Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu - określenie przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku

Gatunek - populacja mikroorganizmów wykazujących wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego samego rodzaju

Identyfikacja taksonomiczna bakterii

Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki

Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec)

Gatunek – wiele szczepów podobnych w ściśle określonym zakresie cech

Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA

Identyfikacja taksonomiczna bakterii

Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe

nG + nC

% G+C = x 100%

nA + nT + nC + nG

W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%

Cechy umożliwiające identyfikację bakterii

morfologia skład chemiczny ściany komórkowej obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych zdolność do tworzenia pigmentów sposób odżywiania wymagania pokarmowe źródła C, N, S skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji wymagania tlenowe zakres temperatur i pH wzrostu wrażliwość na antybiotyki patogenność zależności symbiotyczne z innymi organizmami środowisko występowania obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna) sekwencja DNA genomowego

Metody identyfikacji mikroorganizmów

Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:

a) biochemiczne

b) biofizyczne

c) biologii molekularnej

d) immunochemiczne

Metody biochemiczne Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych

związków chemicznych

cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych

wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo• wzrost lub jego brak • zmiana zabarwienia pożywki• reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z

wytwarzanym metabolitem• wytworzenie gazu

Testy biochemiczne

INKUBACJA

(18 – 48 h)

Zawieszenie Naniesienie

Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)

Metody biofizyczne

Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie produktów ich

metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych

Techniki elektroforetyczne Techniki oparte na chromatografii gazowej

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą

technik elektroforetycznych

Analiza profili białkowych• skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek

komórkowych

Sposób postępowania: izolacja białek komórkowych rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym barwienie rozdzielonych białek porównanie z profilami białkowymi bazy danych

Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych

Elektroforeza dwukierunkowa

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową

Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany komórkowej

• skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych

warunków hodowli • zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej

bakterii kodowany jest przez DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach

Analiza jakościowa – obecność specyficznych kwasów tłuszczowych

Analiza ilościowa – określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową

Sposób postępowania: saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych metylowanie ekstrakcja z fazy wodnej rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej analiza wyników i porównanie z bazą danych

Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową

Microbial Identification System HP 5898 A firmy Hewlett Packard

Metody biologii molekularnej

Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych

Metody hybrydyzacyjne Metody oparte o technikę PCR

Metody hybrydyzacyjne

Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA,

zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest

znakowany • radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H]• barwnikiem fluorescencyjnym• enzymem

Metody hybrydyzacyjne

• Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystująsondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA)

• Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000)

• Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępnośćinformacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzącychod różnych, często bardzo blisko genetyczniespokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemumożliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiejspecyficzności

Metody hybrydyzacyjne

Dot blot

Metody hybrydyzacyjne

Southern blotting

Metody hybrydyzacyjne

• homologia kwasów nukleinowych powyżej 60% świadczy o przynależności organizmu do określonego gatunku

• stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym rodzajem

• hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów niespokrewnionych

FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ

Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem

FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ

Wynik FISH dla mieszaniny wybranych bakterii z rodzaju Bacillus, Escherichia, Pseudomanas, Shigella

Metody wykorzystujące technikę PCR

Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro

specyficznej sekwencji nukleotydów

gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych

Sposób postępowania: amplifikacja fragmentu DNA sekwencjonowanie porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów• 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku

Metody wykorzystujące technikę PCRbadanie mieszanej populacji mikroorganizmów

Metody wykorzystujące technikę PCR

Geny kodujące białka bakteryjne• białko szoku termicznego Hsp 70• białko szoku termicznego Hsp 60• syntaza asparaginylo-tRNA• syntaza alanylo-tRNA• dehydrogenaza glutaminianowa• hydrolaza pirofosforanu• podjednostka β polimerazy RNA (RpoB)• podjednostka β’ polimerazy RNA (RpoC)• czynniki elongacyjne: EF 1α/Tu, EF-Tu, Ef-G/2• białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12• gyrazy

Metody immunochemiczne

Reakcja aglutynacji

Metody immunochemiczne

Test ELISA

Metody immunochemiczne

Test immunochromatograficzny