ODPORNOŚĆ –WAŻNA CECHA

METODY BADAWCZEJ

Ryszard Dobrowolski, Waldemar Korol 1

UMCS Lublin, Wydział Chemii 1 Instytut Zootechniki-PIB,

KLP w Lublinie

Co to jest odporność metody ?

Odporność metody badawczej (ang.

robustness, ruggedness) jest cechą metody,

którą możemy określić badając wpływ

niewielkich, niezamierzonych zmian warunków

postępowania analitycznego (parametrów) na

końcowy wynik oznaczania np. zmiany temp.

mineralizacji lub spalania, czasu mineralizacji,

zmiany pH, zmiany czasu tworzenia barwy itp.

Metody nieodporne i odporne

Metoda nieodporna

niewielkie zmiany

warunków postępowania analitycznego wpływają na końcowy wynik badania

Metoda odporna

niewielkie zmiany warunków oznaczania nie wpływają na końcowy wynik

Graficzny obraz odporności metody badawczej – rys. 1

metoda nieodporna metoda odporna

Schematy i przewodniki badania odporności metody

- Schemat Youdena - postępowanie zalecane przez AOAC [1]

- Przewodnik oceny odporności metodbadawczych stosowanych w biochemii i farmacji podczas ich walidacji - Heyden i wsp.[4]

- Algorytm Donga, stosowany m.in. podczas walidacji metody badania zanieczyszczeń nierozpuszczalnych w tłuszczach [11].

- Przegląd badania odporności metodchromatograficznych - Dejaegher i Heyden [2].

- Schemat walidacji metody uwzględniający badanie odporności w dziedzinie nauk medycznychzaproponowali Frey i Xiang Li [3].

Cel referatu

Celem referatu jest wskazanie odporności jako

cechy metody badawczej, którą należy

uwzględnić podczas sprawdzania lub walidacji

metody.

Podano sposób oceny odporności metody i

przykłady badania odporności przy oznaczaniu

kadmu w glebie metodą GFAAS i chlorków w

paszach metodą amperometrycznego

miareczkowania.

Odtwarzalność – miara odporności metody

Kryteria prowadzenia badań międzylaboratoryjnych określił Horwitz. Liczba laboratoriów uczestniczących (≥8) i liczba badanych matryc (≥6).

Kryterium oceny badań międzylaboratoryjnych jest wskaźnik Horrat H tj. stosunek względnego odchylenia standardowego odtwarzalności uzyskanego w badaniach międzylaboratoryjnych do względnego docelowego odchylenia standardowego odtwarzalności obliczonego z równania Horwitz’a

RSDR (%) = 2 ∙ C-0,15

w którym RSDR oznacza względne docelowe odchylenie standardowe odtwarzalności (%) a C jest niemianowanym ułamkiem masy, np. 1 ppm = 10-6

Akceptowane wartości wskaźnika H mieszczą się w przedziale 0,5 < H < 2.

Odtwarzalność – miara odporności metody

Wskaźnik Horwitz’a Horrat H jest

powszechnie stosowany w ocenie

precyzji metod, np. w normach CEN i ISO

Jednak uczestnictwo w badaniach

międzylaboratoryjnych nie jest

powszechne i tylko wybrane laboratoria,

często po ocenie wyników fazy wstępnej,

mogą uczestniczyć w takich badaniach.

Jak w praktyce określić odporność metody ?

Schemat Youdena

Plan badań odporności metody wg Youdena (AOAC). Przykład 8 kombinacji i 7 czynników zastosowanych do badania odporności

metody analitycznej

Czynnik

Nr kombinacji lub oznaczenia

1 2 3 4 5 6 7 8

A lub a A A A A a a a a

B lub b B B b b B B b b

C lub c C c C c C c C c

D lub d D D d d d d D D

E lub e E e E e e E e E

F lub f F f f F F f f F

G lub g G g g G g G G g

Wynik s t u v w x y z

Plan badań odporności metody wg Youdena (AOAC).(przykład 8 kombinacji i 7 czynników zastosowanych do badania

odporności metody analitycznej)

Dużymi literami A, B, C … i G oznakowano zalecane w procedurze wartości czynników (np. temp. mineralizacji, czas mineralizacji, objętość kwasu do mineralizacji), które mogą wpływać na wynik badania i które nieznacznie zmieniano.

Alternatywne wartości zmienionych czynników oznakowano małymi literami a, b, c… i g. Całkowita liczba kombinacji wynosi 27 tj. 128 i w praktyce jest trudna do sprawdzenia.

Plan badań odporności metody wg Youdena (AOAC).(przykład 8 kombinacji i 7 czynników zastosowanych do badania

odporności metody analitycznej)

Możliwe jest jednak wybranie kilku (8) kombinacji, które odpowiednio równoważą wysokie i niskie wartości badanych czynników. Wyniki tych kombinacji oznakowano w tabeli literami od s do z.

Aby sprawdzić czy zmiana czynnika A na a wywiera wpływ na wynik należy porównać średnią (s + t + u + v)/4 ze średnią (w + x + y + z)/4. Odpowiednio, badając wpływ zmiany czynnika G na g należy porównać średnie (s + v + x + y)/4 i (t + u + w + z)/4 (tab. 1).

PRZYKŁAD 1: BADANIE ODPORNOŚCI METODY GFAAS OZNACZANIA KADMU W GLEBIE

Czynnik* Nr kombinacji lub oznaczenia

1 2 3 4 5 6 7 8

A: temperatura A A A A a a a A

B:czas mineral. B B B b B B b B

C: obj. HNO3 C c C c C c C C

D: obj. HF D D D d d d D D

E: symulacja E e E e e E e E

F: symulacja F f F F F f f F

G: symulacja G g G G g G G G

Wynik s t u v w x y z

Absorbancja 0,475 0,480 0,485 0,481 0,479 0,470 0,477 0,478

* temperatura: A – 180 °C, a - 200 °C; czas mineralizacji B – 30 min, b – 60 min;

objętość HNO3 C- 5 ml, c – 5,5 ml; objętość HF D – 5 ml, d – 5,5 ml

PRZYKŁAD 1: BADANIE ODPORNOŚCI METODY GFAAS OZNACZANIA KADMU W GLEBIE

Równanie Czynnik Odporność

VA= ¼ (s +t+u+v) – ¼ (w +x +y +z) VA

= 0,00425 temp Tak

VB = ¼ (s+t+w+x) – ¼ (u+v+y+z) VB=-0,0043 Czas Tak

VC = ¼ (s+u+w+y) – ¼ (t +v+x+ z) Vc=0,00175 Obj. Tak

VD = ¼ (s+t+y+z) – ¼ (u + v + w + x) VD=-0,0012 Obj. Tak

VE = ¼ (s +u+x z) – ¼ (t + v + w + y) VE=-0,0022 Symulacja Tak

VF = ¼ (s+ v+ w+ z) – ¼ (t+ u+ x + y) VF=0,00025 Symulacja Tak

VG = ¼ (s +v +x + y) – ¼ (t +u+ w+z) VG=-0,0047 Symulacja Tak

PRÓBKA100 ml H2O

2 ml HNO3

2 ml r-r ŻELATYNY

MIESZANIE2 min.

MIARECZKOWANIE

AMPEROMETRYCZNE

AMPEROMIERZ(PAM-AA 2)

mV

AZOTANSREBRA

ELEKTRODY SREBROWE

PRZYKŁAD 2: BADANIA ODPORNOŚCI OZNACZANIA CHLORKÓW W PASZACH METODĄ

AMPEROMETRYCZNEGO MIARECZKOWANIA

(Chem. Anal. 27, 1982, 323-326)

PRZYKŁAD 2: BADANIA ODPORNOŚCI OZNACZANIA CHLORKÓW W PASZY METODĄ AMPEROMETRYCZNEGO MIARECZKOWANIA

Czynnik* Nr kombinacji lub oznaczenia

1 2 3 4 5 6 7 8

A: tłuszcz A(6,83) A(6,76) A(6,69) A(6,93) a(6,93) a(6,88) a(7,03) a(7,11)

B: czas ekstr. B(6,61) B(6,85) b(6,60) b(6,81) B(7,14) B(6,94) b(6,73) b(6,81

C: obj. ekstr. C(6,88) c(6,94) C(6,80) c(6,82) C(6,89) c(6,72) C(6,88) c(6,86)

D: obj. HNO3 D(6,92) D(6,76) d(6,75) d(6,79) d(6,63) d(6,76) D(6,90) D(6,77

Wynik s t u v w x y z

Zawartość,

g/kg

6,81 6,83 6,71 6,84 6,89 6,82 6,88 6,89

*tłuszcz w paszy A – bez dodatku tłuszczu, a z dodatkiem 4,9% tłuszczu; czas ekstrakcji chlorków B – 2

min, b – 2,5 min; objętość ekstraktu C- 100 ml, c – 125 ml; objętość HNO3 D – 2 ml, d – 2,5 ml

PRZYKŁAD 2: BADANIA ODPORNOŚCI METODY OZNACZANIA CHLORKÓW W PASZY METODĄ AMPEROMETRYCZNEGO MIARECZKOWANIA

Równanie Czynnik Odpor-

ność

VA = ¼ (s+t+u+v) – ¼ (w+x+y+z) VA=-0,1850 Tłuszcz Tak

VB= ¼ (s+t+w+x) – ¼ (u+v+y+z) VB =0,1475 Czas ekst. Tak

VC= ¼ (s+u+w+y)– ¼ (t+v+x+z) VC =0,0275 Obj. ekstr. Tak

VD = ¼ (s+t+y+z)– ¼ (u+v+w+x) VD =0,1100 Obj. kw.

azot.Tak

Badanie odporności → wykrywanie istotnych

różnic pomiędzy wariancjami i wartościami średnimi serii pomiarowych

Różnice wykrywamy na podstawie testów

statystycznych, (np. test Studenta - wariant

dwustronny)

WYNIK TESTU (F-pozytywny)

Wartości średnie próbek nie różnią się istotnie.

P = 94.87%

texp=2.550, tkryt(95%, 5)=2.571

WPROWADZONE DANE

1. M-ka bez dod. tłuszczu 6.83 M-ka + 4,9 % tłuszczu 6.93

2. 6.76 6.88

3. 6.69 7.03

4. 6.93 7.11

PARAMETRY STATYSTYCZNE

liczność serii n 4 4

średnia rytm. ∑/n 6.803 6.987

odchylenie std. SD 0.1024 0.1028

(CV) RSD×100% 1.506 1.471

błąd std. SD/√n 0.05121 0.05138

PODSUMOWANIE

• Ocena odporności metody pozwala na lepsze poznanie i zrozumienie

czynników, które mogą wpływać na końcowy wynik badania.

• Wiedza w tym zakresie pozwala na lepszą kontrolę metody ponieważ

znamy granice tolerancji parametrów metody w obrębie których

uzyskujemy poprawne wyniki.

• Badanie odporności metody może być szczególnie zalecane i przydatne

przy wdrażaniu elastycznego zakresu metody zwłaszcza w przypadku gdy

uwzględnimy zmienność matrycy.

• Wprawdzie zmienność matrycy nie jest czynnikiem wynikającym

bezpośrednio z definicji odporności metody jednak, w przypadku

wytwarzanych aktualnie produktów takich jak środki farmaceutyczne,

żywność, pasze zmienność matrycy jest wręcz regułą i wynika z dążenia

do zaspokojenia potrzeb Klienta a nawet kreuje te potrzeby.

PODSUMOWANIE

• Badanie odporności metody podczas walidacji nie powinno wpływać

zasadniczo na czas walidacji i związane z tym koszty.

• Wykonane pomiary można wykorzystać do oceny precyzji metody.

• Dane nt. wpływu zmiennych czynników na wynik badania można

wykorzystać do budowy budżetu niepewności metody.

Dziękuję za uwagęPytania ?

Instytut Zootechniki-PIB, Krajowe Laboratorium Pasz,

ul.Chmielna 2, 20-079 Lublin, tel/fax +48 81 7436349

www.klp.izoo.krakow.pl