Ewelina Warzych, Dorota Lechniak Apoptoza w oogenezie i ...

Apoptoza w oogenezie i wczesnymrozwoju zarodkowym ssaków

Ewelina Warzych, Dorota Lechniak

Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierz¹t,Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego, Poznañ

Apoptosis in oogenesis and preimplantation embryo development of

mammals

S u m m a r y

In this paper, the authors made an attempt to summarize the presentknowledge on apoptosis in mammalian oocytes and embryos. On the contraryto necrosis, apoptosis is a programmed death of damaged or mutated cells. Sev-eral studies showed that it takes place during oogenesis (oocyte growth andmaturation), as well as at some stages of preimplantation embryo development(morula, blastocyst). Although apoptosis is observed in vivo, the frequency ofthis phenomenon increases in vitro. There is a number of methods detectingapoptotic cells, however, none of them gives a clear evaluation of the studiedprocess. A complex analysis with the use of several methods is therefore ad-vised. Because in ovary the majority of oocytes undergo atresia (over 99%), thescientists concentrate on developing new methods aiming at improvement offemales’ reproductive performance. The process of apoptosis seems to be a cru-cial limiting factor.

Key words:

apoptosis, oocyte, embryo, TUNEL.

1. Wstêp

Apoptoza i nekroza s¹ zjawiskami zwi¹zanymi ze œmierci¹komórkow¹. Apoptoza jest procesem konserwatywnym polega-j¹cym na samobójczej œmierci komórki, kontrolowanym zarównoprzez czynniki wewnêtrzne jak i zewnêtrzne. Jest to najczêœciejobserwowana forma degradacji komórki, bêd¹ca istotnym ele-mentem rozwoju i ró¿nicowania organizmów wielokomórkowych(1). Nekroza natomiast jest procesem biernym, katabolicznym

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Ewelina Warzych,Katedra Genetykii Podstaw HodowliZwierz¹t,Akademia Rolniczaim. AugustaCieszkowskiego,ul. Wo³yñska 33,60-637 Poznañ;e-mail: [email protected]

1 (68) 172–182 2005

i degradacyjnym. Zachodzi pod wp³ywem bodŸca zewnêtrznego wywo³anego me-chanicznym uszkodzeniem komórki, szokiem termicznym, wolnymi rodnikami tle-nowymi czy toksynami metabolicznymi. Komórkê podlegaj¹c¹ nekrozie charaktery-zuje rozpad j¹dra, pêcznienie i przerwanie integralnoœci b³ony komórkowej, co po-woduje uwolnienie enzymów litycznych i uszkodzenie s¹siednich komórek. W efek-cie powstaje ognisko martwicy, do którego nap³ywaj¹ granulocyty obojêtnoch³on-ne, limfocyty i makrofagi, bior¹ce udzia³ w procesie zapalnym (2).

2. Molekularne pod³o¿e apoptozy

Po raz pierwszy zjawisko programowej œmierci komórki opisa³ Walther Flem-ming, który w 1885 r. opublikowa³ pracê o degeneracji komórek w jajniku królika(3). Termin apoptoza wprowadzi³ dopiero Kerr i wsp. (4) jako zjawisko zamieraniakomórek, w którym dochodzi do kondensacji chromatyny, fragmentacji j¹dra i two-rzenia tzw. cia³ek apoptotycznych. Dziœ wiadomo, ¿e apoptoza jest procesem wielo-etapowym, rozpoczynaj¹cym siê w momencie izolowania danej komórki od otocze-nia, co oznacza utratê wszelkich po³¹czeñ miêdzykomórkowych. Nastêpnie docho-dzi do kondensacji chromatyny, obkurczania cytoplazmy, agregacji chromatyny przyb³onie j¹drowej oraz do fragmentacji j¹dra. Procesy te najczêœciej s¹ poprzedzoneciêciem DNA na odcinki odpowiadaj¹ce d³ugoœci nukleosomu (ok. 180-200 pz). Koñ-cowym etapem apoptozy jest fragmentacja cytoplazmy i rozdzia³ organelli komór-kowych na struktury zwane cia³kami apoptotycznymi. Zostaj¹ one usuniête np. nadrodze fagocytozy, bez uszkadzania komórek otaczaj¹cych, dlatego opisywany pro-ces mo¿e dotyczyæ tylko pojedynczych komórek, a nie ca³ych tkanek.

Z obszernego piœmiennictwa wynika, ¿e proces apoptozy jest regulowany przezwiele czynników (5-13). Zak³ada siê, ¿e ka¿da komórka posiada potencjaln¹ zdol-noœæ wejœcia na œcie¿kê apoptozy, natomiast decyzja o rozpoczêciu owego szlakuzale¿y od zrównowa¿onej proporcji wewn¹trzkomórkowych czynników pro- i anty-apoptotycznych.

Opisuj¹c przebieg apoptozy w komórce nale¿y rozró¿niæ dwa jej g³ówne szlaki: ze-wnêtrzny (receptorowy) i wewnêtrzny (mitochondrialny). Uproszczony schemat ilus-truj¹cy te procesy przedstawiono na rysunku. W szlaku receptorowym obserwuje siêtworzenie tzw. receptosomu, który powstaje w wyniku pobudzenia receptorów œmier-ci, nale¿¹cych do nadrodziny receptorów TNF (czynnika martwicy nowotworu, ang. Tu-

mour Necrosis Factor). Pojawienie siê aktywnej formy receptosomu prowadzi do auto-proteolizy enzymu prokaspazy 8, który jest bezpoœrednim aktywatorem kaspazy 3.Natomiast w szlaku wewnêtrznym, zasadnicz¹ funkcjê w przekazywaniu sygna³uœmierci odgrywaj¹ czynniki mitochondrialne uwalniane do cytosolu (AIF – Apoptosis

Inducing Factor, cytochrom c). Aktywuj¹ one prokaspazy 9 i powoduj¹ utworzenie ak-tywnego kompleksu zwanego apoptosomem. Obydwa opisane szlaki prowadz¹ doaktywacji zasadniczego etapu regulacji apoptozy, którym jest kaskada kaspaz (14).

Apoptoza w oogenezie i wczesnym rozwoju zarodkowym ssaków

BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 172-182 2005 173


174 PRACE PRZEGL¥DOWE

Rys

.U

pros

zczo

nysc

hem

atilu

stru

j¹cy

akty

wac

jêpr

oces

uap

opto

zyw

oocy

tach

ssak

ów.

Wyr

ó¿ni

ono

szla

kze

wnê

trzn

yzw

i¹za

nyz

akty

wac

j¹re

cept

o-ró

wb³

onow

ych

(œm

ierc

i),or

azsz

lak

wew

nêtr

zny

skup

iony

wok

ó³m

itoc

hond

riów

.Obi

edr

ogii

nduk

cjip

row

adz¹

dow

zbud

zeni

aka

skad

yka

spaz

efek

toro

-w

ych,

któr

es¹

bezp

oœre

dnim

iw

ykon

awca

mi

prze

mia

nko

mór

kow

ych

char

akte

ryst

yczn

ych

dla

proc

esu

apop

tozy

(7).

Kaspazy s¹ syntetyzowane w formie nieaktywnych proenzymów (zymogenów),których aktywacja mo¿e przebiegaæ na drodze homo- lub heteroaktywacji. Homoak-tywacja polega na oligomeryzacji cz¹steczek enzymów, co prowadzi do wzrostu ichaktywnoœci proteolitycznej. Te z kolei, na drodze heteroaktywacji aktywuj¹ kaspazywykonawcze. Kaspazy selektywnie tn¹ bia³ka zawsze w pozycji za kwasem asparagi-nowym. Wykazuj¹ one dwojak¹ aktywnoœæ – z jednej strony inaktywuj¹ bia³ka po-przez ciêcie proteolityczne, z drugiej natomiast mog¹ dzia³aæ aktywuj¹co, gdy do-chodzi do usuniêcia negatywnej domeny regulatorowej lub dezaktywacji czynnikaregulatorowego. Nukleaza CAD (Caspase Activated Deoxiribonuclease) w taki w³aœniesposób zostaje aktywowana przez kaspazê 3, co uruchamia proces ciêcia DNA nafragmenty o d³ugoœci 180-200 pz. Kaspazy aktywowane s¹ hierarchicznie – w po-cz¹tkowej fazie apoptozy pobudzane s¹ kaspazy inicjatorowe (najczêœciej poprzezautoproteolizê), a nastêpnie kolejne a¿ do kaspaz wykonawczych, których substra-tami s¹ ró¿ne bia³ka komórkowe (15).

Dotychczas opisano wiele bia³ek zwi¹zanych z kontrol¹ apoptozy, z których nad-rzêdn¹ rolê pe³ni¹ bia³ka z rodziny Bcl-2 (oncogene B-cell leukemia 2). Cech¹ charakte-rystyczn¹ tych bia³ek jest wystêpowanie homologicznych sekwencji BH1, BH2, BH3i BH4 (Bcl-2 homology regions). Stanowi¹ one kryterium podzia³u rodziny Bcl-2 na trzypodrodziny: Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-w, Bcl-xL, A1, Mcl-1), Bax (Bax, Bak, Bok) oraz BH3 (Bak,

Bid, Bik). Bia³ka z podrodziny Bcl-2 s¹ inhibitorami apoptozy, natomiast pozosta³edwie podrodziny nale¿¹ do grupy promotorów œmierci komórkowej. Uwa¿a siê, ¿egen Bcl-2 jest najsilniejszym inhibitorem apoptozy, natomiast najlepiej poznanymjej promotorem jest gen Bax (Bcl-2 associated X protein).

Bia³ka z rodziny Bcl-2 reguluj¹ proces apoptozy poprzez system wzajemnych od-dzia³ywañ sprowadzaj¹cych siê g³ównie do zdolnoœci tworzenia heterodimerów z³o-¿onych z bia³ek pro- i antyapoptotycznych. Podstawow¹ funkcjê w procesie powsta-wania dimerów pe³ni domena BH3. W wiêkszoœci bia³ek z rodziny Bcl-2 wystêpujedomena transb³onowa na koñcu karboksylowym, umo¿liwiaj¹ca ich adaptacjêw b³onach organelli. Struktura czwartorzêdowa tych bia³ek pozwala na tworzeniekana³ów b³onowych, które powstaj¹ pod wp³ywem sygna³u apoptotycznego powo-duj¹cego oligomeryzacjê bia³ka Bax, a nastêpnie wbudowywanie uzyskanych oligo-merów w b³ony organelli. Opisywane zjawisko wp³ywa na wzrost przepuszczalnoœcib³on mitochondrialnych dla wody, jonów i zwi¹zków drobnocz¹steczkowych, pêcz-nienie mitochondriów, pêkanie zewnêtrznej b³ony mitochondrialnej i uwalnianiez przestrzeni miêdzyb³onowej cytochromu c i AIF (Apoptosis Inducing Factor) –dwóch g³ównych czynników indukuj¹cych apoptozê na opisywanym wczeœniej szla-ku wewnêtrznym. Natomiast ochronna rola bia³ek Bcl-2 w mitochondriach polegaprawdopodobnie na kontrolowaniu przepuszczalnoœci kana³ów b³onowych lub two-rzeniu dodatkowych kana³ów stabilizuj¹cych homeostazê mitochondrium (9).


BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 172-182 2005 175

3. Wykorzystanie metody TUNEL do wykrywania komórek apoptotycznych

Istotn¹ cech¹ komórek apoptotycznych wykorzystywan¹ do detekcji apoptozyjest fragmentacja DNA na odcinki równe wielokrotnoœci d³ugoœci nukleosomów.Ró¿nice w sposobie degradacji DNA stanowi¹ podstawê odró¿nienia martwicy odapoptozy. W komórkach nekrotycznych dochodzi do uwolnienia proteaz, które tra-wi¹ bia³ka histonowe, natomiast aktywne nukleazy niszcz¹ nieos³oniête DNA. Naskutek przypadkowych ciêæ powstaj¹ odcinki DNA o zró¿nicowanej d³ugoœci, którew ¿elu elektroforetycznym tworz¹ obraz smugi (smear). Natomiast w przypadkuapoptozy obserwuje siê fragmentacjê DNA odzwierciedlaj¹c¹ strukturê oktamerówhistonowych, w wyniku której na ¿elu powstaje obraz tzw. drabinki (ladder) odcin-ków stanowi¹cych wielokrotnoœæ d³ugoœci nukleosomu (180-200 pz).

Podczas apoptozy, wskutek trawienia DNA powstaje wiele pêkniêæ jedno- i dwu-niciowych, których znakowanie jest wykorzystywane w technice TUNEL (Terminal de-

oksynukleotydyl transferase mediated d-UTP Nick End-Labeling) (16). W metodzie tej en-zym terminalna transferaza (TdT) dobudowuje znakowane nukleotydy bez obecnoœ-ci matrycy do wolnych koñców wodorotlenkowych. Technika TUNEL pozwala na wy-krycie szeœciokrotnie wiêkszej liczby komórek apoptotycznych ni¿ przy u¿yciu tech-nik barwieñ histologicznych, prawdopodobnie dziêki detekcji komórek we wczes-nych stadiach apoptozy, w których zmiany morfologiczne s¹ trudne do oznaczenia(16).

4. Apoptoza w oogenezie

Potencja³ rozrodczy samicy wyra¿aj¹cy siê okreœlon¹ liczb¹ oocytów w jajnikuustala siê w ¿yciu p³odowym, po czym zmniejsza siê w ka¿dym cyklu p³ciowym.Przyjmuje siê, ¿e ponad 99% pêcherzyków jajnikowych podlega atrezji (17). Badanianad potencja³em rozwojowym ¿eñskich komórek p³ciowych nabieraj¹ obecnie corazwiêkszego znaczenia zarówno w medycynie jak i hodowli zwierz¹t. W rozrodziecz³owieka najwa¿niejszymi zagadnieniami s¹ poszukiwanie sposobów ochrony oocy-tów u kobiet poddawanych chemioterapii oraz opracowanie metod przed³u¿ania ¿y-wotnoœci pierwotnych pêcherzyków jajnikowych i odsuwania w czasie zjawiska me-nopauzy. W przypadku hodowli zwierz¹t g³ównym celem jest ustalenie optymal-nych warunków hodowli in vitro preantralnych pêcherzyków zmierzaj¹ce do lepsze-go wykorzystania potencja³u rozrodczego wartoœciowych samic (18).

Najnowsza publikacja Tilly i wsp. (19) wykazuj¹ca istnienie w jajnikach dojrza-³ych p³ciowo myszy pierwotnych komórek rozrodczych (GSC, germinal stem cells)i odnawiania siê populacji pêcherzyków jajnikowych, ca³kowicie zmienia dotychcza-sowe teorie obowi¹zuj¹ce w tej dziedzinie (19). Wykazano, ¿e w jajnikach doj-rza³ych p³ciowo samic myszy mo¿e dochodziæ do powstawania nowych oocytów wy-wodz¹cych siê z komórek GSC. W obrêbie tkanki jajnikowej wykryto aktywnoœæ



genu SCP3 (bia³ko kompleksu synaptonemalnego), który podlega ekspresji tylkopodczas profazy pierwszej mejozy. Nale¿y jednak pamiêtaæ, ¿e mysz stanowi jedy-nie model doœwiadczalny i nie wiadomo w jakim zakresie uzyskane wyniki odzwier-ciedlaj¹ analogiczne zjawiska u innych gatunków ssaków.

Prawid³owe funkcjonowanie jajnika w okresie rozrodczym w jednakowym stop-niu zale¿y od proliferacji jak i degeneracji komórek. Apoptoza jest zjawiskiem ob-serwowanym we wszystkich stadiach oogenezy, od pierwotnych komórek p³cio-wych, przez oogonia, do oocytów I rzêdu (20). Przypuszcza siê, ¿e ok. dwie trzeciepierwotnych komórek p³ciowych kobiet ulega degeneracji ju¿ podczas ¿ycia p³odo-wego lub zaraz po urodzeniu (3). Do wyjaœnienia opisywanego zjawiska proponowa-ne s¹ trzy mechanizmy okreœlane jako „œmieræ przez zaniedbanie” (death by neglect),„œmieræ przez uszkodzenie” (death by defect) oraz „œmieræ przez samo poœwiêcenie”(death by self-sacrifice). W pierwszym przypadku apoptozê indukuje zbyt niska aktyw-noœæ czynników wzrostowych dzia³aj¹cych za poœrednictwem swoistych recepto-rów. Przy utrudnionym dostêpie do receptorów dochodzi do upoœledzenia przeka-zu sygna³ów miêdzykomórkowych i do œmierci komórek. Drugi mechanizm wynikaz b³êdów podczas rekombinacji mejotycznej indukuj¹cych apoptozê. Natomiast„œmieræ przez samo poœwiêcenie” zachodzi, wówczas gdy grupa pierwotnych komó-rek p³ciowych zamiera na drodze sterowanego samobójstwa, poœwiêcaj¹c siê dlakomórki lepiej od¿ywionej i maj¹cej wiêksze szanse na rozwój (3).

Apoptozê w oocytach owulowanych lub dojrzewaj¹cych in vitro stwierdzonom.in. u ludzi (3,21,22) i byd³a (23,24) oraz u myszy (22,25,26). Wykazano, ¿e czê-stoœæ wystêpowania zmian apoptotycznych w oocytach niedojrza³ych jest stosunko-wo niska, bowiem u byd³a wynosi 7%. W oocytach dojrza³ych zmiany te dotycz¹ ju¿23% komórek (24). Ponadto, z ca³¹ pewnoœci¹ stwierdzono, ¿e czêstoœæ apoptozyw oocytach wzrasta wraz z wiekiem samicy. Dotychczas zale¿noœæ tê zaobserwowa-no u ludzi (27) oraz myszy (26,28). Wykazano indukuj¹cy wp³yw suboptymalnychwarunków dojrzewania oocytów in vitro na czêstoœæ wystêpowania apoptozy m.in.u ludzi (29), byd³a (20) i myszy (28). Jednak¿e wyniki uzyskiwane przy zastosowaniuznanych metod detekcji apoptozy (np. TUNEL, przemieszczenie fosfatydyloseryny)nie s¹ jednoznaczne m.in., dlatego ¿e omawiane techniki mog¹ generowaæ tzw.fa³szywe wyniki pozytywne. Nie zawsze stwierdza siê bowiem zwi¹zek pomiêdzywynikami uzyskanymi po zastosowaniu tych metod a wystêpowaniem zmian morfo-logicznych, charakterystycznych dla apoptozy (22,30). Sugeruje siê, ¿e szlaki akty-wacji oraz przebieg apoptozy mog¹ byæ na tyle zró¿nicowane, i¿ kompleksowa ana-liza tego zjawiska w oocytach powinna obejmowaæ ró¿ne techniki (21).

Proces apoptozy badany jest równie¿ na poziomie transkrypcji lub translacji po-przez analizê ekspresji genów. Dotyczy to g³ównie genów koduj¹cych czynniki pro-lub antyapoptotyczne z rodziny Bcl-2. W oocytach myszy stwierdzono obecnoœætranskryptów genów Bax i Bcl-2 (31). W badaniach Yang i wsp. (1) stwierdzono, ¿eoocyty bydlêce charakteryzuj¹ce siê nieprawid³ow¹ morfologi¹ przed dojrzewaniemin vitro czêœciej wykazywa³y zmiany apoptotyczne oraz podwy¿szony poziom bia³ka


BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 172-182 2005 177

Bax. Natomiast wœród oocytów o prawid³owej morfologii rzadziej obserwowanoapoptozê i w przeciwieñstwie do poprzedniej grupy wy¿szy poziom bia³ka Bcl-2 (1).

Wiadomo, ¿e przez ca³y okres wzrostu i dojrzewania oocyty pozostaj¹ w œcis³ymzwi¹zku z komórkami pêcherzykowymi za poœrednictwem tzw. z³¹czy szczelino-wych. Na podstawie otrzymanych wyników Yang i wsp. (1) donosz¹, ¿e oocyty by-dlêce pozbawione kilku zwartych warstw komórek wzgórka jajonoœnego, w póŸniej-szych etapach rozwoju zarodkowego po zap³odnieniu in vitro znacznie czêœciej wy-kazuj¹ zmiany apoptotyczne (np. fragmentacjê cytoplazmy). Jednak w innych bada-niach nie stwierdzono bezpoœredniego zwi¹zku pomiêdzy morfologi¹ komórek ziar-nistych i œciany pêcherzyka a jakoœci¹ oocytu (32). Autorzy wskazuj¹, ¿e w pêcherzy-kach jajnikowych zwykle wystêpuje pewna liczba komórek ze zmianami apoptotycz-nymi, przy czym sygna³ apoptotyczny przekazywany jest z komórek pêcherzyko-wych do oocytu dopiero po przekroczeniu pewnego krytycznego poziomu.

5. Apoptoza w zarodkach

W okresie przedimplantacyjnym zarodki cechuje stosunkowo wysoka czêstoœæzamierania jeszcze przed osi¹gniêciem stadium blastocysty. Pomimo ¿e apoptozazachodzi naturalnie w warunkach in vivo, jakoœæ blastocyst uzyskanych in vitro jestzdecydowanie ni¿sza (10). Blastomery ze zmianami apoptotycznymi obserwowanozarówno w zarodkach prawid³owych jak i zahamowanych w rozwoju (30). Na pod-stawie uzyskanych wyników w licznie przeprowadzonych badaniach dowodzi siê, ¿ewarunki hodowli zarodków in vitro wp³ywaj¹ na podwy¿szon¹ czêstoœæ apoptozy(33). Jednak¿e nadal z ca³¹ pewnoœci¹ nie mo¿na stwierdziæ jaka jest rola apoptozyw rozwoju zarodkowym i czy zaobserwowane zjawisko jest przede wszystkim odpo-wiedzi¹ zarodka na odmienne œrodowisko rozwoju.

Do identyfikacji blastomerów apoptotycznych w przedimplantacyjnych zarod-kach ssaków najczêœciej stosuje siê metodê TUNEL. Komórki takie stwierdzonow 70-80% blastocyst ludzkich (6) i mysich (16) oraz w prawie wszystkich blastocy-stach bydlêcych (34,35). Przeanalizowano tak¿e zarodki we wczeœniejszych stadiachrozwoju. U byd³a, Matwee i wsp. (24) stwierdzili apoptotyczne blastomery w przy-padku ok. 5% zarodków 8-16-blastomerowych i 79% morul. Natomiast w zarodkachwe wczeœniejszych stadiach (od zygoty do siedmiu blastomerów) nie obserwowanozmian apoptotycznych, co œwiadczy o zale¿noœci apoptozy od stadium zarodka. Jed-nak¿e, podobnie jak w przypadku oocytów, metodyka u¿yta do detekcji apoptozyw zarodkach ma istotny wp³yw na interpretacjê wyników. Stwierdzono bowiem, ¿ew zarodkach bydlêcych fragmentacja cytoplazmy nie zawsze znajduje potwierdze-nie w badaniu fragmentacji DNA metod¹ TUNEL i tylko zarodki pozytywne podwzglêdem obu cech mo¿na uznaæ za apoptotyczne (30).

Apoptoza jest zjawiskiem naturalnie wystêpuj¹cym w zarodkach, jednak w sub-optymalnych warunkach in vitro obserwuje siê to zjawisko znacznie czêœciej (33).



W badaniach wykazano, ze sk³ad i rodzaj po¿ywki hodowlanej w istotny sposóbwp³ywaj¹ na jakoœæ zarodków. Stwierdzono, ¿e obecnoœæ w pod³o¿u czynnikówwzrostu np. IGF 1, IGF 2, insuliny i hormonu wzrostu, znacz¹co podwy¿sza procentuzyskiwanych blastocyst oraz ca³kowit¹ liczbê blastomerów w zarodku (23,36-39).

Prawdopodobnie celem apoptozy jest tak¿e eliminacja komórek z nieprawid-³owoœciami chromosomowymi lub blastomerów wêz³a zarodkowego blastocysty na-dal zachowuj¹cych zdolnoœæ przekszta³cania siê w komórki trofoblastu. Obydwa tezjawiska mog¹ ograniczaæ prawid³owy rozwój zarodka (6). Blastomery ze zmianamiapoptotycznymi obserwowano w wiêkszoœci (93%) blastocyst bydlêcych pochodz¹-cych z hodowli in vitro. Komórki takie obecne by³y w obrêbie ca³ej blastocysty zeznaczn¹ przewag¹ w wêŸle zarodkowym, a ich liczba wzrasta³a wraz z czasem ho-dowli (35). Potwierdza to znaczenie apoptozy w eliminacji nieprawid³owych gene-tycznie blastomerów wêz³a zarodkowego, które mog³yby daæ pocz¹tek zarodkomo obni¿onym potencjale rozwojowym. Ponadto, Liu i wsp. (40) w swoich badaniachwykazali wp³yw ploidalnoœci zarodka na czêstoœæ zachodzenia apoptozy. W mysichzarodkach partenogenetycznych o haploidalnej liczbie chromosomów znacznie czêœ-ciej obserwowano blastomery apoptotyczne ni¿ w zarodkach diploidalnych. W ba-daniach tych udowodniono równie¿, ¿e obecnoœæ genomu ojcowskiego nie jest ko-nieczna do aktywacji procesu apoptozy.

Apoptozê stwierdzono w zarodkach pozyskanych zarówno in vivo jak i in vitro,jednak w ka¿dych warunkach proces ten ma nieco odmienny przebieg. Ró¿nice do-tycz¹ momentu zachodzenia procesu degradacji DNA oraz fragmentacji j¹dra pod-czas rozwoju przedimplantacyjnego. Zjawiska te obserwuje siê we wczeœniejszychstadiach rozwojowych zarodków hodowanych in vitro w porównaniu z warunkami in

vivo. Proces degradacji DNA in vitro wystêpuje od stadium 3-8-blastomerów, nato-miast in vivo od stadium moruli. Fragmentacja j¹dra jest obserwowana in vitro odstadium 9-16-blastomerów, a in vivo – podobnie jak poprzednio – od stadium mo-ruli (30). Autorzy konkluduj¹, ¿e opisane ró¿nice s¹ prawdopodobnie wynikiem ak-tywacji genomu zarodkowego u byd³a w stadium 8-16-blastomerów. Suboptymalnewarunki in vitro modyfikuj¹ proces ekspresji genów hamuj¹cych apoptozê, przez cojest on uaktywniany wczeœniej. Nale¿y jednak podkreœliæ, ¿e wyniki ró¿nych grupbadawczych nie s¹ jednoznaczne. Gjorret i wsp. (30) wykazali aktywnoœæ apopto-tyczn¹ w zarodkach byd³a ju¿ w stadium 3-8-blastomerów, podczas gdy Matweei wsp. (24) oraz Byrne i wsp. (34) dopiero w stadium 8-16-blastomerów. Nasuwa siêzatem wniosek, podobny jak w przypadku badañ oocytów, ¿e kompleksowa analizaprocesu apoptozy w zarodkach powinna obejmowaæ kilka technik detekcji. Ponad-to sugeruje siê, ¿e we wczesnych stadiach rozwoju zarodkowego (do stadium8-16-blastomerów) pomimo uruchomienia procesu apoptozy, szlaki apoptotycznes¹ prawdopodobnie blokowane, a proces ten ulega aktywacji dopiero pod wp³y-wem silnego bodŸca zewnêtrznego jak czynniki chemiczne lub szok termiczny.Wynika to najprawdopodobniej z ni¿szej wra¿liwoœci zarodków na bodŸce zew-nêtrzne (41).


BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 172-182 2005 179

Badaniami ekspresji wybranych genów reguluj¹cych proces apoptozy objêtorównie¿ zarodki przedimplantacyjne. Transkrypty dla genów Bax i Bcl-2 wykryto me-tod¹ RT-PCR we wszystkich stadiach rozwojowych od zygoty do blastocysty zarów-no u myszy (28,31) jak i u byd³a (11). Równie¿ w badaniach immunochemicznych po-twierdzono obecnoœæ bia³ek tych genów w zarodkach byd³a (1,11). Na podstawiewyników z licznie przeprowadzonych badañ potwierdzono teoriê, ¿e proporcja po-miêdzy poziomem ekspresji genów Bax i Bcl-2 mo¿e byæ markerem determinuj¹cymprze¿ywalnoœæ zarodków (1,31,42). W badaniach zarodków cz³owieka powi¹zanopoziom bia³ek Bax i Bcl-2 z ich morfologi¹, stwierdzaj¹c wy¿szy poziom bia³ka Bcl-2w zarodkach prawid³owych, a przewagê bia³ka Bax w pofragmentowanych (42). Po-dobne rezultaty uzyskano w przypadku zarodków bydlêcych (1). W wyniku analizyekspresji genów koduj¹cych kaspazy wykazano zmiennoœæ w obecnoœci poszczegól-nych kaspaz w zarodkach bydlêcych (31). Niektóre z nich (np. kaspazê 12) wykrytowe wszystkich badanych stadiach (od zygoty do blastocysty), natomiast innych (np.kaspazy 11) nie wykryto w ¿adnej badanej próbie. Jednak¿e pomimo tego zró¿nico-wania, potwierdzono ich podstawowe funkcje w procesie apoptozy w zarodkachprzedimplantacyjnych (5,11,43). Wykazano istotny zwi¹zek pomiêdzy aktywnoœci¹kaspaz a fragmentacj¹ j¹dra komórkowego (11). Stwierdzono równie¿ jednoczesn¹aktywacjê kaspaz, ekspresjê genu Bad i zainicjowanie apoptozy (11). Nie we wszyst-kich doniesieniach potwierdza siê jednak te wyniki. Martinez i wsp. (44) nie wykaza-li zwi¹zku aktywnoœci kaspaz ani z procesem apoptozy, ani z fragmentacj¹ blasto-merów w ludzkich zarodkach przedimplantacyjnych. Po zastosowaniu uniwersalne-go inhibitora kaspaz sprzê¿onego z FITC, aktywnoœæ tej grupy enzymów stwierdzonowe wszystkich stadiach rozwojowych zarodków, jednak¿e nie powi¹zano jej z mor-fologi¹ pofragmentowanych blastomerów. Na podstawie tych wyników zasugerowa-no, ¿e kaspazy mog¹ byæ pobudzane równie¿ poprzez mechanizmy nie powi¹zanez apoptoz¹, przez co mog¹ mieæ nie tylko funkcjê formatywn¹, ale te¿ destrukcyjn¹.

6. Podsumowanie

Obecnie, zarówno w medycynie jak i w hodowli zwierz¹t du¿e znacznie ma jakoœæzarodków uzyskiwanych w warunkach in vitro. Czêstoœæ wystêpowania apoptozy sta-nowi wa¿ny marker potencja³u rozwojowego zarodków. Wykazano, ¿e uruchomienieprocesu apoptozy jest cech¹ specyficzn¹ dla stadium rozwojowego zarodka. Stwier-dzono te¿, ¿e zachodzi on zarówno w warunkach in vivo jak i in vitro, jednak jego czê-stoœæ in vitro jest znacznie wiêksza. Istniej¹ hipotezy wyjaœniaj¹ce to zjawisko i nie-w¹tpliwie celem wielu prowadzonych aktualnie badañ jest takie zoptymalizowaniewarunków hodowli in vitro, aby ograniczyæ proces degeneracji blastomerów.

Istotnym problemem oceny apoptozy s¹ niedoskona³oœci stosowanych technikdetekcji. Stosunkowo czêsto obserwuje siê tzw. fa³szywe wyniki pozytywne, bêd¹cepodstaw¹ nieprawid³owych wniosków. Dotyczy to zarówno badañ oocytów jak i za-



rodków. Dlatego te¿ pomimo zaawansowania badañ, nadal istnieje szereg nie wyjaœ-nionych dot¹d zagadnieñ, a czêœæ uzyskanych dotychczas wyników wymaga weryfi-kacji.

Praca finansowana ze œrodków KBN w latach 2003-2005 jako projekt badawczy zamawianynr PBZ/KBN 084/PO6/2002.

Literatura

1. Yang M. Y., Rajamahendran R., (2002), Anim. Reprod. Sci., 70, 159-169.2. Trzciñska M., (2003), Biotechnologia, 1(60), 93-105.3. Tilly J. L., (2001), Nature Rev., 2, 838-848.4. Kerr J. F., Wyllie A. H., Currie A. R., (1972), Br. J. Cancer, 26(4), 239-57.5. Betts D. H., King W. A., (2001), Theriogenology, 55, 171-191.6. Hardy K., (1999) Rev. Reprod., 4, 125-134.7. Hengartner M. O., (2000), Nature, 407, 770-776.8. Kiliañska Z. M., Miœkiewicz A., (2003), Post. Biol. Kom., 30(1), 129-152.9. Motyl T., Gajkowska B., P³oszaj T., Warêski P., Orzechowski A., Zimowska W., Wojewódzka U., Ry-

niewicz Z., Rekiel A., (2000), Post. Biol. Kom., 27(1), 31-51.10. Ro¿ynkowa D., Filip A., (1999), Post. Biol. Kom., 26(3), 561-578.11. Spanos S., Rice S., Karagiannis P., Taylor D., Becker D. L., Winston R. M. L., Hardy K., (2002), Repro-

duction, 124, 353-363.12. Sulejczak D., (2000), Post. Biol. Kom., 27(4), 527-568.13. Wyllie A. H., (1997), British Medical Bulletin, 53(3), 451-465.14. Bielak-¯mijewska A., (2003), Kosmos, 52(2-3), 157-171.15. Handyside A. H., Hunter S., (1986), Roux’s Arch. Dev. Biol., 195, 519-526.16. Gavrielli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S. A., (1992), J. Cell Biol., 119, 493-501.17. K¹tska L., (2001), Post. Biol. Kom., 28, 177-187.18. K¹tska L., Ryñska B., (1998), Theriogenology, 50, 213-222.19. Johnson J., Canning J., Kaneko T., Pru J. K., Tilly J. L., (2004), Nature, 428, 145-150.20. Rizos D., Ward F., Duffy P., Boland M. P., Lonergan P., (2002), Mol. Reprod. Dev., 61, 234-248.21. Morita Y., Tilly J. L., (1999), Dev. Biol., 213, 1-17.22. van Blerkom J., Davis P. W., (1998), Hum. Reprod.,13(5), 1317-1324.23. Kolle S., Stojkovic M., Boie G., Wolf E., Sinowatz F., (2003), Biol. Reprod., 68(5), 1584-1589.24. Matwee C., Betts D. H., King W. A., (2000), Zygote, 8, 57-68.25. Reynaud K., Driancourt M. A., (2000), Mol. Cell Endocrinol., 163, 101-108.26. Takase K., Ishikawa M., Hoshiai H., (1995), Tohoku J. Exp. Med., 175(1), 69-76.27. Wu J., Zhang L., Wang X., (2000), Fertil. Steril., 74(6), 1137-1141.28. Jurisicova A., Rogers I., Fasciani A., Casper R. F., Varmuza S., (1998), Mol. Hum. Reprod., 4(2),

139-145.29. Trounson A., Anderiesz C., Jones G. M., Kausche A., Lolatgis N., Wood C., (1998), Hum. Reprod.,

13(3), 52-62.30. Gjorret J. O., Knijn H. M., Dieleman S. J., Avery B., Larsson L. I., Maddox-Hyttel P., (2003), Biol. Re-

prod., 69, 1193-1200.31. Exley G. E., Tang C., McElhinny A. S., Warner C. M., (1999), Biol. Reprod., 61, 231-239.32. Zeuner A., Müller K., Reguszynski K., Jewgenow K., (2003), Theriogenology, 59, 1421-1433.33. Briston D. R., Schultz R. M., (1997), Biol. Reprod., 56, 1088-1096.34. Byrne A. T., Southgate J., Brison D. R., Leese H. J., (1999), J. Reprod. Fertil., 117, 97-105.35. Neuber E., Luetjens C. M., Chan A. W. S., (2002), Theriogenology, 57, 2193-2202.36. Augustin R., Pocar P., Wrenzycki C., Niemann H., Fischer B., (2003), Reproduction, 126, 91-99.


BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 172-182 2005 181

37. Byrne A. T., Southgate J., Brison D. R., Leese H. J., (2002), Mol. Reprod. Dev., 62, 489-495.38. Makarevich A. V., Markkula M., (2002), Biol. Reprod., 66, 386-392.39. Spanos S., Becker D. L., Winston R. M. L., Hardy K., (2000), Biol. Reprod., 63, 1413-1420.40. Liu L., Trimarchi J. R., Keefe D. L., (2002), Biol. Reprod., 66(1), 204-210.41. Weil M., Jacobson M. D., Coles H. S., Davies T. J., Gardner R. L., Raff K. D., Raff M. C., (1996), J. Cell

Biol., 133, 1053-1059.42. Hardy K., (1997), Mol. Hum. Reprod., 3(10), 919-925.43. Jurisicova A., Varmuza S., Casper R. F., (1996), Mol. Hum. Reprod., 2, 93-98.44. Martinez F., Rienzi L., Iacobelli M., Ubaldi F., Mendoza C., Greco E., Tesarik J., (2002), Hum. Re-

prod. Dev., 17(6), 1584-1590.



Ewelina Warzych, Dorota Lechniak Apoptoza w oogenezie i ...

Documents

Transcript of Ewelina Warzych, Dorota Lechniak Apoptoza w oogenezie i ...