POLITECHNIKA ŚLĄSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ

I BIOTECHNOLOGII

AUTOREFERAT

Synteza i ocena aktywności biologicznej pochodnych urydyny,

jako potencjalnych inhibitorów syntazy chitynowej.

mgr inż. Katarzyna Ferenc

Promotor: dr hab. inż. Ilona Wandzik, prof. Pol. Śl.

GLIWICE 2017

Badania prowadzone w ramach pracy doktorskiej zostały współfinansowane

przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Innowacyjna Gospodarka

1

SPIS TREŚCI

1. WPROWADZENIE ......................................................................................................................... 2

2. OMÓWIENIE WYNIKÓW ............................................................................................................ 4

2.1 Synteza amidowych pochodnych urydyny .............................................................................. 7 2.1.1 Synteza pochodnych zawierających dwie jednostki urydyny 7

2.2 Synteza pochodnych zawierających jedną jednostkę urydyny .............................................. 9 2.2.1 Synteza monomerycznych analogów „dimerów urydynowych” 9 2.2.2 Synteza bursztynylowych pochodnych urydyny 11

2.3 Synteza analoga substratu syntazy chitynowej ..................................................................... 13

2.4 Synteza pochodnych urydyny zawierających fragment o potencjale do chelatowania

jonów metali ............................................................................................................................ 14 2.4.1 N-podstawione hydrazony zawierające jednostkę urydyny 14 2.4.2 Pochodne aldehydu salicylowego i urydyny 17

2.5 Ocena aktywności biologicznej ............................................................................................... 18 2.5.1 Badania in vitro otrzymanych związków w kierunku inhibicji syntazy chitynowej 18 2.5.2 Badania aktywności przeciwgrzybiczej 21

3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI ................................................................................................. 23

4. LITERATURA ............................................................................................................................... 25

2

1. WPROWADZENIE

W ostatnich latach coraz więcej pacjentów choruje z powodu infekcji grzybiczych. Wśród

nich dominują pacjenci posiadający osłabiony układ odpornościowy, szczególnie po przebytej

chemioterapii czy antybiotykoterapii. Również zmieniający się styl życia, tj. migracje ludności oraz

intensyfikacja odbywanych podróży sprzyja rozwojowi grzybic, a zwłaszcza dermatoz1. Wiele

obecnie stosowanych leków przeciwgrzybiczych powoduje efekty uboczne i cechuje się małą

selektywnością działania. Co więcej, długotrwałe stosowanie tych samych leków powoduje, że

grzyby stają się na nie odporne. Niestety, w porównaniu do szerokiej gamy dostępnych leków

antybakteryjnych, środki przeciwgrzybicze stanowią zaledwie ich niewielki procent i coraz częściej

obserwowane są mechanizmy oporności wielu szczepów na podawane leki2,3. Dlatego intensyfiko-

wane są badania mające na celu poszukiwanie alternatywnych leków przeciwgrzybiczych. Do

grupy tych badań wpisują się badania stanowiące cel niniejszej pracy.

Ze względu na podobieństwo komórek ludzkich i komórek grzybów wynalezienie selektyw-

nie działających leków przeciwgrzybiczych jest niezwykle trudnym zagadnieniem. Niemniej

jednak, istnieją pewne elementy różnicujące oba typy komórek; jednym z nich jest ściana

komórkowa, która nie występuje w komórkach ssaków. Głównymi polisacharydami występują-

cymi w ścianie komórkowej grzybów jest glukan i chityna4. Obydwa polimery są syntezowane w

komórce grzyba przez enzymy zlokalizowane w błonie komórkowej – syntazę glukanową i syntazę

chitynową (Rysunek 1).

Rysunek 1. Schemat ściany komórkowej grzybów oraz zakotwiczone w błonie komórkowej syntaza

chitynowa i syntaza glukanowa.

Syntaza chitynowa i glukanowa, brane są pod uwagę jako cele molekularne w poszukiwaniu

związków o potencjalnym działaniu przeciwgrzybiczym5,6,7, a inhibitory syntazy glukanowej sta-

nowią obecnie jedną z grup stosowanych leków przeciwgrzybiczych – echinokandyn. Nie ma

natomiast przykładów inhibitorów syntazy chitynowej, które byłyby stosowane jako leki.

Terapie skojarzone stanowią jedną z coraz częściej stosowanych metod leczenia. Szczególnie

gdy pojawiają się mechanizmy obronne komórek chorobotwórczych i występuje zjawisko oporno-

ści na podawane leki, połączenie kilku substancji leczniczych może znacznie poprawić właściwości

3

terapeutyczne z jednoczesnym wyeliminowaniem skutków ubocznych8,9 10. Pomimo skuteczności

echinokandyn w zwalczaniu wielu zakażeń grzybiczych, zaobserwowano mechanizmy obronne

zachodzące w komórkach grzybów, będące następstwem stosowania leków tej grupy11,12,13. Jednym

z nich jest wzrost komórek grzybów w obecności wysokich stężeń środka przeciwgrzybiczego,

podczas gdy przy jego niskich lub umiarkowanie wysokich stężeniach komórki są podatne na dzia-

łanie leku14,15. Określany, jako mechanizm kompensacyjny, paradoksalny wzrost komórek w obec-

ności echinokandyn obserwuje się przede wszystkim w obecności kaspofunginy. Objawia się on

nadprodukcją chityny w miejscu, gdzie dochodzi do zahamowania syntezy glukanu i występuje

jego ubytek w warstwie ściany komórkowej grzyba16,17,18. Rozwiązania problemu spadku aktywno-

ści tych leków upatruje się w terapiach skojarzonych. Oczekuje się, że jednoczesne stosowanie

inhibitora syntezy glukanu (echinokandyny) z inhibitorem syntezy chityny, zahamuje mechanizm

kompensacyjny.

W obecnie stosowanych terapiach przeciwgrzybiczych brak jest przypadków zastosowania

takich połączeń. Poszukiwanie kombinacji tych inhibitorów wydaje się zasadne, tym bardziej, że

badania nad synergizmem kaspofunginy i nikkomycyny Z, inhibitora kompetycyjnego syntazy

chitynowej, okazały się całkiem obiecujące19.

W chwili obecnej nie jest znany dokładny mechanizm działania syntazy chitynowej, jak rów-

nież struktura 3D enzymu, stąd poszukiwanie i projektowanie nowych inhibitorów tego enzymu

oparte jest na analogiach do naturalnego substratu enzymu lub znanych związków aktywnych, np.

nukleozydów peptydowych. Naturalne nukleozydy peptydowe takie jak nikkomycyny i polioksyny

są inhibitorami kompetycyjnymi syntazy chitynowej20. Nie są jednak dobrymi kandydatami na leki

ze względu na polarny charakter, a tym samym słabą przenikalność przez błony komórkowe.

Dlatego projektując struktury nowych związków, opisanych w niniejszej pracy, kierowano się

między innymi obniżeniem ich polarności w stosunku do znanych związków aktywnych. Podczas

projektowania nowych struktur zadbano również, aby proponowane ugrupowania mogły potencjal-

nie kompleksować jony metali dwuwartościowych, takich jak jony Mg2+ czy Co2+, będących

kofaktorami syntazy chitynowej.

Zakres niniejszej pracy obejmował następujące zadania:

Zaprojektowanie nowych pochodnych urydyny, uproszczonych analogów strukturalnych

naturalnego substratu syntazy chitynowej, UDP-GlcNAc;

Syntezę zaprojektowanych związków;

Charakterystykę spektroskopową i fizykochemiczną otrzymanych pochodnych;

Ocenę aktywności biologicznej otrzymanych związków: ocenę zdolności do inhibicji

syntazy chitynowej oraz badania przeciwgrzybicze i synergizmu z kaspofunginą.

4

2. OMÓWIENIE WYNIKÓW

Zdolność nikkomycyn i polioksyn do hamowania syntazy chitynowej wynika z ich struktu-

ralnego podobieństwa do naturalnego substratu enzymu (UDP-GlcNAc). Ocenia się, że występu-

jąca w strukturze polioksyn i nikkomycyn jednostka polioksyny uracylowej C (UPOC), zapewnia

wiązanie inhibitorów w miejscu aktywnym enzymu, podobnie jak fragment urydyny odpowiada za

wiązanie naturalnego substratu (Rysunek 2). Dodatkowo, grupa karboksylowa przy atomie

węgla C-5’ urydyny fragmentu UPOC stwarza potencjalne możliwości koordynacji jonów metali

w centrum aktywnym, tak jak ugrupowanie difosforanowe obecne w UDP-GlcNAc. Nikkomycyna

Z należy do związków, które cechuje największy potencjał w inhibicji syntazy chitynowej. Jest to

również jedyny inhibitor, który przeszedł badania kliniczne21.

W ramach pracy przeprowadzono syntezę nowych pochodnych urydyny, jako potencjalnych inhi-

bitorów syntazy chitynowej o strukturach ogólnych przedstawionych na Rysunku 3, sklasyfikowa-

nych jako:

Uproszczony analog naturalnego substratu syntazy chitynowej;

N-podstawione hydrazony zawierające jednostkę urydyny;

Pochodne aldehydu salicylowego i urydyny;

Amidowe pochodne urydyny: związki zawierające jedną jednostkę urydyny oraz dwie

jednostki urydyny, zwane dalej „dimerami urydynowymi”.

Rysunek 2. Porównanie struktur naturalnych inhibitorów syntazy chitynowej

i naturalnego substratu enzymu oraz jednostka strukturalna UPOC.

5

Rysunek 3. Struktury zaprojektowanych związków z zaznaczonym elementem hydrofobowym.

W prowadzonych badaniach dla każdej z zaproponowanych do syntezy struktur (P1 ÷ P20)

obliczono współczynnik miLogP, korzystając z programu Molinspiration Cheminformatics 201622.

Uzyskane wartości wskazują, że większość z zaprojektowanych struktur wykazuje niższą

polarność w porównaniu z naturalnym substratem enzymu (UDP -GlcNAc) jak i nikkomycyną Z,

Rysunki 4 ÷ 7.

Najprostszym analogiem naturalnego substratu jest struktura P6. Związek ten posiada

pierścień cykloheksylowy, który podobnie jak pierścień piranozowy w UDP-GlcNAc, występuje

w konformacji krzesłowej. Dodatkowo w pochodnej P6 pierścień cykloheksylowy oddalony jest od

jednostki urydyny o taką samą liczbę wiązań jak ma to miejsce w UDP-GlcNAc i nikkomycynie Z

(Rysunek 4).

Rysunek 4. Naturalny substrat (UDP-GlcNAc), nikkomycyna Z

oraz analog naturalnego substratu P6.

6

Podczas wiązania naturalnego substratu w miejscu aktywnym syntazy chitynowej kluczowe

jest tworzenie kompleksów między ugrupowaniem difosforanowym UDP-GlcNAc, a kationami

metali dwuwartościowych. Dlatego wprowadzone ugrupowania zostały tak zaprojektowane, aby

mogły kompleksować jony metali. Wprowadzone do struktur nowych związków (P1 ÷ P5) ugru-

powania iminowe i hydrazonowe, umożliwiają chelatowanie jonów metali (Rysunek 5).

Rysunek 5. N-podstawione hydrazony zawierające jednostkę urydyny oraz pochodne

aldehydu salicylowego i urydyny P1 ÷ P5.

Opierając się na hipotezie dwóch miejsc aktywnych sytnazy chitynowej, zgodnie z którą znaj-

dują się one w niewielkiej odległości od siebie, zaprojektowano pochodne P7 ÷ P9 o charakterze

„dimerów urydynowych” (Rysunek 6). Obecność dwóch jednostek urydyny w nowych związkach

daje szansę na jednoczesne zablokowanie dwóch miejsc aktywnych enzymu. Dodatkowo obecne

wiązanie amidowe przy C-5’ urydyny miało na celu zwiększyć odporność związków na hydrolizę.

Rysunek 6.„Dimery urydynowe” P7 ÷ P9.

7

Zaplanowano również syntezę analogów związków dimerycznych, tj. pochodnych z jednym frag-

mentem urydyny w cząsteczce, celem porównania aktywności tych związków (P10 ÷ P20,

Rysunek 7).

Rysunek 7. Analogi „dimerów” i bursztynylowe pochodne urydyny P10 ÷ P20.

Kluczowymi substratami w przeprowadzonych syntezach były pochodne urydyny: izopropy-

lidenourydyna (S2), aldehyd urydynowy (S3), aminourydyna (S4) oraz aminourydyna z zabezpie-

czonymi grupami hydroksylowymi przy C-2 i C-3 rybozy (S5). Związki te otrzymano z dostępnej

handlowo urydyny S1, stosując metody literaturowe S223, S324, S425, S526,27.

2.1 Synteza amidowych pochodnych urydyny

2.1.1 Synteza pochodnych zawierających dwie jednostki urydyny

Badania nad związkami o charakterze „dimerów urydynowych” zawierających dwie

jednostki urydyny wskazywały, że łącznik pomiędzy jednostkami urydyny o długości równej ~12

÷ 14 Å zapewnia największą aktywność28,29. Uzyskana wartość IC50 = 1.1 mM dla najbardziej

aktywnego „dimeru” nie była jednak zadowalająca w porównaniu do znanych już wcześniej

inhibitorów syntazy chitynowej, takich jak polioksyny czy nikkomycyny. Zaprojektowano trzy

8

nowe związki o charakterze „dimerów urydynowych” P7 ÷ P930. Starano się, aby w nowych

pochodnych odległości pomiędzy jednostkami urydyny nieco różniły się od tych, jakie wyznaczyła

grupa Finney’a dla swoich pochodnych (Rysunek 8). Jedynie związek P7, który zawiera jako

łącznik jednostkę kwasu bursztynowego charakteryzuje się tą samą odległością pomiędzy

jednostkami urydyny co badany uprzednio analog z jednostką kwasu winowego jako łącznika.

Związek P7 jest jego uproszczonym analogiem.

Rysunek 8. Koncepcja inhibitorów o charakterze „dimerów urydynowych” według Yeager’a

i Finney’a oraz nowe związki zsyntezowane w ramach pracy doktorskiej.

W nowej serii dimerycznych pochodnych głównym elementem linkera łączącego jednostki urydyny

jest fragment bursztynylowy. Dodatkowo dwie pochodne zawierają również fragment glicylowy

(jeden lub dwa zależnie od długości linkera, Rysunek 8). Uznano, że łącznik glicylowy pomiędzy

fragmentami urydyny ma możliwość koordynowania jonów metali poprzez tworzenie pięcioczło-

nowego pierścienia pomiędzy metalem, a azotem grupy aminowej i tlenem grupy karboksylowej31.

Dodatkowo, obecność wiązań amidowych i ich odporność na hydrolizę, wpływa na stabilność

związków w układach biologicznych.

Spośród szeregu czynników kondensujących stosowanych w reakcjach kondensacji grupy

karboksylowej i aminowej32, 33, do badań wybrano pochodną fosfoniową benzotriazolu (PyBOP,

heksafluorofosforan-O-(benzotriazol-1-ilo)oksytripirolidynofosfoniowy). Poza obecnością zasady

generującej anion karboksylanowy, w prowadzonych kondensacjach kluczowe było zastosowanie

czynnika osuszającego, np. bezwodnego MgSO4.. Stosując bezwodnik bursztynowy, prowadzono

9

reakcje podwójnego i jednoczesnego sprzęgania grup aminowych z anionami karboksylanowymi.

Na Schemacie 1 przedstawiono reakcje syntezy „dimerów” P8 ÷ P9 według procedury z zastoso-

waniem bezwodnika bursztynowego.

Schemat 1. Synteza „dimerów urydynowych” P7 ÷ P9.

2.2 Synteza pochodnych zawierających jedną jednostkę urydyny

2.2.1 Synteza monomerycznych analogów „dimerów urydynowych”

W kolejnym etapie pracy zaplanowano syntezę serii związków zawierających jedną jed-

nostkę urydyny (Rysunek 9). Związki P10-P14 otrzymano jako analogi strukturalne pochodnych

dimerycznych, aby porównać ich aktywność ze związkami zawierającymi dwie jednostki

urydyny34.

Rysunek 9. Struktury monomerycznych analogów „dimerów urydynowych”.

W syntezie monomerycznych analogów, jako substraty wykorzystano zabezpieczoną grupami

TBDMS 5’-aminourydynę S5 oraz jej pochodną 3 zawierającą fragment glicylowy. Reakcje syn-

tezy pochodnej 3 przeprowadzono w dwóch etapach (Schemat 2).

10

Schemat 2. Synteza pochodnej 3.

Reakcje kondensacji substratu S5 z bezwodnikiem bursztynowym w syntezie związków

P10 ÷ P14 nie wymagały obecności czynnika kondensującego, stosowanego w przypadku otrzy-

mywania „dimerów” (Schemat 3)35. Finalne produkty P11 ÷ P14 otrzymano poprzez deprotekcję

grup hydroksylowych 2’-OH i 3’-OH, stosując w zależności od pożądanego produktu, TBAF lub

AcCl po 1.1 eqv. na grupę (Schemat 3).

Schemat 3. Synteza monomerycznych analogów „dimerów urydynowych”.

W trakcie badań biologicznych okazało się, że związek P12 wykazuje zdolność do inhibicji

syntazy chitynowej. Dlatego zdecydowano się na syntezę analogów związku P12, różniących się

rodzajem grupy estrowej w łańcuchu bursztynylowym.

11

2.2.2 Synteza bursztynylowych pochodnych urydyny

Syntezę bursztynylowych pochodnych urydyny P12 ÷ P20 (Rysunek 10), prowadzono na

drodze reakcji kondensacji odpowiednich monoestrów kwasu bursztynowego z pochodnymi

urydyny.

Rysunek 10. Bursztynylowe pochodne urydyny.

Szczegółowe warunki prowadzonych reakcji syntezy monoestrów kwasu bursztynowego zebrano

w Tabeli 2.

Tabela 2. Warunki dla reakcji syntezy monoestrów kwasu bursztynowego.

Lp. Związek ROH Katalizator/

rozpuszczalnik

Czas

[h]

Temp.

[oC]

Wyd.

[%]

Czystość

[%]

1. 15 MeOH MeOH 2 65 98 99

2. 16 EtOH EtOH 0.5 78 90 89

3. 17 iPrOH iPrOH 3.0 82 93 82

4. 18 t-BuOH NHS, DMAP, Et3N/ toluen 12 110 24 93

5. 19 BnOH DMAP, Et3N/ CH2Cl2 24 40 66 99

6. 20 (p-Me)BnOH

CsCO3/1,4-dioksan 4 101 23 99

7. THF 12 67 58 99

8. 21 (p-OMe)BnOH PPTS/ toluen 2 110 19 93

Reakcje syntezy związków P12 ÷ P20 przeprowadzono na drodze bezpośredniej konden-

sacji 5’-amino-5’-deoksyurydyny S4, posiadającej wolne grupy hydroksylowe w pozycji 2’ i 3’

z odpowiednimi monoestrami.

Reakcje testowe z wykorzystaniem S4 przeprowadzono dla syntezy metylowego i etylowego estru

kwasu bursztynowego (Schemat 4, Tabela 4). Możliwość zastosowania niezabezpieczonej 5’-ami-

nourydyny S4 w syntezie bursztynylowych pochodnych, pozwala wyeliminować etap deprotekcji

oraz możliwe przy tym straty i ewentualne zanieczyszczenia produktów finalnych. W reakcjach,

w których jako substrat zastosowano substrat S4 otrzymano oczekiwane pochodne estrowe P12

i P15.

12

Schemat 4. Reakcje kondensacji 5’-aminourydyny S4 z monoestrami 15 i 16.

Tabela 4. Warunki w reakcjach testowych aminourydyny S4 z monoestrami.

Lp. Substraty Produkt Rozpuszczalnik Katalizator Czas

[h]

Temp.

[oC]

Wyd.

[%]

1. S4 15 P12 DMF PyBOP (1 eqv.)/

Et3N (2 eqv.) 2 t. pok. 40

2. S4 16 P15 DMF PyBOP (1 eqv.)/

Et3N (2 eqv.) 2.5 t. pok. 25

3. S4 16 P15 DMF HBTU (1 eqv.)/

Et3N(2 eqv.) 2.5 t. pok. 40

Z uwagi na wyższą wydajność w reakcji monoestru etylowego (40%), w porównaniu do

wydajności uzyskanej w reakcji z PyBOP (25%), do dalszych kondensacji wybrano HBTU w roli

czynnika kondensującego,

Zgodnie z wybraną metodą, 5’-aminourydynę S4 rozpuszczono w DMF, po czym dodano

odpowiedni monoester 17 ÷ 21, HBTU (1.0 eqv.), Et3N (2.0 eqv.) oraz bezwodny MgSO4

(Schemat 5). Otrzymano produkty P16 ÷ P20 o wysokiej czystości, jednak konieczność zastoso-

wania chromatografii kolumnowej oraz żywic jonowymiennych spowodowała znaczny spadek

wydajności (Schemat 5).

13

Schemat 5. Reakcje syntezy bursztynylowych pochodnych 5’-aminourydyny S4.

2.3 Synteza analoga substratu syntazy chitynowej

W ramach niniejszej pracy zaprojektowano uproszczony analog naturalnego substratu, zwią-

zek P6 (Rysunek 11). Założono, że zbliżona do UDP-GlcNAc struktura związku P6, w tym pier-

ścień cykloheksylowy imitujący konformację krzesłową fragmentu cukrowego naturalnego sub-

stratu, zapewni odpowiednie usytuowanie cząsteczki w centrum aktywnym enzymu. Dodatkowo,

obecny w strukturze związku P6 fragment glicylowy może stanowić potencjalne miejsce koordy-

nacji, takie jak ugrupowanie difosforanowe w naturalnym substracie. Syntezę związku P6 przepro-

wadzono w trzech etapach (Schemat 6).

Rysunek 11. Struktura naturalnego substratu syntazy chitynowej UDP-GlcNAc i związku P6.

14

Schemat 6. Synteza analoga naturalnego substratu, pochodnej P6.

2.4 Synteza pochodnych urydyny zawierających fragment

o potencjale do chelatowania jonów metali

2.4.1 N-podstawione hydrazony zawierające jednostkę urydyny

Hydrazony są produktami kondensacji aldehydów i ketonów z pochodnymi hydrazyny, opi-

sane ogólnym wzorem R1C=NNR2. Istnieje wiele doniesień literaturowych na temat aktywności

przeciwgrzybiczej36, , przeciwbakteryjnej37, , przeciwzapalnej38 czy przeciwnowotworowej39 po-

chodnych hydrazonów. Wiele z tych związków może być stosowanych jako inhibitory enzymów40.

Mając na uwadze właściwości biologiczne, a przede wszystkim kompleksujące hydrazonów,

wynikające między innymi z obecności w cząsteczce charakterystycznego motywu R2C=NNR2, za-

projektowano hydrazony, zawierające motyw urydynowy (Rysunek 13)41. W przedstawionych po-

chodnych urydyny, kolorem niebieskim zaznaczono charakterystyczne ugrupowanie hydrazonowe,

a przerywaną linią, wspólną dla wszystkich pochodnych jednostkę urydyny. Kluczowym elemen-

tem struktury nowych hydrazonów jest motyw urydynowy, odpowiedzialny za oddziaływania

z resztami aminokwasów w miejscu aktywnym inwertujących glikozylotransferaz, do których

należy syntaza chitynowa.

15

Rysunek 13. N-podstawione hydrazony urydynowe.

Wzrost lipofilowości hydrazonów urydynowych uzyskano wybierając jako substraty hydrazydy,

zawierające takie elementy strukturalne, jak np. pierścień aromatyczny czy grupę t-butylową.

Syntezę hydrazonów urydynowych prowadzono metodą kondensacji aldehydu 2’,3’-O-izopropyli-

denourydyny S3 z czystymi optycznie hydrazydami42 28 (enancjomer R) i 29 (enancjomer S)

(Schemat 7).

Schemat 7. Synteza hydrazonów urydynowych P1 i P2.

W reakcji addycji nukleofilowej grupy aminowej pochodzącej od hydrazydów 28 i 29 do karbony-

lowgo atomu węgla C-5’ aldehydu S3, otrzymano produkty P1 i P2 w postaci mieszaniny izome-

rów (Tabela 5).

Tabela 5. Warunki addycji hydrazydów 28 i 29 do aldehydu urydynowego S3.

Lp. Substrat Produkt Rozpuszczalnik

Czas

[h]

Temp.

[oC]

Wyd.

[%]

Izomer

E/trans : E/cis

1. 28 P1 CH2Cl2 3.0 40 90 4:1

2. 29 P2 CH2Cl2 3.0 40 75 2:1

W otrzymanych acylohydrazonach P1 i P2 obecność wiązania amidowego i ugrupowania

hydrazonowego generuje różne rodzaje izomerii mogącej wystąpić w produktach reakcji. Izomeria

geometryczna może występować z uwagi na wiązanie HC=N, z kolei możliwość rotacji grupy

acylowej wokół wiązania amidowego i związane z tym różne położenie tej grupy względem atomu

azotu pochodzącego od wiązania amidowego i względem atomu wodoru, stwarza możliwości syn-

16

lub antiperiplanarnej konformacji produktów. Wnikliwa analiza 1H NMR i 2D NMR pozwoliła

stwierdzić, że w mieszaninie reakcyjnej obecne były zarówno izomery geometryczne, jak i konfor-

mery rotacyjne. Przypisanie dominującej formy izomeru zostało oparte na szczegółowej analizie

widm 2D NMR (COSY, HSQC, HMBC, CIGAR, NOESY) wykonanych w DMSO-d6. Stwier-

dzono, że związki P1 i P2 są obecne w roztworze DMSO w postaci izomerów E, co jest zgodne

z danymi literaturowymi43,44,45,46.

Aby otrzymać N-hydrazony urydynowe w formie odbezpieczonej, przeprowadzono próbę

usunięcia grupy izopropylidenowej w związku P1. Jak wykazała analiza NMR, w mieszaninie

poreakcyjnej zaobserwowano dwa produkty P3a i P3b w stosunku 1:1. Identyfikacja powstałych

produktów była możliwa dzięki analizie 2D NMR, na podstawie której wywnioskowano, że mie-

szaninę produktów stanowią dwa tautomery P3a i P3b (Schemat 8). Ze względu na fakt, że proces

odbezpieczania pochodnej P1 skutkował otrzymaniem mieszaniny tautomerów, nie podjęto próby

odbezpieczenia pochodnej P2.

Schemat 8. Deprotekcja związku P1 i formy tautomeryczne P3a i P3b.

Na potrzeby niniejszej pracy, przy współpracy z dr hab. Aleksandrą Dąbrowską z Uniwersy-

tetu Gdańskiego, przeprowadzono wstępną ocenę powinowactwa jonów manganu(II) do hydrazonu

P1, wykorzystując metodę miareczkowania spektrofotometrycznego. W badaniu tym, analitem był

wodny roztwór związku P1, natomiast mieszanina soli manganu(II) ze związkiem P1 pełniła funk-

cję titranta. Uzyskane dane wskazują na wystąpienie co najmniej jednej równowagi lub utworzenie

się związku kompleksowego w postaci chelatu o stechiometrii 1:1. Wyznaczona stała trwałości

kompleksu manganu ze związkiem P1 (logβ = 2.41) jest większa niż odpowiadająca jej stała dla

kompleksu 1:1 urydyna/mangan(II) (logβ = 1.3647), co sugeruje występowanie dodatkowego od-

działywania.

Wzrost stabilności kompleksu 1:1 dla hydrazonu P1/mangan(II) w porównaniu do kompleksu 1:1

urydyna/mangan(II) może wskazywać na tworzenie chelatu. Biorąc pod uwagę przedstawione

przez Knoblocha i współautorów48 różne możliwe sposoby wiązania jonu metalu w chelacie z ury-

dyną i (Rysunek 15 B), zaproponowano strukturę chelatu P1 z dwuwartościowymi jonami manganu

(Rysunek 15 A).

17

Rysunek 15. A/ Sugerowany model hydrazonu P1 w związku komplesowym z Mn2+, B/Modele

chelatów urydyny z jonami metali dwuwartościowych na podstawie [48].

2.4.2 Pochodne aldehydu salicylowego i urydyny

Hydrazony zawierające w strukturze monosacharyd lub nukleozyd również mogą być inte-

resujące, ze względu na bardzo istotne oddziaływania tych jednostek w układach biologicznych49.

Związki te, jako ligandy metali mogą pełnić funkcje katalizatorów np. w reakcjach enancjoselek-

tywnej epoksydacji czy utleniania50. Przykładem takiego katalizatora jest pochodna cukrowa alde-

hydu salicylowego, w której fragment salicylowy oraz grupa hydrazonowa są zaangażowane

w tworzenie wiązań z metalem (Rysunek 16 A)51. Wzorując się na strukturze katalizatora salicylo-

wego, zdecydowano o syntezie związków P4 i P5, będących pochodnymi urydyny i aldehydu sali-

cylowego (Rysunek 16 B).

Rysunek 16. Struktury pochodnych aldehydu salicylowego: A/ jako liganda wanadu, B/ zaprojekto-

wane pochodne urydyny.

Oczekiwano, że związek P4 posiadając w strukturze dwa ugrupowania odpowiedzialne za kom-

pleksowanie jonów metali, jakimi są fragment aldehydu salicylowego oraz ugrupowanie hydrazo-

nowe (Rysunek 16 B), wykaże oddziaływania z jonami metali w centrum aktywnym syntazy chi-

tynowej. Podobnie związek P5, w którym zamiast grupy hydrazonowej, wprowadzono fragment

glicylowy, posiadający również potencjalną zdolność do kompleksowania jonów metali.

Dodatkowo, zakładano, że obecność w strukturach pochodnych P4 i P5 pierścienia aromatycznego

18

wpłynie korzystnie na lipofilowość związków i ich przenikalność przez błony komórkowe. Synteza

pochodnej P4 została przedstawiona na Schemacie 9 i 10.

Schemat 9. Synteza pochodnej P4.

Schemat 10. Synteza pochodnej P5.

2.5 Ocena aktywności biologicznej

2.5.1 Badania in vitro otrzymanych związków w kierunku inhibicji syntazy

chitynowej

Badania nad oceną aktywności biologicznej otrzymanych pochodnych urydyny stanowiły

ostatni etap niniejszej pracy. Do badań biologicznych przeznaczono związki P1 ÷ P20. Zastoso-

wana metodyka, bazująca na powinowactwie chityny do lektyny WGA jest szeroko stosowana

w badaniach potencjalnych inhibitorów syntazy chitynowej52. Podstawowymi zaletami stosowania

tej metody w porównaniu do alternatywnej metody radiochemicznej53,54, są bezpieczeństwo pracy

oraz brak konieczności stosowania drogich, znakowanych radioizotopami substratów. Ponadto, me-

toda wiązania chityny przez WGA jest bardzo czuła, pozwala na oznaczenia niewielkich ilości po-

wstającego w reakcji oligomeru (GlcNAc)n.

Badania biologiczne obejmowały zasadnicze dwa etapy, jakimi są:

Izolowanie enzymu z drożdży piekarniczych;

Przeprowadzenie reakcji enzymatycznej z udziałem badanych związków i ocena ich

aktywności.

19

Izolowanie syntazy chitynowej z drożdży piekarniczych

Syntazę chitynową potrzebną do przeprowadzenia reakcji enzymatycznych wyizolowano

w postaci frakcji membranowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae, postępując zgodnie z opi-

saną w literaturze metodą mechanicznego rozcierania komórek drożdży przy użyciu szklanych

kulek55.

Metoda ta, zwana potocznie metodą mechaniczną, polega na rozbijaniu ściany komórkowej szkla-

nymi kulkami, umieszczając probówkę z komórkami drożdży na mini wirówce typu worteks.

Proces izolowania enzymu przedstawiono na Rysunku 17.

Rysunek 17. Etapy postępowania przy mechanicznej dezintegracji ściany komórkowej.

W ramach badań biologicznych przeprowadzono reakcje testowe mające na celu porównanie

aktywności syntazy chitynowej w ultraosadzie oraz w świeżym supernatancie 2 (przed ultrawiro-

waniem). W obu przypadkach niezaobserwowano wyraźnych różnic w aktywności enzymu.

W związku z tym w badaniach oceny aktywności biologicznej związków pominięto etap ultrawiro-

wania i stosowano enzym w postaci supernatantu.

Ocena aktywności związków P1 ÷ P20

W zastosowanej metodzie oceny aktywności enzymatycznej syntazy chitynowej, WGA,

którą powleczone są dołki płytki mikrotitracyjnej, silnie wiąże powstałą w reakcji enzymatycznej

chitynę (etap I, Rysunek 18)56. Frakcje membranowe, stanowiące źródło syntazy chitynowej, inku-

bowano z reagentami niezbędnymi do zajścia reakcji enzymatycznej, tj. MgCl2 , UDP-GlcNAc,

GlcNAc. Enzym aktywowano trypsyną, a do mieszaniny reakcyjnej dodano również digitoninę,

rozpuszczającą błonę komórkową. Następnie do każdego dołka płytki dodano koniugat peroksy-

dazy chrzanowej z WGA (WGA-HRP), który wiążąc się z chityną powstałą w reakcji, utworzył

Supernatant 3

2.5 mM MgCl2,

50 mM Tris-HCl

Szklane kulki

Drożdże Supernatant 1

Osad

Supernatant 2 Badania

enzymatyczne

15 cykli: 30 s

wirowanie i

chłodzenie

30 s chłodzenie w

Wirowanie

4000

obr/min, 5

minut

Ultraosad

Osad

Ultrawirowanie

100 000 × g 1 godzina

20

rodzaj „kanapki” (etap II, Rysunek 18). Aktywność peroksydazy chrzanowej w koniugacie z WGA

(WGA-HRP) ustalono na podstawie postępu utleniania 3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyny (TMB)

nadtlenkiem wodoru (etap III, Rysunek 18). Pojawienie się niebieskiego zabarwienia świadczyło

o utworzeniu się kompleksu CT (ang. charge-transfer complex) z maksimum absorpcji przy około

655 nm. Zmierzona absorbancja roztworu w studzienkach płytki mikrotitracyjnej pozwalała na

określenie ilości wytworzonej chityny, a tym samym na określenie aktywności syntazy

chitynowej. Reakcje inkubowano bez związków oraz w obecności związków P1 ÷ P20.

Rysunek 18. Etapy badania aktywności frakcji membranowych: synteza i wiązanie chityny (I), wiąza-

nie WGA-HRP z unieruchomioną chityną (II), kolorymetryczne oznaczanie aktywności HRP (III).

W przypadku, gdy związki nie były rozpuszczalne w wodzie, rozpuszczano je w DMSO,

a do reakcji kontrolnej (bez związków) również dodawano odpowiednią objętość DMSO. Dodanie

tego rozpuszczalnika miało na celu wyeliminowanie jego wpływu na prowadzoną reakcję enzyma-

tyczną, gdyż samo DMSO wykazuje pewien stopień inhibicji syntazy chitynowej. Związki przeba-

dano dla stężeń 0.75 mM ÷ 3.0 mM. Prowadzono również reakcję kontrolną bez związków, co

stanowiło punkt odniesienia do wyznaczania parametru IC50. W każdej serii badanych związków

zastosowano znany inhibitor syntazy chitynowej, nikkomycynę Z, pełniącą rolę kontroli dodatniej,

dla której przeprowadzono analogiczną reakcję.

Analizując wyniki aktywności biologicznej nowych pochodnych urydyny zaobserwowano,

że spośród wszystkich związków dwa wykazały zauważalną aktywność. Dla pochodnej P12 zano-

towano największy spadek absorbancji, obserwowany wraz ze wzrostem stężenia związku. Okre-

ślono wartość IC50 = 0.8 mM (Rysunek 19). Wartość parametru IC50 dla P12 jest porównywalna

z wartością stałej KM dla syntazy chitynowej, mieszczącej się w granicach 0.5 ÷ 0.8 mM zależnie

od izoformy55. Świadczy to o zbliżonym powinowactwie związku P12 i naturalnego substratu en-

zymu (UDP–GlcNAc).

21

Rysunek 19. Nowe pochodne urydyny wykazujące zdolność do inhibicji syntazy chitynowej.

Spośród nowych pochodnych dimerycznych, tylko jedna z nich, „dimer” P9 wykazał zdol-

ność do hamowania syntazy chitynowej, jednak znacznie niższą niż pochodna monomeryczna P12.

Dla związku P9 zanotowano bowiem wartość IC50 = 3 mM (Rysunek 19). Pozostałe związki nie

wykazały znaczącej aktywności. We wcześniejszych badaniach nad dimerycznymi pochodnymi

urydyny, Finney i Yeager zauważyli, że dimeryzacja prowadzi do wzrostu inhibicji enzymu28,29.

W badaniach opisanych w niniejszej pracy nie zaobserwowano korzyści płynącej z dimeryzacji,

rozbieżności te mogą wynikać z różnicy w szczepach drożdży stosowanych do izolowania frakcji

membranowych. Inną przyczyną mogą być różne warunki izolowania frakcji membranowych, które

mogą prowadzić do różnych proporcji poszczególnych izoform enzymu.

Spośród wszystkich pochodnych udało się wytypować jedną, wykazującą wyraźnie obniża-

jącą aktywność syntazy chitynowej, pochodną P12.

2.5.2 Badania aktywności przeciwgrzybiczej

Pochodne dimeryczne i odpowiadające im monomery przetestowano następnie w kierunku

działania przeciwgrzybiczego we współpracy z dr Urszulą Nawrot w Katedrze i Zakładzie Mikro-

biologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. Badania te przeprowadzono dla ośmiu różnych

patogennych szczepów, w tym Aspergillus fumigatus i Candida albicans. Badania wykonano zgod-

nie z zaleceniami Komisji Europejskiej Badań Wrażliwości Drobnoustrojów (EUCAST) metodą

mikrorozcieńczeniową (Tabela 6)57,58. Wraz z nowymi związkami, badaniu aktywności przeciw-

grzybiczej dla grzybów z gatunku Candida albicans poddano znany lek przeciwgrzybiczy, fluko-

nazol. Wartość parametru MIC dla flukonazolu 0.000125 mg/ml okazała się znacznie niższa niż

wartość MIC dla pochodnej P12, jedynego aktywnego związku

(Tabela 6)34.

22

Tabela 6. Wartości MIC nowych pochodnych wobec grzybów różnych gatunków i szczepów.

Gatunek Szczep

MIC

(mg/mL)

P12 P14 P13 P11 P10 P7 P8 P9 Flukonazol

C. albicans ATCC 90028 1 >1 >1 >1 >1 >3 >1 >1 0.000125

C. glabrata ATCC 90030 0.06 ÷ 0.12 >1 >1 >1 >1 - >1 >1 b.d.

A. fumigatus BCCM/IHEM13934 0.25 ÷ 0.50 >1 >1 >1 >1 - >1 >1 b.d.

A. niger BCCM/IHEM 3766 0.5 >1 >1 >1 >1 - >1 >1 b.d.

S. cerevisiae L’hirondelle (Lesaffre) 0.25 - - - - - - - b.d.

Spośród przebadanych związków, jedynie związek P12 wykazał aktywność przeciwgrzybi-

czą wobec wszystkich testowanych szczepów grzybów (np. MIC80 = 0.25 mg/ml dla S. cerevisiae).

Chociaż aktywność ta była jedynie umiarkowana, na uwagę zasługuje fakt jednoczesnej aktywności

przeciwgrzybiczej tego związku oraz oznaczonej wcześniej zdolności do inhibicji syntazy chityno-

wej, pochodzącej z grzybów tego samego gatunku, Saccharomyces cerevisiae (IC50 = 0.8 mM).

Badania synergizmu

W badaniach nad synergizmem zastosowano połączenie kaspofunginy w stężeniach

0.0039 ÷ 1.0000 mg/l oraz związku P12 w stężeniach 0.0156 ÷ 1.000 mg/ml, celem wyznaczenia

cząstkowego stężenia hamującego (FIC)59. Indeks ten wyraża stosunek wartości MIC biologicznie

aktywnego związku w obecności drugiego związku o określonym stężeniu, do wartości MIC tego

samego związku badanego pojedynczo, zgodnie ze wzorem:

FIC = 𝑀𝐼𝐶(𝑘𝑎𝑠𝑝𝑜𝑓𝑢𝑛𝑔𝑖𝑛𝑎+𝐏𝟏𝟐)

𝑀𝐼𝐶(𝑘𝑎𝑠𝑝𝑜𝑓𝑢𝑛𝑔𝑖𝑛𝑎)+

𝑀𝐼𝐶(𝑷𝟏𝟐+𝑘𝑎𝑠𝑝𝑜𝑓𝑢𝑛𝑔𝑖𝑛𝑎)

𝑀𝐼𝐶(𝑷𝟏𝟐)

Parametr ten wyznaczono w oparciu o metodę szachownicy (ang. checkerboard)60 (Ta-

bela 26). Najlepsze wyniki wśród przeprowadzonych badań odnotowano w przypadku połączenia

kaspofunginy o stężeniu 0.062 mg/l i związku P12 o stężeniu 0.031 mg/ml na grzybach z gatunku

C. albicans. Uzyskana wartość FIC = 0.28 dla kaspofunginy i związku P12, świadczy o wystąpie-

niu

synergizmu. Innymi słowy, podobny efekt grzybobójczy, jaki występuje przy zastosowaniu jedynie

kaspofunginy, można uzyskać poprzez połączenie kaspofunginy i związku P12, ale co istotne, przy

znacznie niższym jej stężeniu. (Tabela 7). Takie działania synergiczne mogą się przyczynić

do ograniczenia stosowania antybiotyków i zmniejszenia ich negatywnego wpływu na zdrowie pa-

cjentów.

23

Tabela 7. Wartości indeksu FIC dla kaspofunginy i związku P12.

3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI

Celem niniejszej pracy było zaprojektowanie, synteza i ocena aktywności wybranych po-

chodnych urydyny, jako inhibitorów syntazy chitynowej. Enzym ten jest odpowiedzialny za bio-

syntezę chityny, jednego z elementow ściany komórkowej grzybów. Ze względu na fakt, że chityna

nie wystepuje u ssaków, inhibitory syntazy chitynowej mogą okazać się bezpiecznymi środkami

przeciwgrzybiczymi. Choć wiele analogów substratu i znanych związków aktywnych zostało zsyn-

tezowanych, to jedynie kilka wykazało znaczącą aktywność inhibicyjną.

Projektując struktury do syntezy kierowano się trzema kryteriami. Po pierwsze, pochodne

posiadały fragmenty urydyny, gdyż zakłada się jej znaczący udział w wiązaniu substratu w centrum

aktywnym syntazy chitynowej. Po drugie, mając na uwadze metalozależność syntazy chitynowej,

do struktur nowych pochodnych wprowadzono elementy strukturalne posiadające cechy ligandów

metali dwuwartościowych, takie jak ugrupowanie iminowe czy hydrazonowe. Po trzecie, poprzez

umiejscowienie w łańcuchach bocznych pierścieni aromatycznych oraz grup alkilowych, starano

się obniżyć polarność nowych pochodnych, a tym samym poprawić ich potencjalne przenikanie

przez błonę do komórki. Łącznie zaprojektowano dwadzieścia struktur, P1 ÷ P20.

Synteza zaprojektowanych związków była wieloetapowa. Z uwagi na różnorodność struktur,

optymalne warunki reakcji, sposób oczyszczania i charakterystykę związków dobie-rano indywi-

dualnie. Kluczowymi substratami w syntezach był aldehyd urydynowy S3 oraz pochodne 5’-ami-

nourydyny S4 i S5. Amidowe pochodne urydyny P6÷P20 zostały zsynte-zowane poprzez konden-

sację substratów aminowych S4 i S5 z grupą karboksylową kwasu bursztynowego lub glicyny wo-

bec odpowiednio dobranych czynników kondensujących. Pochodne hydrazonów P1÷P5 zsyntezo-

wano w wyniku reakcji aldehydu urydynowego S3 z wybranymi pochodnymi hydrazyny. Struktury

wszystkich produktów określono metodą spektroskopii 1H i 13C NMR. Do identyfikacji złożonych

pochodnych oraz izomerów stosowano zaawansowane techniki 2D NMR (COSY, HSQC, HMBC,

Candida albicans

(ATCC 90028)

Kaspofungina MIC (mg/l) 0.250

Związek P12 MIC (mg/ml) 1.000

Połączenie: Kaspofungina + P12 MIC (mg/ml) 0.062 + 0.031

FIC indeks 0.280 (synergizm)

24

CIGAR, NOE). Ponadto struktury finalnych związków do badań biologicznych potwierdzono na

podstawie spektrometrii masowej (ESI HRMS).

Ocenę aktywności związków P1 ÷ P20 przeprowadzono wobec syntazy chitynowej izolo-

wanej z drożdży S. cerevisiae. Za najbardziej odpowiednią metodę izolowania enzymu uznano me-

todę mechanicznego rozcierania komórek drożdży z wykorzystaniem szklanych kulek. Zastoso-

wana w badaniach aktywności biologicznej metoda wykorzystująca powinowactwo chityny do lek-

tyny WGA okazała się powtarzalna, co więcej oznaczona wartość IC50 = 1 µM dla kontroli dodat-

niej, nikkomycyny Z, była zgodna z danymi literaturowymi61. Reakcje enzymatyczne prowadzono

zgodnie z przepisem literaturowym, stosując trypsynę w roli aktywatora enzymu oraz jony Mg2+,

jako kofaktory.

Badania nad pochodnymi dimerycznymi wykazały, że związki te nie posiadają znaczącej

aktywności wobec syntazy chityny z drożdży S. cerevisiae w badanym zakresie stężeń do 3 mM.

Jedynie związek P9 wykazał bardzo słabą aktywność (IC50 = 3 mM). Niespodziewanie, jego

monomeryczna forma, związek P12, wykazał większą aktywność (IC50 = 0.8 mM).

Poza badaniami nad oceną zdolności nowych pochodnych do inhibicji syntazy chitynowej,

prowadzone były badania przeciwgrzybicze oraz badania synergizmu z kaspofunginą. Badania te

zostały wykonane w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocła-

wiu. Badanie aktywności przeciwgrzybiczej dla połączenia kaspofunginy i nowego związku aktyw-

nego P12 dało pozytywny wynik. Oznaczona wartość parametru FIC = 0.28 wskazuje na wystąpie-

nie synergii. W związku z tym, pochodna P12 pomimo swojej umiarkowanej aktywności biologicz-

nej (MIC = 1.0 mg/ml), może być wykorzystywana do projektowania i syntezy analogów w bada-

niach efektów połączenia z innymi, znanymi lekami przeciwgrzybiczymi.

Wyniki przedstawione w niniejszej pracy zostały opisane w sześciu publikacjach7,30,34,35,41,52.

25

4. LITERATURA

1 M. P. Hayette, R. Sacheli, Curr. Fungal Infect. Rep., 2015, 9, 164-179.

2 M. A. Pfaller, D. J. Diekema, Clin. Microbiol. Rev., 2007, 133-163.

3 J. B. Anderson, Nat. Rev. Microbiol., 2005, 3, 547-556.

4 Latge J.P, Mol. Microbiol., 2007, 66, 279-290.

5 C. A. Munro, Adv. Appl. Microbiol. 2013, 83, 145-172.

6 J. Ruiz – Herrera, G. San – Blas, Curr. Drug Targets: Infect. Disord., 2003, 3. 77-91.

7 K. Kral, J. Paszkowska. K. Piaskowy, M. Chwaszcza, I. Wandzik, "Syntaza chitynowa jako cel molekularny w poszukiwaniu

środków przeciwgrzybiczych" w Na pograniczu chemii i biologii, , Wydawnictwo Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza

w Poznaniu, 31, 2013, 251 –260.

8 P. E. B.Verwer, M. L. van Duijn, M. Tavakol, I. A. J. M. Bakker-Woudenberg, W. W. J. van de Sande, Antimicrob. Agents

Chemother. 2012, 56,1595-1598.

9 S. C. Deresiński, D. A. Stevens, Clin. Infect. Dis. 2003, 36, 1445-1457.

10 R. Musiol, A. Mrozek-Wilczkiewicz, J. Polański, Current Medicinal Chemistry, 2014, 21, 1, 1-24.

11 D. S. Perlin, Ann. N.Y. Acad. Sci., 2015, 40, 1-11.

12 L. A. Walker, K. K. Lee, C. A. Munro, N. A. R. Gow, Antimicrob. Agents Chemother., 2015, 59, 5932-5941.

13 V. Valiante, J. Macheleidt, M. Föge, A. A. Brakhage, Front. Microbiol., |2015, 6, 1-12.

14 C. Rueda, M. Cuenca-Estrella, O. Zaragoza, Antimicrob. Agents Chemother.,2014, 58, 1071-1083.

15 C. J. Walraven, S. M. Bernardo, N. P. Wiederhold, S. A. Lee, Med. Mycol., 2014, 52, 131-139.

16 K. K. Lee, D. M. MacCallum, M. D. Jacobsen, L. A. Walker, F. C. Odds, N. A. R. Gow, C. A. Munro, Antimicrob. Agents

Chemother., 2012, 56, 208-217.

17 L. A. Walker, N. A. R. Gow, C. A. Munro, Antimicrob. Agents Chemother., 2013, 57, 146-154.

18 L. A. Walker, C. A. Munro, I. de Bruijn, M. D. Lenardon, A. McKinnon, N. A. R. Gow, PLoS Pathog., 2008, 4, 1-12.

19 H. Sandovsky-Losica, R. Shwartzman, Y. Lahat, E. Segal, J. Antimicrob. Chemother. 2008, 635-637.

20 G. W. Gooday, Inhibition of Chitin Metabolism w Biochemistry of Cell Walls and Membranes in Fungi, Springer-Verlag

(Eds),: Berlin; 1990, 61-76. 21 D. E. Nix, R. R. Swezey, R. Hector, J. N. Galgiani, Antimicrob. Agents Chemother., 2009, 53, 2517-2521.

22 http://www.molinspiration.com/

23 T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999.

24 S. Eppacher, N. Solladie, B. Bernet, A. Vassela, Helv. Chim. Acta, 2000, 83, 1322.

25 K. A. Winans, C. R. Bertozzi, Chem. Biol. 2002, 9, 113-129.

26 M. A. Peterson, B. L. Nilsson, S. Sarker, B. Doboszewski, W. Zhang, M. J. Robins, J. Org. Chem., 1999, 64, 8183-8192.

27 A. E. Trunkfield, T. D. H. Bugg, S. S. Gurcha, G. S. Besra, Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 2651-2663.

28 A. R. Yeager, N. S. Finney, Journal of Organic Chemistry, 2004, 69, 613-618.

29 A. R. Yeager, N. S. Finney, Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 6451-6460.

30 K. Kral, T.Bieg, U. Nawrot, K. Włodarczyk, A. Lalik, P. Hahn, I. Wandzik, Bioorg. Chem.,2015, 61, 13-20.

31 M. H. Khodabandeh, M. D. Davari, M. Zahedi, G. Ohanessian, Int. J. Mass Spectrom., 2010, 291, 73-83.

32 A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602.

33 M. M. Joullié, K. M. Lassen, ARKIVOC, 2010, 8, 189-250.

34 K. Kral, T.Bieg, U. Nawrot, K. Włodarczyk, A. Lalik, P. Hahn, I. Wandzik, Bioorg. Chem.,2015, 61, 13-20.

35 J. Paszkowska, K. Kral, T Bieg, K. Żaba, K. Węgrzyk, N. Jaśkowiak, A. Molinaro, A. Silipo, I. Wandzik, Bioorg. Chem.

2015, 58, 18-25. 36 B. B. Casanova, M. N. Muniz de Oliveira, T. de Oliveira, L. F. Machado, M. M. Fuentefria, A. M. G. Gosmann, S. C. B.

Gnoatto, Molecules. 2015, 20, 9229-9241.

37 O. O. Ajani, C. A. Obafemi, O. C. Nwinyi, D. A. Akinpelu, Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 214-221.

26

38 S. Ulloora, R. Shabaraya, R. Ranganathan, A. V. Adhikari, Eur. J. Med. Chem. 2013, 70, 341-349.

39 Y. Wang , G. Zhang, G. Hu, Y. Bu, H. Lei, D. Zuo, M. Han, X. Zhai, P. Gong, Eur. J. Med. Chem., 2016, 123, 80-89.

40 M. M. E. Shakdofa, M. H. Shtaiwia, N. Morsya, T. M. A. Abdel-rasseld, Main Group Chem., 2014, 13,

187-218. 41 K. Kral, T. Bieg, A. Kudelko, A. Barabaś, A. Dąbrowska, I. Wandzik, Nucleos. Nucleot. Nucl., 2017, 36, 159-169.

42 A. Kudelko, W. Zieliński, K. Ejsmont, Tetrahedron, 2011, 37, 7838-7845.

43 G. Bartkowiak, Ł. Popenda, S.Jurga, G. Schroeder, New J. Chem. 2015, 39, 4695–4707.

44 N. Galic´, A. Dijanošic´, D. Kontrec, S. Miljanic´, Spectrochim. Acta Part A: Molecular and BiomolecularSpectroscopy.

2012, 95, 347–353.

45 A. B. Lopes, E. Miguez, A. E. Kummerle, et al. Characterization of amide bond conformers for a novel heterocyclic template

of N-acylhydrazone derivatives. Molecules. 2013, 18, 11683–704.

46 A. Yu. Ershova, I.V. Lagodab S. I. Yakimovichc, V. V. Pakal’nisc, I. V. Zerovac, A. V. Zerovac, V.V. Shamanina,. Tau-

tomerism and conformational isomerism of mercaptoacetylhydrazones of aliphatic and aromatic aldehydes. Russ. J. Org.

Chem. 2009, 45, 5, 660–666.

47 B. Knobloch, C. P. Da Costa, W. Linert, H. Sigel, Inorg. Chem. Comm., 2003, 6, 90-93.

48 B. Knobloch, W. Linert,W. PNAS. 2005, 102, 7459–7464

49 A. A.H. Abdel-Rahman, O. M. Ali, A. A.S. J. Abdel-Megeed, Heterocyclic Chem., 2013, 50, 484.

50 J. Becher, I. Seidel, W. Plassb, D. Klemm, Tetrahedron, 2006, 62, 5675-5681.

51 J. Becher, I. Seidel, W. Plassb, D. Klemm, Tetrahedron, 2006, 62, 5675-5681.

52 K. Kral, I. Wandzik, „Lektyny wiążące chitynę – zastosowanie w badaniach biologicznych”, w Badania i Rozwój Młodych

Naukowców w Polsce, Materiały konferencyjne – wiosna część II, Wydawnictwo Młodzi Naukowcy, Wrocław, 2016.

53 L. Glaser, D. H. Brown, J. Biol. Chem., 1957, 228, 729-742.

54 F. A. Keller, E. Cabib, J. Biol. Chem., 1971, 246, 160-166.

55 P. Orlean, J. Biol. Chem. 1987, 262, 12, 5732-5739.

56 H. A. Lucero, M. J. Kuranda, D. A. Bulik, Anal. Biochem., 2002, 305, 97-105.

57 M. C. Arendrup, M. Cuenca-Estrella, C. Lass-Flörl,W. Hope, EUCAST technical note on the EUCAST definitive document

EDef 7.2: Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts

EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin. Microbiol. Infect., 2012, 18, E246–E247.

58 Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Sus-

ceptibility Testing (EUCAST). Clin. Microbiol. Infect. 2008, 14, 982-984.

59 M. J. Hall, R. F. Middleton, D. Westmacott, J. Antimicrob. Chemother. 11, 1983, 427-433.

60 R. Musiol, A. Mrozek-Wilczkiewicz, J. Polański, Current Medicinal Chemistry, 2014, 21, 1, 1-24.

61 T. H. Kang, E. I. Hwang, B. S. Yun, C. S. Shin, S. Kim, 2008, Biol. Pharm. Bull. 31, 755-759.

27

WYKAZ OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH

Lista Publikacji:

1. T. Bieg, K. Kral, J. Paszkowska, W. Szeja, I. Wandzik, “Microwave assisted regioselective

benzylation: an access to glycal derivatives with a free hydroxyl group at C4”, J. Carbohydr.

Chem., 31, 2012, 593-601

2. J. Paszkowska, K. Kral, T. Bieg, U. Nawrot, W. Szeja, I. Wandzik, „Synthesis and biological

evaluations of 5’-substituted derivatives of uridine as glycosyltransferase inhibitors”, Mole-

cules, 18, 2013, 8018-8027

3. K. Kral, J. Paszkowska. K. Piaskowy, M. Chwaszcza, I. Wandzik, "Syntaza chitynowa, jako

cel molekularny w poszukiwaniu środków przeciwgrzybiczych" w Na pograniczu chemii i bio-

logii, Wydawnictwo Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, 31, 2013, 251 –260.

4. J. Paszkowska, K. Kral, T. Bieg, K. Żaba, K. Węgrzyk, N. Jaśkowiak, A. Molinaro, A. Silipo,

I. Wandzik „Synthesis and biological evaluation of 5’-glycyl derivatives of uridine as inhibitors

of 1,4-β-galactosyltransferase” Bioorganic Chemistry, 58, 2015, 18-25.

5. K. Kral, T. Bieg, U. Nawrot , K.Włodarczyk, A. Lalik,

Przemysław Hahn, Ilona Wandzik, “New monomeric and dimeric uridinyl derivatives as in-

hibitors of chitin synthase”, Bioorganic Chemistry 61, 2015, 13–20.

6. K. Kral, I. Wandzik, „Lektyny wiążące chitynę – zastosowanie w badaniach biologicznych”,

w Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce, Materiały konferencyjne – wiosna część

II, Wydawnictwo Młodzi Naukowcy, Wrocław, 2016.

7. K. Kral, T. Bieg, A. Kudelko, A. Barabaś, A. Dąbrowska, I. Wandzik, “New N-substituted

hydrazones, derivatives of uridyl aldehyde”, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids,

2017, 36, 159-169.

Prezentacje konferencyjne:

1. 6th Central Europe Conference – "Chemistry towards Biology": 10-13 września 2013, Triest,

Włochy,"C-5’ substituted uridine derivatives as Schiff base ligands", K. Kral, J. Paszkowska,

T. Bieg, A. Kudelko, I. Wandzik – poster

2. Gliwickie Spotkania Naukowe: 15-16.11.2013, Gliwice, "Synthesis of dimeric uridine deriva-

tive - potential inhibitor of chitin synthase", K. Kral, J. Paszkowska, T. Bieg, I. Wandzik –

poster

28

3. 27th International Carbohydrate Symposium: Bangalore, 12-17 stycznia 2014, Bangalore, In-

die, “Synthesis of 5’- uridinyl diamide derivatives as analogues of peptidyl antibiotics”,

I. Wandzik, J. Paszkowska, T. Bieg, K. Kral, U. Nawrot, K. Żaba, W. Szeja – poster

4. Multidyscyplinarna Konferencja Nauki o Leku: 12-14 maja 2014, Korytnica/k. Szydłowa

„Evaluation of anti-denaturation activity of C-5’ – substituted uridine derivatives”, K. Kral,

J. Paszkowska, N. Jaśkowiak, I. Wandzik – poster

5. Chemistry Towards Biology: 9-12 września, 2014, Katowice, „Are dimeric uridine derivatives

promising candidates for chitin synthase inhibition?”, K. Kral , P. Hahn, T. Bieg, J. Paszkow-

ska, U. Nawrot, I. Wandzik – poster

6. 58 Ogólnopolski Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa Chemicznego: 21-25 września 2015,

Gdańsk, New uridinyl derivativws as inhibitors of chitin synthase, K. Kral, T. Bieg, U. Na-

wrot, K.Włodarczyk, A. Lalik, P. Hahn, I. Wandzik – poster

7. “Na pograniczu chemii i biologii”, XI Ogólnopolskie Seminarium Doktorantów, 1-4 czerwca

2013, Ustroń. „Synteza inhibitorów syntazy chitynowej, jako potencjalnych środków przeciw-

grzybiczych”, K. Kral – referat

Staże naukowe:

Staż naukowy w ramach Projektu Canaletto na Uniwersytecie Fryderyka II w Neapolu w okresie

23.09.2014 – 23.10.2014. Prowadzenie badań w zakresie izolacji syntazy chitynowej oraz

oddziaływania białko-ligand techniką STD NMR.

Projekty:

Wykonawca w projekcie: POIG.01.01.02-14-102/09 „Cukry jako surowce odnawialne w syntezie

produktów o wysokiej wartości dodanej”, współfinansowany przez Unię Europejską

z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego.

Stypendia:

1. Stypendium „DoktoRIS - Program stypendialny na rzecz innowacyjnego Śląska” Wspołfinan-

sowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (2013 – 2015).

2. Zwiększenie stypendium doktoranckiego z dotacji na działania projakościowe przyznawane

dla 30% najlepszych doktorantów w latach 2012/2013, 2013/2014.

3. Stypendium dla najlepszych doktorantów w roku 2012/2013.