1

Katarzyna Poniedziałek-Kempny, Iwona Rajska, Izabela Mandryk,

Barbara Gajda

Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków świni

Kraków 2015

2

Instrukcja wdro żeniowa Nr i-1/2015

DYREKTOR INSTYTUTU ZOOTECHNIKI PIB

prof. dr hab. Eugeniusz Herbut

Opracowano: w Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierząt

Kierownik: prof. dr hab. Zdzisław Smorąg

Recenzenci: dr Jarosław Wieczorek

Opracowanie redakcyjne: mgr Magdalena Bielska

Zdj ęcie na okładce: abc.news.go.com

Skład komputerowy, druk i oprawa: Maria Makarewicz

ISBN 978-83-7607-250-0

Drukowano w Zespole Wydawnictw i Poligrafii IZ PIB.

– 3 –

Niniejsza instrukcja przedstawia stosowane w Dziale Biotech-nologii Rozrodu Zwierząt Instytutu Zootechniki Państwowego Instytutu Badawczego techniki zapłodnienia in vitro metodą standardową oraz metodą ICSI oocytów świni. Techniki te są stosowane i optymalizowa-ne w ramach prac badawczych związanych z realizacją tematów statu-towych, grantów autorskich oraz Funduszu Badań Własnych IZ PIB, jak również realizowanych prac magisterskich i doktorskich.

Autorzy

– 4 –

Wstęp

Rozwój biotechnologii rozrodu świń, a w szczególności trans-genezy oraz klonowania, pociąga za sobą potrzebę rozwoju metod, któ-re zapewniają uzyskiwanie dobrej jakości gamet i zarodków tego ga-tunku. Podstawową technologią jest tutaj pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków, które jest cennym alternatywnym dla uzyskiwanych w wa-runkach in vivo źródłem zarodków. Jest to metoda kompleksowa po-zwalająca też w sposób bardziej precyzyjny, niż ma to miejsce w wa-runkach in vivo, na uzyskiwanie zarodków w ściśle określonym sta-dium rozwoju. Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków składa się z kilku etapów biologicznych takich jak: dojrzewanie in vitro oocytów, zapłodnienie in vitro oraz hodowla in vitro zarodków. Metody dojrzewania in vitro oocy-tów oraz hodowla in vitro zarodków świni zostały zaprezentowane w broszurach pt. „Dojrzewanie in vitro oocytów świni” oraz „Hodowla in vitro zarodków ssaków”. Niniejsza broszura dotyczy jednego z etapów pozaustrojowego uzyskiwania zarodków świni, tj. zapłodnienia in vitro.

Pierwsze udane próby zapłodnienia in vitro u świni przeprowa-dzili w 1986 roku Cheng i inni. Pozwoliły one na uzyskanie prosięcia po zapłodnieniu oocytów dojrzałych in vivo nasieniem świeżym, ejaku-lowanym. Kolejną próbą uwieńczoną sukcesem były badania przepro-wadzone przez Mattioli i in. (1989) z użyciem do zapłodnienia oocytów dojrzałych in vitro, z których po przeniesieniu uzyskano żywe prosięta. Te osiągnięcia zapoczątkowały intensywne badania zmierzające do opracowania technologii o wysokiej efektywności. Koncentrowały się one na badaniach takich czynników jak: jakość oocytów przeznaczo-nych do dojrzewania i zapłodnienia czy jakość plemników i ich przygo-towanie. Mimo tych wysiłków efektywność pozaustrojowego uzyski-wania zarodków u świń nadal pozostaje na niskim poziomie. Do zapłodnienia in vitro u świń wykorzystuje się nasienie knu-ra ejakulowane (Binh i in., 2009) lub najądrzowe (Kolbe i Holtz, 1999), bezpośrednio po pobraniu ((Kolbe i Holtz, 2000), po konserwacji w stanie płynnym (Kim i in., 1998) lub zamrożonym (Garcia-Rosello i in., 2006). Podejmowane są też próby zapłodnienia nasieniem liofilizowa-nym (Kang i in., 2014).

– 5 –

Obecnie stosowane metody zapłodnienia in vitro u świń pozwa-lają na uzyskanie ok. 60−70% zapłodnionych oocytów. Jednakże odse-tek prawidłowych oocytów zapłodnionych pojedynczym plemnikiem jest znacznie niższy. Wniknięcie do oocytu więcej niż jednego plemni-ka, czyli zapłodnienie polispermiczne jest jednym z głównych proble-mów zapłodnienia in vitro u świń. Zjawisko to występuje u ponad 50% zapłodnionych oocytów. Rozwiązaniem problemu polispermii może być wykorzystanie do zapłodnienia techniki docytoplazmatycznej in-iekcji plemnika lub główki plemnika lub samego jądra do oocytu, czyli metoda ICSI (ang. Intra Cytoplasmic Sperm Injection). Oprócz ICSI podejmowane są próby stosowania innych technik umożliwiających wprowadzenie plemnika do oocytu takich jak: częściowe nacięcie osłonki przejrzystej oocytu − PZD (Partial Zona Dissection), mecha-niczne lub chemiczne wykonanie otworu w osłonce przejrzystej – ZD (Zona Drilling) oraz iniekcja plemnika pod osłonkę przejrzystą oocytu – SUZI (Subzonal Sperm Injection). U świń po raz pierwszy zapłodnienie techniką ICSI przeprowa-dzili Catt i Rhodes w 1995 roku, ale dopiero późniejsze doświadczenia przeprowadzone przez Kolbe i Holtza (2000) oraz Martina (2000) po-zwoliły uzyskać na tej drodze żywe potomstwo. Iniekcję plemnika do oocytu przeprowadza się w mikroskopie odwróconym z wykorzystaniem mikromanipulatorów wyposażonych w pipetę podtrzymującą oraz iniekcyjną. Po dokonaniu iniekcji oocyty poddaje się sztucznej aktywacji i przeznacza do hodowli in vitro. Zaletą metody ICSI może być wykorzystanie jej do zapłodnienia nasieniem o obniżonej koncentracji lub ruchliwości plemników (Kolbe i Holtz, 1999), nasieniem seksowanym (Probst i Rath, 2003), kriokonserwowa-nym (Lopez-Saucedo i in., 2012) czy też pobranym post mortem (Li i in., 2013). Metoda ICSI jest obecnie rutynowo stosowana w zapłodnieniu pozaustrojowym u ludzi w większości klinik na świecie, również w Polsce. W przypadku zwierząt gospodarskich metoda ta nie znalazła szerszego zastosowania m. in. z powodu niskiej efektywności (Man-dryk, 2013). W tej sytuacji uzasadnionym jest zastosowanie tej metody do takich celów jak uzyskiwanie zwierząt transgenicznych poprzez wy-korzystanie plemników jako wektorów egzogennego DNA (Perry i in., 1999), ochrona gatunków zagrożonych wyginięciem (Cheng i in., 2012)

– 6 –

czy też w programach zachowania bioróżnorodności (Lee i Yang, 2004). Niezależnie od celów, w jakich metoda ICSI jest stosowana, ba-dania z jej wykorzystaniem przyczyniły się do poznania fundamental-nych mechanizmów zachodzących w trakcie zapłodnienia i wczesnego rozwoju zarodkowego u ssaków (Yong i in., 2003). W niniejszej broszurze przedstawione zostały metody postępo-wania w zapłodnieniu in vitro u świń metodą standardową oraz metodą ICSI, które były i nadal są stosowane w pracach badawczych w Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierząt Instytutu Zootechniki Państwowego Instytutu Badawczego.

– 7 –

Zapłodnienie in vitro u świni metodą standardową

Do standardowego zapłodnienia in vitro przeznacza się oocyty dojrzałe, czyli takie, które osiągnęły stadium metafazy II.

Zdolność do zapłodnienia muszą posiadać także plemniki. W warunkach in vivo zdolność do zapłodnienia plemniki uzyskują w drogach rodnych samicy, gdzie ulegają kapacytacji. Proces ten moż-na przeprowadzić również w warunkach in vitro. Kapacytacja in vitro plemników polega na ich inkubacji w odpowiedniej pożywce kapacyta-cyjnej o zbliżonym składzie do płynu jajowodowego. Zawarte w po-żywce związki stymulują procesy biochemiczne prowadzące do zmian na powierzchni błon komórkowych plemnika umożliwiające uzyskanie zdolności do zapłodnienia.

Pożywki stosowane do zapłodnienia Pożywki przygotowuje się w laboratorium. Po odważeniu od-

czynników (kat. Sigma) na wadze analitycznej rozpuszcza się je w wo-dzie destylowanej, dostępnej komercyjnie (kat. Sigma). Pożywki przed zastosowaniem filtruje się przy pomocy filtrów miliporowych 0,22 µl Millex- GS (f. Renner). Bezpośrednio, przed użyciem pożywkę ogrze-wa się do temperatury 39oC i stabilizuje się w inkubatorze CO2 (w wa-runkach 5% stężenia CO2 w atmosferze i maksymalnej wilgotności)

a) Pożywka do kapacytacji plemników

Kapacytację plemników przeprowadza się w pożywce zmodyfikowanej mM199. Pożywka kapacytacyjna powinna posiadać pH 6,0–6,2. Skład pożywki mM199 do kapacytacji plemników (na 50 ml H20):

1) TCM 199 (M2520) − 0,7350 g 2) CaCl2 − 0,0162 g 3) Pirogronian sodu − 0.0050 g 4) NaHCO3 − 0,1000 g 5) Glukoza − 0,0275 g 6) HEPES − 0,2980 g 7) BSA − 0,2000 g

– 8 –

b) Pożywka do zapłodnienia Standardowe zapłodnienie in vitro przeprowadza się w zmodyfikowa-nej pożywce mM199 (modified Medium 199, Yang i in. 1999) z dodat-kiem kofeiny. Skład pożywki mM199 do zapłodnienia (na 50 ml H2O):

1) TCM 199 (M2520) − 0,7350 g 2) CaCl2 − 0,0162 g 3) Pirogronian sodu − 0.0050 g 4) NaHCO3 − 0,1000 g 5) Glukoza − 0,0275 g 6) HEPES − 0,2980 g 7) BSA − 0,2000 g 8) Kofeina − 0,0975 g

Po rozpuszczeniu składników oznacza się pH pożywki za pomocą apa-ratu do oznaczania pH lub pasków wskaźnikowych. Pożywka powinna mieć wartość pH 7,0–7,2.

1) Postępowanie z oocytami Oocyty świni dojrzałe in vitro przed inkubacją z plemnikami pozbawia się komórek wzgórka jajonośnego metodą enzymatyczną po-przez umieszczenie oocytów w 0,02% roztworze hialuronidazy (0,002 g/ml PBS). Pozostałe komórki oczyszcza się metodą mechaniczną za pomocą specjalnej pipetki. Następnie oocyty umieszcza się we wcze-śniej przygotowanych kroplach 50 µl pożywki IVF pod olejem mine-ralnym.

Fot. 1. Holder wraz z pipetką do usuwania komórek wzgórka jajonośnego (f. Vitrolife)

– 9 –

Fot. 2. Oocyt dojrzały z rozproszonym wieńcem komórek wzgórka

jajonośnego

Fot. 3. Oocyt dojrzały pozbawiony komórek wzgórka jajonośnego

z widocznym ciałkiem kierunkowym

– 10 –

2) Postępowanie z nasieniem 1 ml świeżego nasienia knura (ejakulowanego, rozrzedzonego w jednym z komercyjnych rozrzedzalników) odwirowuje się przez 25 sekund (6000 rpm). Uzyskaną frakcję plemników wiruje się ponownie 2-krotnie w roztworze PBS z dodatkiem 0,001 g/ml BSA (albumina surowicy bydlęcej). Kolejną uzyskaną frakcję plemników rozcieńcza się w pożywce do kapacytacji w celu otrzymania koncentracji plemni-ków 1mln/ml. Następnie plemniki inkubuje się przez 1 godzinę w tem-peraturze 39oC i w atmosferze 5% CO2 w powietrzu.

Fot. 4. Wirówka laboratoryjna (f. Eppendorf) Ocena nasienia Nasienie przeznaczone do zapłodnienia poddaje się ocenie pod

mikroskopem biologicznym. Ocenia się ruch ogólny, ruch postępowy oraz koncentrację plemników. Ocenę ruchu postępowego oraz koncen-trację przeprowadza się w komorach Leja 20 (Leja Products BV) przy użyciu komputerowo wspomaganej analizy SCA (Computer Assisted Sperm System). Koncentrację plemników można także oceniać przy pomocy komory Bürkera.

– 11 –

Fot. 5. Mikroskop biologiczny do oceny nasienia (f. Nikon)

Fot. 6. Komora Bürkera do oceny koncentracji plemników

Fot. 7. Komora Leja do oceny plemników przy pomocy programu SCA

– 12 –

Fot. 8. Ocena nasienia przy pomocy programu komputerowego SCA

3) Inkubacja gamet Do kropli z oocytami dodaje się 50 µl pożywki kapacytacyjnej

z plemnikami. Inkubację gamet przeprowadza się w temperaturze 39oC, atmosferze 5% CO2 w powietrzu przez 4 godziny.

Fot. 9. Inkubacja gamet w kroplach pożywki do zapłodnienia

4) Hodowla in vitro potencjalnych zygot Po inkubacji potencjalne zygoty przepłukuje się 4-krotnie

w pożywce do hodowli zarodków NCSU-23 i przekłada się do pożywki NCSU-23 znajdującej się w plastikowych naczynkach 4-oczkowych (f. Nunc). W jednym oczku naczynka umieszcza się 10−12 zarodków. Hodowlę prowadzi się w temperaturze 39oC, 5% stężeniu CO2 w po-

– 13 –

wietrzu i maksymalnej wilgotności (inkubator CO2). Czas hodowli wy-nosi 6−8 dni. Co 24 godziny przeprowadza się ocenę zarodków pod mikroskopem stereoskopowym. Szczegółowy opis metody hodowli in vitro zarodków przedstawiono w instrukcji pt. „Hodowla in vitro za-rodków ssaków”.

Fot. 10. Inkubator do hodowli oocytów i zarodków (f. Eppendorf)

Fot. 11. Blastocysta ekspandująca uzyskana w wyniku zapłodnienia

i hodowli in vitro

– 14 –

Zapłodnienie in vitro u świń metodą ICSI

Pożywki Wszystkie manipulacje z oocytami oraz iniekcję plemnika do

cytoplazmy oocytu przeprowadza się w zmodyfikowanej pożywce NCSU-37 bez glukozy (IVC-PyrLac-HEPES), uzupełnionej pirogronia-nem sodu, mleczanem sodu, β-merkaptoetanolem, BSA oraz HEPES. Wartość pH pożywki IVC-PyrLac-HEPES powinna wynosić 7,2.

a) Pożywka do manipulacji z oocytami i do iniekcji plemnika

(IVC-PyrLac-HEPES) (na 50 ml H2O): 1. NaCl − 0,3177 g 2. NaHCO3 − 0,1053 g 3. KCl − 0,0178 g 4. KH2PO4 − 0,0081 g 5. MgSO4⋅7H2O − 0,0147 g 6. CaCl2⋅2H2O − 0,0125 g 7. D-sorbitol − 0,1093 g 8. Penicylina − 0,0032 g 9. Streptomycyna − 0,0025 g

Uzupełnienie do pożywki IVC-PyrLac-HEPES (na 30 ml H2O):

1. Pirogronian sodu − 0,0006 g 2. Mleczan sodu − 0,0092 g 3. β-merkaptoetanol − 1,50 µl 4. BSA − 0,1200 g 5. HEPES − 0,1431 g

b) Pożywka do przygotowania plemników (na 10 ml PBS):

1. BSA − 0,004 g/ml

c) Pożywka do manipulacji z plemnikami (IVC-PyrLac-HEPES-PVP):

1. PVP − 0,2 g 2. PBS − 4,8 ml

Wartość pH pożywki IVC-PyrLac-HEPES-PVP powinna wy-nosić 7,0.

– 15 –

d) Roztwór do aktywacji oocytów po iniekcji (na 10 ml H2O): 1. D-mannitol − 0,0005 g 2. CaCl2 − 0,0001 g 3. MgSO4 − 0,0001 g 4. BSA − 0,01 g

1. Postępowanie z oocytami Podobnie jak w przypadku zapłodnienia metodą standardową,

dojrzałe in vitro oocyty oczyszcza się enzymatycznie z komórek wzgórka jajonośnego. Pozbawione komórek oocyty wiruje się w 0,5 ml pożywki IVC-PyrLac-HEPES przez 4 minuty (16000 rpm) celem odsu-nięcia ciemnych kropel lipidowych na brzeg oocytu.

Fot. 12. Dojrzały oocyt świni po odwirowaniu

2. Postępowanie z plemnikami 1 ml nasienia knura wiruje się przez 4 minuty (1000 rpm). Uzy-

skaną frakcję plemników przemywa się w pożywce PBS-BSA i wiruje 3-krotnie w pożywce IVC-PyrLac-Hepes-PVP. Tak przygotowane plemniki przeznacza się bezpośrednio do iniekcji oocytów.

3. Iniekcja plemnika do cytoplazmy oocytu Iniekcję plemnika do oocytu przeprowadza się w temperaturze

38,5°C, w mikroskopie odwróconym z dołączonymi mikromanipulatorami.

– 16 –

Fot. 13. Mikroskop odwrócony f. Nikon z dołączonymi mikromanipulatorami

W tym celu przygotowuje się sterylną szalkę Petriego z 3 µl kroplą mieszaniny plemników w pożywce IVC-PyrLac-Hepes-PVP oraz 10 µl kroplą pożywki manipulacyjnej IVC-PyrLac-Hepes do której wprowadza się oocyty. Wszystkie krople pokrywa się ogrzanym olejem mineralnym.

Fot. 14. Szalka Petriego z dwoma kroplami pożywki IVC-PyrLac-Hepes-PVP

Iniekcję plemnika do cytoplazmy oocytu przeprowadza się za pomocą szklanej pipety iniekcyjnej przygotowanej w warunkach labo-ratoryjnych lub dostępnej komercyjnie. Za pomocą drugiej pipety pod-trzymującej unieruchamia się oocyt tak, aby I ciałko kierunkowe było

– 17 –

widoczne w pozycji godziny 12 lub 6. Takie ułożenie oocytu pozwala na przeprowadzenie iniekcji bez uszkodzenia jego wrzeciona kariokine-tycznego. Po wyszukaniu plemnika o prawidłowej budowie morfolo-gicznej, końcem pipety iniekcyjnej unieruchamia się go poprzez złama-nie wstawki lub witki i wraz z niewielką ilością pożywki aspiruje od strony witki lub główki do wnętrza pipety. Następnie pipetą iniekcyjną w pozycji godziny 3, w sposób manualny przebija się otoczkę przejrzy-stą oocytu, aspiruje niewielką ilość cytoplazmy oocytu, uwalniając do wnętrza oocytu zawartość pipety iniekcyjnej (plemnik wraz z pobraną cytoplazmą oraz niewielką objętością pożywki).

Fot. 15. Iniekcja plemnika do cytoplazmy dojrzałego oocytu (Martin, 2000)

Bezpośrednio po iniekcji usuwa się pipetę iniekcyjną i uwalnia

oocyt z pipety podtrzymującej. Ma to na celu zminimalizowanie ciśnie-nia wewnątrzkomórkowego wywieranego na oocyt.

4. Aktywacja oocytów po iniekcji Po wykonaniu iniekcji oocyty wraz z wprowadzonym plemni-

kiem poddawane są aktywacji w komorze do elektroporacji, pomiędzy dwoma równoległymi elektrodami i stymulowane impulsem 1,5 kV/cm przez 20 µs.

5. Hodowla in vitro potencjalnych zygot Potencjalne zygoty uzyskane w wyniku zapłodnienia metodą

ICSI hoduje się podobnie jak uzyskane po zapłodnieniu metodą stan-dardową.

– 18 –

Wykaz wyposażenia

1. Aparatura • Komora laminarna • Mikroskop stereoskopowy, np. Nikon SMZ-10A • Mikroskop stereoskopowy, np. Nikon SMZ-1270 • Mikroskop odwrócony, np. Nikon z dołączonym mi-

kromanipulatorem • Stolik podgrzewany + płytka grzejna jako urządzenie

dodatkowe do mikroskopu stereoskopowego (prod. firmy SEMIC) i mikroskopu odwróconego

• Mikroskop fluorescencyjny (do oceny jakości uzyska-nych blastocyst) np. Nikon ECLIPSE E600

• Komora do elektroporacji BTX ElectroCell Manipula-tor 2000

• Inkubator CO2 (z automatyczną regulacją dwutlenkiem węgla) np. MCO-17AIC (f. SANYO) lub Galaxy 48R (f. Eppendorf)

• Program komputerowy CASA do analizy nasienia • Butla z dwutlenkiem węgla • Waga laboratoryjna, np. MSA125P-100-DA (f. Sarto-

rius) • Lodówka z zamrażarką • Autoklaw • Wirówka R5430 (f. Eppendorf )

2. Drobny sprzęt laboratoryjny

Pipety automatyczne o poj.: • 0,5 – 10 µl + jednorazowe sterylne końcówki • 2 – 20 µl + jednorazowe sterylne końcówki • 20 – 200 µl + jednorazowe sterylne końcówki • 100 – 1000 µl + jednorazowe sterylne końcówki • 500 – 2500 µl + jednorazowe sterylne końcówki • Statyw do pipet automatycznych

Holder − Pipeta do usuwania komórek wzgórka jajono-śnego (np. f. Vitrolife)

– 19 –

• Końcówki do Holdera – np. nr kat. 14301, 14302, 14306, 14313 (f. Vitrolife)

• Pipety ICSI – np. nr kat. 14321, 15415 (f. Vitrolife) • Pipety holdingowe – np. nr kat. 15653 (f. Vitrolife)

3. Szkło i plastiki laboratoryjne

Szkło: • Naczynka wagowe + szpatułki • Naczynka embriologiczne z wklęsłym dnem – wzór

użytkowy nr 112506 • Szkiełka zegarkowe o średnicy 40 mm • Szkiełka laboratoryjne podstawowe • Szkiełka laboratoryjne nakrywkowe • Komora Bürkera • Komora Leja

Plastiki: • Probówki wolnostojące Falcon o poj. 50 ml – kat. nr

P15-G • Probówki stożkowe Falcon o poj. 15 ml – kat. nr P15-C • Probówki Eppendorf Safe-Lock PCR Clean o poj. 0,5

ml – kat. nr 0030 123 301 • Probówki Eppendorf Safe-Lock PCR Clean o poj. 1,5

ml – kat. nr 0030 123 328 • Strzykawki jednorazowe o poj. 5, 10 i 20 ml • Igły do strzykawek 1,2 x 40 mm • Filtry miliporowe 0,22 µl Millex-GS (prod. Renner) • Szalka Petriego BD Falcon 100 x 15 mm • Szalka Petriego BD Falcon 60 x 15 mm • Szalka Petriego BD Falcon 60 x 15 mm IVF Round

Dish • Naczynka plastikowe 4-oczkowe (prod. Nunc) • Zlewki plastikowe o poj. 500 ml

– 20 –

4. Materiały medyczne • Kompresy jałowe z gazy 13-nitkowej o wymiarach 7 x

7 cm • Rękawice jałowe • Trzonek do skalpela + wymienne ostrza nr 22 • Pęsety anatomiczne • Nożyczki okulistyczne

5. Płyny i pożywki

• Płyn do manipulacji z oocytami: Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline op. 100 ml – kat. Sigma nr D4031

• Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V op. 25 g – kat. Sigma nr A491

• Surowica płodów bydlęcych (FCS) op. 100 ml – kat. Sig-ma nr F7524

• Pożywka TCM-199 op. 1 L – kat. Sigma nr M2520 • HEPES op. 5 g – kat. Sigma nr H4034 • Płyn pęcherzykowy – przygotowany w laboratorium

6. Odczynniki

• H20 op. 100 ml – kat. Sigma nr W3500 • NaCl op. 500 g – kat. Sigma nr S5886 • KCl op. 250 g – kat. Sigma nr P5405 • CaCl2 op. 100 g – kat. Sigma nr C1016 • KH2PO4 op. 100 g – kat. Sigma nr P5655 • MgSO4 op. 500 g – kat. Sigma nr M2643 • NaHCO3 op. 500 g – kat. Sigma nr S5761 • Penicylina op. 10 MU – kat. Sigma nr P3032 • Streptomycyna op. 5 g – kat. Sigma nr S1277 • Phenol Red op. 5 g – kat. Sigma nr P3532 • Tauryna op. 25 g – kat. Sigma nr T8691 • Hipotauryna op. 5 g – kat. Sigma nr H1384 • Glukoza op. 100 g – kat. Sigma nr G8270 • α-glutamina op. 25 g – kat. Sigma nr G8540 • Kofeina op. 5 g – kat. Sigma nr C0750 • Pirogronian sodu op. 25 g – kat. Sigma nr P4562

– 21 –

• Hialuronidaza op. 500 mg – kat. Sigma nr H3506 • Olej mineralny op. 500 ml – kat. Sigma nr M8410 • D-sorbitol op. 100 g – kat. Sigma nr S1876 • Mleczan sodu op. 5 g – kat. Sigma nr L7022 • MgSO4⋅7H2O op. 25 g – kat. Sigma nr 230391 • CaCl2⋅2H2O op. 5 g – kat. Sigma nr C7902 • β-merkaptoetanol op. 5 g – kat. Sigma nr M6250 • Poliwinylopirolidon op. 100 g – kat. Sigma nr PVP 360 • Kanamycyna op. 5 g – kat. Sigma nr K1377 • L-cysteina op. 25 g – kat. Sigma nr C7352 • 10 N roztwór NaOH – przygotowany w laboratorium

Dodatkowe wyposażenie: • Paski wskaźnikowe pH 6,2-8,2 – kat. nr 715753288 (prod.

firmy Avantor Performance Materials Poland) • Termos do transportu jajników i nasienia do laboratorium

Fot. 12.: : http://active-medical-practice.com/live-piglets-derived-from-in-vitro-produced-zygotes-results.html Pozostałe fotografie wykonali: Prof. dr hab. Barbara Gajda Dr inż. Izabela Mandryk Mgr inż. Katarzyna Poniedziałek-Kempny Mgr inż. Iwona Rajska

– 22 –

Literatura Binh N.T., Van Thuan N., Miyake M. (2009). Effects of liquid preservation of sperm on their ability to activate oocytes and initiate preimplantational devel-opment after intracytoplasmic sperm injection in the pig. Theriogenology 71, 1440−1450. Catt J.W., Rhodes S.L. (1995). Comparative intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in human and domestic species. Reprod. Fert. Develop., 7: 161−167. Cheng W.T.K, Polge C., Moor R.M. (1986). In vitro fertilization of pig and sheep. Theriogenology 25, p. 146 (abstract). Cheng W.M., Wu Z.H., Zhang X., Zhu Y.B., Pang Y.W., Guo M., Wang D., Tian J.H. (2012). Effects of different activation regimens on pronuclear for-mation and developmental competence of in vitro-matured porcine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reprod. Domest. Anim., 47: 609−614. Garcia-Rosello E., Coy P., Vasquez F.A.G., Ruiz S., Matas C. (2006). Analy-sis of different factors influencing the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) yield in pigs. Theriogenology, 66: 1857−1865. Kang H.H., Lee J.W., Kang M.J., Kim K.H., Moon S.J. (2014). In vitro devel-opment of porcine oocytes following intracytoplasmic sperm injection of freeze-dried spermatozoa with trehalose. J. Embryo Transfer, 29: 51−57. Kim N.H., Lee J.W., Jun S.H., Lee H.T., Chung K.S. (1998). Fertilization of porcine oocytes following intracytoplasmic spermatozoon or isolated sperm head injection. Mol. Reprod. Dev., 51: 436−444. Kolbe T., Holtz W. (1999). Intracytoplasmic injection (ICSI) of in vivo or in vitro matured oocytes with fresh ejaculated or frozen-thawed epididymal spermatozoa and additional calcium-ionophore activation in the pig. Theri-ogenology, 52: 671−682. Kolbe T., Holtz W. (2000). Birth of a piglet derived from an oocyte fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Anim. Reprod. Sci., 64: 97−101. Lee J.W., Yang X. (2004). Factors affecting fertilization of porcine oocytes following intracytoplasmic injection of sperm. Mol. Reprod. Dev., 68: 96−102.

– 23 –

Li X.X., Lee D.S., Kim K.J., Lee J.H., Kim E.Y., Park J.Y. (2013). Leptin and nonessential amino acids enhance porcine preimplantation embryo development in vitro by intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology, 79: 291−298. Lopez-Saucedo J., Paramio-Nieto M.T., Fierro R., Pina-Aguilar R.E. (2012). Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in small ruminants. Anim. Reprod. Sci., 133: 129−138. Mandryk I. (2013). Optymalizacja warunków hodowli zarodków uzyskanych po zapłodnieniu metodą ICSI świeżych i kriokonserwowanych oocytów świni. Praca doktorska, Wyd. IZ PIB. Martin M.J. (2000). Development of in vivo-matured porcine oocytes follow-ing intracytoplasmic sperm injection. Biol. Reprod., 63: 109−112. Mattioli M., Bacci M.L., Galeati G., Seren E. (1989). Developmental compe-tence of pig oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology, 31: 1201−1207. Probst S., Rath D. (2003). Production of piglets using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flowcytometrically sorted boar semen and artificially activated oocytes. Theriogenology, 59, 961−973. Perry A.C., Wakayama T., Kishikawa H., Kasai T., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. (1999). Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science, 284: 1180−1183. Rajska I. (2015). Iniekcja plemnika do cytoplazmy (ICSI) jako alternatywa dla standardowego zapłodnienia in vitro u świń. Rocz. Nauk. PTZ, 11: 55−66. Yang J.G., Chen W.Y., Li P.S. (1999). Effects of glucocorticoids on matura-tion of pig oocytes and their subsequent fertilizing capacity in vitro. Biol. Re-prod., 60: 929−936. Yong H.Y., Pyo B.S., Hong J.Y., Kang S.K., Lee B.C., Lee E.S., Hwang W.S. (2003). A modified method for ICSI in the pig: injection of head membrane-damaged sperm using a 3-4 µm diameter injection pipette. Hum. Reprod., 18: 2390−2396.

– 24 –

SPIS TREŚCI

Wstęp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Zapłodnienie in vitro metodą standardową u świni . . . .

Pożywki stosowane do zapłodnienia . . . . . . . . .

Postępowanie z oocytami . . . . . . . . . . . . .

Postępowanie z nasieniem . . . . . . . . . . . . .

Ocena nasienia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Inkubacja gamet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Hodowla in vitro potencjalnych zygot . . .

Zapłodnienie in vitro metodą ICSI . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pożywki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Postępowanie z oocytami . . . . . . . . . . . . . .

Postępowanie z plemnikami . . . . . . . . . . .

Iniekcja plemnika do cytoplazmy oocytu .

Aktywacja oocytów po iniekcji . . . . . . . . .

Hodowla in vitro potencjalnych zygot . . .

Wykaz wyposażenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4

7

7

8

10

10

12

12

14

14

15

15

15

17

17

18

22