szczepu Salmonella enterica ser. Enteritidis

ATCC 13076 (Fig. 3).

1. Do dołków pierwszego rzędu w kolumnach od 1 do 12 dodać po 100 ul zawiesiny szczepu

Salmonella spp. o odpowiedniej gęstości optycznej (OD600) odpowiadającej odpowiedniej

liczbie jednostek koloniotwórczych (CFU na 1 ml)1. Szczegółowo: zawiesiny o gęstościach

optycznych 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 i 2.0 odpowiednio do dołków 1 i 7, 2 i 8, 3 i 9, 4 i 10, 5

i 11 oraz 6 i 12.

2. Do dołków pierwszego rzędu w kolumnach od 1 do 6 dodać po 100 ul zawiesiny bakteriofa-

ga o gęstości 6,5 x 109. Stosunek objętościowy bakterii do zawiesiny cząstek fagowych

wynosi 1:1.

3. Analogicznie do dołków w drugim rzędzie dodać po 75 l hodowli o odpowiedniej gęstości

oraz po 125 l zawiesiny bakteriofagów. Stosunek objętościowy bakterii do bakteriofagów

wynosi 1:1,5.

4. Analogicznie do dołków w trzecim rzędzie dodać po 50 l hodowli o odpowiedniej gęstości

oraz po 150 l zawiesiny bakteriofagów. Stosunek objętościowy bakterii do bakteriofagów

wynosi 1:3.

5. Przygotować układ kontrolny, w kolumnach od 7 do 12 w rzędach od 1 do 3 zamiast zawie-

siny bakteriofaga dodać jałowe podłoże LB, co stanowi kontrolę wzrostu szczepu Salmonel-

la o określonych gęstościach. Dodatkowo, w kolumnie 3, rząd 6, 7 i 8 nanieść zawiesinę

bakteriofaga - kontrola jej jałowości oraz w kolumnie 7, w rząd 7 i 8 nanieść podłoże LB -

kontrola jałowości podłoża stosowanego do rozcieńczenia hodowli w układzie badanym

oraz kontrolnym.

6. Płytki ELISA przykryć jałowymi pokrywkami i inkubować przez 4 h w temp. 37°C. Po tym

czasie, do wszystkich dołków dodać po 50 l mieszaniny alamarBlue® + 20% Tween™80

2.

Ze względu na wrażliwość mieszaniny na działanie promieni słonecznych, płytki zakryć folią

aluminiową i poddawać dalszej inkubacji w temp. 37°C przez 3 h. Wizualnej obserwacji do-

konywać co 30 minut. 1Zależność pomiędzy wartością gęstości optycznej OD600 a wartością CFU określać doświadczalnie w kilku nieza-

leżnych eksperymentach. 2Przygotowywać tuż przed dodaniem do dołków na płytce ELISA (3 części alamarBlue

® + 1 część 20% jałowego r-ru

TweenTM

80).

Zmodyfikowany protokół pomiarowy umożliwia ocenę aktywności protekcyjnej bakteriofagów

przed wzrostem bakterii Salmonella Enteritidis. Zmiana barwy niebieskiej na czerwoną mieszaniny

reakcyjnej alamarBlue + 20% Tween80, zachodząca pod wpływem utleniania, spowodowanego meta-

boliczną aktywnością w komórkach świadczy o wzroście hodowli. Niebieskie zabarwienie dodanego do

hodowli mieszaniny reakcyjnej alamarBlue + 20% jałowy roztwór Tween80 świadczy o protekcyjnym

charakterze użytej zawiesiny fagowej, która uniemożliwiała rozwój komórek S. Enteritidis. Szczegółowy

opis postępowania:

1. Przygotować podłoże LB, porozlewać po 20 ml do stożkowych, płaskodennych kolbek

Erienmayera o pojemności 100 ml i wysterylizować w autoklawie.

2. Zaszczepić 20 ml jałowego podłoża LB, hodowlę inkubować przez noc w temp. 37°C na wy-

trząsarce (rpm=150). Tak przygotowaną zawiesinę, przechowywać w lodówce (temp. 4°C)

nie dłużej niż 1 tydzień i traktować jako inokulum do bieżących posiewów.

PL 217 019 B1

10

3. Pobrać 20 l inokulum szczepu S. Enteritidis i zaszczepić nim 20 ml jałowego podłoża płyn-

nego LB (w kolbach Erlenmayera o pojemności 100 ml). Hodowlę inkubować przez

1 godzinę w temp. 37°C na wytrząsarce (rpm=150).

4. Przygotowaną hodowlę rozcieńczyć w taki sposób, aby uzyskać zawiesiny, w których ilość

komórek w 1 ml wynosić będzie odpowiednio: 2000, 200 i 20 komórek. Używać do do-

świadczeń z zawiesiną fagową o charakterze protekcyjnym.

5. Do płytki jałowej płytki titracyjnej, 96-dołkowej do dołków w kolejnych kolumnach nanieść

zawiesiny komórek S. Enteritidis, charakteryzujących się różnymi gęstościami (100 l)

i dodać zawiesiny fagowej (100 l).

6. Przygotować układ kontrolny - kontrolę wzrostu bakterii będą stanowić hodowle bakteryjne

o różnych gęstościach, kontrolę jałowości preparatu fagowego będzie stanowić badana zawie-

sina fagowa, a kontrolę jałowości używanego podłoża będzie stanowić podłoże LB.

7. Płytkę titracyjną przykryć wieczkiem i inkubować w temp. 37°C przez 4 godziny.

8. Płytkę titracyjną przykryć wieczkiem i inkubować w temp. 37°C przez 4 godziny.

9. Płytkę titracyjną przykryć wieczkiem i zabezpieczyć folią aluminiową przed dostępem świa-

tła, a następnie inkubować w temp. 37°C przez 4 godziny. Po 4 godzinach inkubacji doko-

nać odczytu.

Badanie stabilności temperaturowej bakteriofagów

Analiza stabilności temperaturowej przechowywania bakteriofagów była prowadzona przez

3 miesiące w trzech różnych temperaturach: -20°C, +4°C oraz w temperaturze pokojowej. Stabilność

ta była mierzona poprzez określanie miana fagów metodą płytkową na początku eksperymentu, po

miesiącu oraz po trzech miesiącach przechowywania w w/w temperaturach. Bakteriofagi były zawie-

szone w podłożu LB po uprzednim namnożeniu i oczyszczeniu od komórek bakteryjnych. Wyniki ba-

dań wskazują, że niektóre bakteriofagi z posiadanej kolekcji, a mianowicie 3sent1, 8sent65

i 8sent1748 (Fig. 4), utrzymują swoje miano na poziomie rzędu wielkości w ciągu trzech miesięcy

w temperaturze przechowywania -20°C lub +4°C w przeciwieństwie do innych fagów np.: 1st1 czy

2styp5 (Fig. 4), co jest istotne z punktu widzenia trwałości produktu.

Badanie bezpieczeństwa preparatu bakteriofagowego

Oznaczanie poziomu endotoksyn

Oznaczanie stężenia endotoksyny (LPS) głównego składnika ściany komórkowej bakterii Gram-

-ujemnych dokonano za pomocą testu LAL (Limulus Amebocyte Lysate). W tym celu użyto gotowych

zestawów do kolorymetrycznego pomiaru poziomu i aktywności LPS:

1. Zestaw firmy Genscript (ToxinSensor LAL Endotoxin Assay Kit).

2. Zestaw firmy LONZA (QCL-1000 Endpoint chromogenie LAL Assay).

W testach tych LAL reaguje z endotoksyną znajdującą się w badanych próbkach wytwarzając

produkt, który następnie reaguje z chromogennym substratem umożliwiając ilościowy pomiar spektro-

fotometryczny. Natężenie barwy jest wprostproporcjonalne do stężenia endotoksyny. Badaniu zostały

poddane próbki zawierające fagi, pobrane w poszczególnych fazach procesu technologicznego (anali-

za efektywności ultrawirowania - próby A1-A2, analiza efektywności procesu zatężania przy użyciu

membran: 100 kDa - próby B1-B5, oraz 50 kDa - próby C1-C7). Uzyskane wyniki wskazują na obec-

ność znaczących ilości LPS w próbach po etapie zatężenia bakteriofagów (Tabela 6).

T a b e l a 6. Wyniki wykrytego stężenia LPS w analizowanych próbach.

Nr próbki Opis Stężenie LPS EU/ml

1 2 3

A1 Próba zawierająca osad (bakteriofagi) po ultrawirowaniu zawieszony

w buforze SM >10

6

A2 Próba zawierająca supernatant po ultrawirowaniu 106 345

B1 Próba wyjściowa - ciecz pohodowlana zawierająca bakteriofagi po

oddzieleniu bakterii i sterylizacji >10

6

B2 Preparat zatężony 10-krotnie (retentat) 156 389

B3 Przesącz (parmeat) – ciecz która przedostała się przez membranę

zatężającą 4 888

PL 217 019 B1 11

cd. tabeli 6

B4 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbie-rana jako permeat

55

B5 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbie-rana jako retentat

0,5

C1 Próba wyjściowa – ciecz pohodowlana zawierająca bakteriofagi po oddzieleniu bakterii i sterylizacji

211 327

C2 Przesącz (permeat) – ciecz która przedostała się przez membranę

zatężającą 25

C3 Preparat 10-krotnie zatężony (retentat) 1,36 x 1010

C4 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbie-rana jako retentat (pierwszy zbiór 100 ml)

1,69 x 109

C5 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbie-

rana jako retentat (drugi zbiór 200 ml) 1,32 x 10

9

C6 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbie-

rana jako retentat (trzeci zbiór 200 ml) 1,05 x 10

8

C7 Sól fizjologiczna płucząca membranę po zakończeniu procesu zbie-

rana jako retentat (czwarty zbiór 200 ml) 1 549

Badanie cytotoksyczności

Badanie przeprowadzono metodą wychwytu czerwieni obojętnej. Test przeprowadzono na płyt-

kach 96-dołkowych przy użyciu linii komórkowej 3T3. Komórki 3T3 to mysie nietransformowane fibro-

blasty standardowo wykorzystywane do badania toksyczności in vitro. Badaniom poddano preparat

zawierający mieszaninę trzech różnych bakteriofagów w serii 4 rozcieńczeń, pomiary wykonano

w duplikatach oraz w 5 niezależnych powtórzeniach. Na podstawie uzyskanych absorbancji wyliczano

procent żywotności porównując absorbancję uzyskaną w próbach badanych i w próbie kontrolnej tj.

komórkach inkubowanych w medium hodowlanym (Fig. 5).

Test cytotoksycznosci przy użyciu linii komórkowej 3T3.

1. W każdej studzience płytki 96 pozycyjnej umieścić 10 000 fibroblastów 3T3 w standardo-

wym medium hodowlanym i hodować przez 24 h w inkubatorze (37°C; 5% CO2).

2. Następnie zastąpić medium hodowlane preparatem rozcieńczonym w medium preparatem

bakteriofagowym i hodować przez kolejne 24 h (37°C; 5% CO2).

3. Po inkubacji usunąć medium z preparatem bakteriofagowym, przepłukiwać monowarstwę

fibroblastów PBS i inkubować ją z roztworem czerwieni obojętnej w PBS przez 3 h (37°C;

5% CO2).

4. Po usunięciu roztworu czerwieni obojętnej i przepłukaniu PBS komórki lizować, a ilość po-

chłoniętego barwnika oznaczać kolorymetrycznie.

Uzyskane wyniki wskazują, że nawet w wysokich stężeniach preparat nie wykazuje działania

cytotoksycznego co oznacza, że nie należy oczekiwać wystąpienia ostrej toksyczności przy zastoso-

waniu preparatu in vivo w dawkach sięgających co najmniej 108 bakteriofagów.

Badania in vivo

Efektywność i bezpieczeństwo stosowania prototypowego preparatu bakteriofagowego w pro-

tekcji przed salmonellozą u kurcząt brojlerów

Badania zostały przeprowadzone we współpracy z Uniwersytetem Warmińsko-Mazurskim i fir-

mą VETLAB.

Cel: Ocena możliwości zastosowania bakteriofagów w protekcji przed zakażeniami salmonello-

zą u kurcząt brojlerów.

Do infekcji kurcząt użyto szczep Salmonella enterica ser. Enteritidis 65/S/10 pozyskany od firmy

VETLAB, natomiast do przygotowania preparatu fagowego wykorzystano 3 bakteriofagi: 3sent1,

8sent65 i 8sent1748 wyizolowane z różnych szczepów Salmonella enterica (Tabela 3) i charakteryzu-

jące się szerokim spektrum specyficzności względem różnych serowarów Salmonella oraz względem

badanych szczepów serowaru Enteritidis. Na podstawie specyficzności tych trzech bakteriofagów

można założyć specyficzność kompletnego preparatu (Tabela 7). Preparat fagowy został przygotowa-

ny w ten sposób, że każdy z trzech bakteriofagów poddano zoptymalizowanej procedurze namnaża-

PL 217 019 B1

12

nia, a następnie zmieszano uzyskane zawiesiny fagowe tak aby każdy z nich w końcowym produkcie

charakteryzował się zbliżoną wartością miana. Przygotowano mieszaniny o dwóch różnych stęże-

niach bakteriofagów: wysokim wynoszącym 2,0 x 108 PFU/ml oraz niskim wynoszącym 2,0 x 10

6

PFU/ml. Następnie mieszaniny rozporcjowano i poddano sterylizacji poprzez mikrofiltrację. Zasto-

sowany preparat sprawdzony pod względem czystości mikrobiologicznej nie wykazywał obecności

bakterii.

T a b e l a 7 Specyficzność preparatu założona na podstawie specyficzności fagów wchodzących w jego skład.

Serowar Szczep 3sent1 8sent1748 8sent65 PREPARAT

1 2 3 4 5 6

Typhimurium LT2 + + + +

1751 - + -

Typhi ATCC 13311 + + + +

Paratyphi A ATCC 19150 - + -

Infantis 789 - - -

Brandenburg 584 + + + +

Hadar 817 + + + +

Enteritidis D ATCC 13076 + + + +

1748 + + + +

65/S/10 + + + +

249 + + + +

1014/S/09 K-1 + + + +

1192/S/09 K-8 + + -

1250/S/09 + + + +

14446/S/09 K-31 + + + +

1535/S/09 + + + +

2050/S/09 K-4 + + + +

Ferma „K” K-3 + + + +

Ferma „K” K-6 + + + +

Ferma „K” K-9 + - -

Ferma „K” K-10 + + -

Ferma „K” K-11 + - -

Ferma „K” K-12 + - -

Ferma „K” K-14 + + + +

Ferma „K” K-18 - - -

Pac K-parter - + +

Pac K-piętro + + + +

Woź K-6 + + + +

Woź K-7 + + -

Woź K-9 + + + +

64/S/10 + + + +

65/S/10 + + + +

PL 217 019 B1 13

cd. tabeli 7

1 2 3 4 5 6

517/S/09 + + + +

571/S/09 + + + +

833/S/09 + + + +

838/S/09 + - +

838/S/09 B + + + +

847/S/09 + + + +

848/S/09 + - -

865/S/09 + + + +

866/S/09 + + + +

945/S/09 + + + +

975/S/09 + + + +

1013/S/09 K-4 + + + +

1021/S/09 + + + +

1022/S/09 K-9 + + + +

1044/S/09 K-2 + - +

1047/S/09 K-1 + + + +

1048/S/09 K-8 + + + +

1061/S/09 K-5 - - -

1067/S/09 K-2 + - -

1067/S/09 K-3 + + + +

1085/S/09 MEK + + + +

1106/S/09 K-1 + + + +

1143/S/09 + + + +

1171/S/09 + + + +

1206/S/09 MEK + + + +

1231/S/09 + + + +

1250/S/09 + + + +

1257/S/09 K-7 + + + +

1422/S/09 MEK + + + +

1445/S/09 K-46 + - +

1465/S/09 MEK + + + +

1535/S/09 + + + +

1542/S/09 NWJ + + + +

1545/S/09 MEK + - +

1572/S/09 NWJ + + + +

1573/S/09 NWJ + + + +

1714/09 + + + +

1748 + + + +

2149/09 + + + +

2619/S/10 + + + +

PL 217 019 B1

14

Przebieg doświadczenia

Do badań użyto 150 kogutków Ross 308 podzielonych losowo na 5 równych grup utrzymy-

wanych w odizolowanych od siebie pomieszczeniach - boksach. Kurczęta żywione były standar-

dowymi mieszankami pełnoporcjowymi produkcji Agrocentrum Kolno. Warunki utrzymania kurcząt

były zgodne z zaleceniami producenta materiału hodowlanego. Kurczęta umieszczone w boksie 1,

2 i 3 zostały zakażone pałeczkami Salmonella Enteritidis w 4 dniu życia dawką 1 x 105 CFU na

sztukę (Tabela 8). Natomiast kurczęta z boksu 1 i 2 nie zostały zakażone pałeczkami Salmonella.

Preparat bakteriofagowy podawany był kurczętom umieszczony w boksie 1 (niskie stężenie 2,0 x 106

PFU/ml oznaczone jako FN), 2 i 5 (wysokie stężenie 2,0 x 108

PFU/ml oznaczone jako FW). Prepa-

rat bakteriofagowy podawano kogutkom przez pierwsze 14 dni życia 1 raz dziennie. Kurczętom

w boksie 4 i 5 nie podawano preparatu bakteriofagowego. Okres odchowu kurcząt wynosił 21 dni,

a w jego trakcie padło tylko 5 ptaków z różnych boksów (Tabela 8). Ponieważ wykryta śmiertel-

ność kurcząt była minimalna i nie była zależna od określonej grupy ptaków, więc nie mogła być

wynikiem podawania preparatu.

T a b e l a 8

Schemat podawania bakterii i bakteriofagów oraz przeżywalność ptaków.

Boks Zakażenie Salmonella Zastosowanie bakteriofagów Przeżywalność kurcząt

1 1 x 105 CFU na sztukę 2,0 x 10

6 PFU/ml 30/30

2 1 x 105 CFU na sztukę 2,0 x 10

8 PFU/ml 29/30

3 1 x 105 CFU na sztukę - 28/30

4 - - 30/30

5 2,0 x 108 PFU/ml 28/30

Wykrywanie pałeczek Salmonella

Pobieranie próbek na obecność pałeczek Salmonella odbywało się w następujący sposób (Fig. 6):

Badano odchody przez 21 dni eksperymentu,

Badano ściółkę gdzie pobierano wymazy podeszwowe w 3, 15 i 21 dobie życia ptaków,

Badano Brojlery 21-dniowe gdzie sprawdzano wątrobę, śledzionę oraz jelita,

Badano boksy przed wstawieniem piskląt gdzie pobierano wymazy ze ścian, karmideł,

kwoki poideł i podłogi - kontrola,

Badano pisklęta 1-dniowe gdzie sprawdzano narządy wewnętrzne, jelita i mekonium -

kontrola.

Pobrane próbki poddano badaniu na obecność pałeczek Salmonella w akredytowanym labora-

torium VETLAB, Brudzew. Laboratorium to, w 2008 roku otrzymało zatwierdzenie nr GIWhig-5120-

-23/08 Głównego Lekarza Weterynarii do wykonywania badań w kierunku obecności pałeczek Salmo-

nella metodą bakteriologiczno-jakościową.

W wyniku badania nie stwierdzono obecności pałeczek Salmonella w badanych próbkach na-

rządów wewnętrznych i jelit piskląt kurzych 1-dniowych, wyściółki z mekonium oraz wymazów czysto-

ściowych z boksów przed zasiedleniem. Brak pałeczek Salmonella lub różny poziom ich wykrywania

w przypadku analizy odchodów z 21 dni eksperymentu oraz podeszwy w 3, 15 i 21 dobie życia (Tabe-

la 9), a także narządów wewnętrznych 21-dniowych Brojlerów (Fig. 7) był zależny od badanego boksu

kurcząt. Mianowicie, u kurcząt w boksie 4 i 5 zgodnie z oczekiwaniem nie wykryto bakterii. U kurcząt

w boskie 3, zakażonych pałeczkami Salmonella, którym nie podawano preparatu, pałeczki wykrywane

są od 6 doby. Natomiast u kurcząt zakażony pałeczkami Salmonella z boksu 1 i 2 gdzie podawano

faga widoczne jest zahamowanie namnażania bakterii do momentu zaprzestania podawania prepara-

tu. Co ważne liczba wykrywanych pałeczek w narządach i jelitach 21-dniowych ptaków jest bardzo

niska w stosunku do kurcząt, którym nie podawano preparatu, a więc bakteriofagi zapobiegają nam-

nażaniu się bakterii, a tym samym pojawianiu się ich w odchodach eksperymentalnie zakażonych

ptaków. Można więc zaobserwować, że bakteriofagi zmniejszają około 200-krotnie poziom zakażenia

nawet tydzień po zaprzestaniu ich stosowania.

PL 217 019 B1 15

T a b e l a 9. Poziom obecności pałeczek Salmonella w odchodach podczas eksperymentu.

Doba Zakażenie Obecność pałeczek Salmonella Dodatek

faga Boks 1 Boks 2 Boks 3 Boks 4 Boks 5

FN+/S+ FW+/S+ F-/S+ F-/S- FW+/S-

1 - - - - - Tak

2 - - - - - Tak

3 2,5 x 103 - - - - - Tak

4 - - - - - Tak

5 - - - - - Tak

6 - - 1,0 x 101 - - Tak

7 - - + - - Tak

8 - - 5,3 x 103 - - Tak

9 - - + - - Tak

10 - - 1,0 x 104 - - Tak

11 - - + - - Tak

12 - 3,0 x 101 3,5 x 10

4 - - Tak

13 - - + - - Tak

14 - 2,0 x 103 5,5 x 10

3 - - Tak

15 4,1 x 103 1,0 x 10

2 1,5 x 10

3 - - Nie

16 + + + - - Nie

17 2,1 x 102 + 3,0 x 10

4 - - Nie

21 5,0 x 102 2,2 x 10

3 4,3 x 10

4 - - Nie

„-„ oznacza, że nie wykryto pałeczek Salmonella,

„+" oznacza, że wykryto pałeczki Salmonella ale trudno było określić ich miano.

Wykrywanie obecności bakteriofagów.

Próbki poddawane badaniom na obecność bakteriofagów pobierano z odchodów przez 21 dób

eksperymentu oraz z wymazów czystościowych z boksów przed zasiedleniem, przed zakażeniem oraz

dobę i tydzień po zakończeniu podawania bakteriofagów. Nie wykryto bakteriofagów w narządach we-

wnętrznych. Zaobserwowano, że brak bakteriofagów lub różny poziom ich wykrywania w odchodach

ptaków (Tabela 10) oraz podeszwy (Tabela 11) był zależny od badanego boksu kurcząt. Mianowicie,

w przypadku kurcząt z boksów 1, 2 i 5, którym podawano preparat, obserwowano obecność bakteriofa-

gów w odchodach, jednak liczba ich zmniejszała się wraz z zaprzestaniem podawania, a w przypadku

boksu 2 i 5, gdzie użyto większego stężenia bakteriofagów, fagi nie były już wykrywane. Warto dodać, że

w odchodach ptaków z boksu 5 wykrywano o wiele mniejszą liczbę bakteriofagów niż w przypadku bok-

su 2, co może wynikać z braku pałeczek Salmonella, a więc możliwości namnażania bakteriofagów.

T a b e l a 10. Poziom miana bakteriofagów w odchodach ptaków.

Doba

Miano bakteriofagów

Boks 1

FN+/S+

Boks 2

FW+/S+

Boks 3

F-/S+

Boks 4

F-/S-

Boks 5

F+/S-

1 0 0 0 0 0

3 0 1,8 x 107 0 0 5,6 x 10

2

10 8,0 x 106 5,5 x 10

4 0 0 5,0 x 10

3

15 1,2 x 107 5,0 x 10

1 0 0 8,2 x 10

2

17 1,7 x 104 0 0 0 0

21 5,0 x101 0 0 0 0

PL 217 019 B1

16

T a b e l a 11. Poziom miana bakteriofagów w analizowanych wymazach podeszwowych.

Doba

Miano bakteriofagów

Boks 1

FN+/S+

Boks 2

FW+/S+

Boks 3

F-/S+

Boks 4

F-/S-

Boks 5

F+/S-

Doba po zakończeniu podawania faga (15) 1,0 x 105 1,0 x 10

3 0 0 2,4 x 10

3

Tydzień po zakończeniu podawania faga (21) 6,5 x 105 0 0 0 0

Konkluzje z badań nad działaniem preparatu na brojlery

Na podstawie przeprowadzonych testów możemy stwierdzić, że preparat jest bezpieczny

i efektywny.

1. Preparat jest bezpieczny dla drobiu.

2. Bakteriofagi przechodzą przez układ pokarmowy i dostają się do odchodów i ściółki.

3. Bakteriofagi nie dostają się do narządów wewnętrznych ptaków.

4. Bakteriofagi znikają po zaprzestaniu podawania preparatu.

5. Bakteriofagi zapobiegają pojawianiu się bakterii w odchodach eksperymentalnie zaka-

żonych ptaków.

6. Bakteriofagi zmniejszają 200 krotnie poziom zakażenia tydzień po zaprzestaniu ich sto-

sowania.

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga specyficznego wobec wybranego szczepu

bakterii, znamienny tym, że

a) uzyskuje się kolekcję szczepów bakteriofagowych zawierającą szczep bakteriofaga

specyficzny wobec wybranego szczepu bakterii,

b) prowadzi się hodowlę wybranego szczepu bakterii na jałowym medium hodowlanym,

c) próbki hodowli nanosi się na specjalną wielodołkową płytkę pomiarową, dodaje się za-

wiesiny badanego szczepu bakteriofaga w różnych stężeniach i inkubuje się w tempera-

turze około 37°C przez co najmniej 4 godziny,

d) do próbek hodowli dodaje się rezaurynę i kontynuuje się inkubację bez dostępu światła

w temperaturze około 37°C przez co najmniej 3 godziny,

e) kontroluje się barwę lub fluorescencję hodowli i szczep bakteriofagowy zawarty w ho-

dowli która zachowała barwę niebieską lub nie wykazała istotnego wzrostu fluorescencji

w porównaniu z próbą kontrolną identyfikuje się jako szczep bakteriofaga specyficzny

wobec wybranego szczepu bakterii, przy czym jako próbę kontrolną stosuje się jałową

próbę poddaną takiej samej inkubacji,

f) namnaża się zidentyfikowany szczep bakteriofaga specyficzny wobec wybranego

szczepu bakterii.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wybranym szczepem bakteryjnym jest szczep

S. enterica srovar Enteritidis.

3. Zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu do zapobiegania lub zwalczania za-

każeń zwierząt hodowlanych, zwłaszcza drobiu, patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na dzia-

łanie tych bakteriofagów, przy czym wytwarzany preparat jest przeznaczony do podawania zagrożo-

nym zwierzętom wraz z pokarmem lub wodą w odstępach od jednego do siedmiu dni.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytwarzany preparat zapewnia co naj-

mniej 200-krotne zmniejszenie poziomu zakażenia przez tydzień po zaprzestaniu podawania.

5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że zwalczanym zakażeniem jest zakażenie

drobiu patogennymi szczepami Salmonella sp., a do wytwarzania preparatu stosuje się szczep bakte-

riofaga wybrany z grupy obejmującej: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep

8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1).

6. Szczep bakteriofaga nadający się do zapobiegania lub zwalczania zakażeń patogennymi

szczepami Salmonella sp. wybrany z grupy obejmującej: PCM F/00069 (szczep 8sent1748),PCM

F/00070 (szczep 8sent65) oraz PCM F/00071 (szczep 3sent1) i wykazujący stabilność w chłodniczych

warunkach przechowywania co najmniej przez 3 miesiące.

PL 217 019 B1 17

Rysunki

PL 217 019 B1

18

PL 217 019 B1 19

PL 217 019 B1

20

Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)