Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

Wydział Nauk o Zwierzętach

Marta Kręglewska

Ocena toksyczności ostrej drogą pokarmową

metodami alternatywnymi

Praca dyplomowa

na kierunku studiów podyplomowych:

Zwierzęta laboratoryjne – hodowla, utrzymanie i użytkowanie

Praca wykonana pod kierunkiem

dr Magdaleny Chłopeckiej

Zakład Farmakologii i Toksykologii

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

SGGW

Warszawa 2016

Oświadczenie promotora pracy

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam,

że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego.

Data .................................... Podpis promotora pracy ...................................................

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została

napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny

z obowiązującymi przepisami.

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur

związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją

elektroniczną.

Data ..................................... Podpis autora pracy ...............................................

Streszczenie

Ocena toksyczności ostrej drogą pokarmową metodami alternatywnymi.

Co roku na rynki światowe trafia bardzo wiele nowych substancji, których wprowadzenie do obrotu

wymaga przeprowadzenia badań toksykologicznych w celu zidentyfikowania wszystkich ewentualnych

zagrożeń dla zdrowia i środowiska. Uzupełniane są również badania dla substancji już istniejących zgodnie

z aktualnym stanem wiedzy i obowiązującymi przepisami. Pełna ocena wymaga szeregu badań, głównie z

użyciem zwierząt, co wiąże się to z ogromnymi kosztami, długim czasem oczekiwania na wyniki i

sprzeciwem wobec wykorzystywaniu zwierząt jako modele doświadczalne. Od kilku dekad w wielu

krajach prowadzone są badania nad wdrożeniem alternatywnych metod badawczych spełniających tzw.

zasady 3R zgodnie z którymi ogranicza się lub nawet wyeliminuje zwierzęta z eksperymentów oraz

doskonali istniejące metody in vivo celem ograniczenia cierpienia zwierząt. Polecane obecnie metody

badania toksyczności ostrej droga pokarmową (OECD 420, 423, 425) są metodami alternatywnymi w

porównaniu z metodami klasycznymi, ponieważ znacząco ograniczają liczbę zwierząt w eksperymencie,

pozwalają na wcześniejsze humanitarne uśmiercenie w przypadku nasilonych objawów i cierpienia

zwierzęcia a także (OECD 420) odejście od kryterium śmierci jako punktu końcowego. W ostatnich latach

opracowuje się również nowe strategie badawcze, których celem ma być wyeliminowanie zwierząt z badań

i zastąpienie ich metodyką łączącą metody in vitro i in silico.

Słowa kluczowe: toksyczność ostra drogą pokarmową, LD50, metody alternatywne

Summary

Acute oral toxicity assessment by using alternative methods.

There are numerous new substances that are introduced to the world markets every year. Bringing them in

circulation must be preceded by a series of toxicological studies in order to identify all possible hazards for

health and environment. Besides, previously existing substances undergo re-evaluation and if necessary

supplementary studies are conducted in accordance to the current knowledge status and legal regulations. A

full evaluation of a substance requires copious studies, many of which involve laboratory animals. It results

in time and cost consuming process that additionally raises an objection against the use of animals in

experiments. For the last decades there have been many attempts to employ alternative experimental

models which fulfill 3R rules, i.e. reduce the number of used animals or completely replace them and refine

existing in vivo methods to limit animals’ suffering. Nowadays the recommended methods for oral acute

toxicity testing (OECD 420, 423, 425) are alternative in comparison to the classical methods because they

largely reduce the number of involved animals and allow for the early, humane euthanasia in case of severe

symptoms and suffering signs. Moreover, it is possible to reject the criterion of animals death as an end-

point (OECD 420). Recent years have also brought new experimental approaches which are aimed at

complete elimination of animal studies and their replacement by methods that join in vitro and in silico

tests.

Key words: acute oral toxicity, LD50, alternative methods

Spis skrótów:

ADI (Acceptable Daily Intake) - dopuszczalne dzienne spożycie

ATC (Acute Toxic Class Method) – metoda klas toksyczności ostrej

CFU-GM (Colony Forming Unit - Granulocyte-Macrophage) – jednostka tworząca kolonię

granulocytów i makrofagów

EURL ECVAM ( The European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal

Testing) - Unijne Referencyjne Laboratorium Alternatywnych Metod Badań na Zwierzętach

EWG - Europejska Wspólnota Gospodarcza

FD (Fixed Dose procedure) – metoda dawki ustalonej

FDA (Food and Drug Administration) - Agencja Żywności i Leków

FRAME (Fund for the Replacement of Animal Medical Experiments)

GFAP (Glial fibrillary acidic protein) - kwaśne włókienkowe białko glejowe

GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) - Globalnie

Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania

HSP-32 (Heat shock protein – 32) – białko szoku cieplnego 32

IL-1, IL-6 – Interleukina 1, Interleukina 6

ILAR (Institute for Laboratory Animal Research) – Instytut Badań na Zwierzątach

Laboratoryjnych

LD (lethal dose) – dawka śmiertelna

MBP (myelin basic protein) – zasadowe białko mieliny

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) - bromek 3-(4,5-

dimetylo-tiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu

NF-H – neurofilament H

NOAEL (no observed adverse effect level) - najwyższa dawka substancji nie wywołująca

szkodliwych efektów

NRU (Neutral Red Uptake) – wychwyt czerwieniu obojętnej

OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) - Organizacja

Współpracy Gospodarczej i Rozwoju

TNF (tumor necrosis factor) - czynnik martwicy nowotworu

UD (up-down method) – metoda większej-mniejszej dawki

WE – Wspólnota Europejska

WHO (World Health Organisation) - Światowa Organizacja Zdrowia

Spis treści

1. Wstęp .............................................................................................................................6

2. Cel i zakres pracy............................................................................................................6

3. Toksykologia – najstarsza nauka medyczna ....................................................................7

4. Toksykometria ................................................................................................................8

5. Metody alternatywne w badaniach toksykologicznych ....................................................9

6. Badanie toksyczności ostrej drogą doustną .................................................................... 11

6.1. Metody klasyczne ...................................................................................................... 11

6.1.1. Modyfikowana metoda klasyczna: OECD 401 ........................................................ 12

6.2. Alternatywne metody oceny toksyczności ostrej drogą doustną .................................. 13

6.2.1. Metoda klas toksyczności ostrej (OECD 423) ......................................................... 14

6.2.2. Metoda ustalonej dawki (OECD 420) ..................................................................... 16

6.2.3. Metoda większej – mniejszej dawki (OECD 425) ................................................... 18

6.2.4. Porównanie stosowanych metod oceny toksyczności ostrej drogą pokarmową ........ 18

7. Zastosowanie zasad 3R w metodach badania toksyczności ostrej drogą pokarmową ..... 19

8. Nowe strategie badawcze w procesie oceny toksyczności ostrej drogą doustną ............. 20

8.1. Ograniczenie i zastąpienie zwierząt w eksperymencie ................................................ 21

8.2. Zastosowanie metod in vitro w ocenie systemowej toksyczności ostrej ...................... 21

9. Podsumowanie i wnioski .............................................................................................. 23

11. Piśmiennictwo ................................................................................................................ 25

1. Wstęp

W dobie intensywnego rozwoju przemysłu chemicznego, farmaceutycznego,

kosmetycznego i nowoczesnej produkcji rolnej, co roku na rynkach europejskich i

światowych pojawia się bardzo wiele nowych substancji chemicznych. Wszystkie one

wymagają dokładnego przebadania pod kątem zagrożeń dla zdrowia i środowiska zgodnie z

aktualnym stanem wiedzy i obowiązującymi przepisami. W celu oszacowania potencjalnego

ryzyka stosowania opracowano wiele metod toksykologicznych z wykorzystaniem zwierząt,

które obecnie są wymagane prawem międzynarodowym, a także indywidualnie przez każde

państwo. Pociąga to za sobą konieczność wykonania licznych badań, głównie z użyciem

zwierząt. Wiąże się to z ogromnymi kosztami, długim czasem oczekiwania na wyniki i co

zrozumiałe, sprzeciwem wobec tak dużej liczby zwierząt wykorzystywanych do doświadczeń.

Od lat prowadzone są liczne badania nad opracowaniem alternatywnych metod w celu

ograniczenia lub wyeliminowania zwierząt z tego typu doświadczeń. W przypadku

systemowej toksyczności ostrej na przestrzeni lat wypracowano nowe metody alternatywne

znacząco ograniczające liczbę zwierząt. Opracowuje się również nowe strategie, których

celem ma być wyeliminowanie zwierząt z badań i zastąpienie ich metodyką łączącą metody in

vitro i in silico. Ze względu jednak na duże ograniczenia tych metod, wątpliwości i ciągle

jeszcze dość niską korelację z wynikami in vivo, nie wypracowano do tej pory

zwalidowanych metod in vitro, które pozwoliłyby na wiarygodna oceną systemowej

toksyczności ostrej.

2. Cel i zakres pracy

Celem pracy jest przedstawienie zalecanych i stosowanych obecnie w Unii Europejskiej

metod oceny toksyczności ostrej po narażeniu droga pokarmową ze szczególnym

uwzględnieniem ich oceny jako metod alternatywnych w porównaniu z klasycznymi

metodami in vivo. W pracy omówiono najważniejsze zadania toksykometrii, w tym przyczyny

wprowadzenia i rolę metod alternatywnych w badaniach toksykologicznych. Przedstawiono

również propozycje nowych strategii w badaniach systemowej toksyczności ostrej mające na

celu ograniczenie lub całkowite wyeliminowanie badań na zwierzętach.

3. Toksykologia – najstarsza nauka medyczna

Od starożytności do połowy XVII w. wiedza z zakresu toksykologii była gromadzona na

podstawie obserwacji, jak organizm ludzki reagował na daną substancję, jakie objawy

zatrucia wykazywał, czy powodował śmierć człowieka czy też nie. Głównie obserwowano

zatrucia, które były wynikiem wykorzystania trucizn jako broń w konfliktach politycznych i

osobistych lub wynikiem przypadkowych zatruć wynikających ze spożycia niepoznanych

roślin. Tak stopniowo poznawano trujące rośliny. Rozwój alchemii pozwolił z kolei na

poznanie szkodliwego działania niektórych metali, np. ołowiu (prace Agricoli, Paracelsusa, i

Martina Pansy) (Magowska, 2006).

Paracelsus, a właściwie Philippus Theophrastus Aureolus Bombastus von Hohenheim (1493-

1541) jako pierwszy stwierdził, że specyficzne substancje odpowiedzialne są za właściwości

toksyczne roślin lub są truciznami dla zwierząt. W toku swojej działalności badawczej

dowiódł, że odpowiedź organizmu na różne substancje zależy od podanej dawki. Jego badania

wykazały, że małe dawki danej substancji mogą być nieszkodliwe lub nawet korzystne dla

organizmu, natomiast wysoka dawka może być toksyczna. Niniejsze stwierdzenie to tak

naprawdę główny nurt toksykologii, czyli badanie zależności dawka-odpowiedź. Jego

najsłynniejsza wypowiedź, która najlepiej wyraża to, czym jest toksykologia to: „Cóż jest

trucizną? Wszystko jest trucizną i nic nią nie jest. Tylko dawka decyduje, czy coś jest

trucizną.” (Borzelleca, 2000).

W stworzeniu toksykologii eksperymentalnej mieli udział członkowie stowarzyszenia Royal

Society w Londynie. W drugiej połowie XVII zaczęto podawać zwierzętom wyciągi czy

nasiona trujących roślin w celu stwierdzenia dawki śmiertelnej (np. podawanie ptakom

kulczyby wronie oko zawierających strychninę). Liczba zwierząt w eksperymentach nie miała

znaczenia. Znany ze swych eksperymentów Włoch, Felice Fontany, badając w latach 1760-

1770 badał właściwości trujące jadu żmii potrafił wykorzystać do pojedynczego badania

nawet 300 żab (Magowska, 2006). Pierwszym, który opisał zasady przeprowadzania

doświadczeń na zwierzętach i wykrywania trucizn w tkankach i płynach ustrojowych, był

Matthieu J.B. Orfila. W latach 1814-1815 powstało jego dzieło „Traktat o truciznach”, które

porządkowało wiedzę na temat eksperymentów i było inspiracją do tworzenia kolejnych

książek, podręczników z zakresu toksykologii. Od tego czasu trucizny przestały być „bronią

doskonałą”, ponieważ rozpoczęła się era doskonalenia metod wykrywania trucizn w płynach

ustrojowych, tkankach i innych materiałach, a analiza toksykologiczna stała się ważną bronią

w walce z trucicielami i trucicielkami na salach sądowych (Parascandola, 2012)

Wraz z rewolucją przemysłową mającą miejsce w XIX i XX wieku rozpoczęła swój rozwój

toksykologia przemysłowa, toksykologia katastrof i w końcu toksykometria czyli stosowana

toksykologia doświadczalna. Połowa XIX wieku przyniosła pierwsze próby badań

toksykometrycznych, w tym celową i kontrolowaną ekspozycji zwierząt doświadczalnych na

pyły przemysłowe w drewnianych komorach, a później dużo szczelniejszych komorach z

pełną aparaturą pomiarową (gazometr, manometr). Wzrost liczby osób pracujących w

przemyślę, a tym samym rosnący stopień narażenia ludzi spowodował większe

zainteresowanie się obszarem higieny pracy w przemyśle i wzmożenie badań laboratoryjnych

w ocenie narażenia pracowników na zagrożenia obecne w miejscu pracy. W wyniku

działalności laboratoriów prowadzących te badania powstały takie instytucje państwowe jak

Agencja Żywności i Leków w Stanach Zjednoczonych czy National Cancer Institute (1948

r.). W drugiej połowie XX w. wraz ze wzrostem świadomości ludzkiej na temat zagrożenia

zdrowia spowodowanego rozwijającym się przemysłem i pogłębiającym skażeniem

środowiska, rozpoczęto współpracę międzynarodową w kierunku oceny stopnia skażenia,

ochrony środowiska, a także działania profilaktyczne – działania Europejskiej Wspólnoty

Gospodarczej - EWG, Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju - OECD, Światowej

Organizacji Zdrowia - WHO. Dzięki tej współpracy wprowadzono w życie odpowiednie

regulacje prawne narzucające na producentów leków, środków ochrony roślin, preparatów

biobójczych, kosmetyków, artykuły gospodarstwa domowego, wykonywanie badań

toksykometrycznych w kierunku oszacowania stopnia toksyczności: surowców,

półproduktów, produktów gotowych (Magowska, 2006; Piotrowski, 2008).

4. Toksykometria

Toksykometria jest najważniejszą dziedziną toksykologii stosowanej zajmującą się oceną

wszystkich potencjalnych zagrożeń dla zdrowia człowieka i środowiska, jakie mogą stanowić

pojedyncze substancje i ich mieszaniny. Co roku na rynki europejskie trafia ok. 2000 nowych

substancji chemicznych, które muszą zostać przebadane zgodnie z aktualnym stanem wiedzy.

Wraz z rozwojem nowoczesnej toksykologii zakres wymaganych badań toksykologicznych w

procesie dopuszczenia substancji na rynek stawał się coraz szerszy. Początek działań

mających na celu ujednolicenie zasad i zakresu badań toksykometrycznych miał miejsce

dopiero w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku (Bruchajzer, 2006). Do celów badań

toksykometrycznych należą m.in. ocena działania szkodliwego, stwierdzenie przyczyny

śmierci, ocena mechanizmu działania substancji i w końcu wyznaczenie wskaźników

poziomu narażenia (np. NOAEL, ADI), dzięki którym możliwe jest zapewnienie

bezpieczeństwa chemicznego. Pełen zakres oceny zagrożeń dla zdrowia zgodnie z aktualnymi

przepisami obejmuje ocenę wynikającą z właściwości fizykochemicznych pojedynczych

substancji i mieszanin oraz ich właściwości toksykologicznych ocenianych na podstawie

badań: toksyczności ostrej (działanie systemowe po narażeniu doustnym, inhalacyjnym,

dermalnym, działanie drażniące na skórę i oko, działanie uczulające), toksyczności

krótkoterminowej, toksyczności długoterminowej, działań odległych, wpływu na rozrodczość

czy działania neurotoksycznego (Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 z późniejszymi

zmianami, Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008).

5. Metody alternatywne w badaniach toksykologicznych

Z uwagi na szeroki zakres badań toksykologicznych na zwierzętach, jakie są wymagane

podczas wprowadzania substancji chemicznych na rynek, wywierany jest ciągły nacisk na

stosowanie metod alternatywnych. Metody alternatywne definiowane są jako metody

pozwalające osiągnąć określony cel naukowy przy jednoczesnym wyeliminowaniu lub

ograniczeniu liczby potrzebnych zwierząt oraz zmniejszeniu cierpienia zwierząt

wykorzystywanych w eksperymentach. Za metodę alternatywną uznaje się metodę badawczą,

która spełnia przynajmniej jedną z zasad 3R, czyli zasadę zastąpienia zwierząt modelami

nieodczuwającymi cierpień (Replacement), zasadę ograniczenia liczby zwierząt (Reduction)

oraz zasadę doskonalenia metod badawczych (Refinement). Twórcami tych zasad są W.M.S.

Russell and R.L. Burch. W swojej książce wydanej w 1959 r. pt. „The Principles of Humane

Experimental Technique”, przedstawili nowe podejście do zagadnienia badań naukowych w

kontekście ich doskonalenia w każdym aspekcie, tak, aby otrzymywać rzetelne wyniki przy

jednoczesnym zachowaniu dobrostanu zwierząt. W publikacji autorzy wskazują, jak duże

znaczenie ma dystres, cierpienie, niehumanitarne traktowanie zwierząt w trakcie prowadzania

doświadczeń (Russel i Burch, 1959). Zasady 3R stopniowo zbierały coraz większe grono

zwolenników. W pod koniec lat sześćdziesiątych została stworzona fundacja FRAME (Fund

for the Replacement of Animal Medical Experiments), której celem była wdrażanie idei 3R

w życie (Balls, 2007). Kolejnymi pracami wspierającymi były “Animal Liberation” Petera

Singer’a (1975), australijskiego filozofa, który twierdzi, że w ogóle powinno przestać

eksperymentowanie na zwierzętach oraz „Alternatives to Animal Experiments” Davida

Smyth’a (1978). Zasady 3R zyskiwał coraz większą popularność, dzięki czemu

międzynarodowe władze zwróciły uwagę na problem doświadczeń na zwierzętach. Efektem

tego było powstanie w 1986 r. pierwszej Dyrektywy dotyczącej ochrony zwierząt

wykorzystywanych do celów doświadczalnych opublikowanej przez Wspólnotę Europejską

(Dyrektywa 86/609/EWG, 1986).

Powstanie tej Dyrektywy było poniekąd odległą konsekwencją tzw. afery talidomidowej z

końca lat 50-tych. Talidomid był lekiem wprowadzonym na rynek w 1953 r. przez firmę

Chemie Grünenthal jako lek przeciwbólowy, przeciwwymiotny i usypiający do nabycia bez

recepty, zalecany również do stosowania w leczeniu porannych dolegliwości kobiet we

wczesnej ciąży. Krótko po wypuszczeniu leku, zaczęto zbierać doniesienia o wystąpieniu u

pacjentów biorących lek neuropatii obwodowej. Odnotowywano również zwiększenie

urodzeń dzieci z defektami, lecz początkowo nie łączono tego z działaniem talidomidu

(Vargesson 2015). Dopiero w 1961 r. dwóch niezależnych lekarzy, Lenz w Niemczech oraz

McBride w Australii potwierdziło teratogenne działanie tego leku (Lenz, 1962; McBride,

1961). Talidomid przeszedł badania na zwierzętach, które były wymagane w tamtych latach,

lecz nie przeprowadzono wówczas badań na ciężarnych samicach różnych gatunków

zwierząt. Tragedia talidomidowa spowodowała duże zmiany w prawodawstwie dotyczącym

wdrażania leków, ponieważ pokazała ona różnice międzygatunkowe w metabolizowaniu, w

reakcjach na leki. Okazało się, że gryzonie, które były tradycyjnie stosowane w badaniach,

były dużo mniej wrażliwe na działanie talidomidu niż naczelne czy króliki. Poszerzono zakres

badań m.in. o działanie teratogenne i wdrożono również obowiązkowe badania na innych

gatunkach, nie będących gryzoniami, a także badania in vitro. Spowodowało to gwałtowne

zwiększenie liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniach przy jednoczesnym wdrażaniu

regulacji prawnych dotyczących wprowadzania leków na rynek (Vargesson, 2015).

Tragedia talidomidowa, wzrost liczby badań i zwierząt w nich wykorzystywanych i

jednocześnie coraz większa potrzeba realizowania idei 3R spowodowały, że została zwrócona

większa uwaga na badania na zwierzętach, a szczególnie na badania wymagane do rejestracji

substancji chemicznych. Skutkiem tego podejścia było powstanie pierwszej dyrektywy

chroniącej zwierzęta w doświadczeniach, rozpoczęcie intensywnych badań w wielu

laboratoriach nad opracowaniem nowych metod badawczych, powstanie organizacji i

instytucji opracowujących i walidujących metody z wykorzystaniem zasad 3R (ECVAM,

ILAR). W 2010 roku weszła w życie nowa Dyrektywa w sprawie ochrony zwierząt

wykorzystywanych do celów naukowych w celu ujednolicenia wymagań dotyczących badań

na zwierzętach, której wartością wspólnotową jest dobrostan zwierząt (Dyrektywa

2010/63/UE). Na podstawie tej Dyrektywy została stworzona polska Ustawa z dnia 15

stycznia 2015 o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych

(Dz.U. 2015 poz. 266), która kładzie duży nacisk na dobrostan zwierząt, stosowanie metod

alternatywnych w badaniach, odpowiednie kwalifikacje personelu i sprawdzanie istotności

prowadzonych badań.

6. Badanie toksyczności ostrej drogą doustną

Droga narażenia na substancję stanowi bardzo ważny czynnik, który wraz z określonymi

właściwościami fizykochemicznymi, warunkuje możliwość wystąpienia zatrucia jak również

jego skutki (Spoo, 2004). Większość zatruć u ludzi i zwierząt następuje na skutek narażenia

drogą doustną, a przewód pokarmowy stanowi wrota wnikania substancji chemicznych do

organizmu, co prowadzi do pojawienia się objawów ogólnych.

Toksyczność ostra to zdolność substancji o wywołania efektu toksycznego po podaniu

pojedynczej dawki lub kilku dawek w czasie 24 godzin. Toksyczność ostrą substancji w

metodach tradycyjnych wyznaczano na podstawie śmiertelności zwierząt w grupie i

wyliczaniu na jej podstawie średniej dawki śmiertelnej (LD50) czyli dawki, która powoduje

śmierć 50% wykorzystanych w badaniu zwierząt. Parametr ten został wykorzystany 1927

roku przez J.W. Trevan w badaniach toksyczności m.in. insuliny i kokainy. Wyznaczenie jako

„celu” śmierci zwierząt pozwoliło na porównanie różnych substancji i zauważenia różnic w

sile i sposobie działania trucizn na organizm. Prace Trevan'a przyczyniły się do tego, że

kolejne publikowane prace naukowe modyfikujące i udoskonalające wykorzystywały właśnie

wartość LD50 (Trevan, 1927).

Badanie toksyczności ostrej drogą doustną jest wymagane dla wszystkich substancji

wprowadzanych na rynek europejski w ilości powyżej 1 tony/ rok (Rozporządzenie (WE) nr

1907/2006).

6.1. Metody klasyczne

Metody klasyczne cechowały się wykorzystaniem dużej liczby zwierząt, ponieważ zmierzały

do określenia dokładnej dawki LD50. Metodzie tej wykorzystywano zazwyczaj gryzonie

(myszy, szczury), lecz jeżeli było to zasadne to również inne gatunki zwierząt. Analizując

doświadczenia oceniające toksyczność ostrą substancji wykonane na przestrzeni lat

zauważono, że uzyskiwane wartości LD50 w powtarzanych doświadczeniach różnią się nawet

2-3 krotne. W związku z tym zaczęto pracę nad ujednoliceniem metody i zmniejszeniem

liczby zwierząt, tym bardziej, że głównym celem badania toksyczności ostrej doustnej nie

było wyznaczenie dawki LD50, tylko poznanie właściwości toksycznych badanej substancji.

Przyspieszenie prac spowodowało, w przypadku państw europejskich, wprowadzenie

Dyrektywy z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawodawczych,

wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i

etykietowania substancji niebezpiecznych (67/548/EWG), która regulowała prawnie kwestie

badań bezpieczeństwa. Do lat 80-tych XX wieku stosowano metody Lichfielda i Wilcoxona

opracowane w latach 40-tych ubiegłego wieku (Krysiak, 1997; Litchfield i Wilcoxon, 1947).

6.1.1. Modyfikowana metoda klasyczna: OECD 401

W 1981 roku Międzynarodowa Organizacja Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju

wykorzystując ekspertów z całego świata opublikowała zbiór wytycznych służących do oceny

bezpieczeństwa stosowania substancji chemicznych „Wytyczne OECD do badań substancji

chemicznych” (OECD Guidelines for the Testing of Chemicals). Zatwierdzenie tych

wytycznych przez państwa członkowskie przyczyniło się do tego, że wyniki badań uzyskane

zgodnie z tymi wytycznymi były wzajemnie uznawane. Pierwszą wytyczną OECD

przedstawiającą protokół postępowania przy badania toksyczności ostrej doustnej była

wytyczna OECD 401, stanowiąca zmodyfikowaną metodę Lichfielda i Wilcoxona. W każdej

grupie należało wykorzystać 10 zwierząt (po 5 samców i samic, gatunkiem preferowanym był

szczur), co dawało 40 zwierząt na pojedyncze badanie uwzględniając grupę kontrolną (przy 3

poziomach dawkowania). Liczba poziomów dawkowania miała pozwolić na obserwację

narastających objawów zatrucia oraz śmiertelności w grupie. Informacje zebrane podczas

badania powinny być wystarczające do wykreślenia krzywej zależności dawka-odpowiedź i

obliczenia wartości LD50. Medialna dawka śmiertelna mogła być określone na podstawie

następujących metod: Blissa, Litchfielda i Wilcoxona, Finneya, Weila, Thomsona, Millera i

Taintera (Bliss, 1938; Litchfield i Wilcoxon, 1947; Finney, 1971; Weil, 1952; Thompson.

1947; Miller i Tainter, 1944). Po paru latach (1987) wprowadzono modyfikację, a

mianowicie, wytyczna zakładała wykorzystanie 5 zwierząt tej samej płci na każdy poziom

dawkowania, a wykorzystanie obu płci w przypadku stosowania testu granicznego, w którym

dawka wynosiła min. 2000 mg/kg m.c. Wyznaczenie wartości LD50 pozwalało na

zaklasyfikowanie substancji do odpowiedniej klasy toksyczności ostrej według Hodge'a i

Sternera (Tabela 1) jak również odpowiednie oznakowanie pod względem zagrożeń (Ahmed,

2015). Wytyczne OECD są okresowo sprawdzane pod kątem postępów naukowych w danych

dziedzinach lub zmieniających się praktyk oceniania. Z uwagi na dużą liczbę zwierząt

wykorzystywanych do doświadczeń jak również ich cierpienie, metoda klasyczna metoda

OECD 401 została całkowicie wycofana przez państwa członkowskie z wytycznych OECD w

2002 roku (Jodynis-Liebert i Seńczuk, 2006).

Tabela 1. Klasyfikacja wg Hodge'a i Sternea (Ahmed, 2015)

Klasa toksyczności Określenie Wartość LD50, droga

pokarmowa, szczury, mg/kg

1 nadzwyczaj toksyczna ˂ 1

2 bardzo toksyczna 1 ÷ 50

3 toksyczna 50 ÷ 500

4 średnio toksyczna 500 ÷ 5000

5 słabo toksyczna 5000 ÷ 15000

6 praktycznie nietoksyczna ˃ 15000

6.2. Alternatywne metody oceny toksyczności ostrej drogą doustną

Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania (GHS) oraz nowa strategia w

polityce postępowania z substancjami chemicznymi spowodowała przyspieszenie prac nad

wprowadzeniem nowych metod badania toksyczności ostrej. Przełomową decyzją w

wytycznych dla oceny substancji była rezygnacja z wyznaczania medialnej dawki śmiertelnej,

ze względu na fakt, iż dla klasyfikacji substancji nie jest konieczne wyznaczanie dokładnej

wartości LD50. Zgodnie z obowiązującymi przepisami badanie toksyczności ostrej musi

pozwolić na klasyfikację substancji do odpowiedniej kategorii, co skutkuje odpowiednim

oznakowaniem przekazującym wystarczające informacje o zagrożeniach w kontakcie z daną

substancją bądź mieszaniną (Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr

1272/2008, Tabela 3). Od początku lat 90-tych (z późniejszymi modyfikacjami) rozpoczęto

wprowadzanie nowych, alternatywnych metod badania toksyczności ostrej w warunkach in

vivo. Obecnie dopuszczone w krajach Unii Europejskie metody badania toksyczności ostrej

to: metoda klas toksyczności ostrej (acute toxic class method, ATC) (OECD Test Guideline

423, 1996, aktualizacja 2001), metoda ustalonej dawki (fixed dose procedure, FD) (OECD

Test Guideline 420, 1992, aktualizacja 2002), metoda dawki skokowej (up-down method, UD)

(OECD Test Guideline 425, 1997, aktualizacja 2008). Wszystkie wymienione metody

alternatywne zostały tak przygotowane, by móc zaklasyfikować badaną substancję czy

mieszaninę zgodnie z GHS. Zgodnie z Globalnie Zharmonizowanym Systemem Klasyfikacji i

Oznakowania substancje chemiczne i mieszaniny klasyfikowane są do pięciu kategorii

(Tabela 1.).W 2009 r. po wejściu w życie tzw. Rozporządzenia CLP (Rozporządzenie

Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, oznakowania i

pakowania substancji i mieszanin, zmieniające i uchylające dyrektywy 67/548/EWG i

1999/45/WE oraz zmieniające rozporządzenie (WE) nr 1907/2006) są klasyfikowane w 4

kategoriach zagrożenia pod względem toksyczności ostrej (substancja jest poza klasyfikacją,

jeśli jej medialna dawka śmiertelna przekracza 2000 mg/kg masy ciała). Najważniejszą zaletą

nowych metod badawczych było bardzo wyraźne zmniejszenie liczby zwierząt

wykorzystywanych i uśmiercanych w przebiegu badania. Do badań poleca się

wykorzystywanie zwierząt jednej płci, ze względu na wyższą wrażliwość są to zazwyczaj

samice.

Tabela 2. Kategorie toksyczności ostrej doustnej – klasyfikacja GHS (GHS (Rev.5), 2013)

Kategoria LD50 – średnia dawka śmiertelna

1 LD50 < 5 mg/kg

2 5 mg/kg < LD50 < 50 mg/kg

3 50 mg/kg < LD50< 300 mg/kg

4 300 mg/kg < LD50< 2000 mg/kg

5 2000 mg/kg < LD50< 5000 mg/kg

5/nieklasyfikowane LD50 > 5000 mg/kg

6.2.1. Metoda klas toksyczności ostrej (OECD 423)

Metoda wprowadzona w 1996 roku (z późniejszymi aktualizacjami). Jej główną zaletą jest

wykorzystanie małej liczby zwierząt. Na każdym etapie wykorzystuje się trzy zwierzęta tej

samej płci (zazwyczaj samice). Badanie wymaga wyboru najwłaściwszej dawki wyjściowej

czyli takiej, która prawdopodobnie spowoduje śmierć minimum jednego zwierzęcia w grupie.

Przy wyborze dawki początkowej uwzględnia się wszystkie dostępne dane z innych badań

toksyczności, właściwości fizykochemiczne substancji, wyniki oceny struktura chemiczna a

aktywność biologiczna, planowane zastosowanie substancji.

- 0, 1, 2, 3: liczba zwierząt w agonii i padłych na każdym na każdym etapie

- GHS: Globalny harmonizowany System Klasyfikacji (mg/kg masy ciała)

- na każdym etapie wykorzystujemy zwierzęta jednej płci

- ∞ nieklasyfikowana

Ryc. 1. Schemat badania zasadniczego w metodzie klas toksyczności przy zastosowaniu

dawki wyjściowej 5 mg/kg m.c. (OECD Test Guideline 423, 1996, aktualizacja 2002)

Zakładając, że dawka wyjściowa jest dawką najniższą (5mg/kg m.c., zgodnie z GHS) i

powoduje śmierć 2 lub 3 zwierząt, badanie można zakończyć już na tym etapie i

zaklasyfikować badaną substancję do kategorii 1. W przypadku wystąpienia jednego zgonu

lub nie wystąpienia śmierci zwierzęcia, przechodzi się do kolejnego etapu i podaje się tę samą

dawkę kolejnym 3 zwierzętom. Powtórzenie wyniku z poprzedniego etapu skutkuje

klasyfikacją w kategorii 1, natomiast brak zgonów lub śmierć jednego zwierzęcia wymaga

powtórzenia procedury na wyższym poziomie dawkowania. W przypadku trafnego wyboru

minimalnej dawki granicznej (5 mg/kg m.c.) jako dawki wyjściowej procedurę można

zakończyć wykorzystując tylko 3 zwierzęta (Ryc. 1). W przypadku pozostałych poziomów

dawkowania przy prawidłowo dobranej dawce wyjściowej maksymalna liczba zwierząt

wykorzystanych do doświadczenia to 6 sztuk dla dawki wyjściowej 2000 mg/kg m.c. i 9 sztuk

dla dawek 300 i 50 mg/kg m.c. (Ryc. 2).

6.2.2. Metoda ustalonej dawki (OECD 420)

Metoda ustalonej dawki pozwala uzyskać informację na temat działania szkodliwego

substancji po podaniu pojedynczej dawki substancji. Metoda ta pozwala zrezygnować z

parametru oceny jaką jest śmierć zwierzęcia, a zamiast tego zastosować kryterium końcowe

jakim są wyraźne objawy zatrucia. W tej procedurze wykorzystuje się zwierzęta jednej płci

(zazwyczaj samice), a zalecanym gatunkiem do badań jest szczur. Badanie podzielone jest na

dwa etapy: badanie wstępne i badanie zasadnicze. Badanie wstępne polega na podaniu

pojedynczemu zwierzęciu wybranej dawki wyjściowej z 4 ustalonych dawek (5, 50, 300, lub

2000 mg/kg m.c.) i obserwacji objawów zatrucia (Ryc. 3). W wyborze dawki wyjściowej do

badania wstępnego pomagają wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji, jej

właściwościach fizykochemicznych i wynikach innych dostępnych testów, w tym testów in

vitro. W przypadku braku jakichkolwiek danych na temat substancji badanie rozpoczyna się

od podania dawki 300 mg/kg m.c. Na podstawie reakcji zwierzęcia (śmierć zwierzęcia, oznaki

wyraźnej toksyczności czy brak toksyczności) na podaną substancję podejmuje się decyzję o

kolejnym etapie.

Ryc. 3. Schemat badania wstępnego w metodzie ustalonej dawki przy zastosowaniu dawki

wyjściowej 50 mg/kg m.c. (Test Guideline 420, 1992, aktualizacja 2002)

Badanie wstępne pozwala na wybór dawki zastosowanej jako dawka wyjściowa w badaniu

zasadniczym. W przypadku zaobserwowania wyraźnych objawów zatrucia (Ryc. 3, wynik B),

a nie śmierć nie ma potrzeby kontynuacji badania. Brak objawów (ryc. 3, wynik C) lub śmierć

zwierzęcia (Ryc. 3, wynik A) skutkuje kontynuacją procedury odpowiednio z większą lub

mniejszą dawką. W przypadku trafnie dobranej dawki wyjściowej do badania zasadniczego

wynik otrzymuje się przy wykorzystaniu 5 zwierząt (1 zwierzę z badania zasadniczego może

być włączone do grupy badanej). Każde zwierzę biorące udział w doświadczeniu jest

obserwowane przez minimum 14 dni, a po zakończeniu doświadczenia uśmiercane i

poddawane sekcji zwłok (wykonanie badań mikro- i makroskopowych narządów). Opisana

metoda pozwala określić jedynie zakres LD50, ale wynik badania pozwala na

zaklasyfikowanie substancji pod względem toksyczności ostrej zgodnie z obowiązującymi

przepisami jak również określić stopień potencjalnego zagrożenia zdrowia.

Ryc. 4. Schemat badania zasadniczego w metodzie ustalonej dawki przy zastosowaniu dawki

wyjściowej 50 mg/kg m.c. (Test Guideline 420, 1992, aktualizacja 2002)

6.2.3. Metoda większej – mniejszej dawki (OECD 425)

Dawkę wyjściową w tym badaniu wyznacza się na podstawie informacji zebranych na temat

substancji badanej. Badanie polega na podaniu jednemu zwierzęciu dawkę substancji poniżej

najlepszego szacunku wartości LD50. W zależności od wyniku, dawka jest zmniejszana lub

zwiększana o stały współczynnik (zalecany współczynnik 3,2: wartość 0,5 na skalo

logarytmicznej) Ta sekwencja trwa do momentu odwrócenia początkowego wyniku (np.

moment w którym wzrost dawki powoduje więcej zgonów niż przeżyć, lub zmniejszenie

dawki powoduje więcej przeżyć niż zgonów). Następnie, kolejnym zwierzętom podawane są

dawki zgodnie z zasadą większej-mniejszej dawki do momentu osiągnięcia kryterium

zatrzymania. Sekwencyjne podawanie kolejnych dawek wykonuje się co 48 godzin; w tym

czasie każde zwierzę jest poddane szczegółowej obserwacji przed decyzją o podaniu kolejnej

dawki oraz jej wielkości. Jeżeli moment odwrócenia nie nastąpi przed osiągnięciem wybranej

wyższej (2000 lub 5000 mg/kg) dawki granicznej, to nie większej niż określonej liczbie

zwierząt podawana jest dawka graniczna. Badanie metodą OECD 425 różni się również od

pozostałych zaprezentowanych testów tym, iż umożliwia oszacowanie medialnej dawki

śmiertelnej za pomocą metody szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa.

6.2.4. Porównanie stosowanych metod oceny toksyczności ostrej drogą pokarmową

Wszystkie polecane i stosowane obecnie metody badania toksyczności ostrej drogą

pokarmową są metodami in vivo, a gatunkiem polecanym jest szczur (młode, nieciężarne

samice). Substancje badane podawane są sondą dożołądkowo w celu ścisłej kontroli przyjętej

dawki. Zwierzęta są utrzymywane w ściśle określonych warunkach środowiska dotyczących

parametrów wilgotności, temperatury otoczenia, regulacji czasu dnia i nocy (światło

sztuczne, po 12 godzin dzień i noc) oraz diety laboratoryjnej i dostępu do wody. Wszystkie

metody zakładają codziennie szczegółowe obserwacje zwierząt w doświadczeniu. Częstsze w

dzień podania dawki, a w kolejne dni przynajmniej raz dziennie przez cały okres

doświadczenia. Obserwacje skupiają się na ewentualnych zaburzeniach w obrębie skóry,

sierści, oczu, błon śluzowych, układu oddechowego, pokarmowego, nerwowego,

wydalniczego, zaburzeń w aktywności somatomotorycznej i wzorcach zachowań.

Wynik badania otrzymany we wszystkich opisanych procedurach pozwala na klasyfikację

substancji pod względem toksyczności ostrej doustnej zgodnie z obowiązującymi przepisami.

Żadna z metod nie pozwala na wyliczenie dawki LD50 (zbyt mała liczba zwierząt), przy czym

metoda większej-mniejszej dawki (OECD 425) pozwala na oszacowanie medialnej dawki

śmiertelnej wraz z przedziałem ufności (OECD Series on Testing and Assessment no. 24,

2001).

7. Zastosowanie zasad 3R w metodach badania toksyczności ostrej drogą

pokarmową

Zasada ograniczenia liczby zwierząt (reduction)

Należy podkreślić, że wszystkie opisane procedury przyczyniają się znacząco do zmniejszenia

liczby zwierząt wykorzystanych w doświadczeniach (tabela 4) w porównaniu z badaniami

klasycznymi, w tym również w modyfikowanej metodzie klasycznej OECD 401 (40 zwierząt

przy 3 poziomach dawkowania). Tak znacząca redukcja liczby zwierząt w procedurze jest

możliwa dzięki rezygnacji z konieczności wyliczania medialnej dawki śmiertelnej jako

jedynego kryterium klasyfikacji substancji. Wieloletnia analiza przydatności wyników

toksykologicznych pokazuje, że dokładna dawka LD50 nie jest parametrem niezbędnym do

oceny bezpieczeństwa ksenobiotyków, co więcej stanowi mało przydatne narzędzie w

procesie ekstrapolacji danych na człowieka i zrozumieniu sposobu i mechanizmu działania

trucizn, konsekwencji narażenia czy ustalaniu zasad bezpiecznego postępowania z

substancjami chemicznymi i postępowania terapeutycznego (Prieto i wsp., 2014; Barile,

2008). Ważną decyzją państw członkowskich znacząco zmniejszającą liczbę zwierząt było

odejście od zasady dwupłciowości w badaniach toksyczności ostrej, ze względu na fakt, iż

znaczące różnice we wrażliwości w tej grupie badań zdarzają się bardzo rzadko.

Tabela 4. Wybrane parametry metod oceny toksyczności ostrej droga pokarmową (na

podstawie: OECD Series on Testing and Assessment no. 24, 2001)

Wytyczna

Oceniany parametr

Liczba zwierząt

użytych w badaniu* Liczba zgonów* Uzyskiwany wynik

OECD 420 5-7 1 Zakres LD50

OECD 423 7 2-3 Zakres LD50

OECD 425 6-9 2-3 Oszacowana wartość LD50 z

przedziałem ufności

*podane wartości są wynikiem modelowania statystycznego oraz danych zebranych z wykonanych badań

rejestracyjnych

Zasada udoskonalania metod badawczych (refinement)

Obowiązkiem państw członkowskich jest stałe dążenie do udoskonalanie metod już

stosowanych, co jest wynikiem ciągłego postępu w nauce, coraz większej wiedzy na temat

przydatności metod jak również ich ograniczeń oraz wchodzenia w życie nowych przepisów.

Bardzo ważnym aspektem wprowadzania zasady refinement w opisanych metodach in vivo

jest dopuszczenie możliwości wcześniejszego humanitarnego uśmiercenia zwierząt w

procedurze, zanim dojdzie do naturalnej śmierci. Eutanazji poddaje się zwierzęta w stadium

agonalnym, odczuwające silny ból czy stres. Należy również podkreślić, że metoda ustalonej

dawki (OECD 420) odchodzi od śmierci jako punktu końcowego procedury a zastępują je

wyraźne objawy toksyczności.

Zasada zastępowania zwierząt modelami nieodczuwającymi cierpień (replacement)

Metody oceny toksyczności ostrej w warunkach in vivo są obecnie jedynymi metodami

akceptowanymi przez instytucje regulacyjne w procesie oceny bezpieczeństwa. Wyniki

innych testów np. in vitro, stanowią jedynie źródło dodatkowych informacji w procesie oceny

ostrej toksyczności systemowej i ich wyniki nie maja mocy prawnej, a co za tym idzie nie

mogą być stosowane zamiast oceny toksyczność w warunkach in vivo (EURL ECVAM

Report, 2014, Barile, 2008). Ważnym aspektem jest również fakt, że jedyne akceptowane

obecnie procedury toksyczności ostrej (np. w procesie rejestracji substancji czynnych i

preparatów biobójczych czy pestycydów) są jednocześnie zakazane w przypadku preparatów

kosmetycznych, gdzie obowiązuje całkowity zakaz testowania na zwierzętach

poszczególnych składników jak również gotowych preparatów (Rozporządzenie (WE) nr

1223/2009). W ostatnich latach trwają intensywne prace nad opracowaniem metod i

wypracowaniem strategii, które pozwolą całkowicie wyeliminować zwierzęta z badań

systemowej toksyczności ostrej

8. Nowe strategie badawcze w procesie oceny toksyczności ostrej drogą

doustną

Nowe kierunki w procesie oceny systemowej toksyczności ostrej skupiają się wokół dwóch

aspektów: 1) dalszego ograniczenia liczby zwierząt w eksperymencie, ale przede wszystkim

ich wyeliminowanie z procedury, 2) dalsza praca nad udoskonalaniem metod in vivo mająca

na celu całkowite wyłączenie parametru śmierci zwierzęcia jako punktu końcowego i

zastąpienie go wyraźnymi objawami zatrucia.

8.1. Ograniczenie i zastąpienie zwierząt w eksperymencie

Realizacja tego celu jest wielokierunkowa i obejmuje m.in.: stałe doskonalenie metod in vitro,

wykorzystanie danych z badań krótkoterminowych do wyciągania wniosków na temat

toksyczności ostrej, wprowadzanie do procesu oceny i zbadanie przydatności metod in silico

(modelowanie toksykokinetyczne, badanie zależności struktura związku – aktywność) (EURL

ECVAM Report, 2014). Ponadto, obowiązujące przepisy dotyczące postepowania z

substancjami chemicznymi dają możliwość odstępstwa od wykonywania badań toksyczności

ostrej, szczególnie w przypadku mieszanin. Rozporządzenie CLP (Rozporządzenie

Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008) zaleca stosowanie metody

obliczeniowej dla ustalenia toksyczności ostrej mieszanin w przypadku, gdy znane są

medialne dawki śmiertelne dla wszystkich jej składników. Istnieje również możliwość oceny

toksyczności mieszaniny przez jej porównanie z mieszaniną o podobnym składzie.

Warunkiem takiej oceny pomostowej jest zakwalifikowanie mieszaniny jako

reprezentatywnej dla mieszaniny podlegającej ocenie. Dużo uwagi poświęca się również

możliwości ekstrapolowania danych na temat toksyczności ostrej substancji z innych badań,

szczególnie badań krótkoterminowych. Opracowanie metody oszacowania toksyczności ostrej

na podstawie danych otrzymanych z 28-dniowego testu dawki powtarzanej będzie

szczególnie przydatne w przypadku substancji wprowadzanych na rynek w ilości 10-100 ton

rocznie dla których test ten jest obowiązkowo wykonywany (Rozporządzenie (WE) nr

1907/2006). Kolejnym aspektem jest włączanie w system oceny toksyczności ostrej metod in

silico, głównie modelowania toksykokietycznego. Podjęto już próby ekstrapolacji danych z

wyników osiąganych w testach in vitro na warunki in vivo (Pery i wsp., 2013). Należy jednak

podkreślić, że możliwości ekstrapolacji międzygatunkowej pokazują słabą korelację, co

ogranicza użycie tych metod w przenoszeniu wyników na ssaki (Scholz i wsp., 1014).

Informacje otrzymane z modelowania komputerowego mogą stanowić jeden z elementów

(obok innych danych toksykologicznych) w szacowaniu systemowej toksyczności ostrej

substancji.

8.2. Zastosowanie metod in vitro w ocenie systemowej toksyczności ostrej

Rozpatrując możliwość wprowadzenia metod in vitro do oceny systemowej toksyczności

ostrej należy wziąć pod uwagę ogromne ograniczenia, jakie wiążą się z tym rozwiązaniem.

Metodyka badań in vitro musi uwzględnić między innymi stężenia substancji, które

korespondują ze stężeniami toksycznymi i/lub śmiertelnymi we krwi ludzkiej i tkankach oraz

czas inkubacji odpowiadający narażeniu ostremu. Ponadto, oprócz powszechnie

wykorzystywanych badań cytotoksyczności podstawowej należy wziąć pod uwagę testy na

komórkach z izolowanych z narządów (hodowle pierwotne) celem określenia toksyczności na

narządy docelowe. Brakuje niestety wystandaryzowanych modeli in vitro do oceny

systemowej toksyczności ostrej a wykonywane do tej pory testy mają liczne wady takie jak

trudności w pozyskiwaniu komórek czy możliwość oceny tylko niektórych typów uszkodzeń

(Barile, 2008). Podstawowe kryteria oceny toksyczności ostrej substancji w badaniach in vitro

są podobne jak w przypadku innych badań z użyciem izolowanych komórek: ocenia się m.in.

zmiany w morfologii, proliferację, metabolizm, uszkodzenie błon komórkowych, błon

mitochondrialnych, przyklejanie do podłoża. Istniej również możliwość zastosowania frakcji

postmitochondrialnej (S9) jako źródła monoksygenaz i innych enzymów biorących udział w

metabolizmie substancji. Pomimo wielu prób i zaawansowanych projektów nie wypracowano

do tej pory wiarygodnych, zwalidowanych testów in vitro do badania toksyczności ostrej i

narządowej. Organizacja Unii Europejskiej pracująca nad metodami alternatywnymi do badań

na zwierzętach EURL ECVAM (the European Union Reference Laboratory for Alternatives

to Animal Testing) proponuje walidowanie badania in vitro jedynie jako pomoc w

oszacowaniu dawki wyjściowej do badań na zwierzętach. Wynika to z faktu, iż wyizolowane

komórki uszkodzone w wyniku działania substancji chemicznej nie odzwierciedlą

uszkodzenia całego organu, na które składa się często cała kaskada procesów wynikających z

toksykokinetyki badanego związku. W latach 2005 – 2010 EURL ECVAM zainicjowało

międzynarodowy projekt ACuteTox jest projektem, który ma pozwolić na połączenie badań

cytotoksyczności podstawowej z testami specyficznymi narządowo i danymi kinetycznymi (w

tym metabolizm) (Kinsner-ovaskainen i wsp., 2009). ACuteTox ma na celu również

identyfikację czynników, które można zoptymalizować dla polepszenia korelacji in vitro – in

vivo dla oszacowania systemowej toksyczności ostrej (Hoffmann i wsp., 2010, Zuang i wsp.,

2013; Clemedson i wsp., 2007, Forsby i wsp. 2009).

Poniżej przedstawiono metody, które po zakończeniu projektu ACuteTox na podstawie

analizy statystycznej zostały ocenione jako obiecujące do włączenia w strategię badań i przez

to wybrane do uczestniczenia w badaniach przedwalidacyjnych (rozwijane i optymalizowane

pod nadzorem ECVAM):

1. Badanie wychwytu czerwieni obojętnej przy użyciu linii komórkowej fibroblastów

3T3 (3T3/NRU),

2. Badanie uwolnienia cytokin przy użyciu ludzkiej krwi całkowitej (IL-1, IL-6, TNF-

alpha),

3. Hamowanie wydajności jednostek tworzących kolonię w pozyskanych komórkach

ludzkiej krwi pępowinowej stymulowanej CFU-GM (CBC/CFU-GM),

4. Ekspresja genu (GFAP, HSP-32, MBP oraz NF-H) oraz pomiar wbudowania urydyny

w całkowitej syntezie mRNA w agregatach kultur pierwotnych mózgu szczura,

5. Panel do pomiaru stresu oksydacyjnego (wewnątrzkomórkowa aktywność nadtlenowa,

wewnątrzkomórkowy poziom anionu ponadtlenkowego, utleniona zasada DNA 8-

oksoguanina) oraz badania skriningowe cytotoksyczności (poziomy

wewnątrzkomórkowego Ca2+, potencjał błonowy mitochondrium, potencjał

membranowy cytoplazmy) w komórkach HepG2, SH-Sy5Y i A.704,

6. Test MTT z wykorzystaniem szczurzych hepatocytów.

7. Parametry kinetyczne (pojemność dystrybucji, stopień wiązania z białkami,

oczyszczanie i absorbcja doustna z użyciem komórek Caco-2 i sieci neuronowych) do

oszacowania dawki doustnej na podstawie efektywnego stężenia obserwowanego in

vitro,

8. Oszacowanie przejścia związku przez barierę krew-mózg za pomocą sieci neuronowej

(do testów neurotoksyczności).

9. Podsumowanie i wnioski

1. Ocena toksyczności ostrej drogą pokarmową jest niezbędnym narzędziem do oceny

bezpieczeństwa stosowania substancji chemicznych. Należy podkreślić, że jedynymi

dopuszczonymi metodami badania toksyczności ostrej są badania in vivo. Przez lata

pracowano nad doskonaleniem metod badawczych a wynikiem tych działań było

stworzenie metod spełniających kryteria metod alternatywnych w odniesieniu do

metod klasycznych. Aktualnie obowiązujące metody badawcze pozwoliły na

zmniejszenie (co najmniej 5-krotne) liczby zwierząt w eksperymencie. Doskonalenie

metod ma na celu bardziej humanitarne postępowanie ze zwierzętami w celu

zminimalizowania ich cierpienia i polepszenia dobrostanu

2. Rozwój przemysłu i stały wzrost liczby zwierząt wykorzystywanych do badań

zmotywował państwa do tworzenia międzynarodowych organizacji zajmujących się

nadzorem i opracowywaniem nowych metod badawczych do oceny bezpieczeństwa

substancji chemicznych oraz wspieraniem państw członkowskich w tworzeniu

międzynarodowych regulacji prawnych dotyczących bezpieczeństwa chemicznego.

Pomimo wielu lat intensywnej pracy, do tej pory nie opracowano metod badania

systemowej toksyczności ostrej spełniających zasadę zastąpienia (replacement),

dających pewny wynik potwierdzający działanie substancji badanej na cały organizm.

3. Prowadzone programy badawcze wskazują na ogromną trudność wprowadzenia metod

in vitro do badania systemowej toksyczności ostrej, chociaż z powodzeniem są już

wykorzystywane w toku niektórych badań toksyczności miejscowej (np. w ocenie

działania drażniącego). Wyniki prac wskazują na to, że ocena systemowej

toksyczności ostrej metodami in vitro będzie łączyła kilka testów badających różne

mechanizmy i specyfikę narządową działania trucizny. Wyniki testów in vitro w

połączeniu z metodami modelowania kinetycznego mogą również w przyszłości

wspomóc proces podejmowania decyzji o konieczności skierowania substancji do

badań toksyczności ostrej droga pokarmową metodami in vivo.

4. Należy podkreślić, że każda metoda badawcza zachowująca cechy metod

alternatywnych i stosująca zasady 3R musi jednocześnie dawać ekstrapolacyjnie

wiarygodne wyniki i stanowić podstawę do prawidłowej klasyfikacji substancji pod

katem bezpieczeństwa dla zdrowia.

11. Piśmiennictwo

1. Ahmed M. 2015. Acute Toxicity (Lethal Dose 50 Calculation) of Herbal Drug Somina

in Rats and Mice. Pharmacology & Pharmacy, 6, 185-189 (2015)

2. Balls M. 2007. Animal experimentation and the Three Rs: why truth matters. Altern

Lab Anim.;35(5):451-2.

3. Barile FA. 2008. Principles of toxicology testing. CRC Press, Boca Raton

4. Bliss CI. 1938. Quart. J. Pharm. Pharmacol, 11, 192-216

5. Borzelleca JF. 2000. Paracelsus: herald of modern toxicology. Toxicol Sci. 53(1):2-4.

6. Bruchajzer E. 2006. Toksykometria. W: Podstawy toksykologii, red: Piotrowski JK.

Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 30-62.

7. Clemedson C, Kolman A, Forsby A. 2007. The integrated acute systemic toxicity

project (ACuteTox) for the optimisation and validation of alternative in vitro tests.

Altern Lab Anim.;35(1):33-8.

8. Dyrektywa Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia

przepisów ustawodawczych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do

klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych.

9. Dyrektywa 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego I Rady z dnia 22 września 2010

r.w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych

10. Dz.U. 2015 poz. 266. Ustawa z dnia 15 stycznia 2015 o ochronie zwierząt

wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych.

11. Finney DG. 1971. Probit Analysis. (3rd Edn.) London, Cambridge University Press

12. Forsby A, Bal-Price AK, Camins A, Coecke S, Fabre N, Gustafsson H, Honegger P,

Kinsner-Ovaskainen A, Pallas M, Rimbau V, Rodríguez-Farré E, Suñol C, Vericat JA,

Zurich MG. 2009. Neuronal in vitro models for the estimation of acute systemic

toxicity. Toxicol In Vitro. (8):1564-9.

13. GHS (Rev.5), 2013, Globally Harmonized System of Classification and Labelling of

Chemicals (GHS), Part 3: Health hazards; Fifth revised edition, United Nations,

14. Hoffmann S, Kinsner-Ovaskainen A, Prieto P, Mangelsdorf I, Bieler C, Cole T. 2010.

Acute oral toxicity: variability, reliability, relevance and interspecies comparison of

rodent LD50 data from literature surveyed for the ACuteTox project. Regul Toxicol

Pharmacol. 58(3):395-407.

15. Jodynis-Liebert J, Seńczuk W. 2006. W: Toksykologia współczesna. red. Seńczuk W.

Wydawnictwo Lekarskie PZWL

16. Kinsner-Ovaskainen A, Bulgheroni A, Hartung T, Prieto P. 2009. ECVAM's ongoing

activities in the area of acute oral toxicity. Toxicol In Vitro; 23(8):1535-40.

17. Krysiak B. 1997. Ocena ostrego działania toksycznego substancji chemicznych

metodami alternatywnymi. W: Nowoczesne metody oceny toksyczności substancji

toksycznych. Kurs w ramach wdrażania wyników Strategicznego Programu

Rządowego „Bezpieczeństwo i ochrona zdrowia człowieka w środowisku pracy” IMP,

Łódź.

18. Lenz W. 1962. Thalidomide and congenital abnormalities. Lancet 1:271–272

19. Litchfield JT, Wilcoxon FA.1947: A simplified method of evaluating dose-effect

experiments. J. Pharm. Exp. Ther. 95, 99-113.

20. Magowska A. 2006. Toksykologia współczesna. red. Seńczuk W. Wydawnictwo

Lekarskie PZWL

21. McBride W. 1961. Thalidomide and congenital malformations. Lancet 1:358

22. Miller LC, Tainter ML. 1944. Proc. S oc. Exp. Biol. M e d. NY , 57, 261-264

23. OECD Test Guideline 401, 1981, aktualizacja 1987. Guideline For Testing Of

Chemicals - Acute Oral Toxicity

24. Test Guideline 420, 1992, aktualizacja 2002. Guideline For Testing Of Chemicals -

Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure

25. OECD Test Guideline 423, 1996, aktualizacja 2002. Guideline For Testing Of

Chemicals - Acute Oral Toxicity – Acute Toxic Class Method

26. OECD Test Guideline 425, 1997, aktualizacja 2008. Guideline For Testing Of

Chemicals - Acute Oral Toxicity – Up-and-Down-Procedure (UDP)

27. OECD Series on Testing and Assessment no. 24. 2001. Guidance Document on Acute

Oral Toxicity Testing, ENV/JM/MONO(2001)4

28. Parascandola J. 2012. Kings of poison. Potomac Books, Dulles.

29. Péry AR, Brochot C, Zeman FA, Mombelli E, Desmots S, Pavan M, Fioravanzo E,

Zaldívar JM. 2013. Prediction of dose-hepatotoxic response in humans based on

toxicokinetic/toxicodynamic modeling with or without in vivo data: a case study with

acetaminophen. Toxicol Lett. 220(1):26-34.

30. Piotrowski JK. 2008, Podstawy toksykologii, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne

31. Prieto P, Burton J, Graepel R, Price A, Whelan M, Worth A. 2014. EURL ECVAM

strategy to replace, reduce and refine the use of animals in the assessment of acute

mammalian systemic toxicity. JRC Sciences and Policy Reports, Institute for Health

and Concumer Protection, European Comission

32. Rozporządzenie (WE) nr 1223/2009 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 30

listopada 2009 r. dotyczące produktów kosmetycznych

33. Rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie

klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin, zmieniające i

uchylające dyrektywy 67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniające rozporządzenie

(WE) nr 1907/2006.

34. Rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego o Rady z dnia 18

grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych

ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) i utworzenia Europejskiej Agencji

Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie

Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również

dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG,

93/105/WE i 2000/21/WE

35. Russell, W.M.S. and Burch, R.L., The Principles of Humane Experimental Technique,

Methuen, London (1959).

36. Scholz S, Ortmann 2, Klüver N, Léonard M. 2014. Extensive review of fish embryo

acute toxicities for the prediction of GHS acute systemic toxicity categories. Regul

Toxicol Pharmacol. 69(3):572-9.

37. Smyth D. 1978. Alternatives to Animal Experiments, Scolar Press, London.

38. Spoo W. 2004. Toxicokinetics. W: Clinical Veterinary Toxicology, red: Plumlee KH

Mosby, 8-12.

39. Thompson W. 1947. Bact. Rev., 11: 115-141

40. Trevan JW. 1927. The Error of Determination of Toxicity. The Royal Society.

41. Vargesson N. 2015. Thalidomide-Induced Teratogenesis: History and Mechanisms.

Birth Defects Research (Part C) 105:140–156, 2015.

42. Weil CS. 1952. Biometrics, 8, 249-263

43. Zuang V., Schäffer M., Tuomainen A.M., Amcoff P., Bernasconi C., Bremer S.,

Casati S., Castello P., Coecke S., Corvi R., Griesinger C., Janusch Roi A., Kirmizidis

G., Prieto P., Worth A., Munn S., Berggren E., Whelan M., 2013, EURL ECVAM

progress report on the development, validation and regulatory acceptance of

alternative methods (2010-2013), Joint Research Centre of the European Commission