Oksydacyjnie modyfikowane i deaminowane zasady DNA jako czynnik epigenetyczny

Oxidation and deamination of nucleobases as an epigenetic tool

Jolanta Guz, Marek Jurgowiak, Ryszard Oliński

Katedra Biochemii Klinicznej, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Streszczenie

Omawiane w pracy wyniki badań wskazują, że 5-metylocytozyna (5mC) może ulegać hydrok-sylacji do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), a jej zawartość w genomie ssaków ocenia się na około 0,02–0,7% całkowitej zawartości cytozyny. Tak zmodyfikowana zasada jest związkiem po-średnim w procesie aktywnej demetylacji DNA i obecnie nazywa się ją „szóstą zasadą DNA”.

Chociaż aktywna demetylacja DNA pozostaje nadal zjawiskiem słabo poznanym, to uważa się, że uczestniczą w tym procesie trzy grupy enzymów:

•białkaTetkatalizująceprzemianę5mCdo5hmC,któranastępniemożebyćutlenianado5-for-mylocytozyny(5fC)i5-karboksylocytozyny(5caC);

•AID/APOBECdeaminujące5mC(lub5hmC)dotyminylub5-hydroksymetylouracylu(5hmU)błędnieparującegozguaniną;

•glikozylazaTDGuczestniczącawścieżcenaprawyDNAtypuBER,którausuwa5fC,5caCi5hmUzastępowanenastępniecytozyną,czegoefektemjestdemetylowanyDNA.

DziałanieglikozylazyTDG(i/lubinnychglikozylazDNA)prawdopodobniepoprzedzonejestdeaminacją5mCdotyminy,ponieważsubstratemdlaTDGsąbłędneparyG:T.Etapdeamina-cjizachodzizudziałembiałekrodzinyAID/APOBEC.MożliwejestwspółdziałanieTDGzwy-mienionymi deaminazami.

Wydajesię,żeobecność8-oksyguaniny(8-oksyGua)wDNAmanietylkoznaczeniemutagenne.Postulowanajestrolatejoksydacyjniezmodyfikowanejzasadywregulacjiekspresjigenów,po-przezudziałwprocesierelaksacjichromatyny.Możliwejest,że8-oksyGuawystępującawspe-cyficznych sekwencjach DNA może uczestniczyć w regulacji transkrypcji, co sugerowałoby epi-genetyczne znaczenie obecności tak zmodyfikowanej zasady w DNA.

Słowa kluczowe: czynnikiepigenetyczne•metylacjaDNA•aktywnademetylacjaDNA•oksydacyjnemodyfikacjeDNA•5-hydroksymetylocytozyna•8-oksyguanina

Summary

Recentdiscoverieshavedemonstrated that5-methylcytosine(5mC)maybehydroxymethyla-tedto5-hydroxymethylcytosine(5hmC)inmammalsandthatgenomicDNAmaycontainabo-ut0.02–0.7%of5hmC.TheaforementionedmodificationisthekeyintermediateofactiveDNAdemethylationandhasbeennamed“thesixthbaseinDNA”.

AlthoughactiveDNAdemethylationinmammalsisstillcontroversial,themostplausibleme-chanism/sofactive5mCdemethylationincludeinvolvementofthreefamiliesofenzymes;i)Tet,

Received: 2012.01.18Accepted: 2012.04.03Published: 2012.05.24

275® Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; 66

Reviewwww.phmd.pl® Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; 66: 275-286

e-ISSN 1732-2693

-

-

-

-

-

WproWadzenie

Postępywpoznaniusekwencjigenomowejróżnychorgani-zmów, w tym genomu człowieka, nie doprowadziły dotych-czas do pełnego zrozumienia zjawisk związanych z realizacją informacjigenetycznej.Tazkoleiwydajesiębezpośredniozależna od przejścia chromatyny upakowanej w luźniejsze domeny, dostępne dla białek enzymatycznych, a więc prze-mianyheterochromatynyweuchromatynę.Powiązanejestto zarówno z potranslacyjną modyfikacją histonów, jak i me-tylacjąbądźdemetylacjąDNA.Modyfikacjetakieokreślanesą jako zmiany epigenetyczne, regulujące organizację chro-matyny i ekspresję genów, nie wpływając bezpośrednio na sekwencjęnukleotydówwDNA.InteresującymprzykłademwpływumetylacjiDNAnafunkcjekomórekidalszetegokon-sekwencje dla losów organizmu jest pszczoła miodna (Apis mellifera). W przypadku tego owada wzór metylacji DNA komórkowego decyduje o tym czy dany osobnik przeobra-zi się w robotnicę, czy też pisany mu jest los królowej [50].

Najlepiej scharakteryzowanym markerem epigenetycznym jest grupa metylowa w pozycji 5 cytozyny. Około 3–4%

genomowej cytozyny ulega metylacji, a powstająca 5-mety-locytozyna (5mC) stanowi 0,75–1% ogółu zasad DNA typo-wejkomórkissaków[12].Pomimopowszechnegoprzeko-nania, że wzór metylacji DNA ustalany jest we wczesnych fazachrozwojuzarodkowegoiutrzymywanypodczasżyciaosobniczegoprzezmetylotransferazyDNA(DNMT),wy-niki badań pochodzące z ostatnich dwóch lat sugerują, że w komórkach ssaków możliwa jest także aktywna demety-lacja. W artykule omówiono wyniki prac, które wskazują na możliwość dynamicznej regulacji metylowania DNA, co z kolei sugeruje możliwość reprogramowania, jak się wydawało do niedawna nieodwracalnych, procesów okre-ślających charakter zróżnicowanej komórki. Zwrócono tak-że uwagę na wyniki badań, które sugerują nową, epigene-tycznąfunkcjęinnejobecnejwDNAcząsteczki,jakąjestoksydacyjnie zmodyfikowana guanina, w postaci 8-oksy-guaniny(8-oksyGua).

5-Hydroksymetylocytozyna – „szósta zasada dna”

Hydroksylowana pochodna 5mC, czyli 5-hydroksyme-tylocytozyna (5hmC), została po raz pierwszy opisana

whichisinvolvedinhydroxylationof5mCtoform5hmC,whichcanbefurtheroxidizedto5-for-mylcytosine(5fC)and5-carboxylcytosine(5caC);ii)deaminationof5mC(or5hmC)byAID/APOBECtoformthymineor5-hydroxymethyluracil(5hmU)mispairedwithguanine;iii)theBERpathwayinducedbyinvolvementofTDGglycosylasetoreplacetheabovedescribedbasemodification(5fC,5caC,5hmU)withcytosinetodemethylateDNA.

AplausiblescenarioforengagementofTDGglycosylase(orsomeotherG-Tglycosylase)isthro-ughpriordeaminationof5-mCtothymine,whichgeneratesaG:Tsubstratefortheenzyme.HerecytidinedeaminaseoftheAID/APOBECfamilywasimplicatedinthedeaminationstep.ItispossiblethatTDGmayactinconcertwiththesedeaminases.

ItseemsthatmutationsarenottheonlyeffectofoxidativelymodifiedDNAbases.These,asyet,understudiedaspectsofthedamagesuggestapotentialfor8-oxoguanine(8-oxoGua)toaffectgeneexpressionviachromatinrelaxation.Itispossiblethat8-oxoGuapresenceinspecificDNAsequencesmaybewidelyusedfortranscriptionregulation,whichsuggeststheepigeneticnatureof8-oxoGuapresenceinDNA.

Key words: epigeneticmodifications•DNAmethylation•activeDNAdemethylation•oxidativeDNAmodifications•5-hydroxymethylcytosine•8-oxoguanine

Full-textPDF: http://www.phmd.pl/fulltxt.php?ICID=997954

Word count: 4965 Tables: — Figures: 2 References: 61

Adresautora: prof. dr hab. Ryszard Oliński, Katedra Biochemii Klinicznej, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, ul. Karłowicza 24, 85-092 Bydgoszcz; e-mail: ryszardo@cm.umk.pl

Wykaz skrótów: 5caC – 5-karboksylocytozyna; 5fC – 5-formylocytozyna; 5hmC – 5-hydroksymetylocytozyna; 5hmU – 5-hydroksymetylouracyl; 5mC – 5-metylocytozyna; 8-oksydG – 8-oksy-2’-deoksyguanozyna; 8-oksyGua – 8-oksyguanina; AID – deaminaza cytydyny indukowana aktywacją limfocytów; BER – naprawa DNA przez wycinanie zasad; DNMT – metylotransferaza DNA; ESC – embrionalne komórki macierzyste; NER – naprawa DNA przez wycinanie nukleotydów; NLS – sygnał lokalizacji jądrowej; PCNA – jądrowy antygen komórek proliferujących; SMUG1,TDG,UNG – glikozylazy DNA.

Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: 275-286

276

-

-

-

-

-

w DNA ssaków, we wczesnych latach 70 ubiegłego wie-ku. Stwierdzono wówczas bardzo wysoki poziom tej zmo-dyfikowanej zasady, sięgający aż 15% zawartości genomo-wej cytozyny (C), w mózgach szczura, myszy i żaby [44]. Ponieważpóźniejszepraceniepotwierdziłytejrewelacji,przez następne 30 lat analiza 5hmC, nie cieszyła się spe-cjalnym zainteresowaniem badaczy [29]. W 2009 r. opu-blikowano wyniki dwóch prac, które jak się okazało przy-wróciły zainteresowanie tą modyfikacją DNA [30,53].

Z powodu znaczącej roli jaką odgrywa 5hmC w proce-sach fizjologicznych i stwierdzonego wysokiego poziomu tej zmodyfikowanej zasady w DNA, obecnie nazywa się ją często „szóstą zasadą DNA” [11].

5-Hydroksymetylocytozyna jest oksydacyjną modyfikacją 5mC, co sugeruje, że jej komórkowy poziom może zale-żeć od nasilenia stanu stresu oksydacyjnego. Nie uzyska-no jednak dowodów eksperymentalnych, wskazujących wyraźnie na taką zależność [53].

mecHanizmy odpoWiedzialne za aktyWną demetylację dna

Udział białek Tet w przekształceniu 5mC do 5hmC

5-Metylocytozynajest,jakwynikazwielubadań,ważnymelementemwregulacjiekspresjigenów.MetylacjaDNAodgrywa bowiem rolę w transkrypcyjnym wyciszaniu ge-nów i służy w komórce m.in. do wyciszania licznych se-kwencji powtórzonych, piętnowania rodzicielskiego, jak również wyłączania drugiego chromosomu X w komór-kachosobnikówżeńskich[24,40].PonadtowzórmetylacjiDNA to także konsekwencja demetylacji tej biomolekuły. Demetylacja DNA może być procesem pasywnym, zależ-nymodreplikacji,kiedyDNMTniemetylujenowozsynte-tyzowanego łańcucha DNA. W rezultacie druga runda re-plikacyjna, której nie towarzyszy metylacja zachowawcza, daje całkowicie niezmetylowany DNA. Demetylacja DNA może przebiegać również na drodze enzymatycznej nieza-leżnie od przebiegu cyklu podziałowego komórki [6,56].

Dotychczas zaproponowano kilka możliwych mechanizmów aktywnej demetylacji DNA u kręgowców. Należą do nich:• bezpośrednieusuwaniegrupymetylowejz5mC,zudzia-

łembiałkaMBD2b,• wycięcie5mCprzezglikozylazę(TDGlubMBD4)iza-

stąpieniecytozynąwwynikunaprawytypuBER,• przekształcenie5mCwtyminępoprzez jejdeamina-

cjęzudziałembiałekAID/APOBEC,anastępnieprzy-wrócenieparyG:CwwynikunaprawyBER,wktórejuczestnicząglikozylazyTDG[6,48,56].

Niedawno opublikowane wyniki badań wskazują, że w ak-tywnej demetylacji promotorów genów ulegających ekspre-sjimożerównieżuczestniczyćsystemnaprawyNER[49].Brakjestjednakpotwierdzeniatychobserwacjiwpóźniej-szych badaniach. Warto również nadmienić, że w wyni-kunaprawyNERusuwanesąmasywneadduktywDNA(bulky DNA adducts).

Według najnowszych badań istotną rolę w procesie de-metylacjiDNAmogąodgrywaćbiałkaTet (Ten-eleven-translocation) katalizujące konwersję 5mC do 5hmC [26,53] (ryc. 1).

GenTet1 wykryto w DNA chorych na ostrą białaczkę szpikową(acutemyeloidleukemia-AML)ztranslokacjąt(10;11)(q22;q23)[11].Wwynikutejtranslokacjidocho-dzidofuzjiN-końcowejczęścibiałkaMLL(myelo/lym-phoidleukemia,mixed-lineageleukaemia),zawierającejdomenę CXXC z C-końcową częścią białka Tet1, która za-wiera domenę katalityczną [31].

W 2009 r. zidentyfikowano u człowieka trzy białka, okre-ślane odpowiednio jako Tet1, Tet2 i Tet3 będące homolo-gamibiałekJBP1iJBP2,występującychuTrypanosoma i biorących udział w utlenianiu grupy metylowej tyminy. Wykazano przy tym, że enzym Tet1 człowieka nie mo-dyfikuje tyminy, ale może katalizować reakcję utlenienia 5mC do 5hmC w warunkach in vitro i w hodowlach ko-mórkowych [53]. W kolejnych eksperymentach potwierdzo-no podobną aktywność enzymatyczną pozostałych białek Tet, zarówno w przypadku komórek człowieka, jak i my-szy. Zaobserwowano również, że nadekspresja białek Tet skutkuje obniżeniem poziomu stężenia 5mC i wzrostem 5hmC[26,53].Ponadtoodnotowanoobniżeniepoziomu5hmC w mysich komórkach embrionalnych z obniżoną zawartością Tet1 [53]. Wszystkie enzymy należące do ro-dziny białek Tet są dioksygenazami zależnymi od jonów Fe(II)ia-ketoglutaranu, który podczas reakcji ulega de-karboksylacji do bursztynianu [36].

Udział białek Tet w demetylacji DNA oraz regulacji transkrypcji

Obecnie rozważanych jest kilka możliwych sposobów uczestnictwa białek Tet w demetylacji DNA i późniejszej regulacjiekspresjigenów.Pierwszymodelzakłada,że5hmC pojawiająca się jako produkt reakcji katalizowanej przez białka Tet, nie jest rozpoznawana przez metylotrans-ferazęDNA.Tozkoleimożeskutkowaćbrakiemmetyla-cji nowo zsyntetyzowanego łańcucha DNA podczas repli-kacji,prowadzącdodemetylacjipasywnej(ryc.1).Uważasię też, że 5hmC jest intermediatem, który odgrywa istot-ną rolę w aktywnej demetylacji, z zaangażowaniem me-chanizmunaprawytypuBER(szczegóływdalszejczęściartykułu)[4,11].Pojawieniesię5hmCzamiast5mCwse-kwencjach promotorowych może skutkować również obni-żeniempowinowactwabiałekwiążącychmetylowaneCpG(MBD)dotychsekwencji,cowkonsekwencjimożepro-wadzić do aktywacji transkrypcji [11].

W komórkach embrionalnych myszy wykazano podwójną rolę białka Tet1 w procesie regulacji transkrypcji i to za-równo aktywacyjną, jak i represyjną. W przypadku genów aktywnych transkrypcyjnie, Tet1 uczestniczy w hipomety-lacji obszarów promotorowych, co z kolei skutkuje wzro-stem poziomu ekspresji tych genów. Wykazano, że Tet1 wiążesiępreferencyjniezregionamicharakteryzującymisiędużązawartościądinukleotydówCpG.Zaobserwowanorównież,żewyspyCpGniezwiązanezbiałkiemTet1ce-chuje wyższa zawartość 5mC w porównaniu z wyspami CpGpromotorówgenów,doktórychprzyłączasięTet1.PrzyłączanieTet1dopromotorówgenówjestwięcodwrot-nie skorelowane ze stopniem ich zmetylowania. W my-sich komórkach macierzystych o obniżonej ekspresji genu Tet1 odnotowano znacząco wyższy poziom 5mC w pro-motorachgenówbogatychwdinukleotydyCpG,zwłasz-cza w miejscach wiązania białek Tet1, w porównaniu do

Guz J. i wsp. – Oksydacyjnie modyfikowane i deaminowane zasady DNA…

277

-

-

-

-

-

Ryc. 1. Mechanizmy demetylacji DNA ssaków (na podstawie [4], zmodyfikowane)

Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: 275-286

278

-

-

-

-

-

komórek kontrolnych. Obserwacje te mogą sugerować, że białka Tet1 są niezbędne do utrzymania stanu hipomety-lacji promotorów genów aktywnych transkrypcyjnie [55]. BiałkoTet1uczestniczyrównieżwhamowaniutranskryp-cji przez bezpośrednie wiązanie korepresora Sin3a, two-rzącego kompleks z deacetylazami histonów (HDAC) [54]. Na rolę Tet1 w represji transkrypcji wskazują obserwacje wspólnegowiązaniasięTet1ikompleksubiałekPolycomb2(polycombrepresorcomplex–PRC2)dotychsamychgenów.KompleksPRC2jestodpowiedzialnyzametylacjęlizyny w pozycji 27 histonu H3 (H3K27me3), rozpozna-wanąnastępnieprzezswoistebiałkaefektorowe,cowefek-cie prowadzi do hamowania procesu transkrypcji [4,8].

Sugeruje się, że białka Tet1 i Tet2 odgrywają rolę w utrzy-maniu pluripotencji komórek macierzystych, natomiast obecność Tet3 związana jest z procesem różnicowania komórkowego [36]. Niedobór Tet1 w embrionalnych ko-mórkach macierzystych myszy (embrionic stem cells – ESC)skutkujenasileniemmetylacjiwobrębiepromoto-raNANOGizahamowaniemekspresji,atozkoleimożeprowadzićdoutratypluripotencjikomórek[26].BiałkoNANOGuznawane jestzagłównyczynnikutrzymują-cy w stanie pluripotencji embrionalne komórki macierzy-ste.NadekspresjategobiałkawkomórkachESCzwięk-szaichaktywnośćproliferacyjną,powodującjednocześnieutrzymanie pluripotencjalnego charakteru komórek [41]. SupresjagenuNANOGpromujenatomiastróżnicowaniekomórek macierzystych.

GenTet3 wykazuje wysoką ekspresję w oocytach oraz powstających po zapłodnieniu zygotach. Ostatnie badania wskazują, że tuż po zapłodnieniu komórki jajowej, 5mC jest hydroksylowana do 5hmC tylko w męskim przedją-drzu.Możetosugerować,żeobserwowanaglobalnademe-tylacjagenomuojcowskiegoprzedfuzjąprzedjądrzyjestfaktycznieglobalnąhydroksylacją5mCzudziałemTet3[20,25,36].Pozmianiewzorumetylacjigenomuojcowskie-go poziom Tet3 ulega znacznemu obniżeniu. Aktywność Tet3 wzrasta ponownie kiedy komórki zaczynają różnico-wanie. Trwającemu różnicowaniu towarzyszy jednocze-śnie obniżenie zawartości Tet1 i Tet2 w komórkach [36].

GenomoWa zaWartość 5Hmc

O ile poziom 5mC jest dosyć stały w wielu typach tkanek i można go określić na około 4,5% całkowitej zawartości C, o tyle zawartość 5hmC waha się w szerokich granicach, w za-leżności od typu komórek, czy tkanek [11]. W wątrobie i ją-drach poziom 5hmC jest niski, podobnie jak w kulturach tkan-kowych [52]. W mięśniu sercowym i nerkach poziom 5hmC jest średni, a najwyższy stwierdzono w embrionalnych komór-kach macierzystych i ośrodkowym układzie nerwowym [19]. Szczegółowa analiza wykazała, że w siatkówce i móżdżku myszy poziom 5hmC wynosi około 0,3% zawartości cytozy-ny,natomiastwobszarachmózguzwiązanychzfunkcjąpo-znawczą, korze mózgowej i hipokampie, w granicach 0,7% [35].Ponieważostatniebadaniawskazują,żeprocesymety-lacji i demetylacji DNA związane są z kształtowaniem pa-mięci uważa się, że wzajemne przejście 5mC–5hmC może odgrywać rolę w kształtowaniu pamięci i rozwoju mózgu. Potwierdzajątoobserwacjewskazujące,żepoziom5hmCw hipokampie 90-dniowej myszy wzrasta dwukrotnie, w po-równaniu do zwierząt w pierwszym dniu życia [35].

Bardzomałązawartość5hmCstwierdzonowkomórkachnowotworowych [32]. W tkance nowotworowej jelita gru-bego poziom tej modyfikacji wynosił 0,02–0,06%, pod-czas gdy w „zdrowej” tkance obrzeża nowotworu, mie-ścił się w granicach 0,46–0,57%, całkowitej zawartości nukleotydów.

Początkowodominowało twierdzenie,że formowanie5hmC jest prostym sposobem na reaktywację genów wy-ciszonych poprzez metylację cytozyny, ale ostatnie bada-nia wykluczają raczej taką możliwość, ponieważ wysoki poziom 5hmC nie zawsze koreluje ze wzmożoną aktywa-cją transkrypcji [14,42,54,55,57].

W genomie embrionalnych komórek macierzystych naj-wyższą zawartość 5hmC stwierdzono w miejscach star-tu transkrypcji i wzdłuż sekwencji obszarów kodujących genu, z wyraźną przewagą występowania tej zmodyfiko-wanej zasady w eksonach, w porównaniu z sekwencjami intronowymi [14,54,55,57]. W mózgu dorosłego człowie-ka zdecydowanie wyższy poziom 5hmC stwierdzono w re-gionach promotorowych niż w sekwencjach obszarów ko-dujących genów. Stwierdzono także różnice w dystrybucji 5hmC w genach myszy między komórkami zróżnicowany-mi, takimi jak neurony i embrionalnymi komórkami ma-cierzystymi, co wskazuje, że taka modyfikacja zasad może odgrywać odmienną rolę w regulacji transkrypcji w obu wspomnianych typach komórek [8].

Większość uzyskanych wyników badań dotyczących em-brionalnych komórek macierzystych zgodnie wskazuje, że 5hmC jest umiejscowiona zarówno wzdłuż aktywnych, jak i nieaktywnych genów, których promotory zawierają śred-niązawartośćsekwencjiCpG[8].

Wiązanie białka Tet1, zarówno z metylowanymi sekwen-cjamiCpG, jak izawierającymi5hmC,potwierdzarolętego enzymu w konwersji 5mC do 5hmC [59] i być może dalszejkonwersjido5fCi5caC.

Potwierdzeniemwynikówbadańdotyczącychdystrybucji5hmC w embrionalnych komórkach macierzystych my-szysą rezultatypracdotyczącychpreferencyjnegowią-zania białka Tet do DNA. Takie wiązanie zlokalizowano wmiejscachstartutranskrypcji.Interesującesąwynikiba-dań, które wykazują, że brak Tet1 powoduje wzrost zawar-tości 5mC w miejscach startu transkrypcji [8].

cHarakterystyka GenóW i białek tet

PoznaneussakówenzymyTet1,Tet2 iTet3kodowanesąprzez trzyodrębnegeny.GenTet1 zlokalizowany na chromosomie 10q21, zawiera 12 eksonów obejmujących 134 kpz i koduje białko składające się z 2136 aminokwa-sów. Tet2 umiejscowiony na chromosomie 4q24 zawiera 11 ekso nów i obejmuje obszar 96 kpz. W wyniku alterna-tywnegosplicingupowstajątrzyizoformybiałkaTet2,zbu-dowane odpowiednio z 2002, 1164 i 1194 aminokwasów. GenTet3 znajduje się na chromosomie 2p13, ma długość 61,8kpzizawiera9eksonów.Zidentyfikowano3izofor-my białka Tet3 składające się odpowiednio z 1660, 1440 i 728 aminokwasów [34]. Wszystkie białka Tet zawierają potrzymiejscawiązaniajonówFe(II),orazjednomiejscewiązania a-ketoglutaranu. Dodatkowo białko Tet1 zawiera

Guz J. i wsp. – Oksydacyjnie modyfikowane i deaminowane zasady DNA…

279

-

-

-

-

-

3motywyNLS(sygnałlokalizacjijądrowej,nuclearloca-lization signal) oraz domenę CXXC wiążącą cynk, która jestobecnawewszystkichmetylotransferazachDNAibiał-kachMBDwiążącychmetylowaneDNA[34].Wprzypad-ku Tet1 region bogaty w reszty cysteinowe (cysteine-rich domain–CD)orazmotywDBSH(double-strandedb-he-lix)tworządomenękatalitycznąenzymu.

białka tet a noWotWory

Pierwszeprzesłankisugerujące,żebiałkaTetmogąbyćza-angażowane w proces kancerogenezy i powstawania nie-których postaci białaczek pojawiły się wraz z identyfika-cjąTet1upacjentówzostrąbiałaczkąszpikową(AML),będącychnosicielami translokacji t(10;11) (q22;q23).Kolejne badania wykazały jednak, że w licznych przy-padkach białaczek mutacje najczęściej występują w ge-nie Tet2 [11,34]. Somatyczne mutacje Tet2 obserwowano wostrychbiałaczkachszpikowych(AML),przewlekłychrozrostachmieloproliferacyjnych(MPN–chronicmyelo-proliferativeneoplasms),zespołachmielodysplastycznych(MDS),przewlekłychbiałaczkachmielomonocytowych(CMML–chronicmyelomonocytic leukemia).Mutacjepunktowe dotyczą głównie domeny katalitycznej biał-ka Tet2, skutkując zakłóceniem przekształcania 5mC do 5hmC.Potwierdzajątobadania,wktórychkomórkiszpi-ku kostnego pacjentów z ostrą białaczką szpikową, z mu-tacją Tet2, wykazywały znacząco niższy poziom 5hmC w porównaniu do osób zdrowych [11,28].

Udział białek tet W przekształcaniU 5Hmc do 5-formylocytozyny (5fc) i 5-karboksylocytozyny (5cac)

Jak już wspomniano 5hmC powstaje z 5mC, jako produkt reakcji katalizowanej przez rodzinę enzymów Tet. Okazało się jednak, że 5hmC nie jest końcowym produktem reak-cji enzymatycznej katalizowanej przez Tet. W warunkach in vitro oczyszczone białko enzymatyczne przekształca 5hmCdo5fCidalejdopostaci5caC(ryc.1).Wmacie-rzystych komórkach embrionalnych myszy wykrywa się niewielkie ilości obu pochodnych powstających z prze-mian 5hmC. Są to wartości 10–100 razy niższe, niż poziom 5hmC [11,23,46]. Wskazuje to, że dynamiczne możliwo-ści przekształcania genomu były dotąd przez badaczy nie wpełnidoceniane.Zarówno5fCjaki5caCsąsubstrata-midlaglikozylazyTDG[23].

Przypuszczasię,że5caCmożebyćbezpośrednioprze-kształcana w C z udziałem niezidentyfikowanej do tej pory dekarboksylazy [26]. Jednak bardziej prawdopodob-na w tych przemianach wydaje się ścieżka metaboliczna, którawymagaudziałumechanizmunaprawytypuBER,adokładniejglikozylazyTDG,wusuwaniu5caC/5fCiza-stąpieniutychpochodnychcytozyną[9,10,23].UsunięciegenuTDGumyszy(nokautgenetyczny)jestwskutkachletalnejużwfazierozwojuembrionalnegoizwiązanezza-kłóceniami wzoru metylacji DNA [10]. Niezbędność biał-kaTDGwprzebiegurozwojuembrionalnegopozwoliłanawysunięcie wniosku, że demetylacja jest związana z wcze-śniejszą deaminacją 5mC i przekształceniem w tyminę zudziałemAID(ryc.1),ponieważkanonikalnymsubstra-temdlaTDGsąbłędneparyG:T.LetalnośćembrionalnamyszyzbrakiembiałkaTDGprawdopodobniewynikanietylkozfaktuzaburzeniademetylacjiDNA,aletakżebyć

może z braku bezpośredniej aktywacji transkrypcji wielu genów.BiałkoTDGoddziałujebowiemzwielomaczyn-nikami transkrypcyjnymi, w tym z receptorami retinoido-wym, estrogenowym, tyroidowym [10].

SubstratemdlaTDGsątakżebłędneparyzasad5fC:Gi5caC:G.Cociekawe,wlizatachembrionalnychkomó-rek macierzystych wykazano aktywność glikozylazy wy-cinającej 5caC z oligonukleotydów, natomiast w komór-kachpozbawionychTDG,takiejaktywnościniewykazano[23].Wiadomotakże,żenadekspresjaTDGprowadzidoobniżenia poziomu 5caC, natomiast obniżenie aktywno-ści enzymu związane jest z akumulacją tak zmodyfikowa-nej zasady [23].

deaminacja 5mc do tyminy katalizoWana przez aid/apobec i aktyWna demetylacja z Udziałem Glikozylazy tdG

PonaddekadętemuodkrytowDNAlimfocytówBgen,któregoproduktpełnifunkcjędeaminazycytozyny,prze-kształcającejcytozynęwuracyl(activation–inducedcy-tidinedeaminase–AID,deaminazacytydynyindukowanaaktywacjąlimfocytówB)[38].Obecnośćuracyluwgenachkodującychimmunoglobuliny(Ig)jestjednymzczynni-ków prowadzących do powstania różnorodności przeciw-ciał i pełni ważną rolę zarówno w procesie somatycznych hipermutacji, jak i somatycznej rekombinacji prowadzą-cej do przełączania izotypów przeciwciał [39].

Wostatnichlatachwykazano,żeAIDzaangażowanajesttakże w proces aktywnej demetylacji DNA [3,10].

PierwszeeksperymentalnedowodywskazującenaudziałAIDwprocesieaktywnejdemetylacji5mCopierająsięnawynikach pracy opublikowanej w 2008 roku [48]. W ba-daniach prowadzonych na zarodkach danio pręgowanego (zebrafish) udowodniono, że aktywne usuwanie grupy me-tylowejz5mCwymagaobecnościbiałekAIDiMBD4.W wyniku deaminacji 5mC powstaje tymina (w parze z gu-aniną), która następnie jest usuwana i zastąpiona przez cy-tozynęporozpoznaniuuszkodzeniaprzezMBD4.WynikiRaiiwsp.[48]sugerująrównież,żedoaktywnejdemetyla-cjiwymaganejesttakżenieenzymatycznebiałkoGadd45,niezbędnedopromowaniainterakcjimiędzyAIDiMBD4.WynikipracyPoppiwsp.[47]sugerująpodobnąrolębiał-kaAIDwglobalnejdemetylacjiDNA,jakazachodzipod-czaspóźnychstadiówembriogenezyumyszy.PotwierdziłytobadaniadotyczącemyszypozbawionychAID(AID–/–), których pierwotne komórki zarodkowe wykazywały wzrost hipometylacji w obrębie całego genomu [37]. Obecnie su-gerowanyjesttakżeudziałinnejniżAIDdeaminazycy-tozynyzrodzinyAPOBEC,wprocesieaktywnejdeme-tylacji podczas rozwoju embrionalnego myszy ponieważ zwierzętapozbawioneAIDniewykazująznaczącychde-fektówwrozwojuosobniczym[47].

Badaniadotyczącereprogramowaniajądrowego(nuclearreprogramming) dostarczyły pierwszych znaczących do-wodównaudziałAIDwaktywnejdemetylacjiDNAko-mórek ssaków [3]. W niedzielących się heterokarionach, powstałychwwynikufuzjiembrionalnychkomórekma-cierzystych myszy z ludzkimi fibroblastami, obserwowa-no szybką demetylację regionów promotorowych genów

Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: 275-286

280

-

-

-

-

-

OCT4iNANOG,któresąodpowiedzialnezautrzymaniepluripotencji komórkowej. Opisane wyżej zjawiska były zależneodbiałkaAIDponieważspadekpoziomutegoen-zymu związany był z zablokowaniem demetylacji promo-torów genów i ograniczeniem ich ekspresji.

ZaangażowaniebiałkaAIDwprocesdeaminacji5mCizwiązaneztymutworzeniebłędnychparzasadG:Tsu-gerujeudziałścieżkinaprawyBERwprocesieaktywnejdemetylacji. Obniżenie poziomu 5hmC i 5mC możliwe jest w sposób pasywny jako wynik replikacji i podziału komórki. Nie ulega jednak wątpliwości, że spadek pozio-mu metylacji możliwy jest także w wyniku aktywnej de-metylacjiwkomórkachniereplikujących.UroślinproceszależnyodścieżkinaprawczejBERjestznanyoddawnai został dobrze scharakteryzowany [4]. Wymaga on zaan-gażowania swoistej glikozylazy bezpośrednio usuwającej 5mC[16].Wkomórkachssakównieznalezionoenzymu/ówo podobnej aktywności. Wyniki badań przeprowadzonych w ostatnich latach sugerują inny mechanizm aktywnej de-metylacji w komórkach ssaków, który jednak wymaga za-angażowania enzymów biorących udział w naprawie typu BER[10,21].Dwieglikozylazy,którewystępująwkomór-kach ssaków mogą brać udział w procesie aktywnej deme-tylacji.SątobiałkaTDGi/lubSMUG[10,21].Obiegliko-zylazymogąbyćzaangażowanewproceswycinaniaTi/lubproduktówoksydacji5-hydroksymetylouracylu (5hmU)parzasadzG,cosugeruje,żedziałająonewkompleksiezbiałkamiTetiAID/APOBEC[10,21].Myszypozbawio-neTDG(TDG–/–) giną w 9–10 dniu rozwoju embrionalne-go, co wskazuje, że obecność tej glikozylazy jest niezbęd-na w procesie demetylacji i w prawidłowej ontogenezie. W badaniach immunocytochemicznych wykazano bezpo-średniąinterakcjępomiędzybiałkamiTDGiAID[10].

aktyWna demetylacja W komórkacH ssakóW jako odpoWiedź na bodziec zeWnętrzny

Zdecydowana większość prac opisujących aktywną deme-tylację dotyczyła macierzystych komórek embrionalnych. Demetylacja DNA jest procesem zachodzącym w trakcie regulacji aktywności genomu komórek „dojrzałych”, w od-powiedzi na bodziec zewnętrzny bądź czynnik sygnaliza-cyjny. Obserwowana jest we wczesnych etapach rozwoju osobniczego (komórki zarodkowe) i w wysoce wyspecja-lizowanych komórkach postmitotycznych (neurony) [4].

Jednym z najbardziej interesujących zjawisk jest proces aktywnej demetylacji regionów promotorowych genu mó-zgowegoczynnikaneurotropowego(brain–derivedneu-rothropicfactor–BDNF)iczynnikawzrostufibroblastów(fibroblastgrowthfactor1–FGF1)wneuronachpostmi-totycznych [4].

ZpracyGuoiwsp.[21]wynika,żezademetylacjęDNAkomórekHEK293odpowiedzialnejestwzajemneoddzia-ływaniemiędzybiałkamiTet,AID/APOBECiglikozylaza-miuczestniczącymiwścieżcenaprawytypuBER.Procesrozpoczyna konwersja 5mC do 5hmC, po której następuje indukowanaenzymatycznie(AID/APOBEC)deaminacja5hmCdo5hmU,któryjestwycinanyinastępniezamie-nianynacytozynęwprocesieBER.Wykazano,żerzeczy-wiścieglikozylazyTDGiSMUGsązaangażowanewtentyp naprawy [10,21,23].

Inneprzykładyaktywnejdemetylacjiwodpowiedzinado-cierający do komórki sygnał obserwowano w trakcie sty-mulacjilimfocytówTprzezinterleukinę2,podczasodpo-wiedzi immunologicznej oraz stymulowanej estrogenami odpowiedzitransformowanychkomórekrakapiersi[4].

czy 8-oksyGUa jest czynnikiem epiGenetycznym?

Najlepiej poznaną i wszechstronnie badaną, oksydacyjną modyfikacją DNA o właściwościach mutagennych, jest 8-oksy-2’deoksyguanozyna (8-oksydG),opisywana teżjako postać tautomeryczna 8-hydroksy-2’deoksyguano-zyna(8-OHdG)[58].

Oksydowana guanina jest jednym z najczęściej powstają-cych produktów modyfikacji zasad DNA przez reaktyw-neformytlenu.Takzmodyfikowanaguaninamożetwo-rzyć stabilne pary zasad, zarówno z cytozyną jak i adeniną. W tym ostatnim przypadku może to prowadzić do trans-wersjiGC®TA. W badaniach in vivo wykazano, że obec-ność8-oksyGuawDNAjestodpowiedzialnazazamianęguaniny w tyminę, podczas procesu replikacji (z często-ścią0,7%)[7].Biorącpoduwagęfunkcjonującewkomór-kachmechanizmynaprawy,któreefektywnieusuwajątakązmodyfikowanązasadęmożnazałożyć,że8-oksyGuamasłabe właściwości mutagenne [58].

Wydaje się, że indukowane zmiany mutacyjne nie są je-dynym skutkiem obecności zmodyfikowanej guaniny wDNA.Rozważanyjestteżmożliwywpływ8-oksyGuana ekspresję genów, poprzez udział w relaksacji konkret-nych domen chromatyny.

Dane, które sugerują możliwość regulacji transkrypcji zudziałem8-oksyGuapochodzązpracdotyczącychgenów,których aktywność regulowana jest przez estrogeny [45], genów regulowanych stanem hipoksji [18,43] i pozostają-cychpodwpływemczynnikatranskrypcyjnegoMyc[2].

W 2008 roku wykazano, że ekspozycja komórek na estro-gen związana jest z wyraźnym wzrostem poziomu 8-oksy-Guawregionachpromotorowychdla17b estradiolu [45]. Jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za remodelo-wanie chromatyny, poprzez jej relaksację, może być wy-cinanie8-oksyGuazudziałemglikozylazyOGG1wre-gionachpromotorowychniektórychgenów.Ekspozycjakomórek na estrogen związana jest ze wzrostem poziomu 8-oksyGuawDNAirekrutacjąOGG1oraztopoizomera-zyIIb(TopoIIb) w miejscu występowania elementów od-powiedzinaestrogen(ERE), regionówpromotorowychgenów odpowiedzi na 17bestradiol(E2).UmiejscowieniekompleksureceptoraE2wokreślonychobszarachchroma-tyny jest powiązane z demetylacją lizyny 4 w histonie H3 (H3K4). Taka demetylacja, za którą odpowiedzialna jest swoistademetylazaLSD1,powodujewzmożonegenerowa-nie H2O2,cozkoleiindukujeformowanie8-oksyGuawści-śleokreślonychmiejscachgenomu.ReakcjajestwydajniehamowanaprzezN-acetylo-L-cysteinę,którajestzmiata-czem wolnych rodników tlenowych [45]. Dokładna analiza miejscpromotorowychwykazała,żezarównoOGG1,jakiTopoIIbsąkumulowanepreferencyjniewregionachERE.ModeljakizaproponowaliPerilloiwsp.[45]zakłada,żemiejscapęknięćniciDNAutworzoneprzezOGG1funk-cjonująjakopunktyprzyłączaniaTopoIIb.Przerwawnici

Guz J. i wsp. – Oksydacyjnie modyfikowane i deaminowane zasady DNA…

281

-

-

-

-

-

DNA umożliwia topoizomerazie relaksację chromatyny i tworzenie kompleksu inicjującego proces transkrypcji.

Podobnymechanizmregulacjitranskrypcjizaobserwowa-no w przypadku genów aktywowanych czynnikiem trans-krypcyjnymMyc[1,2](ryc.2).SekwencjaodcinkaDNA,doktóregowiążesiębiałkoMyczostałazdefiniowanajakoCACGTG(E-box,kaseta-E).Poprzyłączeniusięczynni-kaMycdookreślonychregionówchromatynydemetylazaLSD1zaczynaprzejściowądemetylacjęlizyny4histonuH3.Wykazano,żeprzyłączenieMycjestpowiązanezre-krutacjąLSD1dopromotorowychregionówzawierającychsekwencjeCACGTG.Podobniejakwprzypadkuregionówpromotorowych dla genów odpowiedzi na 17b estradiol, takżeiwtymprzypadkuLSD1generujeH2O2 i induku-jeformowanie8-oksyGuawobrębieopisanychsekwen-cji.Domiejsczawierających8-oksyGuarekrutowanajestglikozylazaOGG1iendonukleazaApe1(ryc.2).

InhibicjaprocesówoksydacyjnychwobecnościN-acetylo-L-cysteinylubredukcjapoziomuLSD1,OGG1iendonu-kleazy Ape1 skutkuje drastycznym obniżeniem poziomu transkrypcji genów aktywowanych czynnikiem transkryp-cyjnymMyc.Wartopodkreślić,żeokoło15%genówwge-nomie człowieka może zawierać w regionach promotoro-wychsekwencjewiążąceczynniktranskrypcyjnyMyc[1,2].Obecnieprzyjmujesię,żesekwencje/regionyregulatorowegenów wchodzą we wzajemną interakcję za pomocą wcze-śniejformowanychpętli[2].Wynikibadańopisanychwyżejpozwoliły na zaproponowanie modelu zakładającego po-stępującą relaksację DNA, w wyniku przyłączenia białka Myciformowaniepętli,któreumożliwiająbezpośredniąinterakcjępolimerazyRNAIIiczynnikatranskrypcyjne-go. Demetylacja histonu H3, późniejsze reakcje oksyda-cyjneiindukowananaprawa8-oksyGuasąniezbędnedoefektywnegoformowaniakompleksuinicjującegoprocestranskrypcji. Wyniki przeprowadzonych ostatnio badań wykazały,żeobecnośćczynnikaMycjesttakżeniezbęd-na w procesie elongacji transkrypcji ponieważ przeciw-działa przerywaniu transkrypcji i zatrzymaniu komplek-su transkrypcyjnego [2].

Zakładasię,żepodstawowypoziom8-oksyGuawjądro-wym DNA komórek ssaków jest zbliżony do poziomu jednej cząsteczki na 106 zasad azotowych [15]. W bada-niachzespołukierowanegoprzezGillespie[18],dotyczą-cych genów indukowanych hipoksją wykazano, że stan ten jest odpowiedzialny za wyraźny wzrost poziomu 8-oksy-Gua(dowartościdwóchzmodyfikowanychcząsteczekna103 zasad), ale jest on obserwowany wyłącznie w elemen-tachodpowiedzinahipoksję(HRE).Cowięcej,obecność8-oksyGuawykrytowyłączniewefrakcjichromatynywrażliwej na nukleazę mikrokokalną, a więc wzbogaconą w sekwencje aktywne transkrypcyjnie [43]. Ta sama gru-pabadaczystwierdziła,żeobecnośćwsekwencjachHREmiejscAP(pousunięciuzasad),któresąintermediatemwprocesieusuwania8-oksyGua,jestodpowiedzialnezawiązanie czynnika transkrypcyjnego indukowanego hipok-sją(HIF)izawydajnąekspresjęgenureporterowego[61].Bazującnawynikachtychdoświadczeńautorzywysunęlihipotezę,żeintencjonalnewprowadzanie8-oksyGuaijejpóźniejsza naprawa wpływa na relaksację DNA, co z ko-lei jest odpowiedzialne za rekrutację czynników transkryp-cyjnych i aktywację procesu transkrypcji.

Nabezpośredniudział8-oksyGuawregulacjitranskrypcjiwskazują wyniki badań, w których do sekwencji docelo-wych wiążących czynnik transkrypcyjny NF-kBwprowa-dzano8-oksyGua.Oksydacjawsekwencjikonsensusowejjednej z czterech cząsteczek guaniny powodowała kilka-krotny wzrost powinowactwa podjednostki p50 czynnika NF-kB[22].Ponieważwielesekwencjipromotorowychjestwzbogaconych w guaninę, autorzy wskazują możliwość, że oksydacyjna modyfikacja tej zasady może być jednym z czynników regulacyjnych procesu transkrypcji. W tym kontekście ciekawe wydają się rezultaty innych prac, z któ-rych wynika, że istnieje możliwość przemieszczenia po-tencjałuoksydacyjnegoijegopreferencyjnaakumulacjaw sekwencji bogatej w guaninę [17].

Wyniki uzyskane przez zespół Katedry BiochemiiKlinicznejCMUMKwskazują,że frakcjechromatynyjądrowejaktywnetranskrypcyjnie(euchromatyna,frakcjazwiązana z matriks jądrową) charakteryzują się pięciokrot-niewyższympoziomem8-oksydGwDNAodfrakcjitrans-krypcyjnie nieaktywnej (heterochromatyna). Teoretycznie można założyć, że ta wysoce znamienna statystycznie róż-nica mogłaby być wynikiem większej dostępności DNA dlaRFTweuchromatynie,któryjestwmniejszymstopniuchronionywtejfrakcjiprzezbiałkahistonowe,niżDNAheterochromatyny. Taka teoria nie tłumaczy jednak podob-nie wysokiego, jak w euchromatynowym DNA, poziomu 8-oksydGwDNAfrakcjizwiązanejzmacierząjądrową,ponieważtafrakcjastanowiściśleupakowanąstrukturę.

Abyostateczniezweryfikowaćmożliwośćpreferencyjnejindukcji8-oksydG,wnaszychbadaniach,podjęliśmysięanalizy poziomu 8,5'-cyklo-2'-deoksyadenozyny (cdA), wwymienionychfrakcjachchromatyny.CdAjestpodob-niejak8-oksydGproduktemoddziaływaniarodnika•OH zDNA.Wprzeciwieństwie jednakdo8-oksydG,obec-ność cdA w DNA powoduje zaburzenia w strukturze he-lisy [27] i jest silnym inhibitorem procesu transkrypcji. Nie stwierdzono różnic w poziomie cdA między eu- i he-terochromatynąorazfrakcjązwiązanązmacierząjądro-wą, co wyklucza prawdziwość argumentu „dostępności”. Przedstawionewyżejwynikipozwoliłynamnasformuło-wanie hipotezy zakładającej uniwersalne (nie ograniczone tylko do grupy genów przedstawianych wyżej) znaczenie obecności8-oksydGwDNA,jakoczynnikazwiązanegoz regulacją transkrypcji (dane nieopublikowane).

podsUmoWanie

Jednym z podstawowych warunków przeżycia komór-ki jest utrzymanie integralności i stabilności genomu. Skumulowanie zmian sekwencji DNA wywołanych przez uszkodzenia zasad azotowych, może prowadzić do muta-cji,atymsamymefektówpatologicznych,czyprzyspie-szonego starzenia, a nawet wprost do śmierci komórki.

Komórki zawierają enzymy naprawcze, minimalizujące częstość pojawiania się mutacji, a tym samym następstwa uszkodzeń DNA. Jeżeli jednak ilość zmian w DNA przekra-cza możliwości naprawy ostateczną linią obrony komórki może być jej śmierć w procesie apoptozy, dla dobra całe-go organizmu wielokomórkowego. W ten sposób komór-ka, z dużą liczbą zmian w strukturze DNA jest eliminowa-na zanim stanie się zagrożeniem dla przeżycia organizmu.

Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: 275-286

282

-

-

-

-

-

Ryc. 2. Schemat zakładanego mechanizmu regulacji transkrypcji z udziałem 8-oksydG (na podstawie [2], zmodyfikowane)

Guz J. i wsp. – Oksydacyjnie modyfikowane i deaminowane zasady DNA…

283

-

-

-

-

-

Taka naturalna „logika”, zakładająca obronę integralno-ści materiału genetycznego za wszelką cenę, wydaje się mieć głęboki sens biologiczny zapewniający trwanie ży-cia w przeciagu miliardów lat ewolucji.

W świetle wyników badań uzyskanych w przeciągu ostat-nich kilku lat, wydaje się, że ta oczywista reguła ma swo-jewyjątki.Modyfikacjezasadazotowych,oznaczeniumutagennym mogą bowiem pełnić istotną rolę w przeka-zywaniusygnałówniezbędnychdoprawidłowegofunk-cjonowania komórki, realizowanego w przebiegu me-tabolizmu komórkowego. O ile rola takich modyfikacji w aktywnej demetylacji DNA jest dobrze eksperymen-talnie udokumentowana, o tyle epigenetyczna rola obec-ności8-oksyGuawDNAniemajednoznacznegooparciadoświadczalnego. Należy jednak pamiętać, że do niedaw-narolaRFTinastępstwaichdziałaniawukładachbio-logicznych były kojarzone raczej jednoznacznie z działa-niem patogennym. Obecnie wiadomo, że niektóre z tych reaktywnych cząsteczek (NO, H2O2, O2

•–), pełnią ważną rolę w przekazywaniu sygnałów komórkowych, specjali-zacji komórek i w wielu innych procesach biologicznych. Wydajesię,żejedenznajczęściejformowanychproduk-tówoddziaływaniaRFTzDNA,8-oksyGuamożepełnićtakżefunkcjezwiązanezregulacjątranskrypcji.Częstosekwencje promotorowe genów są bardzo ściśle owinię-te wokół rdzenia histonowego nukleosomu, co utrudnia wiązanie białek regulacyjnych [13]. W procesie aktywa-cji transkrypcji takie sekwencje muszą być udostępnione dla czynników transkrypcyjnych. Zakłada się, że czynniki remodulujące chromatynę mogą jednocześnie pełnić rolę relaksacyjną [13]. Warto zatem postawić pytanie, w jaki sposób czynniki remodelujące mogą się wiązać z DNA i doprowadzić do relaksacji tej molekuły skoro sekwen-cje promotorowe pozostają w ścisłym kompleksie z biał-kami? Dodatkowo, krótkie sekwencje promotorowe mają dosyć sztywną strukturę [51,60].

Pewnymrozwiązaniemomawianychzjawiskmożebyćin-tencjonalne wprowadzenie pęknięcia nici DNA w wyniku wycinaniawprowadzonejuprzednio8-oksyGua,jakzapro-ponowano w badanych modelach eksperymentalnych, opi-sywanych w tym opracowaniu.

Podstawowymnadalwydajesiępytanie,czywieloko-mórkowy organizm „stać” jest na celowe wprowadzanie w miejsca promotorowe genów uszkodzenia, aby umoż-liwić tymsamymregulację fundamentalnychprocesówkomórkowych. W przypadku procesów regulujących ak-tywną demetylację DNA odpowiedź brzmi tak, jest to nie tylkomożliwe,aleikoniecznezważywszynaletalnyfe-notypmyszypozbawionychbiałkaTDG.Jednakiwtymprzypadku pozostaje kilka nie do końca zrozumiałych kwestii. Dlaczego białko Tet czasami przekształca 5mC do5hmC,ainnymrazemdo5fClub5caC?Dlaczegoist-nieją dwa niezależne szlaki demetylacji, opierające się na

deaminacji i oksydacji? Czy różny ich przebieg jest przy-pisany odmiennym procesom fizjologicznym np. deamina-cjapreferowanajestpodczasembriogenezy?Jeślichodzioregulatorowąrolę8-oksyGua,tomimokilkuekspery-mentalnych dowodów, które sugerują udział tej molekuły w regulacji transkrypcji, nadal potrzeba bardziej przeko-nujących dowodów na poparcie tej tezy.

Warto podkreślić, że również innego typu zmiany, uczest-niczące, jak się przypuszcza, w regulacji stopnia upakowa-nia chromatyny, związane z modyfikacją histonów, a do-kładnie z demetylacją reszt lizynowych, są także związane z oksydacją podobną do opisywanej wcześniej, biorącej udział w aktywnej demetylacji DNA [5,33].

Enzymyuczestniczącewtymprocesiesą,podobniejakbiałka Tet, dioksygenazami zależnymi od żelaza i a-keto-glutaranu. Należy także pamiętać, że wspomniane wyżej białkoLSD1,którejestbezpośredniozaangażowanewde-metylacjęlizyny4histonuH3igenerowaniu8-oksyGua,jest monooksygenazą. Opisane w pracy zjawiska wska-zują, że tlen dla organizmów aerobowych, jest nie tylko niezbędnydoefektywnegopozyskiwaniaenergii,aletak-że może pełnić podstawową rolę w regulacji sygnalizacji epigenetycznej.

Tlen umożliwił rozwój i ekspansję na Ziemi organizmów wielokomórkowych wykorzystujących go w swoim meta-bolizmie. Za wygodę pozyskiwania w ten sposób energii tlenowce płacą jednak wysoką cenę. Są nią wolne rodni-ki, generowane z tlenu w przebiegu przemian metabolicz-nych.Ichnadmiarmożebyćniebezpieczny,bowiemstresoksydacyjny wiązany jest z licznymi patologiami komór-kowymi i uważany za czynnik w procesach starzenia. Jednak w trwającej miliony lat ewolucji biochemicznej komórki aerobowe nauczyły się korzystać z powstających w nich wolnych rodników i włączać je w procesy wręcz warunkującetrwanieżyciabiologicznego.Dotakichfun-damentalych procesów z pewnością należą te, które zwią-zanesązregulacjąfunkcjonowaniamateriaługenetycz-nego.Byćmożezatemparadoksalnietesameczynniki,które uczestniczą w przebiegu procesów warunkujących przebieg zjawisk życiowych, są jednocześnie czynnikiem ograniczającym i limitującym czas życia i czynnikiem sprawczymlicznychpatologiikomórkowych.Udziałtle-nuijegometabolitówwfunkcjonowaniugenomuwydajesię zatem być jednym z ciekawszych zagadnień współcze-snej biologii i medycyny, a jego zrozumienie to zarówno satysfakcjazodkryciapięknazjawiskbiologicznych,jaki wymiar praktyczny np. związany z zastosowaniami me-dycyny molekularnej.

podziękoWanie

W przygotowaniu rycin autorom pomoc okazał Kamil Jurgowiak.

[1]AmenteS.,BertoniA.,MoranoA.,LaniaL.,AvvedimentoE.V.,MajelloB.:LSD1-mediateddemethylationofhistoneH3lysine4trig-gersMyc-inducedtranscription.Oncogene,2010;29:3691–3702

[2]AmenteS.,LaniaL.,AvvedimentoE.V.,MajelloB.:DNAoxidationdrivesMycmediatedtranscription.CellCycle,2010;9:3002–3004

piśmiennictWo

[3]BhutaniN.,BradyJ.J.,DamianM.,SaccoA.,CorbelS.Y.,BlauH.M.:ReprogrammingtowardspluripotencyrequiresAID-dependentDNAdemethylation.Nature,2010;463:1042–1047

[4]BhutaniN.,BurnsD.M.,BlauH.M.:DNAdemethylationdynamics.Cell,2011;146:866–872

Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: 275-286

284

-

-

-

-

-

[5]BonasioR.,TuS.,ReinbergD.:Molecularsignalsofepigeneticsta-tes.Science,2010;330:612–616

[6]ChenZ.X.,RiggsA.D.:DNAmethylationanddemethylationinmam-mals.J.Biol.Chem.,2011;286:18347–18353

[7]Cheng K.C., Cahill D.S., Kasai H., Nishimura S., Loeb L.A.:8-Hydroxyguanine,anabundant formofoxidativeDNAdamage,causesG----TandA----Csubstitutions.J.Biol.Chem.,1992;267:166–172

[8]CimminoL.,Abdel-WahabO.,LevineR.L.,AifantisI.:TETfamilyproteinsandtheirroleinstemcelldifferentiationandtransformation.CellStemCell,2011;9:193–204

[9]CortázarD.,KunzC.,SelfridgeJ.,LettieriT.,SaitoY.,MacDougallE.,WirzA.,SchuermannD., JacobsA.L.,SiegristF.,SteinacherR.,JiricnyJ.,BirdA.,SchärP.:EmbryoniclethalphenotyperevealsafunctionofTDGinmaintainingepigeneticstability.Nature,2011;470: 419–423

[10]CortellinoS.,XuJ.,SannaiM.,MooreR.,CarettiE.,CiglianoA.,LeCozM.,DevarajanK.,WesselsA.,SopranoD.,AbramowitzL.K.,BartolomeiM.S.,RambowF.,BassiM.R.,BrunoT.,FanciulliM.,RennerC.,Klein-SzantoA.J.,MatsumotoY.,KobiD.,DavidsonI.,AlbertiC.,LarueL.,BellacosaA.:ThymineDNAglycosylaseises-sentialforactiveDNAdemethylationbylinkeddeamination-baseexci-sionrepair.Cell,2011;146:67–79

[11]DahlC.,GronbaekK.,GuldbergP.:AdvancesinDNAmethylation:5-hydroxymethylcytosine revisited.Clin.Chim.Acta,2011;412:831–836

[12]EstellerM.:RelevanceofDNAmethylation in themanagementofcancer.LancetOncol.,2003;4:351–358

[13]FelsenfeldG.,GroudineM.:Controlling thedoublehelix.Nature,2003;421:448–453

[14]FiczG.,BrancoM.R.,SeisenbergerS.,SantosF.,KruegerF.,HoreT.A.,MarquesC.J.,AndrewsS.,ReikW.:Dynamicregulationof5-hy-droxymethylcytosine inmouseEScellsandduringdifferentiation.Nature,2011;473:398–402

[15]GedikC.M.,CollinsA.,ESCODD(EuropeanStandardsCommitteeonOxidativeDNADamage):Establishing thebackground levelofbaseoxidationinhumanlymphocyteDNA:resultsofaninterlabora-toryvalidationstudy.FASEBJ.,2005;19:82–84

[16]GehringM.,ReikW.,HenikoffS.:DNAdemethylationbyDNAre-pair.TrendsGenet.,2009;25:82–90

[17]GenereuxJ.C.,BoalA.K.,BartonJ.K.:DNA-mediatedchargetrans-portinredoxsensingandsignaling.J.Am.Chem.Soc.,2010;132:891–905

[18]GillespieM.N.,PastukhV.,RuchkoM.V.:OxidativeDNAmodifica-tionsinhypoxicsignaling.Ann.N.Y.Acad.Sci.,2009;1177:140–150

[19]GlobischD.,MünzelM.,MüllerM.,MichalakisS.,WagnerM.,KochS.,BrücklT.,BielM.,CarellT.:Tissuedistributionof5-hydroxyme-thylcytosineandsearchforactivedemethylationintermediates.PLoSOne,2010;5:e15367

[20]GuT.P.,GuoF.,YangH.,WuH.P.,XuG.F.,LiuW.,XieZ.G.,ShiL.,HeX.,JinS.G.,IqbalK.,ShiY.G.,DengZ.,SzabóP.E.,PfeiferG.P.,LiJ.,XuG.L.:TheroleofTet3DNAdioxygenaseinepigeneticre-programmingbyoocytes.Nature,2011;477:606–610

[21]GuoJ.U.,SuY.,ZhongC.,MingG.L.,SongH.:Hydroxylationof5-methylcytosinebyTET1promotesactiveDNAdemethylation intheadultbrain.Cell,2011;145:423–434

[22]Hailer-MorrisonM.K.,KotlerJ.M.,MartinB.D.,SugdenK.D.:Oxidizedguaninelesionsasmodulatorsofgenetranscription.Alteredp50bin-dingaffinityandrepairshieldingby7,8-dihydro-8-oxo-2’-deoxygu-anosine lesions in the NF-kBpromoterelement.Biochemistry,2003;42: 9761–9770

[23]HeY.F.,LiB.Z.,LiZ.,LiuP.,WangY.,TangQ.,DingJ.,JiaY.,ChenZ.,LiL.,SunY.,LiX.,DaiQ.,SongC.X.,ZhangK.,HeC.,XuG.L.:Tet-mediatedformationof5-carboxylcytosineanditsexcisionbyTDGinmammalianDNA.Science,2011;333:1303–1307

[24]HermannA.,GowherH.,JeltschA.:BiochemistryandbiologyofmammalianDNAmethyltransferases.Cell.Mol.LifeSci.,2004;61:2571–2587

[25]IqbalK.,JinS.G.,PfeiferG.P.,SzabóP.E.:Reprogrammingofthepa-ternalgenomeuponfertilizationinvolvesgenome-wideoxidationof5-methylcytosine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011;108:3642–3647

[26]ItoS.,D’AlessioA.C.,TaranovaO.V.,HongK.,SowersL.C.,ZhangY.:RoleofTetproteinsin5mCto5hmCconversion,ES-cellself-re-newalandinnercellmassspecification.Nature,2010;466:1129–1133

[27]JarugaP.,DizdarogluM.:8,5’-Cyclopurine-2’-deoxynucleosides inDNA:mechanismsofformation,measurement,repairandbiologicaleffects.DNARepair,2008;7:1413–1425

[28]KoM.,HuangY.,JankowskaA.M.,PapeU.J.,TahilianiM.,BandukwalaH.S.,AnJ.,LampertiE.D.,KohK.P.,GanetzkyR.,LiuX.S.,AravindL.,AgarwalS.,MaciejewskiJ.P.,RaoA.:Impairedhydroxylationof5-methylcytosineinmyeloidcancerswithmutantTET2.Nature,2010;468: 839–843

[29]KothariR.M.,ShankarV.:5-Methylcytosinecontentinthevertebra-tedeoxyribonucleicacids:speciesspecificity.J.Mol.Evol.,1976;7:325–329

[30]KriaucionisS.,HeintzN.:ThenuclearDNAbase5-hydroxymethyl-cytosineispresentinPurkinjeneuronsandthebrain.Science,2009;324: 929–930

[31]LangemeijerS.M.,AslanyanM.G.,JansenJ.H.:TETproteinsinma-lignanthematopoiesis.CellCycle,2009;8:4044–4048

[32]LiW.,LiuM.:Distributionof5-hydroxymethylcytosineindifferenthumantissues.J.NucleicAcids,2011;870726

[33]MargueronR.,ReinbergD.:Chromatinstructureandtheinheritanceofepigeneticinformation.Nat.Rev.Genet.,2010;11:285–296

[34]MohrF.,DöhnerK.,BuskeC.,RawatV.P.:TETgenes:newplayersinDNAdemethylationandimportantdeterminantsforstemness.Exp.Hematol.,2011;39:272–281

[35]MünzelM.,GlobischD.,BrücklT.,WagnerM.,WelzmillerV.,MichalakisS.,MüllerM.,BielM.,CarellT.:Quantificationofthesi-xthDNAbasehydroxymethylcytosineinthebrain.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2010;49:5375–5377

[36]MünzelM.,GlobischD.,CarellT.:5-Hydroxymethylcytosine, thesixthbaseof thegenome.Angew.Chem. Int.Ed.Engl.,2011;50:6460–6468

[37]MuramatsuM.,KinoshitaK.,FagarasanS.,YamadaS.,ShinkaiY.,Honjo T.: Class switch recombination and hypermutation require ac-tivation-inducedcytidinedeaminase(AID),apotentialRNAeditingenzyme.Cell,2000;102:553–563

[38]MuramatsuM.,SankaranandV.S.,AnantS.,SugaiM.,KinoshitaK.,DavidsonN.O.,HonjoT.:Specificexpressionofactivation-inducedcytidinedeaminase(AID),anovelmemberoftheRNA-editingde-aminasefamilyingerminalcenterBcells.J.Biol.Chem.,1999;274:18470–18476

[39]OlińskiR., JurgowiakM.:UracylwDNA–przyjacielczywróg?PostępyBiochem.,2009;55:25–35

[40]PaluszczakJ.,Baer-DubowskaW.:Zjawiskaepigenetycznewpatoge-nezienowotworów.Nowemożliwościprofilaktykiiterapii?PostępyBiochem.,2005;51:244–250

[41]PanG.,ThomsonJ.A.:Nanogandtranscriptionalnetworksinembry-onicstemcellpluripotency.CellRes.,2007;17:42–49

[42]PastorW.A.,PapeU.J.,HuangY.,HendersonH.R.,ListerR.,KoM.,McLoughlinE.M.,BrudnoY.,MahapatraS.,KapranovP.,TahilianiM.,DaleyG.Q.,LiuX.S.,EckerJ.R.,MilosP.M.,AgarwalS.,RaoA.:Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstemcells.Nature,2011;473:394–397

[43]PastukhV.,RuchkoM.,GorodnyaO.,WilsonG.L.,GillespieM.N.:Sequence-specificoxidativebasemodificationsinhypoxia-induciblegenes.FreeRadic.Biol.Med.,2007;43:1616–1626

[44]PennN.W.,SuwalskiR.,O’RileyC.,BojanowskiK.,YuraR.:Thepre-senceof5-hydroxymethylcytosineinanimaldeoxyribonucleicacid.Biochem.J.,1972;126:781–790

[45]PerilloB.,OmbraM.N.,BertoniA.,CuozzoC.,SacchettiS.,SassoA.,ChiariottiL.,MalorniA.,AbbondanzaC.,AvvedimentoE.V.:DNAoxidationastriggeredbyH3K9me2demethylationdrivesestrogen--inducedgeneexpression.Science,2008;319:202–206

[46]PfaffenederT.,HacknerB.,TrussM.,MunzelM.,MullerM.,DeimlC.A.,HagemeierC.,CarellT.:Thediscoveryof5-formylcytosineinembryonicstemcellDNA.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2011;50:7008–7012

[47]PoppC.,DeanW.,FengS.,CokusS.J.,AndrewsS.,PellegriniM.,JacobsenS.E.,ReikW.:Genome-wideerasureofDNAmethylationinmouseprimordialgermcellsisaffectedbyAIDdeficiency.Nature,2010;463:1101–1105

[48]RaiK.,HugginsI.J.,JamesS.R.,KarpfA.R.,JonesD.A.,CairnsB.R.:DNAdemethylationinzebrafishinvolvesthecouplingofadeamina-se,aglycosylase,andgadd45.Cell,2008;135:1201–1212

Guz J. i wsp. – Oksydacyjnie modyfikowane i deaminowane zasady DNA…

285

-

-

-

-

-

[49]SchmitzK.M.,SchmittN.,Hoffmann-RohrerU.,SchaferA.,GrummtI.,MayerC.:TAF12recruitsGadd45aandthenucleotideexcisionre-paircomplextothepromoterofrRNAgenesleadingtoactiveDNAdemethylation.Mol.Cell,2009;33:344–353

[50]ShiY.Y.,HuangZ.Y.,ZengZ.J.,WangZ.L.,WuX.B.,YanW.Y.:Dietandcellsizebothaffectqueen-workerdifferentiationthroughDNAmethylationinhoneybees(Apismellifera,Apidae).PLoSOne,2011;6, e18808

[51]ShimadaJ.,YamakawaH.:DNA-topoisomeranalysisonthebasisofthehelicalwormlikechain.Biopolymers,1984;23:853–857

[52]SongC.X.,SzulwachK.E.,FuY.,DaiQ.,YiC.,LiX.,LiY.,ChenC.H.,ZhangW.,JianX.,WangJ.,ZhangL.,LooneyT.J.,ZhangB.,GodleyL.A.,HicksL.M.,LahnB.T.,JinP.,HeC.:Selectivechemicallabelingrevealsthegenome-widedistributionof5-hydroxymethylcy-tosine.Nat.Biotechnol.,2011;29:68–72

[53]TahilianiM.,KohK.P.,ShenY.,PastorW.A.,BandukwalaH.,BrudnoY.,AgarwalS.,IyerL.M.,LiuD.R.,AravindL.,RaoA.:Conversionof5-methylcytosineto5-hydroxymethylcytosineinmammalianDNAbyMLLpartnerTET1.Science,2009;324:930–935

[54]WilliamsK.,ChristensenJ.,PedersenM.T.,JohansenJ.V.,CloosP.A.,RappsilberJ.,HelinK.:TET1andhydroxymethylcytosineintrans-criptionandDNAmethylationfidelity.Nature,2011;473:343–348

[55]WuH.,D’AlessioA.C.,ItoS.,XiaK.,WangZ.,CuiK.,ZhaoK.,SunY.E.,ZhangY.:DualfunctionsofTet1intranscriptionalregulationinmouseembryonicstemcells.Nature,2011;473:389–393

[56]WuS.C.,ZhangY.:ActiveDNAdemethylation:manyroadsleadtoRome.Nat.Rev.Mol.CellBiol.,2010;11:607–620

[57]XuY.,WuF.,TanL.,KongL.,XiongL.,DengJ.,BarberaA.J.,ZhengL.,ZhangH.,HuangS.,MinJ.,NicholsonT.,ChenT.,XuG.,ShiY.,ZhangK.,ShiY.G.:Genome-wideregulationof5hmC,5mC,andgeneexpressionbyTet1hydroxylaseinmouseembryonicstemcells.Mol.Cell,2011;42:451–464

[58]ZarembaT.,OlińskiR.:OksydacyjneuszkodzeniaDNA–ichanali-zaorazznaczeniekliniczne.PostępyBiochem.,2010;56:124–138

[59]ZhangH.,ZhangX.,ClarkE.,MulcaheyM.,HuangS.,ShiY.G.:TET1is a DNA-binding protein that modulates DNA methylation and gene transcriptionviahydroxylationof5-methylcytosine.CellRes.,2010;20: 1390–1393

[60]ZhangY.,CrothersD.M.:Statisticalmechanicsofsequence-depen-dentcircularDNAanditsapplicationforDNAcyclization.Biophys.J.,2003;84:136–153

[61]ZielK.A.,GrishkoV.,CampbellC.C.,BreitJ.F.,WilsonG.L.,GillespieM.N.:Oxidantsinsignaltransduction:impactonDNAintegrityandgeneexpression.FASEBJ.,2005;19:387–394

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; tom 66: 275-286

286

-

-

-

-

-