dr Janusz Piechota dr Magdalena Wołoszyńska

Plan wykładów:• Definicja słowa „marker”• Markery związane z kwasami nukleinowymi

rodzaje wykrywanie zastosowanie w diagnostyce medycznej, medycynie sądowej,

archeologii, analizie behawioralnej, systematyce organizmów żywych• Wybrane przykłady markerów białkowych – przykłady wykorzystania w

diagnostyce medycznej, podstawowe metody wykrywania markerów białkowych.

MARKERY MOLEKULARNE

Definicje markerów

„Marker” – ang. znacznik, wskaźnik

Marker molekularny – cząsteczka DNA, RNA lub inna cząsteczka biochemiczna, której występowanie lub postać (np. sekwencja) odróżnia dwa stany. Dwoma rozróżnianymi stanami mogą być np. dwie różne osoby, lub dwa stany fizjologiczne (stan zdrowia i choroby), obecność patogenu itp.

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Definicje markerów

Marker biochemiczny – substancja wielkocząsteczkowa umożliwiająca odróżnienie organizmu lub komórki prawidłowej od zmienionej chorobowo (np. nowotworowej)– białko, aktywność enzymatyczna, cząsteczka będąca wynikiem aktywności (lub braku aktywności) enzymu.

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych

LDH (dehydrogenaza mleczanowa) • Katalizuje ostatni etap szlaku glikolitycznego – przekształcenie pirogronianu

w mleczan• U człowieka występuje 5 izomerów (LDH1-LDH5), różniących się

specyficznością tkankową. W surowicy występują wszystkie, ale największą aktywność posiadają izoformy LDH1 i LDH2 występujące głównie w sercu.

• Poziom LDH we krwi silnie wzrasta we wczesnym okresie zawału mięśnia sercowego.

• Poziom LDH we krwi jest podwyższony w różnych chorobach wątroby

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych

enzymy wątrobowe: aminotransferazy ALAT i AspAT i alkaliczna fosfataza• ALAT (aminotransferaza alaninowa) – przekształca pirogronian w alaninę

(izoforma cytozolowa) lub na odwrót (izoforma mitochondrialna)• AspAT (aminotransferaza asparaginowa) – przekształca szczawiooctan w

asparaginian (izoforma cytozolowa) lub na odwrót (izoforma mitochondrialna) • alkaliczna fosfataza – katalizuje defosforylację estrów fosforanowych.

Optimum działania w środowisku zasadowym.• Podwyższona aktywność we krwi: nieprawidłowa funkcja wątroby, wysoka

aktywność: uszkodzenie wątroby, marskość wątroby.

• Badania aktywności enzymów wątrobowich połączonych oznaczaniem poziomu bilirubiny nazywa się próbami wątrobowymi.

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych

Bilirubina – powstaje na drodze rozpadu hemu uwolnionego z hemoglobiny. Cały proces zachodzi w śledzionie, wątrobie i szpiku kostnympodczas niszczenia czerwonych krwinek.

Podwyższony poziom wraz z enzymami wątrobowymi – zaburzenie funkcji wątroby

Podwyższony izolowany poziom – zespół Gilberta (choroba metaboliczna spowodowana mutacją w genie UGT1A1 kodującym UDP-glukuronylotranferazę, prowadzącą do zaburzeń metabolizmu bilirubiny w wątrobie.

Wysoki poziom – hiperbilirulemia (żółtaczka) – wskazuje na uszkodzenie wątroby spowodowane np. wirusowym zapaleniem wątroby (HAV, HBV, HCV).

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Cechy dobrego markera molekularnego

• Łatwy do wykrycia za pomocą specyficznej metody

• Niskie koszty wykrycia/określenia poziomu

• Możliwie specyficzny dla danego stanu chorobowego

• Diagnoza w próbce, którą łatwo pobrać od człowieka (osoby zdrowej, pacjenta itp.). Idealnie, jeżeli obecny jest w moczu, ślinie, krwi, włosach, skórze.

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Marker genetyczny – charakterystyczna właściwość organizmu, wykorzystywania do określenia jego genotypu. Zwykle jest to gen występujący przynajmniej w dwóch łatwo rozróżnialnych allelach. Markery genetyczne można wykorzystać do rozróżnienia osobników, gatunków, szczepów mikroorganizmów, jak również do określenia położenia innych genów w genomie (tzw. mapy genowe).

Markery morfologiczne – cechy zewnętrzne organizmu, będące wynikiem ekspresji genów. Są łatwe do zaobserwowania, ale posiadają wiele wad (ograniczona liczba, mała ilość alleli, epistaza, wpływ środowiska).

Markery DNA – sekwencje DNA występujące w dwóch lub większej liczbie łatwych do rozróżnienia wersji (allelach). Stosunkowo łatwe do analizy (wiele technik detekcji). Dla wielu schorzeń i cech nie przypisano genów, które leżą u ich podstawy.

Markery biochemiczne/molekularne – są bezpośrednio oparte na właściwościach kwasów nukleinowych. Np. białka o zmienionej sekwencji, enzymy o zmienionej aktywności, zmieniony poziom związków drobnocząsteczkowych, będących wynikiem działania enzymów itp.

MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE

Geny jako markery molekularneGeny odpowiadające fenotypom rozróżnialnym wzrokowoRóżne fenotypy = różne alleleMuszka owocowa – barwa ciała, kolor oczugeny koloru oczu – czerwony, jasnoczerwony, cynober, kolor granatu, cielisty, sepia, szkarłat, różowy, purpura, bordo

Markery biochemiczne – allele wielokrotne w wielu istotnych genachGrupy krwiBiałka immunologiczne – antygeny leukocytów człowieka (HLA – ang. Human leukocyte antigens)HLA-DRB1 – 59 alleliHLA-B – 60 alleli

Geny jako markery molekularneCzasami markerem genetycznym może być stwierdzenie

obecności danego genu lub cechy, którą on warunkuje.

Przykłady:

Markerem transformacji bakterii są geny nadające opornoć na antybiotyki – oporność na antybiotyk oznacza posiadanie określonego genu wprowadzanego do komórki bakteryjnej podczas transformacji.

Wykrywanie patogenów (wirusów, bakterii grzybów) warunkujących określone choroby może być wykonywane poprzez wykrywanie genów (sekwencji DNA) charakterystycznych dla danego patogenu. Wykazanie obecności danego genu wskazuje na obecność określonego. Zatem geny takie są markerami określonej choroby (np. SeptiTest).

Markery DNA/RNA

Sekwencja DNA/RNA występująca w dwóch lub większej liczbie łatwych do odróżnienia wersji.

Obecność sekwencji DNA/RNA lub jej brak wskazującyna określony stan fizjologiczny (np. zakażenie określonympatogenem.

Obecność sekwencji w różnych wariantach jest wynikiem istnienia mutacji i polimorfizmów.

Polimorfizm długości prostych sekwencji (ang. SSLP – simple sequence length polymorphism)

- minisatelity – zmienna liczba powtórzeń tandemowych (ang. VNTR –variable number of tandem repeats),jednostka powtarzana to kilkanaście lub kilkadziesiąt nukleotydów

- mikrosatelity – proste powtórzenia tandemowe (ang. STR – simple tandem repeats lub SSR – simple sequence repeats)jednostka powtarzana to 1 – 6 nukleotydów

Polimorfizmy punktowe (ang. SNP – single nucleotide polymorphism), pojedyncze mutacje punktowe

Polimorfizmy (mutacje) DNA

• Sekwencje powtórzone – 40% ludzkiego genomu

rozproszone tandemowe

krótkie (SINES) długie (LINES) minisatelity mikrosatelity130 – 300 nt kilka tys. nt 10 – 100 nt 1 – 6 nt

10% genomu 20% genomu

Alu – 1 mln kopii kilka tys. loci co 6 – 10 kpz

tworzenie par chromosomów są w centromerach:

w centromerach homologicznych, rekombinacja sekwencja (GGAAT)n

struktura chromosomów –

są w centromerach: sekwencja α,

trwałość transkryptów,

regulacja ekspresji

RFLP (restriction fragment length polymorphism) – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych.

PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych namnożonych w reakcji PCR.

AFLP (Amplified fragment length polymorphism) – polimorfizm długości powielonych fragmentów DNA

cDNA-AFLP – podobnie, jak AFLP, tylko materiałem do trawienia enzymem restrykcyjnym jest cDNA.

Inne typy polimorfizmów DNA

RFLP (restriction fragment length polymorphism) – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych.

Wykrywa polimorfizmy typu SNP i VNTR

SNP VNTP

PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych namnożonych w reakcji PCR.

Bardzo wygodny w użyciu. Najczęściej jest to polimorfizm typu SNP.

AFLP (Amplified fragment length polymorphism) – polimorfizm długości powielonych fragmentów DNA

Wykrywa polimorfizmy typu SNP i VNTR.

Szczególnie przydatny do wykrywania nowych polimorfizmów

cDNA-AFLP – podobnie, jak AFLP, tylko materiałem do trawienia enzymem restrykcyjnym jest cDNA.

Wykrywa polimorfizmy typu SNP.

Szczególnie przydatny do wykrywania polimorfizmów w sekwencjach ulegających ekspresji.

Polimorfizmy typu RFLP i AFLP to nie jest specjalna klasa polimorfizmów DNA. Są raczej wynikiem stosowania określonych technik do ich wykrywania!!!

• Można je zapisać w postać motywu nukleotydów typu (TCAGGC)n;

• Długość sekwencji powtórzonej: 6-100 nukleotydów (najczęściej kilkadziesiąt);

• Wszystkie powtórzenia w tej samej orientacji;

• Ilość powtórzeń bywa bardzo różna (od kilku do 1000);

• Duża zmienność powtórzeń w populacji – nadają się do identyfikacji poszczególnych osobników.

• Zmienność ilości powtórzeń jest generowana w wyniku błędów w rekombinacji.

Minisatelity

Minisatelity

Fragmenty restrykcyjne zawierające VNTR – duża zmienność

HaeIII5'-GGCC-3'

VNTR 17-pz powtórzony 70-450 razy wykazuje różnorodność długości od 1.2 do 7.6 kpz

Trzy allele VNTR (A, B i C) u sześciu osób

Trzy różne allele – 3 układy heterozygotyczne i 3 homozygotyczne

Dla n różnych alleli(n)x(n+1)/2 możliwych genotypów

Markery DNA – biologiczny dowód tożsamości

Polimorfizmy VNTR są idealnymi markerami wykorzystywanymi w medycynie sądowej i kryminalistyce.Dobrze nadają się do określania podobieństwa/pokrewieństwa pomiędzy dwoma próbkami DNA.Są pomocne np. w ustalaniu ojcostwa, sprawców gwałtów itp.

Markery DNA – biologiczny dowód tożsamości

Kryteria, jakie muszą spełniać markery genetyczne stosowane w ekspertyzie sądowej

Sekwencje satelitarne w ustalaniu pokrewieństwa

• Ustalenie genetycznych cech śladu biologicznego jest dla sądów, prokuratury i policji ważnym i najbardziej obiektywnym dowodem, chociaż oficjalnie jest tylko dowodem pomocniczym.

• Ustalanie pokrewieństwa: łączenie rodzin, sprawy spadkowe, obowiązek alimentacyjny.

• Matka – kobieta, która urodziła dziecko; ojciec – mężczyzna wskazany przez matkę – brak zgody – sporne ojcostwo.

• Dzieci urodzone w związku małżeńskim: „Jeżeli dziecko urodziło się w czasie trwania małżeństwa albo przed upływem 300 dni od jego ustania lub unieważnienia, domniemywa się, że pochodzi ono od męża matki.”

Zaprzeczenie ojcostwa wymaga „wykazania niepodobieństwa, aby mąż matki dziecka mógł być ojcem tegoż dziecka”.

• Dzieci urodzone poza małżeństwem: uznanie albo orzeczenie sądowe.

• Powództwo o ustalenie ojcostwa (jeden mężczyzna w jednym procesie): matka przedstawia fakty uprawdopodabniające ojcostwo danego mężczyzny, mężczyzna musi udowodnić, „że niepodobieństwem jest” aby był ojcem.

• Ekspertyza genetyczna jest zlecana przez sąd lub wykonywana na zlecenie prywatne jeśli zgadzają się na to prawni opiekunowie dziecka.

Uzasadnienie Sądu Najwyższego do wyroku z 2001 roku:

„Wynik badania DNA przeprowadzony przez uznaną placówkę naukową wyposażoną w nowoczesną aparaturę i opracowany, tzn. wyrażający w liczbach zarówno szansę, jak i prawdopodobieństwo ojcostwa pozwanego, odzwierciedla w sposób praktycznie pewny (co najmniej w tysięcznych częściach procentu) rzeczywiste związki biologiczne między parą rodzicielską a dzieckiem.”

Lokalizacja markerów

W sprawach kryminalnych stosuje się zazwyczaj 4 do 6 sond VNTRMarkery VNTR rozróżniają do 30 alleli w jednym locus.Może istnieć 200 – 300 genotypów w jednym locus.6 markerów może dostarczyć aż do 4 trylionów różnych profili DNA

Częstotliwość występowania alleli VNTR D1S80 w populacji

Jeśli dwa allele mają częstotliwości p i q w populacji, to dla osobnika heterozygotycznego prawdopodobieństwo P posiadania obu alleli wynosi:

P= 2pq

Oczekiwana częstotliwość danego profilu DNA w populacji – iloczyn prawdopodobieństw dla każdego locus

Prawdopodobieństwo Profilu = (P1) (P2) ... (Pn)

Diagnostyka prenatalna ofiar gwałtów – ustalanie ojcostwa

DNA profiling

SLS (ang. single locus system) – analiza pojedynczego locus, analiza jednopunktowa

Aby potwierdzić ojcostwo lub ustalić pokrewieństwo za pomocą SLS należy wykonaćbadania co najmniej 4 (7) niezależnych loci.

SondyOpis sondy:

- nazwa:

D4S139 – specyficzne locus na chromosomie 4

- Sprzężenia ze znanymi loci- Liczba alleli- Typ dziedziczenia- Częstość mutacji i rekombinacji- Wielkość w liczbie par zasad

DNAchromosom

S – unikatowy segment DNAZ – fragment wysoce powtarzalny w danym miejscuF – rodzina homologicznych fragmentów na licznych

chromosomach

precyzyjna lokalizacja sondy

MLS (ang. multilocus system) – jednoczesna analiza wielu loci, analiza wielopunktowa –Jeffreys, 1985

DNA trawiono enzymem HinfI, zastosowano sondę (CAC)5

DNA fingerprinting

Sondy wielu loci

• Sondy Jeffreysa 33.15 i 33.6 – wielokrotne powtórzenie sekwencji 16 i 37 zasad, pochodzą z genu mioglobiny ludzkiej

- hybrydyzują z 16 – 19 prążkami

- stosowane razem pozwalają zbadać 35 niezależnie dziedziczonych alleli

- 20-25% oznaczanych alleli jest wspólnych dla osób niespokrewnionych, a 62% dla rodzeństwa niejednojajowego

• Sonda MZ1.3 – dziki fag M13

• Sondy oligonukleotydowe (CAC)5, (GTG)5 i (GACA)4 – hybrydyzują z krótkimi powtarzalnymi sekwencjami leżącymi w wielu miejscach genomu

Szansa powtórzenia się wzoru fragmentów oznaczanych sondą MZ1.3 u dwóchniespokrewnionych osób wynosi 1 na 6x1012

1 – pozwany, 2 – dziecko, 3 – matka, 4 – DNA pozwanego i dziecka

DNA trawiono HinfI, Hybrydyzacja z sondą MZ1.3Długość żelu – 140 mmGrubość prążka – 1.4 mm100 stref elektroforetycznychW każdej strefie jedna z 8 kombinacji prążków

Współczynnik wartości prążków wspólnych BSR (band sharing rate):BSRAB= SAB/2 x (1/nA+1/nB) x 100%

BSR dla osób niespokrewnionych: do 45%Dla par rodzic-dziecko: 35 – 85%Jeśli BSR powyżej 45% - uznanie ojcostwa, poniżej 35% - wykluczenie

BSR = 28% BSR = 65%

Próba wykorzystania VNTR jako markera zwiększonego ryzykawystąpienia defektów centralnego układu nerwowego (ang. NTD –

neural tube defect)

NTD- poważne defekty polegające na niedorozwoju mózgu, rdzenia kręgowego i tkanek

okrywających te organy.

- wynikają z niekompletnego zamknięcia cewki nerwowej, które powinno nastąpić w 3 i 4 tygodniu ciąży.

- rozszczep kręgosłupa – bardzo częsty defekt, w USA dotyka jednego na 1000 noworodków.

Przyczyny NTDZaburzony metabolizm homocysteiny - dzieci chore i ich matki mają podwyższony

poziom homocysteiny

homocysteina

metionina cystationina

MTHFRkwas foliowy

CBS

MTHFR – metylenetetrahydrofolateCBS – cystathionine β-synthase

Mutacje w genach kodujących MTHFR i CBS

MTHFR 677 C > T – zmniejszona aktywność MTHFR

podwyższony poziom homocysteiny

CBS 31 pz VNTR – powtórzenie o długości 31 pz, którego liczba powtórzeń osiąga 15-21,

- 18 powtórzeń to najpowszechniejszy allel- aktywność CBS maleje wraz ze wzrostem liczby powtórzeń- poziom homocysteiny rośnie

Czy te mutacje mogą być markerami zwiększonego ryzyka NTD?

Zaobserwowano wyraźny związek między CBS VNTR i polimorfizmem MTHFR 677 C>T a poziomem homocysteiny, ale nie ma korelacji z ryzykiem NTD.

DRD4 – receptor dopaminowy D4- w egzonie 3 genu DRD4 występuje zmienna liczba powtórzeń o długości 48 pz (48 pz VNTR)- najpowszechniejsza forma genu zawiera 4 powtórzenia, nieco rzadsza jest forma posiadająca 7 powtórzeń- występowanie 7 powtórzeń jest skorelowane z 2-3- krotnym spadkiem wiązania receptora z cyklazą adenylową

5HTT – gen transportera serotoniny- w promotorze tego genu występuje 22 pz VNTR- dwa warianty: długi – 16 powtórzeń – częsty

krótki – 14 powtórzeń- forma krótka powoduje zmniejszenie wydajności transkrypcji genu transportera serotoniny i wiązania receptora z serotoniną

Polimorfizmy VNTR w genie DRD4 oraz w promotorze genu 5HTT a osobowość

Dopamina – należy do neurotransmiterów katecholaminowych(epinefryna, norepinefryna, L-dopa)- nadprodukcja dopaminy w mózgu oraz nadwrażliwośćreceptorów powoduje objawy psychotyczne i schizofrenię- niedobór – choroba Parkinsona- receptor D4 – inhibicja cyklazy adenylowej,

Serotonina – należy do grupy neurotransmiterów aminokwasowych i ich pochodnych- działa poprzez receptor związany z białkiem G- powoduje gwałtowny wzrost stężenia cAMP w komórce- wiele leków antydepresyjnych (Prozac) hamuje zwrotne wychwytywanie serotoniny – w efekcie w synapsach jest więcej serotoniny

• Novelty seeking – osoby wykazujące tę cechę są „ciekawe świata”, łatwo się nudzą, są impulsywne, ekstrawaganckie, nieuporządkowane

• Externalizing behavior – agresja wobec przedmiotów i osób, kłótliwość,

skłonność do kradzieży, kłamstwa, oszukiwania, brak samokontroli, niezdolność do rozwijania i utrzymywania satysfakcjonujących relacji z ludźmi

Allele DRD4 i 5HTT a osobowość Kombinacja allelu DRD4 zawierającego 7 powtórzeń i przynajmniej

jednego długiego allelu 5HTT koreluje ze wzrostem współczynnika „poszukiwania nowości” (ang. novelty seeking)

Brak allelu DRD4 zawierającego 7 powtórzeń przy jednoczesnej homozygotyczności pod względem krótkiego allelu 5HTT – gorsza orientacja, większa skłonność do złości

Krótki allel 5HTT koreluje z negatywnymi cechami emocjonalności

Allel DRD4 zawierający 7 powtórzeń zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia zespołu niedoboru koncentracji i nadpobudliwości (ang. ADHDattention deficit/hyperactivity disorder)

Allel DRD4 zawierający 7 powtórzeń występuje częściej u rocznych dzieci, które nie mają dobrego kontaktu z matką

Dzieci posiadające dwa długie allele 5HTT wykazywały częściej „externalizing behavior’ jeśli ich rodzice byli nieprzystosowani do funkcjonowania w społeczeństwie

Jeden bądź dwa krótkie allele 5HTT sprzyjają externalizing behavior” jeśli w rodzinie występował alkoholizm