7/29/2019 J Med Genet-1990-Webb-627-31

1/6

JMed G e n e t 1 9 9 0 ; 2 7 : 6 2 7 - 6 3 1

F r a g i l e X q 2 7 . 3 i n f e m a l e h e t e r o z y g o t e s f o r t h eM a r t i n - B e l l s y n d r o m eT e s s a Webb, P a t r i c i a A J a c o b s

A b s t r a c tX i n a c t i v a t i o n s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t o nl y m p h o c y t e s f r o m e i g h t u n r e l a t e d f e m a l e s h e t e r o -z y g o u s f o r t h e M a r t i n - B e l l s y n d r o m e . F o u r o f t h e s ec a r r i e r s w e r e o f n o r m a l I Q a n d f o u r w e r e m e n t a l l yh a n d i c a p p e d . Wh en BrdU was u s e d t o d i f f e r e n t i a t eb e t w e e n t h e a c t i v e a n d i n a c t i v e X c h r o m o s o m e a na v e r a g e o f 55% o f f r a ( X ) w e r e a c t i v e i n t h e r e t a r d e ds u b j e c t s , b u t o n l y 27% w e r e a c t i v e i n t h o s e o fn o r m a l I Q . Wh en 3 H t h y m i d i n e was u s e d t od i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e a c t i v e a n d i n a c t i v e Xc h r o m o s o m e , a n a v e r a g e o f 58% o f m i t o s e s f r o mh a n d i c a p p e d s u b j e c t s a n d 33% o f m i t o s e s f r o mn o r m a l s u b j e c t s s h o w e d a n a c t i v e f r a ( X ) i n i n f o r m a -t i v e c e l l s . T h e s e r e s u l t s a r e c o m p a r e d w i t h p r e v i o u s l yp u b l i s h e d s t u d i e s a n d i t i s c o n c l u d e d t h a t t h en u m b e r o f i n a c t i v e f r a ( X ) c h r o m o s o m e s c a l c u l a t e da s a p r o p o r t i o n o f a l l c e l l s s c o r e d i s t h e same i nm e n t a l l y n o r m a l a n d m e n t a l l y r e t a r d e d s u b j e c t s .H o w e v e r , t h e n u m b e r o f a c t i v e f r a ( X ) c h r o m o -s o m e s i s c o n s i s t e n t l y h i g h e r i n t h e r e t a r d e d t h a n i nt h e n o r m a l f e m a l e s .S o m e o f t h e many i n t r i g u i n g a s p e c t s o f t h e c y t o -g e n e t i c s a n d i n h e r i t a n c e p a t t e r n s s h o w n i n f a m i l i e sw i t h t h e f r a g i l e X s y n d r o m e a r e t h o s e a s s o c i a t e d w i t hf e m a l e c a r r i e r s . O n e t h i r d o f f e m a l e h e t e r o z y g o t e s a r eo f i m p a i r e d m e n t a l a b i l i t y a n d n e a r l y a l w a y s h a v ed e t e c t a b l e l e v e l s o f t h e f r a g i l e X , w h i l e a p p r o x i m a t e l yo n e t h i r d o f t h e c a r r i e r s w i t h a n o r m a l I Q d o n o t s h o wt h e m a r k e r w i t h a n y c u l t u r e m e t h o d c u r r e n t l y a v a i l -a b l e . 1 2 A s a g e n e r a l r u l e t h o s e c a r r i e r f e m a l e s who a r eo f i m p a i r e d m e n t a l a b i l i t y a l s o s h o w h i g h e r l e v e l s o ff r a g i l e X t h a n d o n o r m a l c a r r i e r s , a l t h o u g h , a s w i t hD e p a r t m e n t o f C l i n i c a l G e n e t i c s , B i r m i n g h a m M a t e r n i t yH o s p i t a l , E d g b a s t o n , B i r m i n g h a m B 1 5 2TG.T Web bW e s s e x R e g i o n a l G e n e t i c s L a b o r a t o r y , G e n e r a l H o s p i t a l ,S a l i s b u r y , W i l t s h i r e S P 2 7 S X .P A J a c o b sC o r r e s p o n d e n c e t o Dr J a c o b s .

h e m i z y g o u s m a l e s , t h e l e v e l o f f r a g i l e X v e r y r a r e l y , i fe v e r , e x c e e d s 5 0 % . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t i n t h ei n t e l l e c t u a l l y n o r m a l c a r r i e r f e m a l e s t h e l e v e l o fd e t e c t a b l e f r a g i l e X i s i n v e r s e l y p r o p o r t i o n a l t o t h ea g e o f t h e s u b j e c t . 3 N e i t h e r t h e a g e e f f e c t n o r t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e n d e t e c t a b l e f r a g i l e X a n d I Q i ss h o w n b y a f f e c t e d m a l e s . D e s p i t e t h e g e n e r a l r e l a t i o n -s h i p s d e l i n e a t e d a b o v e , b o t h n o r m a l a n d h a n d i c a p p e df e m a l e h e t e r o z y g o t e s h a v e b e e n d e s c r i b e d w i t h l e v e l so f f r a g i l e X v a r y i n g f r o m 0 t o 4 0 % .One X c h r o m o s o m e i n e v e r y c e l l w i t h t w o Xc h r o m o s o m e s i s i n a c t i v a t e d e a r l y i n e m b r y o g e n e s i s ,s o t h a t o n l y o n e X r e m a i n s f u n c t i o n a l . T h i s p r o c e s s o fi n a c t i v a t i o n , o r L y o n i s a t i o n , i s b e l i e v e d t o b e r a n d o ms o t h a t a p p r o x i m a t e l y e q u a l p r o p o r t i o n s o f e a c h Xc h r o m o s o m e r e m a i n f u n c t i o n a l i n a n y g i v e n f e m a l e . 4H o w e v e t , i n many s i t u a t i o n s w h e r e o n e X c h r o m o -s o m e i s s t r u c t u r a l l y r e a r r a n g e d , L y o n i s a t i o n a p p e a r sn o n - r a n d o m , a n d t o b e h e a v i l y ' s k e w e d ' i n f a v o u r o ft h e s t r u c t u r a l l y a b n o r m a l c h r o m o s o m e i n a n a n e u -p l o i d s i t u a t i o n a n d i n f a v o u r o f t h e n o r m a l X i nb a l a n c e d X ; a u t o s o m e t r a n s l o c a t i o n s . T h i s a p p a r e n tn o n - r a n d o m i n a c t i v a t i o n i s t h o u g h t t o b e t h e r e s u l t o fs e l e c t i o n o f o n e o r o t h e r t y p e o f c e l l a f t e r r a n d o mi n a c t i v a t i o n . S u c h ' s k e w i n g ' c a n a l s o o c c u r w h e n o n eX c h r o m o s o m e c a r r i e s a m u t a n t g e n e . I n t h i s c a s e t h e' s k e w i n g ' may b e c o n f i n e d t o c e r t a i n t i s s u e s a n du s u a l l y r e s u l t s i n v i r t u a l l y a l l c e l l s h a v i n g t h e n o n -m u t a n t X c h r o m o s o m e a c t i v e , f o r e x a m p l e , b l o o dc e l l s i n f e m a l e s h e t e r o z y g o u s f o r t h e L e s c h - N y h a ns y n d r o m e . 5 H o w e v e r , i n a t l e a s t o n e c o n d i t i o n ,a d r e n o l e u c o d y s t r o p h y , s e l e c t i o n a p p e a r s t o f a v o u r t h em u t a n t c e l l l i n e . 6S e v e r a l s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t u s i n gi n c o r p o r a t i o n o f BrdU t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h ee a r l y a n d l a t e r e p l i c a t i n g X c h r o m o s o m e s i n f r a ( X )h e t e r o z y g o t e s . A n u m b e r o f a u t h o r s h a v e f o u n d t h a tm e n t a l l y h a n d i c a p p e d f e m a l e c a r r i e r s h a v e a n i n c r e a s e dp e r c e n t a g e o f a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s , w h e r e a sn o r m a l c a r r i e r s t e n d t o h a v e a g r e a t e r p e r c e n t a g e o fi n a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s . 7 - 1 4 O t h e r a u t h o r sh a v e n o t f o u n d t h i s r e l a t i o n s h i p t o h o l d . I n s o m es t u d i e s t h e f r a g i l e s i t e w a s f o u n d t o b e p r e f e r e n t i a l l yl o c a t e d o n t h e a c t i v e X c h r o m o s o m e i n a l l c a r r i e r s . ' 5 1 6H o w e v e r , N i e l s e n e t a l ' 7 f o u n d a n e x c e s s o f e a r l yr e p l i c a t i n g o r ' a c t i v e ' f r a g i l e X i n a l l h e t e r o z y g o t e sw i t h h i g h l e v e l s o f t h e m a r k e r X r e g a r d l e s s o f I Q , b u tR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 3 J a n u a r y 1 9 9 0 .R e v i s e d v e r s i o n a c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n 2 7 A p r i l 1 9 9 0 .

6 2 7

group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/

7/29/2019 J Med Genet-1990-Webb-627-31

2/6

W e b b , J a c o b s

i n n o r m a l c a r r i e r s w i t h l o w l e v e l s o f f r a g i l e X t h i st e n d e n c y was r e v e r s e d . U c h i d a e t a 1 8 1 8 f o u n d noto n l y a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p r o p o r t i o n o fa c t i v e f r a g i l e X i n f e m a l e h e t e r o z y g o t e s a n d I Q , b u tt h a t t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e tw o types o f c a r r i e r ,m e n t a l l y i m p a i r e d a n d n o r m a l , l a y i n t h e p r o p o r t i o no f e a r l y o r a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s present i nt h e c a r r i e r , t h e p r o p o r t i o n s b e i n g c a l c u l a t e d on t h eb a s i s o f t o t a l c e l l s s c o r e d a n d no t on t h e b a s i s o f f r a ( X )p o s i t i v e c e l l s a l o n e . T h e s e a u t h o r s f o u n d t h a t t h ep r o p o r t i o n o f l a t e r e p l i c a t i n g o r i n a c t i v e f r a g i l e X wast h e same i n a l l f e m a l e h e t e r o z y g o t e s r e g a r d l e s s o f I Qb u t t h a t v a r i a t i o n s i n t h e p r o p o r t i o n o f e a r l y r e p l i c a t i n gor a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s c o r r e l a t e d w i t hd i f f e r e n c e s i n I Q . A l t h o u g h t h e s e r e s u l t s were l a t e rc o n f i r m e d b y T u c k e r m a n a n d W e b b ' 3 t h e n u m b e r s o fs u b j e c t s s t u d i e d , p a r t i c u l a r l y n o r m a l c a r r i e r s , r e m a i n ss m a l l . T h e r e are s e v e r a l r e a s ons f o r t h i s . F i r s t l y , t h en o r m a l c a r r i e r w i t h a h i g h l e v e l o f f r a g i l e X i s r a r e ;s e c o n d l y , t h e l o w l e v e l s o f f r a g i l e X s h o w n b y m o s tn o r m a l c a r r i e r s means t h a t many h u n d r e d s o f m i t o s e smu st b e e x a m i n e d i n o r d e r t o d e t e c t e n o u g h f r a g i l e Xp o s i t i v e c e l l s t o m a k e c o m p a r i s o n s b e t w e e n e a r l y a n dl a t e X c h r o m o s o m e s v a l i d ; t h i r d l y , t h e a d d i t i o n o fBrdU t o t h e c e l l c u l t u r e , w h i l e f a c i l i t a t i n g d i f f e r e n -t i a t i o n o f e a r l y a n d l a t e r e p l i c a t i n g X c h r o m o s o m e s ,causes a m a r k e d d r o p i n t h e d e t e c t a b l e l e v e l o f f r a g i l eX i n a l l s u b j e c t s . One s t u d y h a s i n d i c a t e d t h a t t h e us eo f 3H t h y m i d i n e t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e a c t i v ea n d i n a c t i v e X c h r o m o s o m e s g i v e s t h e s a m e r e s u l t s a sB r d U , w i t h o u t r e d u c i n g t h e overall d e t e c t i o n r a t e o ff r a g i l e X . 1 3D u r i n g t h e course o f a n i n v e s t i g a t i o n o f f r a g i l e Xf a m i l i e s , i n a c t i v a t i o n s t u d i e s w e r e c a r r i e d out on t h el y m p h o c y t e s o f a n u m b e r o f f e m a l e h e t e r o z y g o t e su s i n g b o t h t h e BrdU a n d 3H t h y m i d i n e m e t h o d sw h e r e p o s s i b l e . I n t h e p a t i e n t s i n w h i c h b o t h m e t h o d sw e r e u s e d , BrdU b u t no t 3H t h y m i d i n e w a s f o u n d t od e c r e a s e t h e l e v e l o f f r a ( X ) e x p r e s s i o n . T h e n u m b e ro f a c t i v e f r a ( X ) p o s i t i v e c e l l s c a l c u l a t e d on t h e b a s i s o fa l l i n f o r m a t i v e c e l l s s c o r e d was f o u n d t o b e p o s i t i v e l yc o r r e l a t e d w i t h m e n t a l i m p a i r m e n t , w h i l e t h e n u m b e r

o f i n a c t i v e f r a ( X ) c e l l s was s i m i l a r i n b o t h n o r m a l a n dm e n t a l l y r e t a r d e d h e t e r o z y g o t e s . R e a n a l y s i s o fp u b l i s h e d case r e p o r t s s h o w s a s i m i l a r c o r r e l a t i o n .M a t e r i a l s a n d m e t h o d sC u l t u r e s o f l y m p h o c y t e s f r o m e i g h t f e m a l e c a r r i e r s o ff r a ( X ) ( q 2 7 . 3 ) were t r e a t e d w i t h e i t h e r BrdU o r3 Hd TTP as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . ' 3 B o t h m e t h o d sw e r e d e s i g n e d t o a l l o w t h e e a r l y a n d l a t e r e p l i c a t i n g Xc h r o m o s o m e s t o b e d i s t i n g u i s h e d . S l i d e s were f i r s tt r y p s i n b a n d e d , t h e X c h r o m o s o m e s i d e n t i f i e d , a n df r a g i l e X p o s i t i v e c e l l s d r a w n a n d t h e p o s i t i o n o f t h etw o X c h r o m o s o m e s m a r k e d . A f t e r d e s t a i n i n g t h es l i d e s w i t h m e t h a n o l , t h o s e c o n t a i n i n g BrdU w e r et r e a t e d w i t h H o e c h s t 3 3 2 5 8 f o l l o w e d b y t r e a t m e n tw i t h U V l i g h t a n d S S C . 1 9 R e s t a i n i n g o f t h e c e l l s w i t hL e i s h m a n a l l o w e d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e a c t i v e a n di n a c t i v e X c h r o m o s o m e s f r o m t h e o r i g i n a l d r a w i n g s .I n t h i s way t h e r e c o u l d b e no b i a s o w i n g t o d i f f i c u l t i e si n i d e n t i f y i n g t h e f r a g i l e s i t e o n t h e p a l e , l a t er e p l i c a t i n g X c h r o m o s o m e . S i m i l a r l y , a f t e r d e s t a i n i n g ,s l i d e s c o n t a i n i n g 3H t h y m i d i n e w e r e d i p p e d i n t oI l f o r d N u c l e a r R e s e a r c h e m u l s i o n K2 a n d k e p t i n t h ed a i k a t 4 C f o r 1 0 t o 1 4 d a y s b e f o r e b e i n g d e v e l o p e da n d r e s t a i n e d w i t h L e i s h m a n . T h e e a r l y a n d l a t er e p l i c a t i n g X c h r o m o s o m e s w e r e i d e n t i f i e d a n d t h e i rf r a g i l e X s t a t u s d e t e r m i n e d b y c o m p a r i s o n w i t h t h ed r a w i n g s . The l a t e r e p l i c a t i n g f r a g i l e X c o u l d not b ed i s t i n g u i s h e d o n c e t h e a u t o r a d i o g r a p h h a d b e e nd e v e l o p e d , so p r e v i o u s d r a w i n g s o f a l l f r a g i l e Xp o s i t i v e m i t o s e s w e r e e s s e n t i a l .A t t e m p t s w e r e m a d e t o a c h i e v e a t l e a s t 2 0 i n f o r -m a t i v e f r a g i l e X p o s i t i v e m i t o s e s f r o m e a c h s u b j e c t .R e s u l t sT a b l e 1 s h o w s t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e i n a c t i v a t i o ns t u d i e s c a r r i e d o u t o n c e l l s f r o m e i g h t f e m a l e f r a g i l e Xc a r r i e r s . I n f o u r o f t h e s e c a r r i e r s , tw o n o r m a l a n d tw om e n t a l l y r e t a r d e d , b o t h t h e BrdU a n d 3H t h y m i d i n em e t h o d s were u s e d . The m e t h o d s ga v e s i m i l a r r e s u l t s

T a b l e I T h e p e r c e n t a g e s o f e a r l y r e p l i c a t i n g f r a g i l e X p r e s e n t i n n o r m a l a n d r e t a r d e d c a r r i e r s .T o t a l n o No a n d ( % )S u b j e c t a n d o f c e l l s o f c e l l s w i t h N o n - T o t a lm e t h o d I Q a n a l y s e d f r a ( X q 2 7 ) E a r l y i n f o r m a t i v e L a t e i n f o r m a t i v e % e a r l y

1 B r d U N o r m a l 1 5 8 8 6 7 ( 4 % ) 4 3 2 1 7 2 1 1 91 3 H d T T P N o r m a l 8 9 2 9 9 ( 1 1 % ) 1 9 1 1 6 9 8 8 2 22 B r d U N o r m a l 4 6 8 2 0 ( 4 % ) 7 1 1 2 1 9 3 72 3 H d T T P N o r m a l 4 7 5 8 5 ( 1 8 % ) 2 1 2 7 3 7 5 8 3 63 3 H d T T P N o r m a l 3 0 6 9 1 ( 3 0 0 % ) 9 5 3 2 9 3 8 2 44 3 H d T T P N o r m a l 2 7 0 4 0 ( 1 5 % ) 7 2 6 7 1 4 5 05 B r d U MR 8 2 8 6 5 ( 8 % ) 1 6 3 2 7 2 3 7 05 3 H d T T P MR 3 4 8 9 5 ( 1 3 % ) 4 5 2 0 3 0 7 5 6 06 B r d U MR 9 1 4 3 7 ( 4 % ) 1 3 1 3 1 1 2 4 5 46 3 H d T T P MR 4 7 0 1 2 8 ( 2 7 % ) 2 9 7 5 2 4 5 3 5 57 B r d U MR 5 4 0 5 0 ( 9 0 % ) 1 1 1 7 2 2 3 3 3 38 BrdU MR 7 5 7 3 4 ( 4 % ) 1 6 9 9 2 5 6 4

6 2 8

group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/

7/29/2019 J Med Genet-1990-Webb-627-31

3/6

F r a g i l e X q 2 7 . 3 i n f e m a l e h e t e r o z y g o t e s f o r t h e M a r t i n - B e l l s y n d r o m ei n d i c a t i n g t h a t t h e us e o f BrdU d o e s no t i n t r o d u c e ab i a s . H o w e v e r , t r e a t m e n t w i t h BrdU c a u s e d a m a r k e dr e d u c t i o n in t h e l e v e l s o f f r a g i l e X d e t e c t e d i n a l lc a s e s , w h e r e a s t r e a t m e n t w i t h t h e v e r y l o w concen-t r a t i o n s o f 3 H d T T P r e q u i r e d t o d i f f e r e n t i a t e t h e l a t er e p l i c a t i n g X c h r o m o s o m e c a u s e d no s i g n i f i c a n tr e d u c t i o n i n l e v e l s o f f r a g i l e X .I t c a n b e s e e n f r o m t a b l e 1 t h a t , a f t e r t r e a t m e n tw i t h e i t h e r BrdU o r 3 H t h y m i d i n e , t h r e e o f t h e f o u rr e t a r d e d h e t e r o z y g o t e s h a d p e r c e n t a g e s o f e a r l y ora c t i v e f r a g i l e X g r e a t e r t h a n 50% o f t h e i n f o r m a t i v em i t o s e s . T h e e x c e p t i o n , t r e a t e d w i t h BrdU o n l y , h a d33% o f h e r i n f o r m a t i v e f r a g i l e X e a r l y r e p l i c a t i n g . A l lf o u r o f t h e n o r m a l c a r r i e r s h a d l e v e l s o f a c t i v e f r a g i l eX o f 5 0 0 / o or b e l o w .W e t h e n c o m p a r e d o ur r e s u l t s w i t h o t h e r p u b l i s h e ds t u d i e s b u t o n l y c o n s i d e r e d t h o s e cases i n w h i c h a tl e a s t 1 0 i n f o r m a t i v e f r a g i l e X p o s i t i v e c e l l s w e r er e p o r t e d . T a b l e 2 c o m p a r e s t h e p e r c e n t a g e s o f a c t i v ea n d i n a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s f r o m 1 2 d i f f e r e n ts t u d i e s w i t h r e s p e c t t o h e t e r o z y g o t e I Q . I n e v e r y case

t h e average v a l u e f o r t h e a c t i v e f r a ( X ) c h r o m o s o m ewas h i g h e r i n t h e m e n t a l l y r e t a r d e d s u b j e c t s t h a n i nt h e n o r m a l c a r r i e r s . W h i l e t h e r e w e r e some o u t l i e r s ,i n m o st cases t h e r e w a s l i t t l e or no o v e r l a p b e t w e e nt h e ranges s h o w n b y t h e tw o t y p e s o f c a r r i e r . The' o u t l i e r s ' w e r e m a i n l y n o r m a l c a r r i e r s who h a d a h i g h( > 1 0 % ) l e v e l o f f r a g i l e X i n t h e i r l y m p h o c y t e s .I n t a b l e s 3 a n d 4 t h e p e r c e n t a g e s o f f r a ( X ) p r e s e n ti n t h e l y m p h o c y t e s o f e a c h s u b j e c t h a v e b e e n m u l t i -p l i e d b y t h e percentage o f e i t h e r a c t i v e o r i n a c t i v ef r a g i l e X . T h i s g i v e s a n a c t u a l p r o p o r t i o n o f f r a g i l e Xp r e s e n t i n t h e a c t i v e or t h e i n a c t i v e s t a t e . Thep r o p o r t i o n o f a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s c a l c u l a t e di n t h i s way may b e a b e t t e r e s t i m a t e o f a no n-f u n c t i o n a l or m u t a t e d gene t h a n a s i m p l e measuremento f t h e p e r c e n t a g e o f d e t e c t a b l e f r a g i l e X w i t h o u tc o n s i d e r i n g w h e t h e r i t l i e s on a n a c t i v e o r a n i n a c t i v eX c h r o m o s o m e .

F o r e a c h o f 1 1 s t u d i e s , t h e p r o p o r t i o n s o f b o t ha c t i v e a n d i n a c t i v e f r a g i l e X p r e s e n t i n t h e l y m p h o -c y t e s o f r e t a r d e d a n d n o r m a l c a r r i e r s i n t h e presence

T a b l e 2 P e r c e n t a g e s o f a c t i v e f r a ( X ) w t t h r e s p e c t t o I Q .MR s u b j e c t s N o r m a l s u b j e c t s O u t l i e r s ( e x c e p t i o n s )

A c t i v e A c t i v e M e n t a l l y r e t a r d e d M e n t a l l y n o r m a lc a r r i e r s w i t h c a r r i e r s w i t hR e f e r e n c e No R a n g e A v e r a g e No R a n g e A v e r a g e < 5 0 0 / o a c t i v e f r a ( X ) > 5 0 0 % o a c t i v e f r a ( X )7 7 1 3 - 8 1 ( 5 8 ) 2 2 2 - 3 7 ( 3 0 ) 2 / 7 0 / 21 7 9 2 5 - 9 4 ( 6 3 ) 5 1 6 - 8 6 ( 5 7 ) 3 / 9 3 / 51 0 7 7 3 - 9 6 ( 8 2 ) 7 2 5 - 8 0 ( 6 0 ) 0 / 7 4 / 78 2 7 1 - 7 8 ( 7 4 ) 2 3 1 - 5 1 ( 4 1 ) 0 / 2 0 / 21 8 5 7 1 - 9 5 ( 8 3 ) 5 1 6 - 6 9 ( 4 0 ) 0 / 5 1 / 59 1 8 2 ( 8 2 ) 2 2 2 - 5 1 ( 3 7 ) 0 / 1 0 / 21 4 4 8 5 - 9 6 ( 9 1 ) 3 4 4 - 1 0 0 ( 6 5 ) 0 / 4 1 / 31 5 7 5 7 - 1 0 0 ( 7 6 ) 2 7 0 - 7 6 ( 7 3 ) 0 / 7 2 / 21 6 4 5 8 - 1 0 0 ( 7 3 ) 0 / 4 -1 2 7 2 9 - 8 1 ( 5 9 ) 3 8 - 1 9 ( 1 5 ) 2 / 7 0 / 31 3 3 5 0 - 8 6 ( 7 0 ) 4 3 0 - 4 2 ( 3 7 ) 0 / 3 0 / 4T h i s s t u d y ( B r d U ) 4 3 3 - 7 0 ( 5 5 ) 2 1 9 - 3 7 ( 2 7 ) 1 / 4 0 / 2T h i s s t u d y 2 5 5 - 6 0 ( 5 8 ) 4 2 2 - 5 0 ( 3 3 ) 0 / 2 0 / 4( 3 H t h y m i d i n e )

T a b l e 3 R a n g e s o f t h e p r o p o r t i o n s o f a c t i v e a n d i n a c t i v e f r a g i l e X c h r o n o s o m e s i n m e n t a l l y r e t a r d e d a n d n o r m a l h e t e r o z y g o t e s .A c t i v e I n a c t i v e

P r o p o r t i o n i n t h e P r o p o r t i o n o f t o t a l P r o p o r t i o n i n t h e P r o p o r t i o n o f t o t a lp r e s e n c e o f B r d U b y e x t r a p o l a t i o n p r e s e n c e o f B r d U b y e x t r a p o l a t i o nR e f e r e n c e MR N o r m a l MR N o r m a l MR N o r m a l MR N o r m a l7 1 - 8 - 2 3 - 4 2 - 7 - 7 - 4 3 - 6 - 3 2 - 0 3 - 9 - 9 - 6 1 - 3 - 1 2 - 0 9 - 5 - 1 2 - 5 3 - 0 - 2 4 - 3 1 3 - 9 - 1 6 - 41 7 2 - 9 - 3 4 - 0 3 - 0 - 3 0 - 0 - - 2 - 0 - 7 - 9 2 - 0 - 1 6 - 0 - -1 0 1 - 0 - 1 5 - 1 0 - 2 - 1 3 - 2 - - 0 - 2 - 2 - 3 0 3 - 3 - 8 - -8 2 - 7 - 4 - 7 0 - 8 - 1 - 4 6 - 0 - 6 - 5 0 - 8 - 1 - 9 1 * 1 - 1 * 4 0 - 9 - 1 * 4 1 * 7 - 2 - 7 1 * 91 8 6 - 3 - 2 4 - 6 0 1 - 1 1 9 - - 05-43 07-54 - -1 4 1 0 - 0 - 2 3 - 0 08-90 1 3 - 2 - 3 2 - 2 3 - 1 - 1 5 - 0 1 - 0 2 - 0 0 - 1 * 6 1 * 0 - 2 - 8 0 - 5 - 01 5 8 - 0 - 2 7 - 0 7 - 7 - 1 4 - 4 5 - 7 - 2 6 - 1 7 - 7 - 1 7 - 5 0 9 - 7 3 - 3 - 4 - 6 0 - 1 4 - 0 3 3 - 5 51 6 1 2 8 - 1 8 - 0 1 0 - 5 - - 0 - 1 1 - 9 35 - -1 2 0 9 - 7 - 0 0 - 3 - 0 - 9 5 - 8 - 2 5 - 9 0 - 5 - 5 9 0 - 4 - 2 - 5 2 4 - 4 - 1 3 - 8 - 1 6 - 4 3 - 3 - 2 7 - 11 3 2 - 4 - 8 - 3 0 7 - 2 5 4 - 7 - 2 8 - 1 2 - 1 - 1 0 - 1 0 - 6 - 4 - 7 1 3 - 3 - 5 1 - 0 1 5 - 8 4 - 9 - 1 3 - 9T h i s s t u d y 2 - 2 - 5 6 0 - 8 1 - 5 9 - 6 - 1 6 - 8 1 - 9 - 9 - 6 1 - 4 - 6 - 0 2 - 5 - 3 2 5 - 8 - 2 0 4 8 - 1 - 1 6 - 4T h i s s t u d y 7 - 8 - 1 4 - 9 24-75 1 4 4 - 1 6 - 5 2 - 2 - 9 - 4 5 - 2 - 1 2 - 1 7 5 - 2 2 - 8 9 - 6 - 1 6 - 6 7 - 0 - 1 7 - 5( 3 H d T T P )

6 2 9

group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/

7/29/2019 J Med Genet-1990-Webb-627-31

4/6

W e b b , J a c o b sT a b l e 4 A v e r a g e d p r o p o r t i o n s o f a c t i v e a n d i n a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s i n m e n t a l l y r e t a r d e d a n d n o r m a l h e t e r o z y g o t e s .

A c t i v e I n a c t i v eP r o p o r t i o n i n t h e P r o p o r t i o n o f t o t a l P r o p o r t i o n i n t h e P r o p o r t i o n o f t o t a lp r e s e n c e o f BrdU b y e x t r a p o l a t i o n p r e s e n c e o f BrdU b y e x t r a p o l a t i o n

R e f e r e n c e MR N o r m a l MR N o r m a l MR N o r m a l MR N o r m a l7 9 - 7 5 1 1 6 - 2 6 - 8 6 - 6 1 1 - 0 1 0 - 7 1 5 - 21 7 1 2 - 3 1 2 - 8 - - 50 9 - 1 - -1 0 3 - 8 1 - 7 - - 0 - 7 0 9 - -8 3 - 7 1 * 1 6 - 3 1 * 4 1 * 3 1 * 2 2 - 2 1 - 91 8 1 2 - 0 2 - 8 - - 2 - 1 2 - 1 - -1 4 1 4 - 5 3 - 7 2 1 - 8 7 - 7 1 - 5 0 9 2 - 0 3 01 5 1 7 - 6 1 1 * 1 1 6 - 0 1 2 - 6 5 1 4 0 4 - 8 4 - 41 6 1 6 - 0 1 0 - 5 - - 7 0 3 5 - -1 2 2 - 8 0 - 7 1 4 - 1 2 - 4 1 * 6 3 - 4 9 3 1 2 - 01 3 4 - 7 1 - 5 1 3 - 0 5 1 2 - 3 25 7 0 79T h i s s t u d y 3 - 3 1 - 2 1 3 - 2 5 8 2 - 9 2 - 9 1 0 - 2 1 2 - 3T h i s s t u d y 1 1 - 4 5 9 1 5 - 5 6 - 0 8 - 7 1 2 - 6 1 1 - 6 1 2 - 2( 3 H d T T P )

o f BrdU a r e s h o w n a n d , w h e r e p o s s i b l e , t h e s e v a l u e sh a v e b e e n e x t r a p o l a t e d t o g i v e t h e p r o p o r t i o n s o fa c t i v e a n d i n a c t i v e f r a ( X ) p r e s e n t i n c u l t u r e s w h i c hd i d n o t c o n t a i n B r d U . T a b l e 3 g i v e s r a n g e s o f v a l u e s ,s h o w i n g t h a t t h e r e i s c o m p l e t e o v e r l a p b e t w e e nm e n t a l l y r e t a r d e d a n d n o r m a l c a r r i e r s i n t h e p r o p o r t i o no f i n a c t i v e f r a ( X ) c h r o m o s o m e s . H o w e v e r , t h e r e i sa l m o s t n o o v e r l a p a t a l l b e t w e e n t h e p r o p o r t i o n s o fa c t i v e f r a ( X ) c h r o m o s o m e s i n r e t a r d e d a n d n o r m a ls u b j e c t s , t h e r a n g e s f o r t h e r e t a r d e d h e t e r o z y g o t e sb e i n g h i g h e r i n e v e r y c a s e . L e v e l s o f a c t i v e f r a g i l e Xa r e t h u s h i g h e r i n t h e m e n t a l l y r e t a r d e d t h a n i n t h en o r m a l c a r r i e r s , b u t l e v e l s o f i n a c t i v e f r a g i l e X a r e t h es a m e i n b o t h g r o u p s . T h e s e d i f f e r e n c e s b e c o m e moreo b v i o u s i n t a b l e 4 w h e r e t h e v a l u e s h a v e b e e na v e r a g e d f o r e a c h s t u d y . T h e a v e r a g e p r o p o r t i o n o fi n a c t i v e f r a ( X ) i s t h e s a m e f o r b o t h r e t a r d e d a n dn o r m a l h e t e r o z y g o t e s , b u t i n e a c h s t u d y t h e p r o p o r t i o no f a c t i v e f r a g i l e X i s g r e a t e r i n m e n t a l l y r e t a r d e d t h a ni n n o r m a l h e t e r o z y g o t e s .D i s c u s s i o nS t u d i e s o f t h e r e p l i c a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g i l e Xc h r o m o s o m e i n f e m a l e h e t e r o z y g o t e s u s i n g b o t hBrdU a n d 3 H t h y m i d i n e c o n f i r m e d t h e o b s e r v a t i o nt h a t BrdU b u t n o t 3 H t h y m i d i n e m a r k e d l y r e d u c e st h e n u m b e r o f c e l l s s h o w i n g t h e f r a g i l e s i t e a t X q 2 7 . 1 3T h e p r e s e n t s t u d y o f e i g h t u n r e l a t e d h e t e r o z y g o t e s f o rt h e f r a g i l e X s y n d r o m e s h o w s a d i r e c t r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e p e r c e n t a g e o f f r a g i l e X t h a t i s a c t i v e o re a r l y r e p l i c a t i n g a n d m e n t a l s t a t u s . A l t h o u g h t h en u m b e r o f u n i n f o r m a t i v e c e l l s w a s i n s o m e c a s e sd i s c o n c e r t i n g l y h i g h , t h e r e w a s n o c o n s i s t e n c y i n t h ep e r c e n t a g e s o b s e r v e d e i t h e r b e t w e e n n o r m a l a n dr e t a r d e d p a t i e n t s o r b e t w e e n c u l t u r e s t r e a t e d w i t h3 H d T T P o r B r d U . T h e c o n c l u s i o n s w e r e t h e r e f o r en o t b i a s e d b y t h e m e t h o d o l o g y . I n g e n e r a l , h e t e r o -z y g o t e s o f n o r m a l i n t e l l i g e n c e h a v e p e r c e n t a g e s o f

a c t i v e f r a g i l e X b e l o w 50% a n d m e n t a l l y h a n d i c a p p e dh e t e r o z y g o t e s a l e v e l o f a c t i v e f r a g i l e X a b o v e 5 0 % .T h i s f i n d i n g h o l d s t r u e w h e t h e r t h e a c t i v a t i o n s t u d i e su s e BrdU o r 3 H t h y m i d i n e t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e nt h e X c h r o m o s o m e s . B e c a u s e t h e a d d i t i o n o f BrdU t ot h e c u l t u r e m e d i u m r e d u c e s l e v e l s o f d e t e c t a b l ef r a g i l e X , t h e r e a r e v e r y f e w s t u d i e s o n n o r m a lc a r r i e r s w i t h l o w f r a ( X ) l e v e l s . A s t h e s e w o m e n a r e i nt h e m a j o r i t y , i t i s t o b e h o p e d t h a t s t u d i e s u s i n g 3 Ht h y m i d i n e may i n d i c a t e w h e t h e r t h i s t y p e o f c a r r i e rh a s l e s s t h a n 5 0 % a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s . I t i sr e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t t h e p h e n o t y p i c e f f e c t m ayb e r e l a t e d t o t h e a c t u a l n u m b e r s o f a c t i v e f r a g i l e Xc h r o m o s o m e s p r e s e n t . T h e r e f o r e t h e d e t e c t a b l e l e v e l so f f r a g i l e X i n t h e c u l t u r e m u s t b e t a k e n i n t o a c c o u n ta s w e l l a s t h e r a t i o o f e a r l y / l a t e r e p l i c a t i n g Xc h r o m o s o m e s . When t h i s i s d o n e ( t a b l e s 3 a n d 4 )t h e r e i s a n o b v i o u s d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r o p o r t i o no f a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s i n t h e n o r m a l a n dm e n t a l l y r e t a r d e d h e t e r o z y g o t e s . I n c o n t r a s t , t h ep r o p o r t i o n s o f i n a c t i v e f r a g i l e X a r e s i m i l a r i n a l l c a s e sr e g a r d l e s s o f I Q . T h i s c o n f i r m s t h e o b s e r v a t i o n m a d eb y U c h i d a e t a l ' 8 o n e i g h t r e t a r d e d a n d s i x n o r m a lh e t e r o z y g o t e s .I t a p p e a r s t h a t i n b o t h n o r m a l a n d r e t a r d e dh e t e r o z y g o t e s t h e s t a t u s o f t h e i n a c t i v e X c h r o m o -s o m e r e n d e r s i t l e s s i n d u c i b l e t o f r a ( X ) e x p r e s s i o n .T h e s m a l l p r o p o r t i o n o f m e n t a l l y n o r m a l f e m a l eh e t e r o z y g o t e s who h a v e h i g h l e v e l s o f f r a ( X ) p o s i t i v ec e l l s a p p e a r t o b e e x c e p t i o n a l i n t h a t t h e i r f r a ( X ) i se a s i l y e x p r e s s e d . O u r s t u d y i s , o f c o u r s e , b i a s e dt o w a r d s t h e s e e x c e p t i o n a l f e m a l e s . T h e m a j o r i t y o fn o r m a l h e t e r o z y g o t e s h a v e n o o r a v e r y l o w l e v e l o fe x p r e s s i o n o f f r a ( X ) p o s i t i v e c e l l s b e c a u s e t h e i r f r a g i l eX c e l l s a r e i n a c t i v e a n d s o l e s s i n d u c i b l e t o e x p r e s s i o n .I t i s p e r h a p s s u r p r i s i n g t h a t t h e r e s h o u l d b e ar e l a t i o n s h i p b e t w e e n f r a g i l e X e x p r e s s i o n i n f e m a l eh e t e r o z y g o t e s a n d t h e p r o p o r t i o n o f a c t i v e f r a g i l e Xc h r o m o s o m e s i n p e r i p h e r a l b l o o d c e l l s , a s t h e l e v e l o f

6 3 0

group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/

7/29/2019 J Med Genet-1990-Webb-627-31

5/6

F r a g i l e X q 2 7 . 3 i n f e m a l e h e t e r o z y g o t e s f o r t h e M a r t i n - B e l l s y n d r o m em e n t a l a b i l i t y i s l i k e l y t o b e c o r r e l a t e d w i t h t h ep r o p o r t i o n o f a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e s i n n e u r a lt i s s u e r a t h e r t h a n i n l y m p h o c y t e s . O u r o b s e r v a t i o n ss u g g e s t t h a t t h e l e v e l o f a c t i v e f r a g i l e X c h r o m o s o m e ss e e n i n p e r i p h e r a l l y m p h o c y t e s m ay r e f l e c t t h ep r o p o r t i o n i n n e u r a l o r o t h e r c e l l s t h a t a r e r e s p o n s i b l ef o r m e n t a l d e v e l o p m e n t .

1 S h e r m a n S L , M o r t o n NE , J a c o b s P A , T u r n e r G . T h e m a r k e r ( x )s y n d r o m e : a c y t o g e n e t i c a n d g e n e t i c a n a l y s i s . Ann H um G e n e t1 9 8 4 ; 4 8 : 2 1 - 3 7 .2 N u s s b a u m R L , L e d b e t t e r D M . F r a g i l e X s y n d r o m e : a u n i q u em u t a t i o n i n m a n . A n n u R e v G e n e t 1 9 8 6 ; 2 0 : 1 0 9 - 4 5 .3 J a c o b s P A , G l o v e r T W , M a y e r M, e t a l . X - l i n k e d m e n t a lr e t a r d a t i o n : a s t u d y o f 7 f a m i l i e s . Am J Med G e n e t 1 9 8 0 ; 7 :4 7 1 - 8 9 .4 L y o n MF. X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n a n d d e v e l o p m e n t a lp a t t e r n s i n m a m m a l s . B i o l R e v 1 9 7 2 ; 4 7 : 1 - 3 5 .5 A l b e r t i n i R J , D e m a r s R . M o s a i c i s m o f p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o -c y t e p o p u l a t i o n s i n f e m a l e s h e t e r o z y g o u s f o r t h e L e s c h - N y h a nm u t a t i o n . B i o c h e m G e n e t 1 9 7 4 ; 1 1 : 3 7 9 - 8 2 .6 M i g e o n B R , M o s e r H W , M o s e r A B , S p r e n k l e J A , S i l e n c e D ,Norum R A . A d r e n o l e u k o d y s t r o p h y : e v i d e n c e f o r X - l i n k a g ei n a c t i v a t i o n a n d s e l e c t i o n f a v o r i n g t h e m u t a n t a l l e l e i nh e t e r o z y g o u s c e l l s . P r o c N a t d A c a d S c i USA 1 9 8 1 ; 7 8 : 5 0 6 6 - 7 0 .7 K n o l l J H , C h u d l e y A E , G e r r a r d J W . F r a g i l e ( X ) X - l i n k e d m e n t a lr e t a r d a t i o n . I I . F r e q u e n c y a n d r e p l i c a t i o n p a t t e r n o f f r a g i l e ( X )( q 2 8 ) i n h e t e r o z y g o t e s . Am J H um G e n e t 1 9 8 4 ; 3 6 : 6 4 0 - 5 .8 U c h i d a I A , J o y c e EM. A c t i v i t y o f t h e f r a g i l e X i n h e t e r o z y g o u sc a r r i e r s . Am J H um G e n e t 1 9 8 2 ; 3 4 : 2 8 6 - 9 3 .

9 H o w e l l R T , M c D e r m o t t A . R e p l i c a t i o n s t a t u s o f t h e f r a g i l e Xc h r o m o s o m e s , f r a ( X ) ( q 2 7 ) i n t h r e e h e t e r o z y g o u s f e m a l e s . H umG e n e t 1 9 8 2 ; 6 2 : 2 8 2 - 4 .1 0 P a u l J , F r o s t e r - I s k e n i u s U , M o j e W , S c h w i n g e r E . H e t e r o z y g o u sf e m a l e c a r r i e r s o f t h e m a r k e r - X c h r o m o s o m e : I Q e s t i m a t i o na n d r e p l i c a t i o n s t a t u s o f f r a ( X X q ) . H um G e n e t 1 9 8 4 ; 6 6 : 3 4 4 - 6 .1 1 T u c k e r m a n E , W e b b T , B u n d e y S E . F r e q u e n c y a n d r e p l i c a t i o ns t a t u s o f t h e f r a g i l e ( X ) ( q 2 7 - 2 8 ) i n a p a i r o f m o n o z y g o t i c t w i n so f m a r k e d l y d i f f e r i n g i n t e l l i g e n c e . J Med G e n e t 1 9 8 5 ; 2 2 : 8 5 - 9 1 .1 2 T u c k e r m a n E , W e b b T , T h a k e A . R e p l i c a t i o n s t a t u s o f f r a g i l eX ( q 2 7 . 3 ) i n 1 3 f e m a l e h e t e r o z y g o t e s . J Med G e n e t 1 9 8 6 ; 2 3 :4 0 7 - 1 0 .1 3 T u c k e r m a n E , W e b b T . T h e i n a c t i v a t i o n o f t h e f r a g i l e Xc h r o m o s o m e i n f e m a l e c a r r i e r s o f t h e M a r t i n B e l l s y n d r o m e a ss t u d i e d b y t w o d i f f e r e n t m e t h o d s . C l i n G e n e t 1 9 8 9 ; 3 5 : 2 5 - 3 0 .1 4 W i l h e l m D , F r o s t e r - I s k e n i u s U , P a u l J , S c h w i n g e r E . F r a ( X )f r e q u e n c y o n t h e a c t i v e X - c h r o m o s o m e a n d p h e n o t y p e i nh e t e r o z y g o u s c a r r i e r s o f t h e f r a ( X ) f o r m o f m e n t a l r e t a r d a t i o n .Am J Me d G e n e t 1 9 8 8 ; 3 0 : 4 0 7 - 1 5 .1 5 F r y n s J P , K l e c z k o w s k a A , K u b i e n E , P e t i t P , V a n d e n B e r g h e H .I n a c t i v a t i o n p a t t e r n o f t h e f r a g i l e X i n h e t e r o z y g o u s c a r r i e r s .H um G e n e t 1 9 8 4 ; 6 5 : 4 0 0 - 1 .1 6 F r y n s J P , V a n d e n B e r g h e H . I n a c t i v a t i o n p a t t e r n o f t h e f r a g i l e - Xi n h e t e r o z y g o u s c a r r i e r s . Am J Med G e n e t 1 9 8 8 ; 3 0 : 4 0 1 - 6 .1 7 N i e l s e n K B , Tommerup N , P o u l s e n H , J a c o b s e n P , B e c k B ,M i k k e l s e n M. C a r r i e r d e t e c t i o n a n d X - i n a c t i v a t i o n s t u d i e s i nt h e f r a g i l e X s y n d r o m e . H um G e n e t 1 9 8 3 ; 6 4 : 2 4 0 - 5 .1 8 U c h i d a I A , F r e e m a n V C P , J a m r o H , P a r t i n g t o n M W , S o l t a nH C . A d d i t i o n a l e v i d e n c e f o r f r a g i l e X a c t i v i t y i n h e t e r o z y g o u sc a r r i e r s . Am J H um G e n e t 1 9 8 3 ; 3 5 : 8 6 1 - 8 .1 9 S c h e m p p W , M e e r B . C y t o l o g i c e v i d e n c e f o r t h r e e h u m a n X -c h r o m o s o m a l s e g m e n t s e s c a p i n g i n a c t i v a t i o n . H um G e n e t 1 9 8 3 ;6 3 : 1 7 1 - 4 .

6 3 1

group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/

7/29/2019 J Med Genet-1990-Webb-627-31

6/6

doi: 10.1136/jmg.27.10.6271990 27: 627-631J Med Genet

T Webb and P A JacobsMartin-Bell syndrome.

heterozygotes for theFragile Xq27.3 in female

http://jmg.bmj.com/content/27/10/627at:Updated information and services can be found

These include:

serviceEmail alerting

corner of the online article.this article. Sign up in the box at the top rightReceive free email alerts when new articles cite

Notes

http://group.bmj.com/group/rights-licensing/permissionsTo request permissions go to:

http://journals.bmj.com/cgi/reprintformTo order reprints go to:

http://group.bmj.com/subscribe/To subscribe to BMJ go to:

group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

http://jmg.bmj.com/content/27/10/627http://group.bmj.com/group/rights-licensing/permissionshttp://group.bmj.com/group/rights-licensing/permissionshttp://journals.bmj.com/cgi/reprintformhttp://journals.bmj.com/cgi/reprintformhttp://group.bmj.com/subscribe/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/http://jmg.bmj.com/http://group.bmj.com/subscribe/http://journals.bmj.com/cgi/reprintformhttp://group.bmj.com/group/rights-licensing/permissionshttp://jmg.bmj.com/content/27/10/627