Komórkowe strategie

reakcji pająków

na stres środowiskowy

2

NR 2638

3

Grażyna Wilczek

Komórkowe strategiereakcji pająków

na stres środowiskowy

Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego Katowice 2008

4

Publikacja jest dostępna także w wersji internetowej

Śląska Biblioteka Cyfrowawww.sbc.org.pl

Redaktor serii: Biologia

Recenzenci

PAWEŁ MIGULA

ELŻBIETA PYZA

EUGENIA TĘGOWSKA

5

Spis treści

Wykaz stosowanych skrótów . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1. Wstęp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.1. Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.2. Pająki wobec stresorów środowiskowych . . . . . . . . . . . . . . . 121.2.1. Metale ciężkie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.2.2. Pestycydy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151.2.3. Temperatura i głodzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.3. Komórkowe reakcje na stres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.3.1. Systemy antyoksydacyjne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191.3.2. Apoptoza i nekroza jako biomarkery stresu . . . . . . . . . . . . . . 201.3.3. Białka szoku cieplnego (Hsp) oraz metalotioneiny (Mt) jako czynniki anty-

oksydacyjne i antyapoptotyczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231.3.3.1. Białka szoku cieplnego (Hsp) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.3.3.2. Metalotioneiny (Mt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2. Cele pracy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3. Materiał i metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.1. Teren badań . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303.2. Charakterystyka badanych gatunków pająków . . . . . . . . . . . . . 303.3. Grupy doświadczalne i stosowane czynniki stresowe . . . . . . . . . . 333.4. Charakterystyka gruczołów jelita środkowego pająków . . . . . . . . . 343.5. Analizy cytometryczne i spektrofotometryczne . . . . . . . . . . . . . 363.5.1. Wskaźniki śmierci komórkowej i białka stresu . . . . . . . . . . . . . 363.5.1.1. Przygotowanie materiału do analiz cytometrycznych . . . . . . . . . . 363.5.1.2. Ilościowa ocena komórek apoptotycznych i nekrotycznych . . . . . . . . 363.5.1.3. Ilościowa ocena komórek ze zdepolaryzowanymi mitochondriami . . . . . 383.5.1.4. Ilościowa ocena komórek Mt pozytywnych . . . . . . . . . . . . . . 393.5.1.5. Ilościowa ocena komórek Hsp70 pozytywnych . . . . . . . . . . . . . 403.5.1.6. Proteazy kaspazopodobne (Cas-3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403.5.2. Wskaźniki antyoksydacyjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.5.2.1. Glutation całkowity (GSH + GSSG) . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

6

3.5.2.2. Peroksydazy glutationowe: selenozależna (GPOX; EC 1.11.1.9) i niezależnaod selenu (GSTPx) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.5.2.3. S-transferaza glutationowa (GST; EC 2.5.11.18) . . . . . . . . . . . . 423.5.2.4. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD; EC 1.15.1.1) . . . . . . . . . . . . 433.5.2.5. Katalaza (CAT; EC 1.11.1.6) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433.6. Oznaczanie stężenia białka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433.7. Analizy statystyczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.8. Odczynniki chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4. Wyniki. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.1. Analiza czynnikowa udziału zastosowanych stresorów oraz płci i stanowiskaw odpowiedziach komórkowych u pająków . . . . . . . . . . . . . . 45

4.2. Efekty zastosowanych czynników stresogennych w odniesieniu do wskaźni-ków śmierci komórkowej i białek stresu w gruczołach jelita środkowego pa-jąków Agelena labyrinthica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.2.1. Szok termiczny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494.2.2. Pestycyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504.2.3. Łączne działanie wysokiej temperatury i pestycydu . . . . . . . . . . . 514.2.4. Głodzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544.3. Efekty zastosowanych czynników stresogennych w odniesieniu do wskaźni-

ków śmierci komórkowej i białek stresu w gruczołach jelita środkowego pa-jąków Xerolycosa nemoralis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.3.1. Szok termiczny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544.3.2. Pestycyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 554.3.3. Łączne działanie wysokiej temperatury i pestycydu . . . . . . . . . . . 554.3.4. Głodzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564.4. Efekty zastosowanych czynników stresogennych w odniesieniu do wskaźni-

ków antyoksydacyjnych w gruczołach jelita środkowego pająków Agelenalabyrinthica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.4.1. Szok termiczny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 594.4.2. Pestycyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 594.4.3. Łączne działanie szoku termicznego i pestycydu . . . . . . . . . . . . 604.4.4. Głodzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 604.5. Efekty zastosowanych czynników stresogennych w odniesieniu do wskaźni-

ków antyoksydacyjnych w gruczołach jelita środkowego pająków Xerolycosanemoralis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.5.1. Szok termiczny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 634.5.2. Pestycyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 634.5.3. Łączne działanie szoku termicznego i pestycydu . . . . . . . . . . . . 644.5.4. Głodzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 644.6. Porównanie reakcji samic i samców na zastosowane czynniki stresogenne . 67

5. Dyskusja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5.1. Rodzaj czynnika stresowego a zmiany poziomu wskaźników śmierci komór-kowej u pająków . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5.2. Antyoksydacyjna obrona u pająków w odpowiedzi na czynniki stresowe . . 745.3. Reakcje samic i samców pająków w odpowiedzi na stres . . . . . . . . 805.4. Przedekspozycyjne wskaźniki stresu u zwierząt z terenów referencyjnych

i silnie zanieczyszczonych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.4.1. Komórkowe reakcje samic i samców pająków na dodatkowe czynniki streso-genne a wcześniejsza preekspozycja na zanieczyszczenia. . . . . . . . . 87

5.4.2. Hsp70 i metalotioneiny u pająków z terenów w różnym stopniu zanieczy-szczonych w odpowiedzi na zadane stresory . . . . . . . . . . . . . . 89

5.5. Podsumowanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

6. Wnioski . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Summary. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

1.1. Wprowadzenie

Organizmy w swym środowisku życia podle-gają wpływom różnorodnych czynników streso-gennych, które w zależności od siły i czasudziałania mogą modyfikować ich procesy fizjo-logiczne, a w skrajnych przypadkach zmniejszaćszanse przeżycia. Z jednej strony są to czynnikinaturalne, takie jak zbyt wysoka lub zbyt niskatemperatura, wilgotność, dostępność pokarmu,interakcje z innymi organizmami, z drugiej zaśsą to substancje chemiczne. Wymienione ele-menty składają się na pojęcie „stresu środowi-skowego”, rozumianego jako zespół oddziały-wań o charakterze stresotwórczym lub odpo-wiedź organizmu na tego typu czynniki (VAN

STRAALEN, 2003). Stresory działają bezpośredniona poziomie komórki, chociaż przesuniętew czasie pośrednie skutki ich oddziaływańmogą się manifestować na wyższych poziomachorganizacji biologicznej. W badaniach ekotoksy-kologicznych rozwijane są koncepcje, w którychoceniając efekty działania różnorodnych składo-wych stresu środowiskowego, korzysta się z bio-markerów, definiowanych jako „molekularne,biochemiczne, histologiczne lub fizjologiczneparametry, które na poziomie poniżej organizmuzmieniają się proporcjonalnie do stopnia ekspo-zycji zwierząt na działanie czynników zanie-czyszczających ich środowisko” (DEPLEDGE,FOSSI, 1994; DALLINGER i in., 2000; EASON,O’HALLORAN, 2002) bądź też rozumianych jako

„zmiana na poziomie molekularnym, któramoże służyć za wskaźnik stanu stresu spowodo-wanego przez dowolny czynnik środowiskowy”(LASKOWSKI, MIGULA, 2004). Aby w pełni po-znać kondycję fizjologiczną danej grupy organi-zmów, wskazane jest użycie szerokiego spek-trum parametrów, które pozwoliłyby ocenić pro-cesy metaboliczne zachodzące w komórkach,a tym samym pozwoliłyby rozstrzygać o stopniu„uciążliwości” dla organizmu oddziałującychczynników stresogennych. W odniesieniu dośrodowisk lądowych wiele badań w tym zakre-sie poświęca się bezkręgowcom glebowym,w tym stawonogom (KAMMENGA i in., 2000),a wśród kręgowców również ptakom (CASINI

i in., 2003) i ssakom (TIMBRELL, 1998).Stosunkowo mało informacji na temat bioche-

micznych, histologicznych oraz fizjologicznychzmian, które mogłyby być wykorzystane do oce-ny narażenia lub wykazania skutków działaniaczynników stresogennych o różnym charakterze,zgromadzono dla pająków (Araneae). Ze wzglę-du na małą wybiórczość pokarmową oraz dużąintensywność drapieżniczą bezkręgowce te uwa-ża się za ważne regulatory liczebności wielupopulacji owadów w ekosystemach łąkowych,leśnych i rolniczych (MARC i in., 1999). Pająkiwystępują powszechnie także na terenach zanie-czyszczonych, w tym skażonych metalami cięż-kimi (CLAUSEN, 1984 a; 1984 b; 1986; HUNTER

i in., 1987; DEELMAN-REINHOLD, 1990; RABITSCH,1995) i — jak niejednokrotnie wykazywano —w porównaniu z innymi grupami systematycz-

11

1. Wstęp

2*

nymi zamieszkującymi tereny silnie zdegrado-wane mogą tolerować wysokie stężenia metaliw ciele (HUNTER i in., 1987; MAELFAIT, 1996;HENDRICKX i in., 2003; WILCZEK i in., 2004).Mechanizmy tej tolerancji w omawianej grupiezwierząt są jednak bardzo słabo poznane. Szcze-gólnie mało informacji zgromadzono na tematkomórkowych reakcji na stres u pająków ekspo-nowanych w kontrolowanych warunkach na róż-ne czynniki, które składają się na pojęcie stresuśrodowiskowego. Przyczyną rzadkiego podej-mowania prób hodowli pająków są względy me-todyczne, ogromną trudność bowiem sprawiazapewnienie, szczególnie młodym osobnikom,optymalnych warunków związanych ze specy-ficznymi wymaganiami pokarmowymi i wilgot-nościowymi. Poważnym problemem hodowla-nym jest także kanibalizm rozpowszechnionyw tej grupie drapieżnych bezkręgowców. Jeśliuwzględni się wymienione ograniczenia, więk-szość informacji o fizjologicznych reakcjach nastres pochodzi z badań prowadzonych na osob-nikach odłowionych bezpośrednio z terenu lubtylko okresowo przetrzymywanych w laborato-rium.

1.2. Pająki wobec stresorówśrodowiskowych

Tolerancja czynników stresogennych przezorganizmy jest możliwa dzięki uruchamianiumechanizmów obronnych, których cel stanowizachowanie wewnętrznej homeostazy. Niejedno-krotnie zmiany te dotyczą bilansu energetyczne-go i wiążą się z przeznaczaniem części energiipochodzącej z podstawowych składowych bud-żetu energetycznego, czyli z produkcji (wzrostui reprodukcji) lub/i z kosztów utrzymania orga-nizmu, na procesy naprawcze (SIBLY, CALLOW,1989), w tym także detoksykację i bioeliminację.Badacze tego problemu proponują kilka roz-wiązań optymalnej alokacji energii w zależnościod warunków środowiska oraz możliwości de-toksykacji substancji toksycznych przez określo-ne organizmy. Można założyć, że w nieska-

żonym środowisku niemal całość dostępnej ener-gii jest wykorzystywana w procesach wzrostui reprodukcji, wobec minimalnego przeznaczeniajej na procesy detoksykacyjne. Z kolei w środo-wiskach zanieczyszczonych ilość energii prze-znaczonej na wzrost i reprodukcję generalnieulega zmniejszeniu, jednakże długość życia or-ganizmów nie zmienia się, co jest możliwe dzię-ki intensywnym procesom detoksykacyjnym.W tym drugim przypadku scenariusz optymalnejalokacji energii może się zmieniać w zależnościod właściwości fizjologicznych organizmu, wie-ku czy toksyczności substancji (LASKOWSKI,MIGULA, 2004). Rzeczywiście w wielu bada-niach ekotoksykologicznych u zwierząt ekspo-nowanych na stresory środowiskowe, w tym me-tale, stwierdza się zmiany w przyrostach bioma-sy (ROWE i in., 2001), rozrodczości (SPURGEON

i in., 2000) i/lub tempie respiracji (MIGULA i in.,1990; LASKOWSKI i in., 1996; ROWE i in., 1998).Nie można wykluczyć, że zwierzęta z terenówzanieczyszczonych mogą się cechować mniejszątolerancją na dodatkowe czynniki stresogenne,co w rezultacie skutkuje osłabieniem, a nawetwyginięciem populacji w razie zmiany warun-ków środowiska (STONE i in., 2001). Ostateczniemoże nastąpić przebudowa składu gatunkowegozespołu i zastępowanie gatunków wrażliwych ta-kimi, które są w stanie tolerować określone stre-sory środowiskowe bez wyraźnego uszczerbkuw procesach reprodukcji.

Jeśli odnieść się do omówionych wcześniejzagadnień, to ekologiczna ocena stanu arachno-cenoz terenów zdegradowanych wskazuje, żezwykle nie zmienia się liczebność pająków,przebudowie natomiast ulega struktura gatunko-wa (ŁUCZAK, 1984; 1987a; DĄBROWSKA-PROT,1984; MAJKUS, 2003). W środowiskach w mniej-szym stopniu zanieczyszczonych przeważająnajczęściej pająki sieciowe z rodziny krzyża-kowatych (Araneidae) i omatnikowatych (Theri-diidae), natomiast w środowiskach silnie zanie-czyszczonych dominują słabsze, w bezpośredniejkonkurencji o miejsce i pokarm, sieciowe pająkiz rodzin osnuwikowatych (Linyphiidae) i kwa-dratnikowatych (Tetragnathidae) oraz niebudu-jące sieci pogońcowate (Lycosidae) (ŁUCZAK,1984; 1987b; DEELMAN-REINHOLD, 1990). Intere-

12

sujących informacji na temat tolerancji niedobo-ru lub nadmiaru określonych czynników bio-tycznych i abiotycznych dostarczają badaniasukcesji fito- i zoocenoz na hałdach poprze-mysłowych. Jakościowa analiza arachnofauny,np. hałdy górniczej „Lidice” (peryferie Ostrawy;Ostrawsko-Karwiński Okręg Przemysłowy; Re-publika Czeska), wskazuje, że już we wcze-snych fazach rekultywacji na hałdzie tej znale-ziono przedstawicieli blisko 15 rodzin pająków,wśród których największy udział w zespolepająków miały gatunki z rodziny osnuwikowa-tych (Linyphiidae — 40%), a w dalszej kolejno-ści pająki niebudujące sieci z rodzin: skakuno-watych (Salticidae), pogońcowatych (Lycosidae)i aksamitkowatych (Clubionidae) (MAJKUS,1988). Proporcje te zostały zachowane takżew późniejszych okresach rekultywacji wymie-nionej hałdy (MAJKUS, 2003). Skład gatunkowyarachnocenoz na obszarach zdegradowanychprzez przemysł może zatem wynikać z między-gatunkowych różnic we wrażliwości tych dra-pieżników na działanie określonych substancjitoksycznych w ich środowisku i w rezultaciesprzyjać konkurencji w wymienionej grupie sta-wonogów (CLAUSEN, 1984a; 1984b; GUNNARS-

SON, JOHNSSON, 1989).Reakcje fizjologiczne pająków wobec okre-

ślonych stresorów środowiskowych, w tymo charakterze antropogennym, często są specy-ficzne gatunkowo. Pająki Enoplognatha ovata(Theridiidae) w warunkach silnej presji zanie-czyszczeń przemysłowych (Rybnicki OkręgPrzemysłowy) składały puste kokony, charakte-ryzowała je też duża zmienność rozmiarów ko-konów, jak również większa śmiertelność wylę-gających się pająków (ZIMAKOWSKA-GNOIŃSKA,TARWID, 1984; TARWID, 1987). Także przedstawi-ciel pogońcowatych Pirata piraticus (Lycosidae)zamieszkujący tereny zanieczyszczone cechowałsię spadkiem płodności i reprodukcji (HEND-

RICKX i in., 2003). W innych badaniach obser-wowano natomiast, że w warunkach silnegouprzemysłowienia następował wzrost biomasyniektórych gatunków pająków oraz nasilenie in-tensywności ich procesów życiowych (DĄBROW-

SKA-PROT, 1984; ŁUCZAK, 1987b). W środowi-skach przekształconych przez przemysł stymula-

cja procesów metabolizmu ogólnego u zawijakażółtawego Enoplognatha ovata (Theridiidae),osnuwika pospolitego Linyphia triangularis (Li-nyphiidae) i czaika jesiennego Metellina seg-mentata (Tetragnathidae) przewyższała tempometabolizmu pająków pochodzących ze słaboprzekształconych ekosystemów leśnych o 25—30% (ZIMAKOWSKA-GNOIŃSKA, 1981). Badaniapuli nukleotydów adenylowych w przypadkupająków ze Śląska, przedstawicieli rodzin: Liny-phiidae, Araneidae, Tetragnathidae, Lycosidaewskazują ponadto, że w warunkach zanieczysz-czonego środowiska nie następowało naruszenierównowagi energetycznej organizmu, o czymświadczyła wielkość ładunku energetycznegoadenylatów (AEC) mieszcząca się u badanychgatunków w granicach fizjologicznie optymal-nych (MARCZYK i in., 1993; WILCZEK, 1996).

W kolejnych podrozdziałach zostaną przed-stawione wybrane czynniki stresowe o charakte-rze antropogennym (metale, pestycydy) i natu-ralnym (skrajne temperatury, niedobór pokar-mu), na które pająki często są narażonew swoim środowisku bytowania.

1.2.1. Metale ciężkie

Miejsce zajmowane przez pająki w sieciachtroficznych ekosystemów lądowych, a także ichcechy biologiczne sprawiają, że drapieżniki te sąszczególnie narażone na działanie metali orazzwiązków organicznych (m.in. pestycydów), któ-re dostają się do ich organizmu w wyniku bezpo-średniej ekspozycji, zarówno drogą pokarmowąjak i kontaktowo (HOPKIN, 1989). Stosując po-dział zaproponowany przez DALLINGERA (1993),który został oparty na wielkości wskaźnikówbiokoncentracji metali w tkankach, pająki zali-czono do makrokoncentratorów tych pierwiast-ków. Badania porównawcze kumulacji metaliw ciele różnych grup bezkręgowców zebranychwokół dużych emitorów zanieczyszczeń wska-zują, że stężenia kadmu, miedzi i ołowiu u przed-stawicieli pająków reprezentujących drapieżnebezkręgowce są równie wysokie, jak u organi-

13

zmów detrytusożernych i wielokrotnie wyższew porównaniu z roślinożercami (HUNTER i in.,1987; ANDREWS i in., 1989; MIGULA i in., 2005).Interesujące jest to, że wysokie stężenia metaliznajdowano także u pająków pochodzących z te-renów słabo zanieczyszczonych (KNUTTI i in.,1988; WILCZEK i in., 1996; 2003; 2004). Znacz-nej kumulacji metali w ich ciele sprzyja przedewszystkim wysoka przyswajalność pokarmu, sil-nie rozwinięty polifagizm, spożywanie miękkichtkanek ofiar, a także stosunkowo niski poziommetabolizmu silnie rozbudowanych gruczołówjelita środkowego, w których stężenie metali jestzawsze wyższe niż w innych narządach (MOUL-

DER, REICHLE, 1972; HOPKIN, 1989; WILCZEK,BABCZYŃSKA, 2000).

Do organizmu pająka metale dostają sięgłównie drogą pokarmową (HOPKIN, 1989). Prze-wód pokarmowy stanowi więc pierwszą i naj-ważniejszą linię obrony. Fakt ten potwierdzająbadania, z których wynika, że wchłonięte metalemogą być u pająków deponowane głównie w ko-mórkach gruczołów jelita środkowego (HOPKIN,1986; LUDWIG, ALBERTI, 1988a; 1988b) lub usu-wane wraz z kałem (CLAUSEN, 1991). Czas ma-gazynowania metali u pająków zależy od rodza-ju metalu (LEE i in., 1978; NABHOLTZ, CROSSLEY,1978; HENDRICKX i in., 2003), gatunku (WIL-

CZEK, MIGULA, 1996; KRAMARZ, 2000; HEND-

RICKX i in., 2003; WILCZEK i in., 2005), płci(WILCZEK i in., 2005; 2007) oraz stanu odżywie-nia (BROWN, 1982). Dominacja określonej strate-gii może zależeć jednak od stężenia metaluw pokarmie. Sugerują to wyniki badań BAB-

CZYŃSKIEJ i MIGULI (2002), którzy zmierzyli stę-żenie kadmu w ciele samic i samców pająkaPardosa lugubris (Araneae: Lycosidae) orazw ciele ich ofiary, muszki owocowej (Drosophi-la melanogaster) hodowanej na pożywcekontrolnej, zawierającej śladowe ilości kadmuoraz zawierającej wysokie stężenie tego metalu(426 µg Cd · g–1 suchej masy). Porównanie stę-żenia kadmu w ciele drapieżcy i w ciele ofiaryz obu grup doświadczalnych pozwala wniosko-wać o zróżnicowanej strategii: magazynowaniaw formie nieaktywnej przy niższym stężeniumetali w diecie lub wzmożonego wydalania,gdy stężenie wzrastało.

Dotychczasowe badania pozwoliły także wy-kazać liczne zależności między poziomem ku-mulowanych metali w ciele a strategią i inten-sywnością drapieżniczą pająków (WILCZEK,MIGULA, 1996; WILCZEK i in., 1997; 2003; 2004;2005; 2007), co potwierdzono dla pająków zestanowisk Górnośląskiego Okręgu Przemysłowe-go, Wyżyny Krakowsko-Częstochowskiej orazOstrawsko-Karwińskiego Okręgu Przemysłowe-go, analizując poziom metali zarówno w cielecałych osobników, jak i w wybranych narządach(gruczoły jelita środkowego, gonady) (WILCZEK,BABCZYŃSKA, 2000; WILCZEK i in., 2003; 2004;2005; 2007). Najniższe stężenia Cd, Pb, Cu i Zncechowały osnuwikowate, reprezentowane przezLinyphia triangularis, które pomimo możliwościwiększego pobierania metali ze względu namałą wybiórczość pokarmową i dużą intensyw-ność drapieżniczą (NENTWIG, 1983; FOELIX,1996) odznaczały się niższym, w porównaniuz pozostałymi gatunkami, stężeniem wymienio-nych pierwiastków w ciele (WILCZEK, MIGULA,1996; WILCZEK i in., 1997; 2005; 2007). Sugeru-je to słabą ich przyswajalność z przewodu po-karmowego. Z kolei przedstawiciele niebu-dujących sieci pająków z rodziny Lycosidae (P.lugubris, P. palustris) niezależnie od stopnia za-nieczyszczenia środowiska metalami charaktery-zowały się wysokim stężeniem Cd, Pb, Zn i Cuw porównaniu z wartościami, które notowanou pająków sieciowych z rodzin: Araneidae, Li-nyphiidae czy Agelenidae. Z innych badań wy-nika, że Lycosidae przyswajały więcej Cd i Cuniż pająki sieciowe, czego nie potwierdzono dlaPb (LARSEN i in., 1994).

Warto też zwrócić uwagę na występowanieróżnic w zdolnościach do gromadzenia metaliciężkich przez samice i samce pająków. Z po-równania wartości stężeń Cd, Pb, Cu, Zn, Few ciele osobników obu płci, przedstawicieli ro-dzin Araneidae, Agelenidae, Linyphiidae, Lyco-sidae i Salticidae, wynika, że samce kumulująwiększe ilości tych pierwiastków niż samice(WILCZEK i in., 2005). Poziom Cd, Zn i Cuw gruczołach jelita środkowego pająków pogoń-cowatych Xerolycosa nemoralis i lejkowcówAgelena labyrinthica również był wyższy u sam-ców niż u samic, niezależnie od stopnia zanie-

14

czyszczenia stanowisk badawczych. Tylko ołówkumulował się w wyższym stężeniu w gru-czołach jelita środkowego samic X. nemoralis,natomiast w przypadku A. labyrinthica poziomtego metalu u obu płci był zbliżony (WILCZEK

i in., 2007). Wytłumaczeniem różnic w zdolno-ściach do bioakumulacji metali są behawioralnei fizjologiczne odmienności między samcamii samicami pająków. Samce, w porównaniu z sa-micami, przechodzą mniej linień oraz żyjąznacznie krócej, gdyż giną w krótkim czasie pokopulacji (FOELIX, 1996). Doświadczalnie po-twierdzono, że podczas linienia konkrecje mine-ralne mogą być usuwane z jelita, dzięki czemuobniża się pula metali zmagazynowanych w gru-czołach jelita środkowego (HOPKIN, 1989). Po-nadto samce po osiągnięciu dojrzałości płciowejzaprzestają polowań i pobierania pokarmu,a koncentrują się głównie na odnalezieniu sami-cy. Samce narażone są zatem na dłuższe niż sa-mice okresy głodu wobec relatywnie krótszegookresu życia. Wymienione czynniki mogą zmie-niać metabolizm ich gruczołów jelita środkowe-go i wywoływać morfologiczne zmiany w posta-ci powiększających się wewnątrzkomórkowychkonkrecji granularnych zawierających metalew wymienionym narządzie oraz w komórkachnabłonka jelitowego, co wykazano w przypadkuinnych bezkręgowców (BROWN, 1982).

Specyficznymi biomarkerami narażenia nametale są u zwierząt metalotioneiny (Mt) (PARK

i in., 2001), jak również wewnątrz- i śródkomór-kowe konkrecje mineralne (HOPKIN, 1989; DAL-

LINGER, REINBOW, 1993). Niewiele jednak jestdanych na temat funkcji metalotionein u pa-jąków. Wcześniejsze badania, w których tech-niką cytometrii przepływowej porównywanoliczbę komórek Mt pozytywnych w gruczołachjelita środkowego pająków pogońcowatychX. nemoralis oraz sieciowych A. labyrinthicai L. triangularis odławianych z terenów róż-niących się stężeniem metali w środowisku wy-nika, że tylko w przypadku pająków tunelowych(A. labyrinthica) osobniki z terenu silnie zanie-czyszczonego metalami cechowały się więk-szym odsetkiem komórek Mt pozytywnychw wymienionym narządzie (WILCZEK i in.,2007). W innych badaniach u pogońcowatych

P. lugubris i sieciowych A. labyrinthica ekspo-nowanych na wysoką temperaturę oraz pestycydfosforoorganiczny wykazano nasilenie produkcjimetalotionein, ze wskazaniem na silniejsze reak-cje u pająków niebudujących sieci (WILCZEK,2005). Nie można wykluczyć, że w przypadkupająków indukcja metalotionein w odpowiedzina stres fizyczny i chemiczny jest wyrazemochrony antyoksydacyjnej, w mniejszym stopniuodpowiadając za bezpośrednią neutralizację me-tali ciężkich.

Zdecydowanie więcej informacji dla tej grupydrapieżnych bezkręgowców zgromadzono natemat możliwości deponowania metali w we-wnątrz- i śródkomórkowych konkrecjach mine-ralnych. Metale odkładają się u pająków najczę-ściej w komórkach trawiennych gruczołów jelitaśrodkowego jako tzw. mineralne ziarnistości(BROWN, 1982; HOPKIN, 1989) lub okresowe sfe-ryty (LUDWIG, ALBERTI, 1988a), skąd w sposóbholokrynowy mogą być usuwane do światła jeli-ta (HOPKIN, 1989). Spośród wyróżnionych przezHOPKINA (1986) czterech typów granul: we-wnątrzkomórkowych A, B i C oraz pozakomór-kowych D, najistotniejsze w detoksykacji metaliu pająków wydają się granule typu B, w którychstwierdzono miedź, rtęć, kadm, cynk, ołówi żelazo.

1.2.2. Pestycydy

Pomimo że pająki zwykle nie są bezpośred-nim celem użycia pestycydów, to często nega-tywne skutki działania tego typu związków do-tyczą także tej grupy zwierząt. Oddziaływanie toz jednej strony dotyczy bezpośredniej toksyczno-ści stosowanych środków ochrony roślin wzglę-dem pająków (STARK i in., 1995; TOFT, JENSEN,1998; NYFFELER, SUDERLAND, 2003), z drugiejnatomiast jest wynikiem drastycznego spadku li-czebności ich ofiar na terenie, na którym pesty-cydy są stosowane (HAMERS, KROGH, 1997; VAN

HAMBURG, GUEST, 1997; MARC i in., 1999).Testy przeprowadzone w warunkach laborato-

ryjnych wskazują, że pająki cechuje zróżnicowa-

15

na wrażliwość na pestycydy stosowane w zabie-gach agrotechnicznych. Na przykład przedstawi-ciele rodziny Anyphaenidae, Hibana velox,przejawiały 100% śmiertelność podczas aplika-cji niskich stężeń takich związków jak: chlorpy-rifos, ethion, carbaryl czy dicofol, podczas gdyinne związki, na przykład azadirachtin czy di-flubenzuron, nie wywoływały toksycznych efek-tów nawet wówczas, gdy stosowano je w wyso-kich stężeniach (AMALIN i in., 2000). Wynikibadań ekologicznych wskazują ponadto na za-leżną od płci wrażliwość pająków na działaniepestycydów. Akarycyd (karate; λ-cyhalotryna)powodował u Pardosa amentata (Lycosidae)blisko 50% śmiertelność samców, gdy tymcza-sem odsetek ginących samic był ponad 2-krotniemniejszy (HOF i in., 1995). Skutki stosowaniapestycydów zależą u pająków od pory roku. Do-rosłe P. amentata eksponowane na λ-cyhalotry-nę późną jesienią lub na początku zimy okazałysię stosunkowo mało wrażliwe na zastosowanyzwiązek, podczas gdy w okresie wiosenno-let-nim taka sama ekspozycja powodowała wysokąśmiertelność (HOF i in., 1995). Powodem wzro-stu wrażliwości pogońcowatych na pestycydbyło prawdopodobnie wejście w okres repro-dukcji, co wiązało się z nasiloną ruchliwościąpająków poszukujących partnerów i powodo-wało częstsze kontakty ze stresorem chemicz-nym. Także kondycja fizjologiczna drapieżni-ków mogła być w tym czasie obniżona, samceginą bowiem najczęściej krótko po kopulacji.W przypadku samic wydatki energetyczne naprodukcję kokonów mogły ulec zmniejszeniuw wyniku nasilenia reakcji detoksykacyjnych.

Wczesne i silne efekty działania pestycydu naorganizm pająka manifestują się w postaci upoś-ledzenia zdolności lokomotorycznych, co obser-wowano zarówno u przedstawicieli pająków nie-budujących sieci P. amentata (Lycosidae) (HOF

i in., 1995), jak i sieciowych Oedothorax apica-tus (Linyphiidae) (JAGERS OP AKKERHUIS i in.,1997). Efekty te utrzymywały się nawet przezkilka dni po aplikacji, przejawiając się m.in. za-burzeniami w zachowaniu łowieckim (HOF i in.,1995). W przypadku zastosowania pestycydówfosforoorganicznych przyczyną dysfunkcji moto-rycznych są najczęściej zmiany przekaźnictwa

synaptycznego związane z hamowaniem aktyw-ności acetylocholinesterazy (AChE). Z porów-nania efektu działania dimetoatu u dwóchgatunków pająków: sieciowego A. labyrinthica(Agelenidae) i aktywnie polującego P. lugubris(Lycosidae) wynika, że zarówno jedno-, jaki wielokrotna aplikacja powoduje obniżenie ak-tywności wymienionego enzymu u przedstawi-cieli rodziny Agelenidae. W przypadku P. lugu-bris nie zanotowano istotnych różnic w aktyw-ności AChE zarówno w grupach jednokrotnie,jak i wielokrotnie eksponowanych na pestycyd(BABCZYŃSKA i in., 2006). Rezultaty te są po-dobne do tych, które uzyskali we wcześniej-szych badaniach BABCZYŃSKA i MIGULA (2002)po aplikacji pająkom tego samego gatunku(P. lugubris) innego pestycydu fosforoorganicz-nego — fenitrotionu. Także i w tym przypadkuodpowiedź pająków pogońcowatych była słabaniezależnie od płci.

Z badań NIELSENA i in. (1997), którzy metodąkontaktową zatruwali cypermetryną (pestycydz grupy pyretroidów) Pardosa prativaga (Lyco-sidae), wynika natomiast, że aktywność takichenzymów jak S-transferaza glutationowa (GST)i peroksydaza glutationowa (GPOX) po 30 minod zastosowania wymienionego związku ulegałablisko 50% obniżeniu w stosunku do aktywnościwyjściowej. Kolejne pomiary (po 12, 24, 48, 96godz.) świadczyły jednak o stopniowym powro-cie aktywności GST do wartości kontrolnych,a w przypadku GPOX nawet nasileniu aktywno-ści tego enzymu po 12 godz. od aplikacji. Dwu-etapowa odpowiedź organizmu na zastosowanyzwiązek wskazuje na możliwość regeneracji ak-tywności wymienionych enzymów i sugeruje, żeglutation oraz enzymy związane z jego metabo-lizmem w przypadku wymienionego gatunkupogońcowatych mogą odgrywać istotną rolę de-toksykacyjną, uczestnicząc w antyoksydacji.

1.2.3. Temperatura i głodzenie

Temperatura jest czynnikiem silnie limitu-jącym aktywność ruchową pająków, wymusza-

16

jąc w sposób naturalny okresy głodu. Zakrestemperatur, w którym pająki są zdolne zła-pać ofiarę, obejmuje najczęściej przedział21—35°C. Poniżej 21°C pająki sieciowe nie sąw stanie złapać ofiary, nim ta ucieknie z sieci,natomiast powyżej 35°C są narażone na zbytduże straty wody i szok cieplny (FOELIX, 1996).Przekroczenie górnej granicy tolerancji termicz-nej powoduje odrętwienie, a zbyt długie od-działywanie wysokiej temperatury prowadziw konsekwencji do śmierci organizmu (PULZ,1987; SCHMALHOFER, 1999).

W warunkach działania stresora termicznegow przypadku pająków obserwuje się wiele przy-stosowań behawioralnych oraz fizjologicznych.Zagadnienia te zostały stosunkowo dobrze opi-sane w literaturze przedmiotu i generalnie nieodbiegają od reakcji cechujących inne organi-zmy ektotermiczne (NENTWIG, 1987; FOELIX,1996). Bezkręgowce te wybierają na przykładmiejsca o sprzyjających warunkach termicznych,odpowiednio ustawiając ciało względem pa-dających promieni słonecznych czy w warun-kach silnego nasłonecznienia, zmieniając barwęciała. Temperatura też jest czynnikiem, którywywiera bezpośredni wpływ na rozrodczość,w tym na czas dojrzewania osobników (LI,1995; LI, JACKSON, 1996), produkcję jaj (ZHAO,1984; LI, 1995) czy też przeżywalność pająków(LI, 2002). Czynnik termiczny oddziałujew istotny sposób na liczbę linień, które pająkprzechodzi przed osiągnięciem dojrzałości płcio-wej. W wyższej temperaturze częstotliwość li-nienia jest mniejsza niż w niższej, w której dlaosiągnięcia tego samego etapu rozwoju postna-talnego wymagane jest częstsze linienie (LI,2002). Wysoka temperatura skraca czas życiadorosłych osobników oraz zmniejsza liczbę jajprodukowanych przez samice (LI, JACKSON,1996).

Pająki często są narażone na okresowy niedo-bór pokarmu w ich środowisku bytowania, toteżwykazują dużą tolerancję na taki czynnik streso-wy. Dotychczasowe prace zajmujące się tym za-gadnieniem skupiały się głównie na behawioral-nych i fizjologicznych przystosowaniach doprzetrwania okresu głodu, w mniejszym stopniukoncentrując się na komórkowych konsekwen-

cjach tego zjawiska. Udokumentowano, że tole-rancja okresu głodu u pająków zależy od poryroku (NAKAMURA, 1987), stadium rozwojowegooraz płci (TANAKA, ITO, 1982; NENTWIG, 1986;1987; WISE, 1993). Dorosłe samice aktywniepolującego pająka Lycosa lenta przeżywały na-wet 208 dni bez pożywienia, co stanowiło aż90% średniej długości życia dobrze odżywia-nych osobników. Z kolei osobniki pająków sie-ciowych Filistata hibernalis (Filistatidae) w po-dobnych warunkach przeżywały 305 dni bez po-karmu (ANDERSON, 1974). Już po kilku dniachgłodzenia dochodziło do wyraźnego zmniejsze-nia masy ciała pająków jako wyraz redukcji za-legającego w jelicie spożytego pokarmu (NEN-

TWIG, 1987). W ciągu 140 dni głodzenia Lycosalenta traciła 33% masy, a długość jej opistoso-my skracała się z 8,1 mm do 6,3 mm. W tychsamych warunkach F. hibernalis traciła 41%swej masy, odwłok zaś ulegał skróceniu z 7,1mm do 5,5 mm. Interesujący jest fakt, że pod-czas głodzenia nie zmieniała się długość proso-my pająków (ANDERSON, 1974).

Podczas głodu następują ilościowe zmianysubstancji zapasowych w komórkach trawien-nych. Najistotniejsze to obniżenie w nich pozio-mu glikogenu i lipidów. Obserwowano takżezmiany morfologiczne w postaci zwiększenialiczby wakuol wydzielniczych, które wypełniaływiększą część komórki. Nie jest wykluczone, żezmiany te były wynikiem autofagii, która w ko-mórkach jest aktywowana między innymi w od-powiedzi na niedobór czynników odżywczych.Wakuole pokarmowe występowały rzadko i czę-sto były zdegenerowane. Jądro komórkowe, mi-tochondria i retikulum endoplazmatyczne pozo-stawały w wyniku głodzenia nie zmienione.W warunkach niedoboru pokarmu nie wykrytoistotnych różnic w komórkach sekrecyjnych, na-tomiast w tkance pośredniej znacząco malałailość kropel tłuszczu (LUDWIG, ALBERTI, 1988 b).

Sposobem na radzenie sobie z brakiem po-karmu jest zastosowanie strategii „siedź i cze-kaj”. Strategia ta stanowi pewne rozwiązanieproblemu dzięki przeczekaniu w bezruchu okre-su głodu, aż do pojawienia się ofiary. Taka tak-tyka umożliwia przetrwanie, ogranicza zużycieenergii i jest alternatywą dla poszukiwania no-

173 Komórkowe...

wego środowiska życia (WISE, 1993). Podczasdługiego okresu głodu niemal ustaje aktywnośćruchowa pająków, a zmagazynowana energiajest wykorzystywana do podtrzymania podsta-wowej przemiany materii (NAKAMURA, 1987).W przypadku długotrwałego braku pokarmupająki, aby przeżyć, nie powiększają rozmiarówciała. Jednak pomimo tak niekorzystnych wa-runków mogą się nadal rozmnażać, chociaż licz-ba i masa składanych jaj są niskie. Opróczobniżonej płodności, w przypadku małych i nie-dożywionych samic, stwierdzono także opóźnie-nie okresu wytwarzania kokonów (NAKAMURA,1987; WISE, 1993).

W ciągu kilku dni od rozpoczęcia głodzeniaszybko spada tempo respiracji, po czym stabili-zuje się na niezmiennym poziomie. Redukcjatempa metabolizmu u pająków zwykle nie prze-kracza 40—60% wartości notowanych dlazwierząt karmionych regularnie, osiągając niż-sze wartości u samic niż u samców (ANDERSON,1974; GREENSTONE, BENNETI, 1980; TANAKA, ITO,1982). W przypadku głodującej Lycosa pseudo-annulata tempo metabolizmu obniża się o 17%,podczas gdy w przypadku innego gatunku po-gońcowatych, Pardosa astrigera, redukcja tempametabolizmu sięga 63% u samic i 48% u sam-ców (TANAKA, ITO, 1982). U pająka sieciowegoF. hibernalis tempo respiracji maleje maksymal-nie o 40% (ANDERSON, 1974).

Ważnym ograniczeniem dla pająków jest nietylko całkowity brak pokarmu, lecz także słabozróżnicowana dieta. Badania wskazują, że za-równo dla pająków sieciowych (ZHAO, 1988), jaki niebudujących sieci (GREENSTONE, 1979; UETZ

i in., 1992) ważna jest dieta urozmaicona, w któ-rej można znaleźć różne gatunki ofiar. W przy-padku przedstawicieli rodziny Lycosidae wyka-zano na przykład wzrastającą śmiertelnośćw warunkach laboratoryjnych, gdy dieta opierałasię tylko na muszkach D. melanogaster, ponie-waż w ciele tych ofiar brak jest kwasu linolowe-go i linolenowego, które są niezbędne do pra-widłowego rozwoju pająków (UETZ i in., 1992).

1.3. Komórkowe reakcje na stres

Chociaż koncepcję stresu można rozważać naróżnych poziomach organizacji biologicznej, tonajbardziej powszechne ujęcie tego problemudotyczy indywidualnego organizmu. Jak zapre-zentowano w poprzednich rozdziałach, w litera-turze przedmiotu opisano behawioralne i fizjolo-giczne reakcje pająków na działanie wielu czyn-ników stresogennych, jednak komórkowe reakcjena stres u tych drapieżników poznano w ograni-czonym zakresie.

Stresory, w zależności od rodzaju, siły i cza-su oddziaływania, mogą powodować określonedysfunkcje na poziomie komórkowym, któreklasyfikuje się w skali trzystopniowej (KORS-

LOOT, 2002). Są to:— niewielkie uszkodzenia, które mogą być re-

perowane przez komórkowy system obrony,dzięki czemu całkowicie zostaje przywróco-na homeostaza komórki;

— uszkodzenia w stopniu średnim, które dziękimechanizmom naprawczym częściowo zo-stają usunięte, komórka pozostaje żywa, leczjej kondycja metaboliczna jest obniżona;

— duży stopień uszkodzeń, czego efektem jestzahamowanie procesów metabolicznych i/lubutrata integralności organelli komórkowych,co prowadzi komórkę do śmierci.

Skutki oddziaływania czynników stresowychnajszybciej pojawiają się na poziomie moleku-larnym i dotyczą zmian w syntezie polipepty-dów, utleniania i denaturacji struktur białko-wych, utleniania lipidów i nukleotydów (efektpierwszorzędowy), uszkodzenia błon, DNA, mi-krofilamentów, zaburzeń procesu oddychaniawewnątrzkomórkowego i produkcji energii(efekt drugorzędowy). Konsekwencją tychzmian jest rozpad struktur komórkowych i zaha-mowanie procesów metabolicznych (efekt trze-ciorzędowy).

Uszkodzenia spowodowane działaniem stre-sorów środowiskowych uruchamiają reakcje na-prawcze (np. detoksykacyjne, antyoksydacyjne),które całkowicie lub częściowo przywracają ho-meostazę komórkową. W tym drugim przypadkukomórka pozostaje żywa, lecz jej kondycja me-

18

taboliczna jest obniżona. W skrajnych przypad-kach, gdy stopień uszkodzenia jest duży, komór-ka ginie, m.in. na drodze apoptozy lub nekrozy(KORSLOOT, 2002).

W kolejnych podrozdziałach zostaną omówio-ne niektóre biomarkery, które mogą być mie-rzone u zwierząt w celu oceny efektów od-działywania czynników stresogennych, zarównonaturalnych jak i antropogennych, na procesymetaboliczne zachodzące w komórkach.

1.3.1. Systemy antyoksydacyjne

Stres oksydacyjny oznacza sytuację, w którejprodukcja reaktywnych form tlenu (RFT) prze-kracza możliwość ich unieczynniania oraz zdol-ność naprawy uszkodzonych struktur komórko-wych. Ten rodzaj stresu występuje w wielu sytu-acjach, zwykle w wyniku ekspozycji komórek,tkanek czy organizmów na dodatkowe źródłaRFT bądź zwiększenie tempa ich endogennejprodukcji. W takim ujęciu prooksydacyjny cha-rakter wykazują stresory antropogeniczne, naprzykład metale (KANG, 1997; LAGADIC, 1999;PULIDO, PARRISH, 2003), pestycydy (MASOUD

i in., 2003), policykliczne węglowodory aroma-tyczne (PAH) (CRUZ-RODRIGUEZ, CHU, 2002),polichlorowane bifenyle (PCB) (RODRIGUEZ--ARIZA i in., 2003), oraz stresory naturalne, takiejak skrajne warunki termiczne (GORMAN i in.,1999) czy brak pokarmu (głodzenie) (PASCUAL

i in., 2003; MORALES i in., 2004).Wzrost stężenia reaktywnych form tlenu (np.:

anionorodniki ponadtlenkowe, nadtlenek wodo-ru, rodniki hydroksylowe, rodniki wodoronad-tlenkowe, ozon) uszkadza biologiczne makro-molekuły: kwasy nukleinowe, białka, lipidy,a oksydacyjnie zmodyfikowane cząsteczki zabu-rzają prawidłowe funkcje komórek, co może do-prowadzić do ich śmierci (RODRIGUEZ-ARIZA

i in., 2003). W komórkach powszechnie wystę-pują jednak elementy systemu obrony antyoksy-dacyjnej, którymi zarówno w przypadku krę-gowców, jak i bezkręgowców są m.in. dysmuta-za ponadtlenkowa (SOD) i katalaza (CAT), jak

również glutation (GSH) i enzymy związanez metabolizmem tego tripeptydu (peroksydazyglutationowe — selenozależna, GPOX i nieza-leżna od selenu GSTPx; S-transferaza glutatio-nowa, GST) (AHMAD i in., 1989; AHMAD, 1995;O’BRIEN, TEW, 1996; VAN BLADEREN, 2000;FERNANDEZ-CHECA, 2003).

Stosunkowo niewiele informacji na temat an-tyoksydacyjnych reakcji obronnych zgromadzo-no dla pająków, szczególnie w odniesieniu dokontrolowanego działania czynników stresogen-nych o różnym charakterze. Większość infor-macji pochodzi z badań prowadzonych na osob-nikach odłowionych bezpośrednio z terenu. Wy-nika z nich, że w warunkach środowiskazanieczyszczonego metalami reakcje antyoksy-dacyjne tych drapieżników, podobnie jak i inneenzymatyczne reakcje detoksykacyjne, są gatun-kowo specyficzne (WILCZEK, 2005; WILCZEK

i in., 2003; 2004; 2007). Pająki tunelowe A. la-byrinthica (Agelenidae) z terenów silnie zanie-czyszczonych cynkiem i ołowiem (rejon olkuski)charakteryzował wysoki poziom GPOX i GSTPxoraz wysokie stężenie glutationu w tkankach.W tych samych warunkach pająki niebu-dujące sieci P. lugubris (Lycosidae) cechowałoniższe stężenie GSH i niższa aktywność GPOXi GSTPx niż notowane u pająków sieciowych(WILCZEK i in., 2004). Także z badań na innymprzedstawicielu rodziny Lycosidae, P. palustris,wynika, że wysokie stężenia Zn, Pb i Cd w cieleosobników tego gatunku korelowały z wysokąaktywnością CAT. Z kolei osnuwik L. triangula-ris (Linyphiidae) cechował się nasileniem reak-cji antyoksydacyjnych związanych z aktywno-ścią SOD i CAT, przy niskiej kumulacji metali(WILCZEK, MIGULA, 1996). W warunkach silnegozanieczyszczenia u przedstawicieli wymienio-nych rodzin pająków notowano nasilanie proce-sów enzymatycznej biotransformacji ksenobioty-ków (MARCZYK i in., 1993; VIARENGO, 1989,WILCZEK, MIGULA, 1995; WILCZEK i in., 1997).Dla pająków aktywnie polujących (P. palustris)znamienna była zarówno aktywizacja procesówhydrolizy, katalizowanych przez karboksyloeste-razy (CarE), jak i reakcje sprzęgania angażu-jące GST, gdy tymczasem u pająków sieciowychL. triangularis było to głównie nasilenie reakcji

193*

katalizowanych przez S-transferazy glutationo-we (WILCZEK, MIGULA, 1996; WILCZEK, 1996;WILCZEK i in., 2003). Dotychczasowe badaniawskazują ponadto, że reakcja na stres spowo-dowana życiem w środowisku chronicznie ska-żonym metalami ciężkimi różni samice od sam-ców. Ważnym elementem obrony przed wy-sokim stężeniem metali ciężkich i ichprooksydacyjnymi konsekwencjami jest u sam-ców glutation (GSH), podczas gdy w enzyma-tycznej obronie antyoksydacyjnej uczestniczykatalaza (CAT). Z kolei reakcje antyoksydacyj-ne samic różnych gatunków opierają się zarów-no na zwiększonej aktywności peroksydaz glu-tationowych, jak i katalazy, chociaż poziomtych enzymów jest gatunkowo zróżnicowany(WILCZEK i in., 2007). Nie jest wykluczone, żesamice w warunkach wzmiankowanego wcześ-niej większego narażenia na zanieczyszczeniadla zabezpieczenia materiału genetycznegoi swoich możliwości reprodukcyjnych są w sta-nie wykorzystywać różnorodne mechanizmy de-toksykacyjne, nawet kosztowne energetycznie.

1.3.2. Apoptoza i nekrozajako biomarkery stresu

W warunkach fizjologicznych mechanizmapoptozy odpowiada za zachowanie właściwejrównowagi między intensywnością proliferacjia tempem usuwania uszkodzonych lub zbędnychkomórek (ZAKERI, LOCKSHIN, 2002). Zaburzeniaprzebiegu tego procesu wymuszone na przykładstresorami środowiskowymi mogą zmniejszaćkondycję fizjologiczną danego narządu i w osta-teczności całego organizmu. Apoptozę uważasię obecnie za wrażliwy i wczesny wskaźnikchronicznie działającego stresu (PIECHOTTA i in.,1999; SWEET i in., 1999). Do programowanejśmierci dochodzi, gdy komórka po zadziałaniuokreślonych endo- lub egzogennych bodźcówuruchamia mechanizmy prowadzące do jej sa-mounicestwienia. Proces ten mogą stymulowaćróżnorodne czynniki, na przykład promieniowa-nie (SINGH, 2000), temperatura (GORMAN i in.,

1999), substancje chemiczne (RUDOLF, CERVIN-

KA, 2006) czy niedobór substratów do procesówmetabolicznych (KIESSLICH i in., 2005). Komór-ka wchodząca na drogę apoptozy podlega okre-ślonym zmianom morfologicznym i biochemicz-nym. Mechanizmy dotyczące tego zagadnieniaszeroko omówiono w wielu przeglądowychopracowaniach głównie dotyczących kręgow-ców (np. KŁYSZEJKO-STEFANOWICZ, 2002; BÖHM,SCHILD, 2003). W przypadku zwierząt bezkręgo-wych poznano je w mniejszym stopniu. Mimoże ciągle odkrywa się nowe fakty tłumaczącemechanizmy obserwowanych zjawisk, to naj-więcej danych zgromadzono dla muszki owoco-wej D. melanogaster i nicienia Caenorhabditiselegans (SESHAGIRI, MILLER, 1997; LEE, BAEH-

RECKE, 2000).Szczególnie mało jest informacji na temat

mechanizmów apoptozy u pająków. Odsetek ko-mórek apoptotycznych rejestrowany techniką cy-tometrii przepływowej w gruczołach jelita środ-kowego dorosłych samic pogońcowatych P. lu-gubris i lejkowców A. labyrinthica (WILCZEK,2005) wskazuje, że był on blisko dziesięciokrot-nie niższy w porównaniu z wartościami, któremetodami histologicznymi stwierdzono w wątro-botrzustce ślimaka winniczka Helix pomatia(1,1%) (CHABICOVSKY i in., 2004), ale ponad10-krotnie wyższy od poziomu, który wykazanow wątrobie myszy (0,01%) (CHABICOVSKY i in.,2003). Wskazuje to, że stopień zmian apopto-tycznych, który nieindukowany dodatkowymiczynnikami, jest specyficzny gatunkowo i możezależeć od ogólnej aktywności metabolicznejdanego narządu. W badaniach dotyczących ge-netycznej kontroli programowanej śmierci ko-mórkowej tylko w przypadku jednego gatunkupająka, Araneus ventricosus, opisano klonowa-nie i filogenezę cDNA kodującego homologDAD1 (defender against apoptotic cell death 1).Białko to hamowało apoptozę w odpowiedzi natemperatury niską i wysoką, na które ekspono-wano osobniki wymienionego gatunku (LEE

i in., 2003). Podobną rolę DAD1 wykazano u in-nych gatunków zwierząt na przykład w komór-kach linii tsBN7 chomika, nicienia C. elegansczy w komórkach ludzkich, a w przypadku ro-ślin u rzodkiewnika pospolitego Arabidopsis

20

thaliana (NAKASHIMA i in., 1993; SUGIMOTO i in.,1995; GALLOIS i in., 1997). Sugerowana sekwen-cja aminokwasów budujących białko DAD1w przypadku Araneus ventricosus była w 75,4%i 74,6% homologiczna z podobnym białkiemopisanym odpowiednio u muszki D. melanoga-ster i żaby szponiastej Xenopus laevis orazw 73,1% homologiczna z białkiem znalezionymu ssaków: Homo sapiens, Sus scrofa, Mesocri-cetus auratus, Rattus norvegicus i Mus muscu-lus (LEE i in., 2003).

Potencjalnymi stymulatorami śmierci komór-kowej mogą być m.in. czynniki zwiększające ry-zyko generowania reaktywnych form tlenu(RFT) (MIZUTANI i in., 2002; PULIDO, PARRISH,2003; SREEDHAR, CSERMELY, 2004). W zależnościod stężenia RFT w komórce podejmowana jestdecyzja o rodzaju śmierci na drodze apoptozylub nekrozy (RAFFRAY, COHEN, 1997). Apoptozazachodzi zwykle w następstwie stresu oksyda-cyjnego o mniejszym nasileniu, w odróżnieniuod nekrozy, którą stymuluje silny stres oksyda-cyjny (COURTIN i in., 2002; PROSKURYAKOV i in.,2003). Podstawowym czynnikiem determi-nującym rodzaj śmierci komórkowej w odpowie-dzi na stres oksydacyjny jest poziom wewnątrz-komórkowego stężenia ATP, wykorzystywanegowe wszystkich szlakach aktywacji kaspaz, enzy-mów proteolitycznych kontrolujących apoptozę(RICHTER i in., 1996). Sugeruje się, że niskie stę-żenia reaktywnych form tlenu, przejściowozmniejszające stężenie ATP, prowadzą komórkido śmierci na drodze apoptozy, gdy tymczasemwysokie stężenia nadtlenku wodoru, trwale ob-niżając zasoby wewnątrzkomórkowego ATP, sąprzyczyną śmierci nekrotycznej (GARDNER i in.,1997; LEIST i in., 1997). Jak wynika z badańLEIST i in. (1999), utrzymanie stężenia ATPw komórkach na poziomie przekraczającym 50%wartości wyjściowych jest wystarczające, abyspowodować przekierowanie komórki ze szlakuśmierci nekrotycznej w kierunku śmierci apopto-tycznej. Uważa się także, że przejście w kierun-ku przeciwnym, tzn. od apoptozy do śmierci ne-krotycznej może wynikać z obniżenia się stęże-nia ATP w wyniku aktywacji poli(ADP-rybozy)polimerazy (PARP), która podczas apoptozy jestsubstratem kaspazy-3 i kaspazy-7 (HERCEG,

WANG, 2001). Śmierć komórki na drodze apop-tozy może się zmieniać w formę śmierci nekro-tycznej także w wyniku bezpośredniegohamowania aktywności kaspaz. Równieżi w tym mechanizmie zwrócono uwagę na ha-mującą rolę wzrastającego stężenia H2O2, któryutleniał grupy tiolowe aminokwasów w centrumaktywnym wymienionych enzymów (SAMALI

i in., 1999; CHANDRA i in., 2000), co opóźniałolub całkowicie uniemożliwiało zajście wymie-nionego procesu (HAMPTON, ORRENIUS, 1997;HAMPTON i in., 2002; PRUSKI, DIXON, 2002).

Dotychczasowe badania wskazują na strate-giczną rolę mitochondriów w inicjacji śmiercikomórkowej (BORUTAITE, BROWN, 2003; FERNAN-

DEZ-CHECA, 2003; KROEMER, 2003; ORRENIUS,2004). W dużym uproszczeniu, we wczesnychetapach tego procesu dochodzi do otwieraniaporów mitochondrialnych, tzw. megakanałów,w wyniku zmniejszenia się stosunku ATP/ADPi/lub obniżenia poziomu NAD(P)H i zredukowa-nego glutationu, obniżenia się potencjałutransbłonowego mitochondrium (∆Ψm) oraz mo-dyfikacji składu macierzy mitochondrialnej,w tym wzrostu w niej stężenia Ca2+ (DESAGHER,MARTINOU, 2000; PARONE i in., 2002; LECEOUR

i in., 2004). W kolejnych etapach następujeuwolnienie międzybłonowych protein, na przy-kład cytochromu c, rozpoczynających ostatecznąfazę apoptotycznej kaskady (GUPTA, 2001; PARO-

NE i in., 2002). Uwolnienie cytochromu c akty-wuje białko Apaf-1 (cytozolowe białko adapto-rowe) do utworzenia oligomerycznego kom-pleksu — apoptosomu, który aktywujekaspazę-9, prowadząc do aktywacji kaskady ka-spaz i/lub dokonuje proteolizy białek komórko-wych (SREEDHAR, CSERMELY, 2004). W przypad-ku nicienia C. elegans homologiem Apaf-1 jestbiałko Ced-4, które nie zawiera sekwencji inhi-bitorowych i do aktywacji nie wymaga cyto-chromu c (BOSSY-WETZEL, GREEN, 1999), pod-czas gdy u owadów cytochrom c pełni funkcjępodobną do funkcji u ssaków, chociaż nie jestuwalniany do cytoplazmy i ulega zmianom kon-formacyjnym w mitochondrium (RODRIGUEZ

i in., 1999).Wśród dominujących czynników uruchamia-

jących mitochondrialny szlak śmierci wymienia

21

się reaktywne formy tlenu. Proapoptotyczny me-chanizm działania, na przykład H2O2, prawdopo-dobnie opiera się na blokowaniu przepływu elek-tronów na poziomie reduktazy NADH-Q (kom-pleks NADH-dehydrogenaza; kompleks I)w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, cow ostateczności prowadzi do formowania anio-norodników ponadtlenkowych, które spontanicz-nie lub w obecności SOD zwiększają pulę H2O2(VIDEIRA i in., 2001; MIZUTANI i in., 2002;TADA-OIKAWA i in., 2003). Powstający nadtlenekwodoru jest w stanie otwierać megakanały i in-dukować zmiany ∆Ψm, uruchamiając kolejne eta-py apoptozy. Spadek ∆Ψm poniżej wartości po-tencjału bramkującego kanały może być pierw-szym sygnałem wejścia na drogę śmierciprogramowanej (ZAMZAMI i in., 1995). Wedługniektórych badaczy, spadek potencjału błonowe-go mitochondriów pojawia się dopiero po ekspo-zycji fosfatydyloseryny na powierzchni zew-nętrznej błony komórkowej komórek (CASTEDO

i in., 1995; DENECKER i in., 2001). Zmiany ∆Ψmnastępują prawie równocześnie we wszystkichmitochondriach danej komórki (ZAMZAMI i in.,1995; MARZO i in., 1998), ponieważ sygnały(Ca2+, cytochrom c, kaspazy) powstające w poje-dynczym mitochondrium mogą się przenosić nainne mitochondria. Długotrwałe utrzymywaniesię niskiego potencjału mitochondrialnego jestwskaźnikiem wchodzenia komórek w procesapoptozy. Jeśli depolaryzacja dotyczy pojedyn-czych mitochondriów, to są one rozpoznawanejako nieprawidłowe i podlegają zjawisku auto-fagii. Spadek potencjału mitochondrialnegow większej liczbie tych organelli doprowadzazwykle do uwolnienia cytochromu c i AIF(czynnik indukcji apoptozy), a przy odpowied-nim stężeniu ATP także do aktywacji kaspaz.Gwałtowne załamanie się wartości potencjałubłonowego w większości mitochondriów komór-ki, wyczerpywanie się ATP, prowadzi do nekro-zy. Udokumentowano, że w przypadku, gdy po-nad 90% mitochondriów komórki ma wysoki∆Ψm, taka komórka cechuje się znaczną wy-dolnością energetyczną (LECOEUR i in., 2004).Dlatego też pomiar zmian potencjałów mito-chondrialnych (∆Ψm) jest uważany za dobry wy-znacznik kondycji energetycznej i fizjologicznej

zarówno pojedynczych komórek, tkanek, jaki całych narządów (TIANO i in., 2001; SALEH i in.,2003), może też być wykorzystywany w bada-niach ekotoksykologicznych jako efektywny bio-marker wczesnych, subkomórkowych skutkówoddziaływania substancji chemicznych. Wykaza-no na przykład, że rejestracja zmian potencjałumitochondrialnego po zastosowaniu niskich da-wek związków fosforoorganicznych pozwalawychwycić zaburzenia funkcji mitochondriówpomimo braku wyraźnego hamowania AChE(VIDEIRA i in., 2001). W obecnie stosowanychmetodach do pomiaru ∆Ψm wyzyskuje się lipofi-lowe, kationowe barwniki fluorescencyjne, któremają właściwość gromadzenia się w macierzymitochondrialnej. Do najczęściej stosowanychnależą takie, jak: rodamina 123 (MEDINA i in.,2002), jodek 3,3’-diheksylooksokarbocyjanku(DiOC613) (ROTTENBERG, WU, 1998) czy 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’tetraetylobenzoimidazo-lokarbocyjanek (JC-1) (SALVIOLI i in., 1997).

Większość typowych dla apoptozy zjawiskjest konsekwencją aktywacji kaspaz — proteazcysteinowych, stąd tendencja do identyfikowaniaapoptozy kaspazozależnej z tymi enzymami.Obecność kaspaz potwierdzono zarówno u krę-gowców (RAFFRAY, COHEN, 1997; HAMPTON i in.,2002), jak i u organizmów bezkręgowych (CIKA-

LA i in., 1999; DAISH i in., 2004). Jednak wyka-zano także możliwość śmierci apoptotycznej nadrodze niezależnej od tych enzymów (LEIST,JÄÄTTELÄ, 2001; LOCKSHIN, ZAKERI, 2002; KURA-

NAGO, MIURA, 2007). Ekspresja kaspaz następujew formie nieaktywnych proenzymów, które sąproteolitycznie przekształcane, tworząc aktywnetetrametry (STENNICKE, SALVESEN, 2000). W ka-talizie ataku proteolitycznego na określone sub-straty, kaspazy wykorzystują cysteinę centrumaktywnego oraz dokonują ich cięcia zawsze poreszcie kwasu asparaginowego. Wykazano, żecysteina centrum aktywnego jest szczególniepodatna na utlenianie lub alkilację grupy tiolo-wej (NOBEL i in., 1997). Interesujące jest, że ko-mórki nie mające kaspaz giną głównie na drodzenekrozy, w odróżnieniu od komórek, w którychekspresja wymienionych enzymów kieruje ko-mórkę na szlak apoptozy (KOLENKO i in., 1999).Potwierdzają to m.in. rezultaty badań uzyskane

22

na myszach, u których brak kaspazy-3 i kaspa-zy-9 kierował komórki w kierunku śmierci ne-krotycznej (OPPENHEIM i in., 2001). W pracachpodkreśla się wrażliwość wymienionych enzy-mów na reaktywne formy tlenu, głównie nadtle-nek wodoru, dla którego wykazano inhibicyjnąrolę w odniesieniu na przykład do kaspazy-3(HAMPTON, ORRENIUS, 1997; BORUTAITE, BROWN,2001; HAMPTON i in., 2002).

Ważnym, komórkowym antyoksydantem, któ-ry pozwala utrzymać wymienione enzymy w ichaktywnej formie, jest glutation (HAMPTON, ORRE-

NIUS, 1997). Obniżenie stężenia tego tripeptydumoże osłabiać obronne mechanizmy antyoksy-dacyjne komórki i kierować je na szlaki śmiercinekrotycznej (JACOBSON, 1996; VAN DEN DOBBEL-

STEEN i in., 1996).Zgodnie z powszechnie panującą opinią, ne-

kroza jest skutkiem pasywnej degeneracji i prze-jawem patologii, dlatego uważa się, że nie sta-nowi żadnego mechanizmu adaptacyjnego. Nie-którzy badacze są jednak zdania, że w pewnychprzypadkach potrzebna jest silna reakcja zapal-na, na przykład gdy konieczna jest mobilizacjaukładu immunologicznego. W takiej sytuacjiuruchomienie szlaku nekrozy jest zjawiskiempozytywnym, a nawet pożądanym (PROSKURYA-

KOV i in., 2003). Śmierć komórek na drodze ne-krozy, w odróżnieniu od apoptozy, stanowi pro-ces przypadkowy i bierny. Proces ten obejmujecałe zespoły komórek. Zachodzi pod wpływemróżnorodnych czynników fizycznych, chemicz-nych i biologicznych, które w bardzo krótkimczasie doprowadzają do ciągu zmian morfolo-gicznych, utraty kontroli ciśnienia osmotycznegoi pęcznienia komórek (RAFFRAY, COHEN, 1997;PROSKURYAKOV i in., 2003). Napływające downętrza komórki jony Ca2+ aktywują nukleazy,dokonujące niespecyficznej degradacji DNAw przypadkowych miejscach chromatyny (SUN

i in., 1994). W późniejszych etapach nekrozyjest obserwowane pęcznienie mitochondriów,utrata ciągłości błon plazmatycznych oraz wy-ciek zawartości komórek, łącznie ze składnika-mi lizosomów, do przestrzeni pozakomórkowej(RAFFRAY, COHEN, 1997). Produkty rozpadu wy-zwalają odpowiedź komórek systemu immunolo-gicznego, których masowa migracja prowadzi do

wystąpienia ostrej reakcji zapalnej i częstouszkadza przyległe tkanki. Uruchomienie ścież-ki nekrozy może wynikać z obecności endo- lubegzogennych inhibitorów kaspaz czy braku eks-presji tych białek. Stymulację nekrozy przez za-hamowanie aktywności kaspaz wywoływano,stosując na przykład promieniowanie czy okre-ślone substancje chemiczne (HIRSCH i in., 1997;SANE, BERTRAND, 1999; COELHO i in., 2000). Po-dobny efekt uzyskiwano w wyniku zastosowa-nia NO, który hamował kaspazę-7 i kaspazę-3,przekierowując komórki ze ścieżki śmierci apo-ptotycznej na ścieżkę nekrotyczną, pomimo za-awansowanych etapów tej pierwszej (LEIST i in.,1999). Obecnie mało wiadomo na temat, w jakisposób kaspazy inicjują nekrozę, wydaje sięjednak, że ich rola polega na przekazywaniusygnałów innym proteazom uczestniczącymw tym procesie (PROSKURYAKOV i in., 2003).

Podsumowując, o podjęciu decyzji na tematsposobu śmierci komórki na drodze apoptozyczy nekrozy może decydować poziom stresuoksydacyjnego. Indukcja apoptozy następuje,gdy komórki są w stanie utrzymać swewłaściwości redukcyjne względem reaktywnychform tlenu, nekroza zaś zachodzi wówczas, gdyta homeostaza zostaje zaburzona na przykładw wyniku nadmiernego stresu lub uszkodzeniakomórkowych systemów antyoksydacyjnych(PROSKURYAKOV i in., 2003). Wzajemne relacjemiędzy elementami obrony antyoksydacyjneja konsekwencjami stresu ocenianego ilościowy-mi zmianami komórek apoptotycznych i/lub ne-krotycznych mogą stanowić źródło informacjio kondycji metabolicznej narządu, pozwalającprzewidywać losy budujących go komórek.

1.3.3. Białka szoku cieplnego (Hsp)

oraz metalotioneiny (Mt)

jako czynniki antyoksydacyjne

i antyapoptotyczne

Szeroko rozumiane białka stresu, w tymbiałka szoku termicznego (Hsp) (PARCELLIER

23

i in., 2003) i metalotioneiny (Mt) (SATO, BREM-

NER, 1993; BERNTSSEN i in., 2001; PARK i in.,2001) mogą spełniać funkcję antyoksydacyjną,co wykazano w wielu grupach zwierząt. Induk-cja wymienionych białek w warunkach działaniaokreślonych czynników stresogennych zostałaudokumentowana u zwierząt zarówno w bada-niach laboratoryjnych (BERNTSSEN i in., 2001;PARK i in., 2001; CHABICOVSKY i in., 2004), jaki terenowych (KÖHLER i in., 1999 a; 1999 b; CAR-

PENTER, HOFMANN, 2000; HAMER i in., 2004).

1.3.3.1. Białka szoku cieplnego (Hsp)

Wysoce konserwatywne białka szoku ter-micznego Hsp w warunkach fizjologicznychfunkcjonują jako ATP-zależne cząsteczkowechaperony, wspomagając fałdowanie nowo zsyn-tezowanych polipeptydów, składanie komplek-sów multiproteinowych i transport białek w po-przek błon biologicznych (VAYSSIER, POLLA,1998; PARCELLIER i in., 2003) oraz uczestniczącw procesach proliferacji komórek (HELMBRECHT

i in., 2000). Badania prowadzone w warunkachin vitro i in vivo wskazują na zwiększoną pro-dukcję białek Hsp jako wyraz ochrony przedzniszczeniem komórek wywołanym działaniemczynników stresogennych. W odpowiedzi nastres możliwa jest indukcja pięciu dużych klasbiałek Hsp: 27, 60, 70, 90, 104, a regulacja tegoprocesu odbywa się na poziomie transkrypcyj-nym przez czynniki szoku termicznego (HSF)(SREEDHAR, CSERMELY, 2004). Cytoprotekcyjnafunkcja Hsp jest związana z ochroną białekprzed denaturacją, reperacją uszkodzeń czy de-gradacją nieprawidłowo zsyntezowanych poli-peptydów (WELCH, 1992).

Niektórzy badacze proponują, aby białkaHsp70 uznać za biomarkery szeroko rozumiane-go stresu, w tym wywołanego toksycznym od-działywaniem związków chemicznych. Wzrostekspresji Hsp70 wykazano m.in. w odpowiedzina działanie metali (Cd, Pb, Zn), na przykładu Onsicus asselus (Isopoda) (ECKWERT i in.,1994; 1997), Deroceras reticulatum (Mollusca)

(KÖHLER i in., 1996), Orchesella bifasciata i To-mocerus flavescens (Collembola) (KÖHLER i in.,1999 a) czy Eisenia fetida (Lumbricidae)(REINECKE, REINECKE, 2003). Podobne efektywywoływały związki organiczne, na przykładpestycydy fosforoorganiczne (chloropyrifos)u D. melanogaster (Diptera) (NAZIR i in., 2001),benzo α-piren czy polichlorowane bifenyleu Onsicus asselus (Isopoda) (KÖHLER i in.,1999 b) i u Julus scandinavius (Diplopoda)(ZANGER, KÖHLER, 1996). Stymulację syntezybiałek szoku termicznego rejestrowano zarównou bezkręgowców, jak i kręgowców eksponowa-nych na podwyższoną temperaturę, na przykładu dżdżownicy Eisenia fetida (SANDERS i in.,1994) oraz łososia Salmo salmar (SMITH i in.,1999). Głodzenie nie wywierało natomiast wy-raźnego stymulującego efeku na syntezę wymie-nionych białek, na przykład u krocionogów Ju-lus scandinavius (ZANGER, KÖHLER, 1996), roz-toczy Tetranychus urticae (SHIM i in., 2006),czy myszy (DHAHBI i in., 1997).

Także badania prowadzone na pająkach po-twierdzają indukcję białek szoku termicznegow odpowiedzi na naturalne i chemiczne czynni-ki stresowe. Liczba komórek Hsp70 pozytyw-nych w gruczołach jelita środkowego pająkówA. labyrinthica i P. lugubris, wobec których za-stosowano stres łączony (wysoka temperaturai dimetoat), wzrosła prawie 9-krotnie w porów-naniu z wartościami kontrolnymi. Skutki od-dzielnego zastosowania stresorów były podobneu obu gatunków, lecz zakres zmian okazał sięwiększy u pająków sieciowych. W przypadkuA. labyrinthica był to średnio 5-krotny wzrostliczby komórek Hsp70 pozytywnych w odpo-wiedzi na szok termiczny i blisko 10-krotnywzrost po zastosowaniu pestycydu. Słabsza od-powiedź cechowała reprezentanta pająków nie-budujących sieci (P. lugubris), u którego wysokatemperatura powodowała dwukrotny wzrost licz-by komórek Hsp70 pozytywnych, związek che-miczny zaś wywoływał wzrost blisko 4-krotny(WILCZEK, 2005).

W warunkach stresu indukcja białek Hsp70jest szybka i odbywa się w przeciągu kilku mi-nut, co udokumentowano m.in. u D. melanoga-ster (LINDQUIST, 1986). Z kolei z badań SMITHA

24

i in. (1999) wynika, że u łososia S. salmar po-ziom Hsp70 osiągał maksimum po 2 godz. odzadziałania szoku termicznego. Natomiastu małży Dreissena polymorpha eksponowanychna Cu taki stan osiągany był po 24 godz. i miałtendencję do utrzymywania się (CLAYTON i in.,2000; KAROUNA-RENIER, ZEHR, 2003). Jak wska-zują badania prowadzone na D. melanogaster,stres zmienia komórkową lokalizację białekHsp70, których wyższe stężenie notowanogłównie w jądrze komórkowym i w jąderku, na-tomiast po zaprzestaniu działania czynnikówstresogennych w cytoplazmie, gdzie białka teuczestniczyły w procesach naprawczych (LIND-

GUIST, CRAIG, 1988). Niektórzy autorzy uważają,że najważniejszą funkcją białek Hsp70 podczasstresu jest utrzymanie integralności rybosomów(HARTL, 1996).

Cytoprotekcja indukowana przez Hsp70 możebyć właściwością związaną z hamowaniem apo-ptozy (SAMALI, ORRENIUS, 1998). Udokumento-wano bowiem liczne powiązania między induk-cją syntezy białek szoku termicznego a oporno-ścią komórek na ten rodzaj śmierci. Wykazano,że Hsp70 mogą hamować apoptozę wywołanąróżnorodnymi czynnikami stymulującymi, naprzykład szokiem termicznym, stresem oksyda-cyjnym, niedotlenieniem czy promieniowaniemUV (JÄÄTTELÄ, 1999). Mechanizm protekcyjnywymienionych białek w odniesieniu do proce-sów śmierci komórkowej nie został dobrze po-znany. W przypadku apoptozy wydaje się, żepolega on głównie na usuwaniu niepożądanychi zdenaturowanych białek oraz hamowaniu po-wstawania reaktywnych form tlenu będących in-duktorami tego procesu (SAMALI, ORRENIUS,1998; CARPENTER, HOFMANN, 2000). Potwierdzo-no udział Hsp70 w przeciwdziałaniu aktywacjikaspaz, jak również w hamowaniu efektów wy-nikających z działania już aktywnych kaspaz(PARCELLIER i in., 2003). Odbywa się to prawdo-podobnie na drodze bezpośredniego oddziaływa-nia Hsp70 z Apaf-1, co przeciwdziała werbowa-niu prokaspazy-9 do apoptosomu (BEERE,GREEN, 2001). Hsp70 hamują ponadto uwalnia-nie cytochromu c z mitochondriów i przeciw-działają zmianom jądrowym, towarzyszącymapoptozie (CREAGH i in., 2000; PARCELLIER i in.,

2003). Ważną funkcją tych białek jest uczestnic-two w utrzymywaniu stężenia ATP na właści-wym poziomie, lecz odbywa się to nie nadrodze ochrony samego ATP (RADFORD i in.,1996), lecz stabilizacji kompleksów mitochon-drialnych, co umożliwia syntezę tego związku(LIN i in., 2001).

Jak wskazują inne badania, Hsp70 mogą rów-nież działać ochronnie przeciw nekrozie wy-wołanej szokiem termicznym, stresem oksyda-cyjnym czy niedokrwieniem (ANGELIDIS i in.,1991; PLUMIER i in., 1995). Funkcja antynekro-tyczna Hsp70 prawdopodobnie wiąże się z ha-mowaniem kinaz JNK i p38, co opisano w wy-branych narządach ssaków w warunkach ich nie-dokrwienia (MA i in., 1999). Białka Hsp70powstające w komórkach nekrotycznych przy-puszczalnie są ważnym sygnałem dla systemuimmunologicznego (MELCHER i in., 1999). Obec-nie przypisuje się im rolę immunostymulatorai markera nekrozy (SRIVASTAVA, 2002).

Pomimo niewątpliwej funkcji ochronnej,białka Hsp70 w pewnych warunkach mogą prze-jawiać negatywne działanie na organizm. W ba-daniach na ssakach wykazano ich znaczącą rolęw stymulowaniu reakcji autoimmunologicznych.Jako przykład niech posłużą badania nad pato-genezą bielactwa, które wskazują, że podczasnadmiernego stresu białka te dostając się doprzestrzeni międzykomórkowej, gdy zostanąprzechwycone przez komórki dendrytyczne,wywołują odpowiedź immunologiczną przeciw-ko sobie. Wykazano ponadto, że opisywanebiałka mogą zwiększać ekspresję cząsteczek ad-hezyjnych ICAM-1 przez melanocyty (BOSSY,MANGA, 2004). Nadmierna aktywność białekszoku termicznego jest prawdopodobnie przy-czyną klinicznych objawów towarzyszących mu-kowiscydozie. Okazuje się, że mutacja genu ko-dującego białko CFTR, będące kanałem jono-wym komórek nabłonka, nie zmienia w sposóbdrastyczny transportu jonów przez błonę komór-kową. Usuwanie uszkodzonego białka CFTRprzez białka opiekuńcze może pogarszać stankliniczny pacjentów cierpiących na tę chorobę(WICKNER i in., 1999; ELLGARD i in., 1999). Niebez znaczenia jest również fakt, że Hsp70 jakonegatywne regulatory apoptozy mogą warunko-

254 Komórkowe...

wać oporność komórek nowotworowych na tenproces. Wykazano, że komórki poddane streso-wi termicznemu, pod wpływem którego docho-dziło do indukcji białek Hsp70, były oporne naapoptozę indukowaną lekami cytostatycznymiczy promieniowaniem UVC (SAMALI, COTTER,1996; BEERE, GREEN, 2001; BIELAK-ŻMIJEWSKA,2003).

1.3.3.2. Metalotioneiny (Mt)

Stres może także skutkować wzmożeniemsyntezy metalotionein (Mt) w komórkach. Me-talotioneiny to cytosolowe, niskocząsteczkowe(6—7 kD), bogate w cysteinę (30%) białka(DABRIO i in., 2002), których obecność potwier-dzono zarówno u kręgowców (YURKOW, DE

COSTE, 1999; VASAK, HASLER, 2000), bezkrę-gowców (HENSBERGEN i in., 2000; CHABICOVSKY

i in., 2003; MORGAN i in., 2004), jak i u roślin(ERNST, 1998). Metalotioneiny uczestniczą w ho-meostazie metali biogennych, na przykład Zni Cu (MATSUBARA i in., 1986; MASTERS i in.,1994; SUZUKI i in., 2002) oraz w eliminacji me-tali biologicznie zbędnych, na przykład Cd i Hg(BERGER i in., 1995; HENSBERGEN i in., 2000).

W przypadku kręgowców udokumentowanofunkcję ochronną Mt także wobec różnych czyn-ników powodujących stres oksydacyjny, jak: pro-mieniowanie jonizujące (MATSUBARA i in., 1987;KAGI, 1991), hiperoksja (HART i in., 1990) czyokreślone związki chemiczne, na przykład endo-toksyny czy saponiny (ISZARD i in., 1995). In-dukcja metalotionein następowała u tychzwierząt przede wszystkim w sytuacji wzra-stającego stężenia rodników hydroksylowych,anionorodników ponadtlenkowych oraz rodni-ków organicznych (SATO, BREMNER, 1993). Zaantyoksydacyjną funkcję Mt odpowiada prawdo-podobnie metionina, której przypisuje się funk-cję zmiatacza wolnych rodników tlenowych(THORNALLEY, VASAK, 1985; NORDBERG, 1998).W badaniach prowadzonych w warunkach in vi-tro wykazano, że poziom metalotionein w ko-mórkach HeLa niepoddanych działaniu czynni-

ków stresogennych był niski, jednakże szybko(w przeciągu 1 godz.) podwyższał się, gdy nakomórki działano stresorami chemicznymi, naprzykład cynkiem czy deksametazonem,i osiągał poziom blisko 10-krotnie wyższy niżw kontroli po 24 godz. od zaprzestania działaniaczynnika stresogennego (KARIN i in., 1981).

W badaniach na ssakach udokumentowano,że białka te uczestniczą także w modulacji apo-ptozy. Regulacyjną funkcję Mt wykazano m.in.w izolowanych mitochondriach z komórekwątroby szczurów, u których białka te zwięk-szały przepuszczalność wewnętrznej błony mi-tochondrialnej, gdy ich stężenie było niższe niż50 µM (SIMPKINS i in., 1998). Z kolei w bada-niach prowadzonych na ludzkich liniach komór-kowych wykazano, że obniżenie ekspresji Mthamowało wzrost komórek i inicjowało apoptozęw komórkach nowotworowych (ABDEL-MAGEED,AGRAWAL, 1997; TSANGARIS, TZORTZATOU-STA-

THOPOULOU, 1998). Także w komórkach wątrobymyszy nasilenie ekspresji Mt indukowało anty-apoptotyczne zmiany, podczas gdy ich brakzwiększał podatność komórek tego narządu nastymulatory śmierci komórkowej (KONDO i in.,1997). Wykazano ponadto, że indukcji syntezyMt u szczurów pod wpływem działania związ-ków chemicznych, np. stylbenu (trans-1,2-dwu-fenyloetylen) też towarzyszyło obniżenie stęże-nia GSH (SATO i in., 1995), co mogło być sy-gnałem sprzyjającym śmierci komórek (MACHO

i in., 1997; TAN i in., 1998).W przypadku bezkręgowców lądowych

szczególnie dobrze udokumentowano funkcjeochronne metalotionein wobec metali, m.in.w przypadku muszki D. melanogaster (MARONI,WATSON, 1987), ślimaków, na przykład H. po-matia, Arianta arbustorum (DALLINGER, 1993;CHABICOVSKI i in., 2004), dżdżownic Eisenia fe-tida, Lumbricus rubellus (STÜRZENBAUM i in.,1998; MORGAN i in., 2004) czy skoczogonkówOrchesella cincta (HENSBERGEN i in., 2000).W przypadku bezkręgowców wodnych dane ta-kie zgromadzono na przykład dla skorupiakówCarcinus maenas (PEDERSEN i in., 1998) czymałży Littorina littorea (BEBBIANO i in., 1992).Wykazano na przykład, że w kolejnych pokole-niach muszki D. melanogaster narażonych na

26

wysokie stężenia metali mogą się pojawiaćosobniki o zduplikowanym genie kodującym tebiałka (MARONI i in., 1987).

Nieliczne dane zgromadzono na temat induk-cji metalotionein w odpowiedzi na różne czynni-ki stresowe także dla pająków. Liczba komórekMt pozytywnych w gruczołach jelita środko-wego A. labyrinthica, L. triangularis i X. nemo-ralis zebranych na stanowisku silnie zanieczysz-czonym metalami (Olkusz) była największau pierwszego z wymienionych gatunków. Ponad-to obie płci X. nemoralis miały podobny odsetekkomórek Mt pozytywnych, gdy tymczasem u sa-mic A. labyrinthica był on blisko 70% wyższyniż u samców, u samców L. triangularis zaśo ponad 80% wyższy niż u samic (WILCZEK

i in., 2007). Gdy samice P. lugubris i A. labyrin-thica eksponowano w laboratorium na czynnikistresowe: wysoką temperaturę i/lub pestycydfosforoorganiczny (dimetoat), liczba komórekMt pozytywnych w gruczołach jelita środkowe-go u obu gatunków wzrastała (WILCZEK, 2005).Najwyższy procent komórek Mt pozytywnychmiały P. lugubris z grup poddanych stresowidwóch czynników łącznie. W cytowanej pracywykazano dodatnie korelacje między liczbą ko-mórek Mt pozytywnych i liczbą komórek apo-ptotycznych oraz liczbą komórek ze zdepolary-zowanymi mitochondriami w gruczołach jelitaśrodkowego samic obu gatunków. Podobne za-leżności stwierdzono między liczbą komórek Mt

i Hsp70 pozytywnych w analizowanym na-rządzie obu gatunków pająków (WILCZEK,2005).

Z uwagi na niedostateczność informacji natemat komórkowych reakcji na stres u pająkóww pracy tej skoncentrowano się na ocenie stop-nia nasilenia procesów śmierci komórkowej(apoptozy/nekrozy), enzymatycznych i nieenzy-matycznych parametrach wskazujących na sku-teczność obrony antyoksydacyjnej, w tym pozio-mie białek stresu (metalotioneiny, Hsp70)w gruczołach jelita środkowego samic i samcówdwóch behawioralnie i biologicznie zróżnicowa-nych gatunków poddanych w warunkach labora-toryjnych działaniu stresorów naturalnych i an-tropogennych. Porównanie poziomu analizowa-nych parametrów u osobników pochodzącychz terenów w różnym stopniu zanieczyszczonychmetalami ciężkimi pozwoliłoby zidentyfikowaći ocenić wybór realizowanych strategii kompen-sacyjnych/adaptacyjnych, podejmowanych przezpająki wobec nagle pojawiających się dodatko-wych czynników stresogennych. Uzyskane wyni-ki mogą się okazać pomocne w zweryfikowaniuzastosowanych wskaźników jako biomarkerówekspozycji pająków jako reprezentantów drob-nych drapieżników lądowych na zanieczyszcze-nia. Powinny dać podstawę do wnioskowania natemat możliwości adaptacyjnych pająków dofunkcjonowania na terenach zanieczyszczonych.

274*

The aim of the work was to compare cellular ef-fects of natural (heat shock and starvation) andanthropogenic (organophosphorous pesticide) stress-ors in two, behaviorally different spider species: webbuilding Agelena labyrinthica and wanderingXerolycosa nemoralis, from areas variously pollutedby heavy metals. It was crucial to check whether theresponse of female and male spiders, chronicallyexposed to high metal concentrations in their habitatsto additional stressors, is similar as in spiders fromthe slightly polluted site and decide which of thestressogenic factors exerts the strongest additionalcosts for an organism. Since they are the midgutglands that play a strategic role in digestion and de-toxification, the analyses were conducted in this or-gan. Using cytometric techniques and spectrophoto-metric methods, the following parameters weremeasured:— the intensity of apoptotic and necrotic changes as

well as the quantity of cells with depolarized mi-tochondria and the caspase-like protease activitylevel;

— the quantitative changes in the cells that posi-tively react with metallothionein (Mt) and heatshock protein (Hsp70) antibodies;

— the level of selected antioxidative parameters (to-tal glutathione concentration, activity of selene--dependent glutathione peroxidase; GPOX, sele-ne-independent glutathione peroxidase; GSTPx,glutathione S-transferase; GST, superoxide dis-mutase; SOD, catalase; CAT).Obtained results demonstrated that the individuals

from heavily polluted areas were more sensitive toapplied stressing factors than the animals that havenot been exposed to environmental pollutants. Thediversity in the cellular response of female and malespiders from variously polluted habitats confirms the

necessity of considering the aspect of gender in thiskind of comparisons. Mixing males and females to-gether may conceal quantitative correlations betweenanalysed parameters, when coping with long lastingpre-exposure.

From among all stressing factors applied, themost pronounced changes, measured as the percent-age of apoptotic cells in spider midgut glands, werecaused by hunger. Pro-apoptotic effect of the expo-sure to the applied factors diminished according tothe following order: hunger > heat shock +dimethoate > dimethoate > heat shock. FemaleX. nemoralis seemed more resistant to starvation,since the stressing factor did not enhance necroticchanges in the cells of their midgut glands. In heatshock and/or dimethoate exposed groups the degreeof necrotic changes in the organ was higher than inrespective A. labyrinthica groups. This may indicatehigher sensitivity of the wandering spider species tothe remaining stressing factors.

Enzymatic neutralization of reactive oxygen spe-cies in female X. nemoralis was revealed mainly bythe increased activity of SOD and CAT. In spidersalso glutathione concentration and activity of gluta-thione-dependent enzymes were elevated in responseto stressing factors. Antioxidative responses regis-tered in A. labyrinthica midgut glands were poorlydifferentiated and appeared mainly as increasedglutathione concentration and gender-related GPOX(females and males) or GSTPx (males) activity.

The exposure to stressing factors resulted also inthe induction of stress proteins in the spiders. FemaleX. nemoralis had an increased Mt synthesis whilemales, under the same conditions, had higher Hsp70production. In case of female A. labyrinthica stress-ing factors stimulated the Hsp70 synthesis, while inmales both Hsp70 and Mt production was enhanced.

115

Grażyna Wilczek

Strategies of cellular reaction towards environmental stress in spiders

S u m m a r y

15*

In case of wolf spiders (X. nemoralis) thecytoprotective role of SOD and CAT may be verifiedby positive correlations found for their activity andnecrosis and/or apoptosis intensity in the organ. Incase of tunnel spiders (A. labyrinthica) both parame-ters were either negatively correlated or there wereno correlations at all. Cytoprotective role inA. labyrinthica is likely played by Hsp70, since thepercentage of cells dying according to necrotic path-way was lower in those groups where higher percent-age of Hsp70 positive cells was found.

Analysed indices of cell death in case of both spi-der species are good biomarkers of general stress,caused by the exposure to both natural andanthropogenic factors. However, the lack of unequi-vocal correlations between the level of measured pa-rameters and the kind of stressor is the reason why it

is impossible to point out precisely the cause of thechanges, but only to confirm the stress itself that, de-pendently on its intensity, increased apoptotic and/ornecrotic changes. The analyses of quantitative ratiosmay be used in the comparisons of sensitivity of thespecies to applied stressing factors.

Obtained results confirmed inter-species differ-ences in antioxidative strategies found in previousinvestigations on spiders. Irrespectively of the typeof stressor, in case of X. nemoralis an important de-fensive role in midgut glands is played by SOD andCAT while in case of A. labyrinthica — glutathioneand Hsp70. Quantitative changes in the Mt-positivecells in particular experimental groups may indicatethat in case of spiders the proteins contribute ratherto antioxidative defense than in direct metal bind-ing.

116

Das Ziel der Arbeit war der Vergleich der Effek-te der Einwirkung von natürlichen (thermischerSchock, Hunger) und antropogenen (phosphororgani-sche Pestizide) Stressoren auf die Zellen zweier sichim Verhalten unterscheidenden Spinnenarten, dernetzbauenden Agelena labyrinthica (Agelenidae) undder Jagdspinne Xerolycosa nemoralis (Lycosidae),die aus im unterschiedlichen Grade mit Schwerme-tallen belasteten Gebieten stammen. Wesentlich warebenfalls die Prüfung, ob Spinnenweibchen undMännchen, die in ihrer natürlichen Umgebung chro-nisch hohen Schwermetallbelastungen ausgesetztsind, im Vergleich zu Exemplaren die aus schwachbelasteten Gebieten stammen, in ähnlichem Maßeauf zusätzliche Stressoren reagieren, und welche derstressogenen Faktoren die größte zusätzliche Bela-stung für den Organismus darstellt. Unter Berück-sichtigung der strategischen Rolle der Mitteldarm-drüsen bei den Verdauungs- und Detoxifikationspro-zessen, wurde die Analyse der Zellparameter aufdieses Organ beschränkt. Unter Zuhilfenahme vonzytometrischen Techniken und spektrophotometri-schen Methoden wurden für beide Spinnenarten diefolgenden vergleichenden Untersuchungen durchge-führt:— Intensitätsgrad der apoptotischen und nekroti-

schen Änderungen sowie der quantitativen Verän-derungen von Zellen mit depolarisierten Mito-chondrien sowie des Aktivitätsniveaus derCaspase ähnlichen Protease;

— Quantitative Änderung der positiv mit Antikör-pern auf die Stressproteine Hsp70 und Metallot-hionein (Mt) reagierenden Zellen;

— Niveau ausgewählter antioxidativer Parameter(Glutathion Gesamtkonzentration sowie Aktivi-tät der selenabhängigen Glutathionperoxidase;GPOX, der selenunabhängigen Glutathionperoxi-

dase; GSTPx, Glutathion-S-Transferase; GST,Superoxid-Dismutase; SOD, Katalase; CAT).Die erhaltenen Ergebnisse lassen die Behauptung

zu, dass Exemplare aus stark belasteten Gebietenempfindlicher auf die Stressfaktoren reagieren, alsdiejenigen, die zuvor keiner Belastung ausgesetzt wa-ren. Die Verschiedenartigkeit der Zellreaktionen vonaus unterschiedlich belasteten Gebieten stammendenSpinnenmännchen und Weibchen bestätigen die Not-wendigkeit bei dieser Art von Untersuchungen denGeschlechtsfaktor zu berücksichtigen. Eine gemein-same Behandlung aller Exemplare kann dazu führen,dass die quantitativen Zusammenhänge zwischen denanalysierten Parametern, unter dem Aspekt einerlang anhaltenden Einwirkung der Belastungen aufdie Spinnen, nicht zu Tage treten.

Unter den eingesetzten Stressoren hat Hunger beibeiden Arten die größten, auf Grundlage des prozen-tualen Anteils von apoptotischen Zellen in den Drü-sen des Mitteldarms der Spinnen bewerteten Ände-rungen hervorgerufen. Der proapoptotische Effektder Einwirkung der eingesetzten Stressfaktoren hatsich in folgender Reihenfolge verringert: Hunger >thermischer Schock + Dimethoat > Dimethoat >thermischer Schock. Es hat sich gezeigt, dass X. ne-moralis Weibchen widerstandsfähiger gegen Hungersind, da dieser Stressor die nekrotischen Veränderun-gen in den Zellen ihrer Drüsen im Mitteldarm nichtverstärkt hat. In den Gruppen, die einem thermischenSchock und/oder Dimethoat ausgestzt waren, war derGrad der nekrotischen Veränderungen in dem beidieser Art untersuchten Organ größer als in den ana-logen A. labyrinthica Gruppen. Dies suggeriert einegrößere Empfindlichkeit der jagenden Arten gegen-über den übrigen Stressfaktoren.

Die die reaktiven Sauerstofformen neutralisieren-den enzymatischen Reaktionen haben im Falle der

117

Grażyna Wilczek

Zellstrategien bei der Reaktion auf Umweltstress bei Spinnen

Z u s a m m e n f a s s u n g

X. nemoralis Weibchen hauptsächlich die SOD undCAT Aktivität verstärkt. In Reaktion auf die Stress-faktoren ist bei den Männchen ebenfalls die Konzen-tration des Glutathions sowie die Aktivität der mitseinem Metabolismus in Zusammenhang stehendenEnzyme gestiegen. Die in den Mitteldarmdrüsen vonA. labyrinthica registrierten antioxidantischen Reak-tionen unterschieden sich nur schwach und betrafenhauptsächlich den Anstieg der Glutathion Konzentra-tion und in Abhängigkeit vom Geschlecht die GPOXAktivität (Männchen und Weibchen) oder GSTPxAktivität (Männchen). Die Reaktion auf die Stress-faktoren bei den Spinnen bestand in der Induktionvon Stressproteinen. Die X. nemoralis Weibchenzeichnen sich durch eine erhöhte Mt-Synthese aus,wohingegen die Männchen unter ähnlichen Bedin-gungen die Produktion von Hsp70 erhöht haben. ImFalle von A. labyrinthica haben die Stressfaktorenbei den Weibchen die Synthese von Hsp70, bei denMännchen hingegen sowohl von Hsp70 als auch Mtstimuliert.

Im Falle der Jagdspinnen (X. nemoralis) könnenvon der zellschützenden Funktion von SOD undCAT die positiven Korrelationen zeugen, die zwi-schen ihrer Aktivität und dem Intensivierungsgradder Nekrose und/oder Apoptose in dem analysiertenOrgan zu verzeichnen waren. Im Falle der Labyrinth-spinnen (A. labyrinthica) waren beide Parameter ne-gativ korreliert oder fehlten solche Abhängigkeitenvöllig. Die zellschützenden Funktionen übernehmenbei A. labyrinthica höchstwahrscheinlich Hsp70 Pro-teine, denn ihr prozentualer Anteil an auf dem Wegevon Nekrose sterbenden Zellen war in den Versuchs-gruppen niedriger, bei einigen wurde ein höherer

prozentualer Anteil an Hsp70 positiven Zellen ver-zeichnet.

Die analysierten Indikatoren des Zelltodes stellenim Falle beider Spinnenarten gute Biomarker für denallgemeinen, durch die Einwirkung von sowohl na-türlichen als auch antropogenen Faktoren hervorgeru-fenen allgemeinen Stress dar. Das Fehlen einer ein-deutigen Abhängigkeit zwischen den quantitativenÄnderungen der gemessenen Parameter und der Artder einwirkenden Stressoren erlauben jedoch keinepräzise Differenzierung der Ursachen der eingetrete-nen Änderungen, sondern bestätigen lediglich dieExistenz des Stresses, der in Abhängigkeit des Inten-sitätsgrades der Stressfaktoren die apoptischenund/oder nekrotischen Prozesse verstärkt hat. DieAnalyse der quantitativen Verhältnisse dieser Art vonParameter ermöglichte den Vergleich der Empfind-lichkeit der Arten gegenüber den verwendetenStressfaktoren.

Die erhaltenen Ergebnisse haben die in den vor-angegangenen Untersuchungen nachgewiesene, mitder Art der bei Spinnen in Gang gesetzten antioxida-tiven Reaktionen in Verbindung stehende Differen-zierung der Arten bestätigt. Unabhängig von der Artdes einwirkenden Stressfaktors erfüllt im Falle vonX. nemoralis SOD und CAT eine wichtige Schutz-funktion in den Drüsen des Mitteldarms, wohingegenbei A. labyrinthica Glutation und das Protein Hsp70diese Funktion übernimmt. Die quantitative Ände-rung von Mt positiven Zellen in den einzelnen Ver-suchsgruppen kann darauf hinweisen, dass im Fallevon Spinnen das Metallothionein im größeren Maßedie Rolle des antioxidativen Schutzes, als die direkteBindung des Metalls übernimmt.

118

120

Redaktor GRAŻYNA WOJDAŁA

Redaktor techniczny BARBARA ARENHÖVEL

Korektor LIDIA SZUMIGAŁA

Copyright © 2008 byWydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego

Wszelkie prawa zastrzeżone

ISSN 0208-6336ISBN 978-83-226-1788-5

WydawcaWydawnictwo Uniwersytetu Śląskiegoul. Bankowa 12B, 40-007 Katowicewww.wydawnictwo.us.edu.ple-mail: wydawus@us.edu.plWydanie I. Ark. druk. 15,0. Ark. wyd. 12,0.Przekazano do łamania w lipcu 2008 r.Podpisano do druku w październiku 2008 r.Papier offset. kl. III, 90 g Cena 40 zł

Łamanie: Pracownia Składu KomputerowegoWydawnictwa Uniwersytetu ŚląskiegoDruk i oprawa: SOWA Sp. z o.o.ul. Hrubieszowska 6a, 01-209 Warszawa