Nazewnictwo najczciej uywanych modeli zwierzt laboratoryjnych

16

Zwierzta Laboratoryjne Hodowane w Orodkach Naukowych w Polsce

Zebraa i opracowaa: Elbieta Krysiak

Wydanie niniejszej publikacji zostao dofinansowane przez Komitet Bada Naukowych.

Dzikujemy za pomoc techniczn w przygotowaniu i opublikowaniu materiaw instytucjom:Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skodowskiej Curie, WarszawaInstytut Centrum Medycyny Dowiadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa

Opracowanie obecne jest trzecim wykazem zwierzt laboratoryjnych hodowanych w Polsce opracowanym z inicjatywy Komisji Biologii Zwierzt Dowiadczalnych Polskiej Akademii Nauk na podstawie materiaw uzyskanych z ankiet rozesanych do znanych nam orodkw. Opracowanie to pomylane jest jako rdo informacji, gdzie i jakie zwierzta laboratoryjne s hodowane i dostpne do bada dowiadczalnych w kraju. Stwierdzone pewne luki i zaniedbania w stosowanym nazewnictwie, jak te niedobory w wiedzy o kontroli genetycznej i statusie zdrowotnym zwierzt, skoniy nas do wyposaenia obecnego wykazu w przedstawione w formie krtkich artykuw podstawowe informacje z tego zakresu.Opracowanie zawiera rwnie wykaz instytucji oraz standardowe skrty, uprzednio przyjte lub zaproponowane obecnie, dotyczce ich nazw lub nazwisk osb hodujcych zwierzta. Te standardowe skrty kody powinny by uywane zgodnie z zaleceniami Midzynarodowego Komitetu ds. Standaryzacji Genetycznego Nazewnictwa Zwierzt Laboratoryjnych do oznaczania podszczepw i do tworzenia symboli stad niekrewniaczych. Opracowanie podobnie jak poprzednie wykazy skada si z tabel, w ktrych wymienione s szczepy wsobne i kongeniczne, stada niekrewniacze myszy i szczurw, myszy transgeniczne oraz inne gatunki zwierzt laboratoryjnych hodowanych w Polsce. W tabelach podano rwnie informacje o pochodzeniu zwierzt, liczbie pokole, systemie kojarze, stosowanych metodach kontroli genetycznej i zdrowotnej.Mamy nadziej, e opracowanie to przyczyni si do dalszego uporzdkowania opisu zwierzt przeznaczonych do bada dowiadczalnych, tak aby dane te zbliyy si do wymaga wiatowych.

Przewodniczca Komisji Biologii Zwierzt Dowiadczalnych PANProf. Alina Czarnomska

Nazewnictwo najczciej uywanych modeli zwierzt laboratoryjnych.Alina Czarnomska, Jadwiga Bryliska

Obserwowana w Polsce dua dowolno w posugiwaniu si i brak zrozumienia sensu symboli nadawanych zwierztom laboratoryjnym skania do przypomnienia regu obowizujcych w tym zakresie.Prby ujednolicenia nazewnictwa, pocztkowo tylko szczepw wsobnych myszy, sigaj roku 1919. W Polsce opracowania majce zapozna badaczy z obowizujcymi reguami podjto ju w latach siedemdziesitych [2,4]. Dziki staraniom ICLAS opracowano i opublikowano podobne zalecenia dotyczce stad niekrewniaczych [6]. W latach pniejszych w miar tworzenia coraz to nowych modeli zwierzt opracowywano reguy tworzenia take dla nich nazw i symboli.W obecnym opracowaniu pragniemy przypomnie zasady tworzenia i odczytywania symboli i nazw najczciej w Polsce uywanych myszy i szczurw laboratoryjnych.

Nazewnictwo szczepw wsobnych myszy i szczurwZa szczep wsobny uwaamy grup zwierzt reprezentujcych jeden gatunek, charakteryzujcych si jednorodnoci genetyczn i homozygotycznoci. Pierwszy wykaz wsobnych szczepw myszy przygotowany zgodnie z ujednoliconymi zasadami mianownictwa opracowanymi przez Snella ukaza si w czasopimie Cancer Research w 1952 r. [3] Publikacja ta zawieraa reguy dotyczce nadawania nazw szczepom wsobnym oraz wykaz symboli kodowych bdcych skrtem nazwisk osb lub nazw instytucji utrzymujcych te szczepy. Dalsze podobne wykazy publikowane byy regularnie co cztery lata a do 1985 r. Zasady nazewnictwa wsobnych szczepw szczurw oparte na tych samych zaoeniach co zasady nazewnictwa wsobnych szczepw myszy opublikowane zostay przez Festinga i Staats w 1973 r [7]. Wedug tych zasad szczep wsobny powinien by oznaczony jedn lub kilkoma duymi literami alfabetu aciskiego Np. AKR, BALB/c, C3H, BN (myszy), AUG (August), LEW (Lewis), SHR (Spontaneous Hypertensive Rat), WAG (Wistar Albino Glaxo).

Mieszace uzyskiwane ze skrzyowania dwch szczepw wsobnych powinny wedug zasad mianownictwa opracowanych przez Staats w 1964 r. [14] zawiera w swoim symbolu informacj dotyczc ich pochodzenia. Na pierwszym miejscu umieszcza si zawsze symbol szczepu, z ktrego pochodzi samica a nastpnie rozdzielony znakiem x symbol szczepu samca uytego do kojarze. Oba zamyka si w nawiasie, po ktrym wpisuje si numer pokolenia. Np. (C57BL/6 x DBA/2)F1 Przy oznaczaniu mieszacw uywa si te czsto symboli skrconych.Np. (C57BL/6 x DBA/2)F1 = B6D2F1

Podszczepy stanowi grupy zwierzt wyodrbnione ze szczepu wsobnego mogce si od niego rni genetycznie w wyniku dziaania czynnikw przypadkowych lub zamierzonych. Podszczep oznaczamy wprowadzajc do symbolu szczepu rodzicielskiego (wyjciowego) odpowiedni symbol podszczepu, ktry zwykle stanowi skrt (kod) nazwiska badacza lub nazwy orodka, w ktrym podszczep zosta wyhodowany. Kod ten powinien by wyraony jedn lub kilkoma literami, z ktrych tylko pierwsza moe by liter du. Wyjtkowo dopuszcza si utrzymanie tradycyjnego oznaczenia jako symbolu podszczepu cyfry lub maej litery np. DBA/1 i DBA/2, BALB/c.Przykady oznaczania podszczepw:C3H/W, CBA/Kw, CFW/HanW pimiennictwie spotka mona czasem nazwy podszczepw ze zoonymi symbolami kodowymi, co pozwala na odtworzenie pochodzenia danego podszczepu.Np.: C3H/AW podszczep hodowany w Centrum Onkologii w Warszawie (W) sprowadzony z Instytutu Raka w Amsterdamie (A)CBA/KwHan podszczep hodowany w Hanowerze (Han) sprowadzony z Zakadu Genetyki Uniwersytetu Jagielloskiego w Krakowie (Kw)

Nazewnictwo szczepw kongenicznych i koizogenicznychDwie linie szczepu wsobnego rnice si jednym zmutowanym genem okrelane s jako pary koizogeniczne. Natomiast szczepy kongeniczne rni si krtkim odcinkiem jednego chromosomu a otrzymuje si je na drodze szeregu krzywek genetycznych poczonych z rwnoczesn selekcj. Jeli rnica midzy dwoma szczepami kongenicznymi dotyczy odcinka chromosomu zawierajcego locus zgodnoci tkankowej, szczepy te nazywamy kongenicznie opornymi CR (congenic resistant). Zwierzta z takich dwch szczepw odrzucaj wzajemnie swoje przeszczepy tkankowe. Zasady nazewnictwa stosowanego dla szczepw CR opracowa ich twrca Snell w 1958 r. [13] a opublikowa J.Klein w 1973 r. [9] razem z wykazem dostpnych w owym czasie szczepw CR. Szczep kongeniczny oznaczamy symbolem zoonym z dwch czci przedzielonych kropk lub kresk poziom. Cz pierwsz stanowi peny lub skrcony symbol szczepu ta genetycznego. Cz druga zawiera skrcony symbol szczepu lub stada dawcy, albo te symbol okrelajcy gen wprowadzony ze szczepu dawcy. W przypadku szczepw koizogenicznych w czci drugiej symbolu podaje si nazw locus, w ktrym nastpia mutacja.Przykady:B10.A- szczep ta C57BL/10 (B10), szczep dawca AC3H.B10- szczep ta C3H, szczep dawca C57BL/10 (B10)C57BL/10-H-2d- szczep rni si od szczepu ta haplotypem: H-2dC3H-p- szczep rni si od szczepu ta genem: pC57BL/6J-ob- szczep rni si od szczepu ta genem: ob

Nazewnictwo szczepw wsobnych rekombinacyjnych (RIS Recombinant Inbred Strains)Seri szczepw wsobnych rekombinacyjnych stanowi zbir szczepw wyhodowanych z losowo skojarzonych par zwierzt wybranych z drugiego pokolenia mieszacw z krzywki midzy dwoma znanymi szczepami wsobnymi nazywanymi tu szczepami przodkw (progenitor strains) charakteryzujcymi si odpowiednio brakiem lub ekspresj badanej cechy. Kady nowy szczep RIS jest homozygotyczny w stosunku do jednego z dwch alleli wniesionych przez przodkw we wszystkich loci, w ktrych przodkowie rnili si. W ten sposb w wyniku losowej rekombinacji niesprzonych loci kady szczep z danej serii RIS ma wasn szczegln kombinacj materiau genetycznego pochodzcego od obu szczepw rodzicielskich. Pierwsz seri szczepw wsobnych rekombinacyjnych wyhodowa Bailey w 1971 r. [1] z krzywki BALB/c x C57BL/6 i oznaczy j symbolem CXB skadajcym si ze skrtw nazw szczepw rodzicielskich rozdzielonych X. Ten system oznacze szczepw RIS przyj si i jest obecnie powszechnie stosowany. Szczepy RIS stanowi doskonae narzdzie do wykrywania nowych sprze i mapowania loci genetycznych warunkujcych cechy jednogenowe oraz do bada nad plejotropowym dziaaniem znanych genw (Swank i Bailey [15]). W ostatnich latach liczba serii szczepw RIS bardzo wzrosa.

Nazewnictwo szczepw kongenicznych rekombinacyjnych (RCS Recombinant Congenic Strains)Szczepy te zostay wyhodowane i opisane w 1986 r. przez Demanta i Harta [5]. Pomylane s jako narzdzie do badania uwarunkowanych genetycznie cech ilociowych kontrolowanych przez kilka wspdziaajcych (addytywnych) genw. Do takich cech zalicza si midzy innymi oporno i podatno na nowotwory. Schemat kojarze i charakterystyk tych zwierzt opisano m.in. w publikacji Demanta i Harta [5].Dla oznaczania zwierzt pochodzcych ze szczepw RCS Demant i Hart wprowadzili nastpujce symbole np.: seria linii pochodzcych z krzywki myszy BALB/c x STS oznaczona zostaa symbolem CcS skadajcym si ze skrtw nazw szczepw rodzicielskich (C=BALB/c, S=STS) rozdzielonych ma liter c. Dla okrelenia poszczeglnych linii w danej serii zastosowano kolejne liczby np. CcS-1, CcS-2, CcS-17.

Zwierzta transgeniczneWydaje si, e spord wielu modeli wyhodowanych do bada biomedycznych zwierzta transgeniczne speniaj wieloletnie denie, aby do badania rnych schorze nkajcych czowieka uzyska modele wykazujce taki sam mechanizm procesu chorobowego. Udane prby przenoszenia materiau genetycznego midzy rnymi komrkami zachciy do podjcia bada nad opracowaniem metody pozwalajcej na otrzymanie osobnika, ktry we wszystkich komrkach posiadaby obcy materia genetyczny. Metod tak, polegajc na mikrochirurgicznym wprowadzeniu odcinkw DNA zawierajcych jeden badany gen do przedjdrza mskiego zapodnionych jaj myszy, opracowali Palmiter i Brinster w 1982 r. i 1985 r. [11,12]. Ten udany eksperyment otworzy nowe moliwoci. Do chwili obecnej opracowujc i stosujc rne nowe metody wyhodowano ju wiele rnych linii myszy transgenicznych; pozwolio to na wyjanienie mechanizmw licznych procesw biologicznych, ktrych nie udawao si pozna dotychczas stosowanymi metodami.Pierwsz prb wprowadzenia standardowej nomenklatury dla myszy transgenicznych by system zaproponowany przez Institute of Laboratory Animal Resources, opublikowany w ILAR News w 1992 r. [8].Proponowany symbol skada si z nastpujcych czci:TgN(xxxxx)#Brigdzie:Tg wskazuje, e linia myszy jest transgenicznaN transgen zosta wprowadzony przez niehomologiczn wstawk (xxxxx) oznaczenie wstawki# - kolejny numer danej liniiBri kod laboratorium, w ktrym otrzymano dan lini myszyPrzykad: TgN(Mt1TK)1Bri Oznaczenie to informuje, e linia myszy jest transgeniczna (Tg), wstawka jest niehomologiczna (N), integrowany gen zawiera sekwencje regulatorowe mysiej metallothioneiny (Mt1) oraz gen strukturalny wirusowej kinazy tymidynowej (TK), myszy wyhodowano w laboratorium Brinstera (Bri) i jest to pierwsza linia transgeniczna w tym laboratorium oznaczona nazw standardow.

Nazewnictwo stad niekrewniaczychZasady ujednoliconego nazewnictwa stad niekrewniaczych (outbred stocks) zostay opublikowane po raz pierwszy w 1972 r. przez Festinga i wsp. [6] a pierwszy wykaz zarejestrowanych stad opracowa Loosli w 1974 r. [10]. Stado kadego gatunku ssakw laboratoryjnych hodowane co najmniej przez 4 pokolenia w zamknitej populacji z maksymalnym unikaniem kojarze krewniaczych moe zosta zarejestrowane i otrzyma swj symbol. Jest to jednak moliwe tylko wtedy, kiedy stosowany system kojarze gwarantuje utrzymywanie zmiennoci biologicznej stada przez szereg lat na takim samym poziomie. Za stado uzna mona:Uprzednio wsobny szczep po czterech pokoleniach hodowli systemem kojarze z unikaniem pokrewiestwa, jeli system ten by zamierzony i ma by kontynuowany

Mieszace F1 dwch rnych szczepw wsobnych

Syntetyczne, heterozygotyczne populacje pochodzce z mieszacw F1, wzgldnie segregujce mieszace F2, pod warunkiem, e bd stale odtwarzane z wyjciowych szczepw wsobnych

Odpowiednia wielko zamknitej populacji oraz stosowanie okrelonych systemw kojarze stad niekrewniaczych s niezbdnymi elementami charakterystyki stada. Niedopuszczalne jest prowadzenie jakiejkolwiek kierunkowej selekcji.Symbol stada powinien skada si z 2 4 duych liter poprzedzonych kodem hodowcy lub orodka, w ktrym stado jest utrzymywane. Kod skadajcy si z 1 3 liter, z ktrych tylko pierwsza jest dua, oddzielony jest dwukropkiem od symbolu stada.Przykady:Han:NMRISsc:AHNajwaniejszym znakiem rozpoznawczym dla odrnienia symbolu szczepu wsobnego od symbolu stada niekrewniaczego jest kod hodowcy umieszczony przed symbolem stada i oddzielony od niego dwukropkiem. Zasady oznaczania stanu zdrowotnego zwierzt laboratoryjnychZwierzta laboratoryjne nie tylko te, u ktrych wystpuj atwo wykrywalne objawy choroby ale rwnie bezobjawowi nosiciele zakae patogennych nie nadaj si do dowiadcze, szczeglnie do dowiadcze biomedycznych. Bezobjawowe zakaenia mikroorganizmami chorobotwrczymi mog znacznie skomplikowa interpretacj wynikw bada lub je wrcz zafaszowa. Majc na celu wyeliminowanie takich zagroe opracowano przy wspudziale organizacji midzynarodowych (WHO World Health Organization, FAO Food and Agriculture Organization, ILAR - Institute for Laboratory Animal Resources, ICLAS International Council for Laboratory Animal Science) nastpujc kategoryzacj zwierzt laboratoryjnych:1.Zwierzta gnotobiotyczne:

germ free (GF) - wolne od wszystkich wykrywalnych mikroorganizmw

i pasoytwmonobionty zwierzta GF celowo zasiedlone jednym,

dibionty dwoma lub wieloma okrelonymi rodzajami

polibionty mikroorganizmw

2.Zwierzta SPF (Specified Pathogen Free)

3.Zwierzta konwencjonalne

CV-I kontrolowane, utrzymywane w warunkach czciowej izolacji (semi barrier condition)

CV hodowla otwarta

Opracowano te wykazy mikroorganizmw, ktre powinny by wykluczone u zwierzt danej kategorii i gatunku.Odrbnym zagadnieniem w dziedzinie nazewnictwa zwierzt laboratoryjnych jest oznaczanie odpowiednimi symbolami ich stanu zdrowotnego. Wyrniajc si okrelonymi waciwociami rodowiskowymi a nie genetycznymi znajduj si waciwie poza zakresem dziaania Komitetu Standaryzacji Genetycznej Nomenklatury Myszy. Jednak wobec koniecznoci ustalenia dla nich zasad nazewnictwa grupa pracownikw z Jackson Laboratory przedstawia w 1967 r. pierwsz propozycj, ktra zasadniczo obowizuje i jest stosowana do dnia dzisiejszego.Uzgodnione z Towarzystwem Gnotobiotycznym zasady s nastpujce:Zalecono stosowanie symbolu GN dla zwierzt gnotobiotycznych, SPF dla zwierzt wolnych od wybranych specyficznych dla danego gatunku zakae, CV dla zwierzt konwencjonalnych.Symbolami SPF lub GN mona okrela tylko te zwierzta, ktre s pod sta kontrol mikrobiologiczn.Obok symbolu szczepu lub stada dodaje si w nawiasach kwadratowych nastpujce informacje:stan zdrowotny: CV, CV-I, SPF, GN

rok, w ktrym zwierzta przeszy do danej jednostki lub zostay przeprowadzone w stan gnotobiotyczny

kod osb, ktre uzyskay dany stan zdrowotny zwierzt lub orodka, w ktrym zostao to dokonane.

Przykad:BALB/c[SPF]WAG[SPF95W]CBA[GN72Lac] myszy szczepu CBA przeprowadzone w stan gnotobiotyczny w 1972 r. w Laboratory Animal Centre. Pimiennictwo:1.Bailey D.W.: Recombinant inbred strains. Transplantation, 1971, 11, 325-327

2.Bryliska J., Czarnomska A.: Zasady nazewnictwa zwierzt laboratoryjnych. Zwierzta Lab., 1979, 16 (1-2), 55-62

3.Committee on Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice. Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice. Cancer Res., 1952, 12, 602-613

4.Czarnomska A.: Mianownictwo wsobnych szczepw myszy laboratoryjnych. Zwierzta Lab., 1970, 8 (1-2), 83-88

5.Demant P., Hart A.A.M.: Recombinant Congenic strains A new tool for analyzing genetic traits determined by more than one gene. Immunogenetics, 1986, 24, 416-422

6.Festing M, Kondo K, Loosli R., Poiley S.M., Spiegel A.: International standardized nomenclature for outbred stocks of laboratory animals. ICLA Bulletin, 1972, 30, 16-17

7.Festing M., Staats J.: Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Rats. Transplantation,, 1973, 16, 221-245

8.ILAR News, 1992, 34, 4, 45

9.Klein J.: List of congenic lines of mice. Transplantation, 1973, 15, 137-153

10.Loosli R.: Outbred stocks of laboratory animals: First European Listing. ICLA Bulletin, 1974, 35, 17-22

11.Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., Traumbauer M.E., Rosenfeld M.G., Birnberg N.C., Evans R.M.: Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein- growth hormone fusion genes. Nature, 1982, 300, 611-615

12.Palmiter R.D., Brinster R.L.: Transgenic mice. Cell, 1985, 41, 343-345

13.Snell G.D.: Histocompatibility genes of the mouse: II. Production and analysis of isogenic resistant lines. J.N.C.I, 1958, 21, 843-877

14.Staats J.: Standardized nomenclature for inbred strains of mice Third listing. Cancer Res., 1964, 24, 147-168

15.Swank R.T., Bailey D.W.: Recombinant inbred lines: Value in the genetic analysis of biochemical variants. Science, 1973, 181, 1249-1252

Kontrola genetyczna zwierzt laboratoryjnychAlina Czarnomska, Marta Gajewska, Marek Woszczyski, Jadwiga Bryliska

Podstawowymi wymaganiami, ktrych spenienie jest niezbdne aby wyniki bada z uyciem zwierzt laboratoryjnych byy wiarygodne i powtarzalne s stae, optymalne dla gatunku warunki rodowiskowe, odpowiedni stan higieniczny zwierzt oraz ich jako i jednorodno genetyczna.Dotychczas wyhodowano wiele szczepw wsobnych, stad niekrewniaczych oraz rnych specjalnych modeli zwierzt charakteryzujcych si unikatowym zestawem cech uwarunkowanych genetycznie stanowicych o ich przydatnoci do okrelonego typu dowiadcze i testw. Wybr waciwych zwierzt jest jednym z podstawowych czynnikw warunkujcych uzyskanie wartociowych i powtarzalnych wynikw bada.Niezalene hodowle szczepw zwierzt w rnych orodkach naukowych doprowadziy do powstania szeregu podszczepw, ktre mimo stwierdzonych rnic genetycznych zachoway nazwy szczepw wyjciowych uzupenione symbolem podszczepu [9].Mimo cisego przestrzegania zasad hodowli zawsze naley liczy si z moliwoci powstania i utrwalenia si mutacji. Osobnym zagadnieniem jest sprawa kontaminacji genetycznej, ktrej najczstszymi przyczynami s: za organizacja pracy w zwierztarni, braki w wyszkoleniu personelu, ze nawyki hodowlane, niewaciwe prowadzenie dokumentacji oraz brak dozoru i kontroli.Wynikiem ewentualnych zmian genetycznych w najlepszym razie moe by zauwaalna przez hodowc zmiana cech fenotypowych takich jak np. kolor sierci. Jednak zmiana wikszoci genetycznie uwarunkowanych cech biologicznych czsto wykrywana jest dopiero w trakcie dowiadczenia, gdy wpywa na jego przebieg i w sposb istotny na jako otrzymanych wynikw.W celu wczesnego wykrywania ewentualnych zmian genetycznych w populacji hodowanych zwierzt w wielu orodkach, rwnie krajowych, w latach osiemdziesitych zaczto wprowadza programy monitorowania genetycznego zwierzt dostosowane do potrzeb, zada i moliwoci orodka [3,4,13,14,15].W praktyce genetyczne monitorowanie polega na kontroli utrzymania autentycznoci hodowanych szczepw.W zalenoci od stosowanych metod oznaczania oraz funkcji oznaczonych markerw podzielono je na kilka podstawowych grup: markery immunologiczne, biochemiczne, cytogenetyczne, morfologiczne oraz stosowane ostatnio coraz czciej markery DNA (mikrosatelitarne).

Monitorowanie genetyczne na podstawie wybranych markerw cech jakociowych.Markery immunologiczne W monitorowaniu genetycznym zwierzt laboratoryjnych najczciej stosowane s antygeny zgodnoci tkankowej, kodowane przez geny gwnego kompleksu zgodnoci tkankowej MHC oraz antygeny rnicowania limfocytw np.: Thy1.Wykorzystanie genw gwnego kompleksu zgodnoci tkankowej do kontroli jakoci i jednorodnoci szczepw znalazo szerokie zastosowanie z uwagi na: wysoki stopie polimorfizmu

rola, jak odgrywaj w badaniach immunologicznych

konieczno monitorowania szczepw szczeglnie cennych z racji genotypu MHC (szczepy kongenicznie oporne)

skuteczno i atwo wykrywania kontaminacji.

Do oznaczania genw MHC stosuje si metody transplantacyje, metody serologiczne i metody komrkowe. W metodzie transplantacyjnej najczciej wykorzystywane s przeszczepy skry. Test ten pozwala na identyfikacj rnic genetycznych w obrbie kompleksu genw zgodnoci tkankowej oraz na kontrol jednorodnoci genetycznej szczepu. Problemy dotyczce metodyki i interpretacji wynikw zostay opisane ju w 1951 r. przez Billinghama i Medawara [1]. Metoda jest czua i skuteczna, ujemn jej stron jest konieczno ponad 100 dniowej obserwacji badanych zwierzt. W okoo 10 15% przypadkw odrzucenie przeszczepu spowodowane jest przyczynami technicznymi lub zakaeniem bakteryjnym. Niekorzystn stron metody transplantacyjnej jest jednak przede wszystkim to, e musi by wykonana in vivo, a zatem powinna by stosowana jedynie w wyjtkowych przypadkach.Test hemaglutynacji i reakcja cytotoksyczna zalena od komplementu s podstawowymi metodami serologicznymi, w ktrych zastosowanie odpowiednich przeciwcia pozwala na identyfikacj antygenw zgodnoci tkankowej charakteryzujcych poszczeglne haplotypy MHC [5]. Test cytotoksyczny moe suy zarwno do identyfikacji antygenw MHC jak i do okrelania antygenw rnicowania limfocytw: Ly, Lyb, TL, Thy1.Spord licznych wariantw tego testu najczciej stosuje si zaproponowany przez Pincusa i Gordona [11] test mikrocytotoksyczny na pytkach Terasaki przy uyciu limfocytw z wzw chonnych jako komrek docelowych i wieej surowicy krlika jako rda komplementu.

Markery biochemiczneMarkerem biochemicznym jest uwarunkowana genetycznie cecha fenotypowa, ktr mona okreli za pomoc technik biochemicznych. W praktyce markerami biochemicznymi s izoenzymy i biaka nieenzymatyczne kodowane przez polimorficzne, strukturalne geny. Mnogo oznaczanych markerw biochemicznych i wystpowanie kodujcych je genw na rnych chromosomach przesdzaj o ich istotnym znaczeniu dla potrzeb kontroli genetycznej. Kady szczep wsobny ma ustalony genetyczny profil markerw biochemicznych, ktry pozwala odrni go od innych szczepw i podszczepw. Szczegowy opis metod stosowanych do oznaczania markerw biochemicznych zawarty zosta w podrczniku Zwierzta Laboratoryjne Metody Hodowli i Dowiadcze [16]. Wrd najczciej stosowanych markerw biochemicznych wymieni mona: dehydrogenaz jabczanow Mod1(mysz), b acuch hemoglobiny Hbb (mysz), biako pcherzykw nasiennych Sup1 (szczur), esteraz 1 Es-1 (szczur).

Markery cytogenetyczneRozwj cytogenetyki umoliwi wprowadzenie monitorowania genetycznego zwierzt na podstawie analizy ich kariotypu. Zaobserwowano, e zabarwione w odpowiedni sposb chromosomy wykazuj specyficzny dla siebie i charakterystyczny dla gatunku ukad poprzecznych prkw wzdu ramion chromosomw umoliwiajcy identyfikacj par chromosomw i uoenie kariotypu komrki.Analizujc kariotypy zwierzt ze szczepw wsobnych wykazano szereg morfologicznych cech chromosomw dotyczcych m.inn. ksztatu, intensywnoci zabarwienia i wielkoci prkw C widocznych po zabarwieniu heterochromatyny okolicy centromeru. Stwierdzono wyrane rnice w morfologii prkw C pomidzy poszczeglnymi parami chromosomw kariotypu danego gatunku. Cech charakterystyczn dla wszystkich myszy jest brak prka C w chromosomie Y. U myszy istniej rwnie rnice rozkadu heterochromatyny centromerycznej charakterystyczne dla poszczeglnych szczepw. Obserwacje te pozwalaj na rozrnianie myszy z niektrych szczepw wsobnych za pomc badania prkw C.Rwnie markery chromosomowe powstae w wyniku translokacji mog suy do identyfikacji szczepu. Ich brak lub heterozygotyczno mog wiadczy o kontaminacji np. myszy szczepu AKR Rb(6;15) posiadajce marker powstay w wyniku fuzji centromerycznej chromosomw 6 i 15 atwo odrni badaniem cytogenetycznym od myszy ze szczepu AKR wyjciowego bez tego markera.Jednake wykorzystanie markerw cytogenetycznych do monitorowania genetycznego zwierzt z racji czasochonnoci, trudnoci technicznych i wysokich wymaga dotyczcych kwalifikacji personelu moliwe jest tylko w specjalistycznych laboratoriach do typowania szczeglnych przypadkw.

Markery morfologiczne geny umaszczenia.Do tej grupy markerw naley wiele cech uwarunkowanych ekspresj jednego genu dotyczcych umaszczenia, charakteru okrywy wosowej, nieprawidowoci w budowie szkieletu, ktre w wikszoci przypadkw mog by rozpoznawane i testowane bez uycia specjalistycznego wyposaenia. Najczciej w praktyce stosuje si kontrol genw umaszczenia. Kontrol tak u myszy albinotycznych przeprowadza si stosujc krzywki ze zwierztami ze szczepw barwnych o znanym recesywnym genotypie. W przypadku myszy najczciej uywany jest szczep DBA/2 o genotypie aabbCCdd (a nie agouti, b obecnie Tyrp1b brzowy, C obecnie Tyr nie albinotyczny, d obecnie Myo5ad rozcieczony). Na podstawie oceny umaszczenia mieszacw F1 wnioskuje si o genotypie zwierzcia z badanego szczepu. Ponadto na podstawie umaszczenia myszy w pokoleniu F1 mona wnioskowa o czystoci genetycznej szczepw uytych do krzyowania. Wszystkie zwierzta pierwszego pokolenia mieszacw powinny by jednakowo umaszczone. Wystpienie segregacji wiadczy o kontaminacji szczepu.

Markery mikrosatelitarne w kontroli genetycznej zwierzt szczepowych.Postepowanie, podobnie jak w przypadku innych markerw, polega przede wszystkim na stworzeniu profili genetycznych dla poszczeglnych, podlegajcych kontroli szczepw wsobnych. Markery mikrosatelitarne precyzyjnie zmapowane i rwnomiernie rozproszone w genomie s stosunkowo proste do analizowania.W badaniach stosuje si najczciej technik nieizotopowego PCR i ocen dugoci amplifikowanych alleli na elu agarozowym o wysokiej rozdzielczoci. Przy wyborze markerw naley bra pod uwag nastpujce kryteria:pooenie na rnych chromosomach

odpowiedni poziom polimorfizmu

obecno unikalnych alleli charakteryzujcych poszczeglne szczepy

atwo rozdziau otrzymywanych fragmentw na elu agarozowym o wysokiej rozdzielczoci

prawidowo przebiegajc reakcj PCR

Przy zastosowaniu metody analizy markerw mikrosatelitarnych mona przy niewielkim nakadzie kosztw i w raczej krtkim czasie przeprowadza okresow kontrol genetyczn hodowanych zwierzt przez porwnywanie uzyskiwanych wynikw z uprzednio opracowanymi profilami.Metoda ta, w Polsce nowa, stosowana jest ju w wielu orodkach wiatowych zarwno w celu kontroli genetycznej zwierzt, jak te do badania ich genomu i do dowiadcze z wykorzystaniem analizy sprze [7].Monitorowanie genetyczne na podstawie analizy cech ilociowych.W monitorowaniu genetycznym prowadzonym na podstawie analizy cech ilociowych najczciej wykorzystuje si wskaniki reprodukcyjne i morfometryczne. Prawidowo prowadzona dokumentacja hodowlana zawiera zwykle informacje dotyczce: czasu od skojarzenia do wydania pierwszego miotu

odstpw czasowych midzy kolejnymi miotami

liczby urodzonych modych

liczby odchowanych modych

Powysze dane mog suy do wyliczania wskanikw reprodukcyjnych np. indeks hodowlany (C), rednia liczebno miotu w danej populacji w rnych okresach od urodzenia [2,8]. Szczepy wsobne charakteryzuj si zwykle nisk wydajnoci hodowlan w przeciwiestwie do stad niekrewniaczych i mieszacw F1. Istotny nieoczekiwany wzrost wartoci wspczynnikw reprodukcyjnych moe by sygnaem alarmowym sugerujcym przeprowadzenie szczegowej kontroli genetycznej, gdy moe wiadczy o kontaminacji szczepu. Spord wielu grup wskanikw morfometrycznych w rutynowym monitorowaniu szczepw wsobnych najczciej stosuje si okrelanie wskanikw osteometrycznych: pomiary uchwy [6], czaszki [10], koci udowej. Do niedawna powszechnie rekomendowany by test mandibularny zaproponowany przez Festinga i Lovella [6].Wszystkie badania genetyczne prowadzone na podstawie analizy cech ilociowych musz by zawsze uzupeniane i potwierdzone innymi metodami. Dlatego te obecnie wraz z rozwojem biologii molekularnej umoliwiajcej monitorowanie genetyczne zwierzt na poziomie DNA stosowanie cech ilociowych jest coraz bardziej ograniczane.

Kontrola genetyczna stad niekrewniaczych.Najtrudniejszym zadaniem w hodowli stad niekrewniaczych jest utrzymanie zmiennoci genetycznej zwierzt na moliwie staym poziomie przez wiele pokole. Systemy kojarze i liczebno stad musz by tak dobrane aby wspczynnik wsobnoci (inbredu) by niszy ni 1% na pokolenie. W populacjach mniejszych ni 100 par niezbdne jest stosowanie wybranych metod kojarze rotacyjnych lub tak zwanej metody maksymalnego unikania kojarze krewniaczych. W celu zachowania staego spektrum genetycznego populacji niekrewniaczych w 1981 r. Rapp i wsp. [12] z Centralnego Instytutu Hodowli Zwierzt w Hanowerze wprowadzili metod tak zwanej liniowej optymalizacji w doborze zwierzt do kojarze. Przy zastosowaniu tej metody niezbdna jest jednak charakterystyka wielu wybranych cech ilociowych i jakociowych hodowanych zwierzt, ustalenie normy populacji i charakterystycznej frekwencji klas wartoci. Metoda liniowej optymalizacji jest bardzo pracochonna i kosztowna. W hodowlach, gdzie nie jest moliwe wprowadzenie metody liniowej optymalizacji, mona uzyska ograniczenie i utrzymanie na moliwie jednakowym poziomie zmiennoci stada prowadzc znan z genetyki populacyjnej selekcj stabilizujc. Przy jej zastosowaniu do dalszej hodowli wybieramy tylko te osobniki, u ktrych wartoci badanych cech maj najnisze odchylenie od normy populacji.Jak ju na wstpie powiedziano w hodowli stad niekrewniaczych niezbdne jest ustalenie normy populacji oraz stosowanie jednego ze znanych systemw kojarze rotacyjnych lub metody hodowli z tak zwanym maksymalnym unikaniem inbredu (kojarze krewniaczych).

Pimiennictwo:1.Billingham R.E., Madawar P.B.: The technique of free skin grafting in mammals. J.Exper.Biol., 1951, 28, 385-402

2.Bryliska J.: Zastosowanie wskanikw reprodukcyjnych i morfometrycznych do kontroli zmiennoci genetycznej myszy i szczurw ze stad niekrewniaczych. Zwierzta Lab., 1985, 22(1-2), 3-7

3.Czarnomska A., Kunierczyk P., Strzdaa L., Sitarz M., Woszczyski M., Krysiak E., Zborowska E., Leszczyska Czech J., Zioo E., Pajtasz E., Rak J., Kwaniewska E., Mraz Dulemba M., Radzikowski Cz.: Genetic monitoring of inbred strains and congenic lines of mice maintained at six scientific centres in Poland. Zwierzta Lab., 1987, 24(1-2), 29-38

4.Czarnomska A., Sitarz M., Zborowska E.: Kontrola genetyczna myszy laboratoryjnych. II.Analiza wybranych markerw morfologicznych i immunologicznych u myszy z 23 szczepw wsobnych. Zwierzta Lab., 1983, 20(1-2), 55-66

5.Demant P.: Histocompatibility genes and their use in genetic control of laboratory mice. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart New York: Gustav Fischer Verlag, 299-306

6.Festing M.F.W., Lovell D.P.: Routine genetic monitoring of commercial and other mouse colonies in UK using mandible shape; five years of experience. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart New York: Gustav Fischer Verlag, 341-348

7.Gajewska M., ukasiewicz D., Rutkowski R., Wirth Dzicioowska E: Markery mikrosatelitarne w rutynowym monitorowaniu genetycznym myszy szczepw wsobnych. Doniesienie zjazdowe Zwierzta laboratoryjne w nowym tysicleciu, 2002, streszczenia str. 18

8.Hedrich J.H.: Principles in genetic monitoring. In H.J.Hedrich (ed.), Genetic monitoring of inbred strains of rats. Stuttgart - New York: Gustav Fischer Verlag,, 1990, 8-10

9.Hsu C-K.: Genetic monitoring. In J.G.Fox, B.J.Cohen, F.M.Loew (eds.), Laboratory animal medicine. New York: Academic Press Inc., 1984, 603-612

10.Pietrowicz D., Lindner P., Wojda K.: Analysis of the usefulness of certain craniometric features in genetic identification of laboratory rats. Z.Versuchstierkd., 1982, 24, 257-261

11.Pincus J.H., Gordon R.C.: A microassay for the detection of murine H-2 antigens. Transplantation, 1972, 12, 509-513

12.Rapp K.G., Burow K., Kluge R.: Monitoring of outbred populations. Zwierzta Lab., 1981, 18, 2, 25-33

13.Sitarz M., Woszczyski M., Czarnomska A.: Charakterystyka wsobnych szczepw myszy pod wzgldem markerw biochemicznych Mod-1, Gpd-1, Idh-1, Pgm-1, Gpi-1s. Zwierzta Lab., 1990, 27, 1, 45-52

14.Woszczyski M, Krysiak E., Czarnomska A.: Opracowanie i wdroenie programu rutynowego monitorowania genetycznego szczepw wsobnych myszy na podstawie wybranych grup markerw rnicujcych. Zwierzta Lab., 1990, 27, 2, 9-16

15.Woszczyski M., Sitarz M., Czarnomska A.: Wstpne wyniki kontroli genetycznej szczurw AUG/W, L-E/W, M520/W, SPRD/W, WAG/W, BN/W. Zwierzta Lab., 1990, 27, 2, 17-26

16.Zwierzta Laboratoryjne Metody Hodowli i Dowiadcze. J.Bryliska, J.Kwiatkowska (red.) Rozdzia 6: Kontrola genetyczna. Universitas, 1996, 81-103

Monitorowanie zdrowia zwierzt laboratoryjnychMarek Woszczyski, Elbieta Krysiak

Jednym z warunkw zmniejszenia liczby zwierzt potrzebnych do waciwego wykonania dowiadczenia jest uywanie zwierzt o znanym standardzie zdrowotnym. Ma to istotny wpyw na jako i powtarzalno otrzymywanych wynikw. Dlatego te ju w latach pidziesitych pod patronatem organizacji midzynarodowych (WHO, FAO, ILAR, ICLAS) wprowadzono podzia zwierzt na rne kategorie zdrowotne i opracowano wykazy mikroorganizmw, ktre powinny by wyeliminowane u zwierzt danej kategorii i gatunku. Rwnie w Polsce podjto prby standaryzacji zdrowotnej zwierzt uywanych do dowiadcze. Jedn z nich byo wydane w 1977 r. przez Krajow Spdzielni Hodowli Drobnego Inwentarza zobowizanie prywatnych hodowcw do okresowego badania hodowanych zwierzt w kierunku wykrycia bakterii z grup Salmonella, Shigella, Pasteurella pneumotropica, Mycobacterium tuberculosis oraz grzybw i wierzbowcw. Z inicjatywy Sekcji ds. Zwierzt Laboratoryjnych SITR - NOT we wsppracy z Instytutem Zootechniki w Balicach wydano Karty Informacyjne do Zaoe Technologicznych Produkcji Zwierzcej: Zwierzta Laboratoryjne". Oprcz zalece dotyczcych niezbdnego sprztu, wyposaenia technicznego i obsugi zwierztarni znajduje si tam rozdzia mwicy o kategoriach zdrowotnych zwierzt i ustalona na podstawie midzynarodowych przepisw lista mikroorganizmw, ktre powinny by wyeliminowane w ich hodowli. Obecnie podzia ten zosta nieco zmodyfikowany (patrz rozdzia" Nazewnictwo..."); uwzgldniono np. nie trzy, ale dwie kategorie zwierzt konwencjonalnych:Zwierzta konwencjonalne, kontrolowane pod wzgldem zdrowotnym, utrzymywane w warunkach czciowej bariery sanitarnej

Zwierzta konwencjonalne hodowane w warunkach otwartych.

Podzia na kategorie zdrowotne bywa rny w rnych krajach i zaley np. od specyfiki regionu i dostpnych metod diagnostycznych. Rwnie wykazy mikroorganizmw, ktre powinny by wykluczone w hodowli danej kategorii zwierzt ulegaj zmianom w zalenoci od rozwoju nowych technik diagnostycznych i poznawania nowych, uprzednio nieznanych, gatunkw bakterii czy wirusw. Ze wzgldu na wyhodowanie rnych szczepw myszy z niedoborami immunologicznymi zakres kontroli rozszerza si o gatunki mikroorganizmw nie znajdujcych si w wykazach opracowanych dla zwierzt immunokompetentnych.Aktualne zalecenia dotyczce zakresu kontroli mikrobiologicznej zwierzt laboratoryjnych s publikowane regularnie przez organizacje takie jak ICLAS (International Council for Laboratory Animal Science) czy SOLAS (Society for Laboratory Animal Science).

Wikszo zakae obecnych u zwierzt laboratoryjnych hodowanych w odpowiednich dla danego gatunku warunkach rodowiska przebiega bez wyranych objaww klinicznych, jednak ma znaczcy wpyw na przebieg i wyniki dowiadcze a w konsekwencji prowadzi do koniecznoci powtarzania bada. Powoduje to czasem znaczne zwikszenie liczby uytych zwierzt. Na przykad zakaenie wirusem MHV (wirus zapalenia wtroby) moe wywoywa m.in. zahamowanie wydzielania immunoglobulin, zwikszenie aktywnoci fagocytw, zwikszenie wraliwoci na inne mysie patogeny (Eperythrozoon coccoides, K wirus, Schistosoma mansoni), zmian aktywnoci enzymw wtrobowych, zwolnienie procesu regeneracji wtroby po czciowej hepatektomii, moe te powodowa anemi, leukopeni i trombocytopeni. Subkliniczna infekcja MHV moe przeksztaci si w cik posta choroby poczon z wysok miertelnoci po zabiegu tymektomii, podaniu kortyzonu, cyklofosfamidu, chemioterapeutykw, nawietlaniu radioaktywnym i po zastosowaniu halotanowej narkozy. Zakaenie Mycoplasma pulmonis moe te wywoa kliniczn posta choroby poczon ze znaczn miertelnoci szczeglnie w dugotrwaych eksperymentach, Powoduje to zafaszowanie wynikw wielu bada dotyczcych ukadu oddechowego. Mycoplasma pulmonis moe wywoa zwikszenie aktywnoci komrek NK oraz zmniejszenie humoralnej odpowiedzi na SRBC u szczurw. Zarwno Mycoplasma pulmonis jak i wirus zapalenia wtroby mog by czynnikiem kontaminujacym guzy przeszczepialne i hodowle tkankowe. Infekcje ukadu pciowego mog by przyczyn zmniejszenia parametrw reprodukcyjnych hodowanych zwierzt.

Przy opracowywaniu programu kontroli zdrowia (jej czstoci i spektrum kontrolowanych mikroorganizmw) naley bra pod uwag nastpujce czynniki:Kategori zdrowotn i warunki hodowli zwierzt

Rodzaj dowiadcze, do ktrych bd suyy zwierzta

Stopie zagroenia przeniesienia infekcji z innych populacji gryzoni

Przewidywana rola danych patogenw w okrelonym dowiadczeniu

Wzgldy ekonomiczne

Zaplecze techniczne - moliwoci zastosowania okrelonych technik diagnostycznych

Monitorowanie zdrowia powinno obejmowa kontrol mykologiczna, parazytologiczn, bakteriologiczn i wirusologiczn oraz badanie anatomopatologiczne.

W kontroli wirusologicznej obecnie stosuje si najczciej metody serologiczne takie jak test ELISA, test immunofluorescencji (IFA) i test zahamowania hemaglutynacji (HI) oraz metody biochemiczne i molekularne przy identyfikacji wirusa LDV (Lactic Dehydrogenase Elevating Virus).

W kontroli bakteriologicznej najczciej stosuje si posiewy z wybranych narzdw na podoa namnaajce a nastpnie identyfikacj drobnoustrojw przy pomocy odpowiednich zestaww np. API SYSTEM. W niektrych przypadkach stosuje si rwnie metod PCR (np. do identyfikacji Helicobacter sp., Mycoplasma sp.), test ELISA (Mycoplasma sp., Clostridium piliformis) oraz w pewnych przypadkach np. przy wystpieniu charakterystycznych zmian w wtrobie w chorobie Tyzzera, wywoywanej przez Clostridium piliformis, badanie histopatologiczne.

W kontroli parazytologicznej najczciej stosuje si metody mikroskopowe a w niektrych przypadkach test ELISA i PCR.

Zwierzta sprzedawane przez orodki hodowlane powinny mie zawsze certyfikat zdrowia uwzgldniajcy zakres i czsto prowadzonej kontroli. Na przykad certyfikat z Jackson Laboratory zawiera:Wykaz badanych mikroorganizmw z podziaem na wirusy, bakterie i mykoplazmy, pasoyty zewntrzne i wewntrzne

Rodzaj prby np. surowica, posiew z jelita, posiew z nosogardzieli

Metod np. ELISA, PCR, posiew na odpowiednie podoe

Czstotliwo bada wykonywanych w kierunku identyfikacji konkretnych mikroorganizmw

Wyniki ostatnich 4 bada (okres jednego roku) liczba wynikw pozytywnych w stosunku do liczby zbadanych zwierzt

Numer (symbol) kontrolowanego pomieszczenia lub zespou pomieszcze

Zalecane pimiennictwo:1.Infectious diseases of mice and rats. National Academy Press, Washington, D.C., 1991

2.Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals, 2002, 36, 20-42

3.List of pathogens for specification in SPF laboratory animals. SOLASA, 1988

4.Veterinary public health reports. Guidelines for breeding and care of laboratory animals. ISS/WHO/FAO-CC/IZSTe/94.23, 1994

5.Karty Informacyjne do Zaoe Technologicznych Produkcji Zwierzcej: Zwierzta Laboratoryjne. Instytut Zootechniki, Krakw, 1983