ęść ąsteczkowe biopolimerów - chem.pg.edu.pl · się zjawisko sedymentacji. Uzyskanie...

Część II: Masy cząsteczkowe biopolimerów

MATERIAŁY POMOCNICZE DO WYKŁADÓW Z PODSTAW BIOFIZYKI

IIIr. Biotechnologii prof. dr hab. inż. Jan Mazerski

WYZNACZANIE MAS CZĄSTECZKOWYCH BIOPOLIMERÓW

Określenie masy cząsteczkowej było zawsze jednym z podstawowych zagadnień przy

charakteryzowaniu biopolimerów. Przy poszukiwaniu metod rozwiązania tego zagadnienia

napotykano wiele różnorakich przeszkód. Podstawową była sama masa cząsteczkowa, która dla

typowych białek zawiera się w przedziale od kilkunastu do kilkuset tysięcy daltonów. Żadna z

technik stosowanych przy oznaczaniu masy cząsteczkowej związków chemicznych nie może być

stosowana dla tak dużych cząsteczek. Rozpoczęto więc na przełomie XIX i XX w. poszukiwanie

specjalnych technik pozwalających na choćby przybliżone oszacowanie masy cząsteczkowej

biopolimerów.

MMeettooddyy sseeddyymmeennttaaccyyjjnnee

Pierwsze próby dotyczyły zastosowania metod sedymentacyjnych opierających się na

wykorzystaniu różnic w gęstości rozpuszczalnika i biopolimeru.

SSeeddyymmeennttaaccjjaa zzaawwiieessiinn mmaakkrroosskkooppoowwyycchh

Podczas sedymentacji zawiesin makroskopowych w polu grawitacyjnym obserwujemy

charakterystyczny przebieg zjawiska: bezpośrednio po zakończeniu mieszania cząstki zawieszone

są w całej objętości - ich stężenie jest jednakowe w każdym naczynia.

upływ czasu

Po pewnym czasie, na skutek opadania cząstek zawiesiny górna część płynu nie zawiera zawiesiny,

a na dnie pojawia się osad. Pomiędzy zawiesiną i czystym płynem występuje ostra granica.

W miarę upływu czasu granica ta przesuwa się ku dołowi. Rośnie również grubość osadu na dnie.

Na szybkość sedymentacji ma wpływ:

• różnica gęstości pomiędzy cząstkami zawiesiny a cieczą

• lepkość płynu decydująca o tarciu pomiędzy cząstkami zawiesiny a płynem.

1


Zjawisko opadania makroskopowych cząstek zawiesiny można znacznie przyspieszyć umieszczając

roztwór w wirówce. Pojawiająca się podczas wirowania siła odśrodkowa może mieć wielokrotnie

większa wartość niż siła ciężkości.

SSeeddyymmeennttaaccjjaa mmaakkrroocczząąsstteecczzeekk

W przypadku zawiesiny makrocząsteczek biologicznych różnica gęstości pomiędzy silnie

hydratowanym biopolimerem a roztworem wodnym jest tak mała, że w polu grawitacyjnym nie

obserwujemy zjawiska sedymentacji. Dochodzi do tego jeszcze efekt dyfuzji: aby pojawiła się

sedymentacja siłą działająca na cząsteczkę (ciężar lub siła odśrodkowa) musi przewyższać

przeciwnie skierowana siłę dyfuzji wynikającą z ruchów termicznych. Dopiero gdy poddamy

próbkę działaniu sił odśrodkowych setki lub tysiące razy większych niż siła grawitacyjna pojawia

się zjawisko sedymentacji. Uzyskanie dostatecznie dużych sił odśrodkowych wymaga zastosowania

wirówek o specjalnej konstrukcji, tzw. ultrawirówek. Współczesne ultrawirówki umożliwiają

uzyskanie sił odśrodkowych nawet 500 000 razy przekraczających siłę grawitacji.

W polu sił odśrodkowych makrocząsteczki mogą ulegać sedymentacji lub przeciwnie

skierowanej flotacji. Jeżeli gęstość makrocząsteczek jest większa od gęstości rozpuszczalnika, to

biopolimer sedymentuje. Biopolimery o gęstości mniejszej od gęstości rozpuszczalnika, np. lipidy,

ulegają flotacji, czyli kierują się w stronę menisku

Technika ultrawirowania znajduje obecnie szerokie zastosowanie w badaniu

makrocząsteczek. Umożliwia ona m.in. wyznaczenie bezwzględnych mas cząsteczkowych

biopolimerów. Poza zastosowaniami analitycznymi ma też wielkie zastosowanie przy rozdzielaniu

organelli komórkowych, białek, kwasów nukleinowych, lipoprotein i lipopolisacharydów.

Podstawy teoretyczne

Podczas wirowania na cząsteczkę biopolimeru w roztworze działają 3 siły:

siła odśrodkowa F W T

F[1] aVmarmF 2 ρ==ω=

gdzie: m – masa cząsteczki

ω - prędkość kątowa rotora

r – odległość od osi obrotu

a - przyspieszenie odśrodkowe

V – objętość cząsteczki

ρ - gęstość cząsteczki

2


przeciwnie skierowana siła wyporu W

[2] amaVrVW ss

2s ρ

ρ=ρ=ωρ=

gdzie: ρs - gęstość cieczy

tarcie dynamiczne T zależne od szybkości ruchu cząsteczki

[3] dtdrfT =

gdzie: f – współczynnik tarcia

Przyjmując sferyczny kształt cząsteczki oraz laminarny przepływ cieczy można zastosować wzór

Stokesa:

[4] dtdrd6T πη=

gdzie: d - promień makrocząsteczki

η - lepkość cieczy

W roztworze szybko dochodzi do ustalenia się stanu równowagi, w którym siła tarcia równoważy

siłę odśrodkową pomniejszoną o siłę wyporu i cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym.

Warunek równowagi ma zatem postać:

[5] ( )dtdrd6rVWF 2

s πη=ωρ−ρ=−

Można go przekształcić do postaci:

[6] dtdr

r1d61V 2

s

ωπη=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ρρ

−ρ .

Wielkością charakteryzującą ruch danej cząsteczki w danym rozpuszczalniku jest stała

sedymentacji S:

[7] dtdr

r1S 2ω

= .

Jest ona równa przyrostowi prędkości sedymentacji cząsteczki w wyniku jednostkowego przyrostu

przyspieszenia odśrodkowego. Jednostką stałej sedymentacji jest 1 S (swedberg) = 10-13 s.

Korzystając ze współczynnika sedymentacji można wzór[6] zapisać w postaci:

[8] dS61V s πη=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ρρ

−ρ .

Masę pojedynczej cząsteczki biopolimeru, m, można wyrazić wzorem:

[9] AN

MVm =ρ=

3


gdzie: M - masa cząsteczkowa w gramach

NA - liczba Avogadro.

Podstawiając powyższą zależność do wzoru [6] i mnożąc obustronnie przez NA otrzymujemy:

[10] As dsN61M πη=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ρρ

−

Ze wzoru tego można wyznaczyć masę cząsteczkową makrocząsteczki znając stałą sedymentacji s:

[11]

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ρρ

−

πη=

s

A

1

dsN6M

Powróćmy jeszcze do równania [5]. Można je tak przekształcić, aby uzyskać wzór na szybkość

ruchu cząsteczek:

[12] ( )d6

aVdtdr s

πηρ−ρ

=

Uwzględniając sferyczny kształt cząsteczki można wyrazić objętość jako funkcję średnicy:

V = πd3/6. Prowadzi to do zmodyfikowanej postaci wzoru [12]:

[12a] ( )ηρ−ρ

=36

addtdr s

2

Tak więc przy danym przyspieszeniu odśrodkowym, a, szybkość ruchu sferycznej cząsteczki

biopolimeru jest wprost proporcjonalna do kwadratu promienia i różnicy gęstości cząsteczki i

rozpuszczalnika oraz odwrotnie proporcjonalna do lepkości roztworu.

Cząsteczki niektórych biopolimerów istotnie odbiegają od kształtu sferycznego. W takiej sytuacji

wzór [12] przyjmuje postać:

[12b] ( )ηρ−ρ

=36

adkdtdr s

2

gdzie: k - współczynnik kształtu.

Dla cząsteczek o kształcie dysku wartość k jest większa od 1, a dla cząsteczek o kształcie pręta lub

cygara mniejsza od 1.

Wirówki i ultrawirówki

Wirówki można umownie podzielić ze względu na uzyskiwaną liczbę obrotów na:

niskoobrotowe - do 5 000 obr/min,

średnioobrotowe - do 20 000 obr/min,

ultrawirówki - powyżej 20 000 obr/min.

4


Natomiast ze względu na przeznaczenie, wirówki można podzielić na:

analityczne; zwykle mają bardzo dużą liczbę obrotów i wyposażone są w układ do analizy

przemieszczania się cząsteczek podczas wirowania;

preparatywne; przystosowane do wirowania względnie dużych objętości roztworów;

specjalnego przeznaczenia; np. wirówki hematokrytowe.

Ponieważ jednym z ważnych parametrów podczas wirowania jest temperatura roztworu, więc

wirówki i ultrawirówki wyposażone są w układy termostatujące umożliwiają kontrolę temperatury

nawet z dokładnością do 0,1 stopnia. W ultrawirówkach i wirówkach średnioobrotowych rotor jest

ponadto umieszczony w komorze próżniowej, aby wyeliminowań nagrzewanie się rotora od tarcia o

powietrze. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni próbki muszą być hermetycznie zamknięte. W

zależności od budowy rotora hermetyzacja może dotyczyć całego jego wnętrza lub pojedynczych

próbek.

Rodzaje rotorów

Rotor wirówki to odpowiedni blok lub konstrukcja przymocowana do osi wirówki, w której

umieszcza się probówki wirownicze. Podstawowe typy rotorów to:

rotor horyzontalny (pojemniki na probówki są uchylne)

rotor kątowy

rotor analityczny

W przypadku rotora horyzontalnego, Rys.1A, gilzy probówek wirówkowych są zawieszone

na osiach prostopadłych do osi rotora i podczas wirowania ustawiają się wraz z probówkami pod

kątem 90° do osi obrotu. Podczas wirowania cząstki poruszają się w polu siły odśrodkowej wzdłuż

promienia obrotu w kierunku dna probówki. W miarę oddalania się od menisku działa na nie coraz

większa siła odśrodkowa

Rotor kątowy wykonany jest z jednolitego bloku metalu w którym znajdują się gniazda do

umieszczenia probówek wirówkowych. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni, to rotor zamykany

jest hermetyczną pokrywę. W rotorze kątowym, Rys.1B, probówki wirówkowe nie zmieniają

swego położenia i ustawione są w stosunku do osi obrotu pod kątem α innym niż 90°, najczęściej

30°, 45° lub 60°. Cząsteczki poruszają się prostopadle do osi obrotu i osadzają się na bocznej

ścianie probówki. W rotorze tego typu różnice w odległościach cząsteczek od osi obrotu są

znacznie mniejsze niż w rotorze horyzontalnym, więc i różnice w sile odśrodkowej w różnych

miejscach probówki są mniejsze.

5


A)

S

S

B) α

C)

Rys.1. Schemat budowy rotorów stosowanych w wirówkach laboratoryjnych i ultrawirówkach: A) rotor

horyzontalny (po lewej w spoczynku, po prawej w czasie wirowania), B) rotor kątowy, C) rotor

analityczny

Rotor analityczny wykonany jest z duraluminium, stali

lub tytanu i ma kształt spłaszczonej elipsoidy, Rys.1C. W

rotorze znajdują się dwa cylindryczne otwory, których osie są

równoległe do osi obrotu. Otwory te znajdują się symetrycznie

po obu stronach osi obrotu. Umieszcza się w nich dwie kuwety:

pomiarową z badanym roztworem i balastową o identycznej

masie jako przeciwwagę. Kuwety stosowane w rotorach

analitycznych mają specyficzną budowę, Rys.2.

Rys.2. Budowa kuwety analitycznej

Korpus kuwety analitycznej wykonany jest z metalu, wewnątrz niego znajduje się rdzeń wykonany

z tworzywa lub szkła ze zbiorniczkiem sektorowym. Zbiorniczek zamknięty jest z dwóch stron

przez okienka kwarcowe. Całość jest hermetycznie zamknięta. W połowie wysokości kuwety

znajduje się otwór do jej napełniania. Istnieje kilka podstawowych typów kuwet analitycznych.

Najprostsza jest kuweta jednosektorowa, Rys.3a. Kuweta

dwusektorowa, Rys.3b, ma dwa zbiorniczki. Jeden z nich jest

napełniany badanym roztworem, a drugi rozpuszczalnikiem. Taka

kuweta pozwala rejestrować sedymentację badanego roztworu na

tle rozpuszczalnika.

Rys.3. Typy kuwet analitycznych

W takich klasycznych kuwetach granice sedymentacji mogą być nieostre, co powoduje dużą

niepewność wyznaczenia współczynnika sedymentacji, zwłaszcza substancji o małych masach

6


cząsteczkowych. Zastosowanie kuwety ze sztuczną granicą sedymentacji, Rys.3c, pozwala

wyeliminować ten efekt. Jest to kuweta jednosektorowa z dwoma dodatkowymi zbiorniczkami

połączonymi ze sobą i z dnem kuwety kapilarnymi kanałami. W głównym zbiorniczku sektorowym

umieszcza się rozpuszczalnik, a w dodatkowych zbiorniczkach badany roztwór o większej gęstości.

Gdy rotor osiągnie 7-8 tys. obr/min badany roztwór przemieszcza się na dno kuwety wypierając

rozpuszczalnik w kierunku osi obrotu. Powstaje ostra granica sedymentacji, której położenie

zmienia się w trakcie wirowania.

We wszystkich typach kuwet analitycznych przesuwanie się granicy sedymentacji śledzi się

metodami optycznymi przez pomiar współczynnika załamania światła, który jest proporcjonalny do

stężenia substancji rozpuszczonej. Wykorzystywana może być metoda Pilpota-Svensona lub

metoda interferencyjna Rayleigha. W obu metodach stosuje się wąską, monochromatyczną wiązkę

światła.

Pierwszy z układów rejestruje wartość pochodnej współczynnika załamania światła, dn/dr, wzdłuż

promienia. Pochodna ta jest proporcjonalna do pochodnej stężenia badanej substancji dc/dr. Na

granicy sedymentacji występuje szybka zmiana stężenia, co na wykresie pochodnej przejawia się

występowaniem maksimum, Rys.4.

A)r

dc/d

r

B) r

c

Rys.4. Profile sedymentacji: A) wartość pierwszej pochodnej dc/dr i B) stężenie c w funkcji odległości

od osi obrotu

Układ interferencyjny Rayleigha umożliwia bezpośrednio wyznaczenie współczynnika załamania

światła w każdym punkcie kuwety. Wymaga jednak grubszych kuwet, co z kolei prowadzi do

wydłużenia czasu wirowania nawet do kilkudziesięciu godzin.

7


Wyznaczanie stałej sedymentacji

Najczęściej stosowanym sposobem wyznaczania stałej sedymentacji jest metodą graficzną

bazująca na zależności uzyskanej po scałkowaniu równania [7]:

[13] 2ln r S t const= ω +

gdzie: r położenie granicy sedymentacji po czasie wirowania t z prędkością kątową ω.

Wykonując wykres zależności ln(r) od ω2t powinniśmy otrzymać linię prostą. Nachylenie tej

prostej równe jest współczynnikowi sedymentacji S. Aby uzyskać możliwie dokładną wartość S

należy dokonać co najmniej kilku pomiarów położenia granicy sedymentacji. Wykorzystuje się w

tym celu rotory analityczne.

Określanie masy cząsteczkowej

W początkowym okresie rozwoju metod sedymentacyjnych aby określić wielkość jakiegoś

białka lub organelli komórkowej podawano jej stałą sedymentacji, np. rybosom 70 S. Z czasem

opracowano techniki pozwalające na mniej lub bardziej dokładne oszacowanie masy cząsteczkowej

na podstawie wyników pomiarów sedymentacyjnych. Dwie najpopularniejsze techniki omówimy

poniżej.

z zastosowaniem szybkości sedymentacji Ze wzoru [11] wynika, że znając stałą sedymentacji S można wyznaczyć masę

cząsteczkową. We wzorze tym występują jednak kłopotliwe do eksperymentalnego wyznaczenia

wielkości η i d. Można je wyeliminować korzystając ze wzoru Einsteina na współczynnik dyfuzji

D:

[14] AdN6

RTDπη

=

gdzie: R - stała gazowa,

T - temperatura w kelwinach.

Otrzymujemy wtedy I. równanie Svedberga:

[16]

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ρρ

−=

s1D

RTSM

Pomiary stałej sedymentacji S i współczynnika dyfuzji D oraz gęstości rozpuszczalnika ρs i

gęstości makrocząsteczki ρ pozwalają na wyznaczenie masy cząsteczkowej.

8


metodą równowagi sedymentacyjnej Sedymentacja makrocząsteczek powoduje powstanie gradientu stężenia w roztworze. Po

pewnym czasie wirowania ustala się stan równowagi pomiędzy przeciwnie skierowanymi

procesami sedymentacji i dyfuzji, zwany równowagą sedymentacyjną. Stan równowagi

sedymentacyjnej występuje przy niewielkiej liczbie obrotów (zwykle poniżej 20 000 obr/min). W

stanie równowagi sedymentacyjnej substancja rozpuszczona wypełnia całą kuwetę, a jej stężenie

wzrasta od menisku do dna kuwety. Z warunku równowagi termodynamicznej wyprowadzić można

wzór na masę cząst. substancji rozpuszczonej:

[17] ( )

2

1

2 2 2sA 2

c2RT lncM

N 1 r r=

⎛ ρ ⎞− ω −⎜ ⎟ρ⎝ ⎠

1

Aby zastosować ten wzór należy określić stężenia makrocząsteczki c1 i c2 w odległości r1 i r2 od osi

obrotu. W praktyce doświadczenie nie jest jednak takie proste. Osiągnięcie równowagi

sedymentacyjnej wymaga zwykle kilkudziesięciu godzin wirowania.

Znacznie szybszą wersję omawianej metody zaproponował Archibald. W wersji tej nie jest

niezbędne osiągniecie stanu równowagi. Podczas dochodzenia do stanu równowagi w kuwecie

występują dwa przekroje, przez które nie przemieszczają się sedymentujące cząsteczki. Jest to

powierzchnia menisku (a) i dno kuwety (b). Warunek ten zachodzi niezależnie od tego czy został

osiągnięty stan równowagi czy jeszcze nie:

[18] 2

a ba a b b

1 dc 1 dc Sr c dr r c dr D

ω⎛ ⎞ ⎛ ⎞= =⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

Zależność tą można sprowadzić do układu dwóch równań z których można wyznaczyć m.cz.

biopolimeru odpowiednio przy menisku i przy dnie kuwety:

[19a] aa

2sa a

dcRTdrM

1 r

⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠=

⎛ ρ ⎞− ω⎜ ⎟ρ⎝ ⎠

c

[19b] bb

2sb b

dcRTdrM

1 r

⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠=

⎛ ρ ⎞− ω⎜ ⎟ρ⎝ ⎠

c

Dla roztworu zawierającego jeden rodzaj biopolimeru Ma = Mb. Jeżeli w roztworze znajduje się

mieszanina biopolimerów, to Ma ≠ Mb

9


EElleekkttrrooffoorreezzaa żżeelloowwaa

Elektroforezą nazywamy ruch cząsteczek obdarzonych ładunkiem w roztworze w polu

elektrycznym. Siła F działająca na cząsteczkę w polu elektrycznym jest proporcjonalna do

natężenia pola elektrycznego E i ładunku cząsteczki Q:

[20] F = EQ

Na skutek oporu hydrodynamicznego T cząsteczka porusza się podczas elektroforezy ze stałą

prędkością v. Podstawą rozdziału cząsteczek podczas elektroforezy jest różnica w prędkości

migracji. Rozdział elektroforetyczny może być prowadzony zarówno w roztworach (elektroforeza

swobodna, elektroforeza kapilarna) jak i w nośnikach: na bibule, płytkach cienkowarstwowych lub

w różnego rodzaju żelach.

Rozdział biopolimerów prowadzi się zwykle

na nośniku. Największe zastosowanie znajdują

przezroczyste żele o różnym stopniu usieciowania,

np. żele poliakryloamidowe. Podczas elektrolizy

żelowej, poza ładunkiem cząsteczki, szybkość

migracji zależy również od relacji pomiędzy

wielkością cząsteczki a wielkością porów w żelu.

EElleekkttrrooffoorreezzaa ww oobbeeccnnoośśccii SSDDSS

Prędkość migracji natywnych białek w żelu poliakryloamidowym zależy nie tyle od masy

czast. ile od ładunku i kształtu cząsteczki. W obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS)

cząsteczki białka ulegają denaturacji i tworzą z SDS micelle o ładunku ujemnym.

denaturacja

SDS

micellizacja

SDS

denaturacja

SDS

denaturacja

SDS

micellizacja

SDS

micellizacja

SDS

Wykazano, że ładunek takiej micelli jest praktycznie niezależny od ładunku natywnego białka.

Tym samym szybkość migracji białek w żelu w obecności SDS powinna zależeć przede wszystkim

od wielkości cząsteczki, a pośrednio od m.cz.

10


Badania nad elektroforezą żelową 40 białek o znanych m.cz. w

obecności SDS wykazały, że ich względna ruchliwość

elektroforetyczna Rf:

[21] Rf = odległość migracji białka/ odległość migracji

markera

jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich masy cząst.

W praktyce wykonuje się elektroforezę badanego białka w

mieszaninie z białkami wzorcowymi o znanych m.cz. oraz

markerem (np. błękitem bromofenolowym). Wykonując dla białek

wzorcowych wykres zależności logarytmu m.cz. od Rf otrzymuje się prostoliniową krzywą

wzorcową. Z uzyskanego wykresu lub równania regresji odczytuje się m.cz. badanego białka.

W pokazanym poniżej przykładzie mamy 2 badane białka o wartościach Rf odpowiednio 0,209 i

0,227. Na podstawie uzyskanej zależności można oszacować ich m.cz. na odpowiednio 79 000 i

50 000.

logM = -11,035Rf + 7,2025

4,20

4,30

4,40

4,50

4,60

4,70

4,80

4,90

5,00

5,10

5,20

0,17 0,19 0,21 0,23 0,25 0,27 0,29Rf

log

M

Technika elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS pozwala oszacować

masę cząsteczkową z dokładnością ±10% dla białek o m.cz. z zakresie 15 000 ÷ 100 000 Da. W

zakresie tym dostępne są handlowo zestawy białek wzorcowych.

FFiillttrraaccjjaa mmoolleekkuullaarrnnaa

W metodzie tej jako wypełnienie kolumn chromatograficznych wykorzystuje się żele

pęczniejące pod wpływem fazy ruchomej. Przy filtracji żelowej biopolimerów fazą ruchomą są

najczęściej bufory wodne. Najczęściej używanymi żelami są usieciowane polisacharydy.

W środowisku wodnym ziarna żelu pęcznieją, a w ich wnętrzu pojawiają się wypełnione

wodą pory. Stopień spęcznienia żelu zależy od stopnia usieciowania polisacharydu. Określa się go

11


przy pomocy tzw. indeksu retencji wody wyrażającego ile gramów wody wiąże się z 1 g suchego

żelu.

Jeżeli przez kolumnę wypełnioną spęczniałym żelem będziemy przepuszczać

mieszaninę substancji o zróżnicowanych wielkościach cząsteczek, to substancje o

dużych rozmiarach cząsteczek (żółte) przemieszczać się będą w kolumnie tylko w

przestrzeniach pomiędzy ziarnami żelu. Cząsteczki o mniejszych rozmiarach (zielone

i czerwone) wnikać będą do wnętrza ziaren. Im mniejsze są rozmiary cząsteczek, tym

dłużej będą one „błądzić” wewnątrz porowatych ziaren.

Rozdział substancji podczas filtracji żelowej opiera się więc na różnicy w

wielkości cząsteczek. Kolumnę będą opuszczały najpierw cząsteczki o największych

rozmiarach, potem cząsteczki średniej wielkości, a na końcu cząsteczki najmniejsze.

Zastosowanie filtracji żelowej biopolimerów jest bardzo szerokie. Można ją wykorzystać

do: i) preparatywnego rozdziału mieszanin makrocząsteczek, ii) usuwania z roztworów

biopolimerów substancji małocząsteczkowych, w tym soli, oraz do iii) oznaczania mas

cząsteczkowych.

DDoobbóórr zzłłoożżaa

W handlu dostępne są złoża do filtracji żelowej o bardzo szerokim zakresie rozmiarów pór

wewnątrz spęczniałych ziaren żelu. Poniższa tabela zawiera przykładowe rodzaje złóż typu

Sefadeks. Złoża tego typu są najczęściej stosowane w filtracji molekularnej biopolimerów.

Roboczy zakres m.cz. Rodzaj Sefadeksu

Indeks retencji wody Peptydy i białka Polisacharydy

G-10 1 < 700 < 700 G-15 1,5 < 1 500 < 1 500 G-25 2,5 1 000 - 5 000 100 - 5 000 G-50 5 1 500 - 30 000 500 - 10 000 G-75 7,5 3 000 - 70 000 1 000 - 50 000 G-100 10 4 000 - 150 000 1 000 - 100 000 G-150 15 5 000 - 400 000 1 000 - 150 000 G-200 20 5 000 - 800 000 1 000 - 200 000

Do filtracji molekularnej obiektów o jeszcze większych rozmiarach (kompleksy białkowe,

organelle komórkowe) otrzymano złoża typu Sefaroza lub Bio-Żel pozwalające na rozdział

biopolimerów o masach cząsteczkowych do 150 000 000 Da.

12


OOzznnaacczzaanniiee mmaass cczząąsstteecczzkkoowwyycchh

Rozdział substancji podczas filtracji molekularnej oparty jest na rozmiarach cząsteczek, a

nie na ich masie cząst. Jednakże w przypadku biopolimerów danego rodzaju (np. białek) ich

gęstość jest bardzo zbliżona. Tym samym cząsteczka o większej masie posiada również większe

rozmiary. Stwierdzono doświadczalnie, że dla filtracji molekularnej istnieje liniowa zależność

pomiędzy objętością wycieku z kolumny przy której pojawia się dany biopolimer a logarytmem

jego m.cz.

Ze względu na słabą powtarzalność parametrów rozdziału każdorazowo należy wykonać linię

kalibracyjną stosując białka wzorcowe o znanych m.cz.

Przykład Chcemy oznaczyć masy cząst. heksokizaz typu I – IV z homogenatu wątroby szczura. Jako białka wzorcowe stosujemy: dehydrogenazę Glc-6-P (110 000 Da), albuminę ludzką (67 000 Da), pepsynę (35 000 Da) oraz trypsynę (24 000 Da). Podczas filtracji molekularnej mieszaniny tych białek z badanymi heksokinazami na złożu Sefadeks G-200 zaobserwowano 6 pasm o obj. elucji: Pasmo Obj. elucji Białko A 2,6 ml dehydrogenaza B 3,7 ml heksokinazy I, II i III C 4,4 ml albumina D 5,05 ml heksokinaza IV E 5,9 ml pepsyna F 6,85 ml trypsyna Na podstawie uzyskanych wyników sporządzono zależność kalibracyjną przedstawioną na poniższym wykresie:

log M = 5,475 - 0,157 Ve

4,30

4,40

4,50

4,60

4,70

4,80

4,90

5,00

5,10

5,20

2 3 4 5 6 7 8

obj. elucji

log

M

Dla białek tworzących pasma B i D o objętościach elucji odpowiednio 3,7 i 5,05 ml można oszacować m.cz. odpowiednio 78 000 i 48 000 Da.

13


SSppeekkttrroommeettrriiaa mmaass

Aż do końca lat ’70 XXw jedynymi metodami umożliwiającymi oszacowanie masy

cząsteczkowej biopolimerów były ultrawirowanie, elektroforeza i chromatografia. Wyniki

otrzymane przy pomocy tych metod były bardzo nieprecyzyjne (błąd względny wynosił średnio

10-100%) ponieważ zależały od innych niż masa cząsteczkowa właściwości: kształtu cząsteczki,

gęstości i hydrofobowości.

Jedyna bezpośrednia metoda pomiaru masy cząsteczkowej – spektrometria mas znajdowała się

jeszcze na bardzo wczesnych etapach rozwoju i ograniczona była do substancji lotnych. W latach

’70 pojawiła się metoda desorpcji polem (FD) pozwalająca na otrzymanie widm substancji

nielotnych o masach cząst. do ok. 2 000 Da. Rozwój metod jonizacji przez desorpcję, opartych na

emisji wcześniej istniejących jonów z powierzchni cieczy lub ciała stałego (desorpcja plazmą – PD,

bombardowanie szybkimi atomami – FAB, desorpcja laserowa – LD) umożliwił po raz pierwszy

wprowadzenie spektroskopii mas do analizy biopolimerów. Od tego czasu problemem stało się już

nie wytwarzanie jonów, lecz poprawna analiza ich masy. Jony o pojedynczym ładunku i dużej

masie są technicznie trudne do detekcji z dużą czułością i do analizy ich masy z dobrą

rozdzielczością.

Na początku lat ’90 pojawiły się dwie nowe metody jonizacji (rozpylanie w polu

elektrycznym, elektrosprej – ESI oraz desorpcja laserowa ze stałej matrycy – MALDI), dzieki

którym można było uniknąć tych niedogodności. Metody te umożliwiają bardzo precyzyjną analizę

biopolimerów o dużych masach.

JJoonniizzaaccjjaa bbiiooppoolliimmeerróóww

Obecnie w spektrometrii mas biopolimerów stosuje się powszechnie trzy techniki

wytwarzania jonów. Zostaną one omówione poniżej.

FAB

Technika bombardowania szybkimi atomami (FAB, ang. Fast Atom Bombardment) może

być stosowana dla roztworów zawierających jony w nielotnych rozpuszczalnikach. W praktyce

używa się najczęściej glicerynę, tioglicerynę, alkohol m-nitrobenzylowy (NBA) lub w trybie

rejestracji jonów ujemnych trietanoloaminę. Metoda ta nie może więc być stosowana dla substancji

niepolarnych takich jak np. lipidy obojętne.

Wiązka szybkich atomów (najczęściej argonu, niekiedy ksenonu) otrzymywana jest pośrednio z

wykorzystaniem jonów argonu. Jony są przyspieszane w polu elektrycznym o różnicy potencjałów

14


rzędu kilku do kilkunastu kV i trafiają do komory zderzeniowej, w której na skutek zderzeń z

zawartymi w niej atomami argonu przekazują im swój pęd lub ładunek. Proces zachodzący w

komorze zderzeniowej można opisać równaniem:

Ar+szybki + Arpowolny = Ar+

powolny + Arszybki

Ar

komora

zderzeniowa

Ar

komora

zderzeniowa

Wychwyt

jonów

Wiązka szybkich

jonów

Wychwyt

jonów

Wiązka szybkich

jonów

Emiter elektronów

anoda

Wiązka

jonów

Emiter elektronów

anoda

Wiązka

jonówRoztwór

biopolimeruRoztwór

biopolimeru Jony pozostałe w wiązce są usuwane podczas przejścia pomiędzy elektrodami.

Szybka wiązka obojętnych atomów uderzając w roztwór

analizowanej substancji wytwarza falę uderzeniową, która powoduje

wyrzucenie z roztworu jonów i cząsteczek obojętnych. Wyrzucone

jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do

analizatora. Metoda FAB nie powoduje lub prawie nie powoduje

jonizacji. Z roztworu są bowiem wyrzucane jony już wcześniej w nim istniejące. W zależności od

budowy chemicznej analizowanych substancji oraz pH roztworu w metodzie FAB zbierane mogą

być jony o ładunku dodatnim (wynik protonowania cząsteczki) lub ujemnym (wynik

oddysocjowania protonu od cząsteczki).

W widmach masowych otrzymywanych techniką FAB obserwuje się przede wszystkim jony

o m/z = [M+H]+ lub [M-H]-, czyli tzw. pozorne jony molekularne. Jeżeli cząsteczka posiada więcej

niż jedno miejsce jonizacji, np. n, to występują również jony [M+nH]n+ lub [M-nH]n-.

Ponieważ w metodzie FAB występują głównie jony molekularne, więc można ją zastosować

do mieszanin bez potrzeby ich rozdzielania. Jest to szczególnie wygodne w przypadku analizy

15


produktów enzymatycznego trawienia dużych białek. Poniższy rysunek pokazuje widmo FAB

peptydów uzyskanych podczas trawienia przeciwciała monoklonalnego.

Jest to doskonała metoda wytwarzania pozornych jonów molekularnych substancji

polarnych o dużych masach cząsteczkowych, szczególnie peptydów i polinukleotydów. W

rutynowych pomiarach górny zakres mas metody FAB ograniczony jest do ok. 10 000 Da. Dla

większych mas (biopolimery) stosuje się jedną z poniżej opisanych metod jonizacji.

MALDI

Jonizacja przez desorpcję laserową z wykorzystaniem matrycy (MALDI, ang. Matrix-

associated Laser Desorption/Ionization) polega na zmieszaniu analizowanej substancji z

roztworem małych cząsteczek organicznych zwanych matrycą i odparowaniu rozpuszczalnika.

Cząsteczki matrycy muszą silnie absorbować promieniowanie laserowe (zwykle w zakresie UV).

Pod wpływem wiązki laserowej dochodzi do lokalnego wzbudzenia elektronów w cząsteczkach

matrycy. Jony powstałe przez przeniesienie protonów z fotowzbudzonej matrycy do analizowanej

cząsteczki ulegają następnie desorpcji polem elektrycznym.

+++ Desorpcja

polem elektrycznym

Desorpcja

polem elektrycznym

m* + B => [m-H]- + [BH]+

Metoda MALDI posiada wiele korzystnych cech. Należą do nich przede wszystkim:

16


• zastosowanie matrycy ogranicza tworzenie agregatów i ułatwia tworzenie jonów

molekularnych

• nie ma potrzeby dostrajania długości fali wiązki laserowej do zakresu absorpcji

analizowanej substancji

• ponieważ proces desorpcji nie zależy od rozmiarów analizowanej cząsteczki można

zdesorbowac i zjonizować biopolimery o m.cz. do ok. 1 000 000 Da

• metoda charakteryzuje się znaczną czułością – możliwa jest analiza pikomolowych

ilości białka

Poniższy rysunek przedstawia widmo masowe przeciwciała monoklonalnego o m.cz. ok. 150 kDa

uzyskane techniką MALDI.

W widmach uzyskanych tą techniką najsilniejszy jon odpowiada zwykle jonowi molekularnemu.

Pojawić się mogą również jony odpowiadające cząsteczce wielokrotnie zjonizowanej (M2+, M3+)

oraz jony agregatów biopolimeru o różnym stopniu zjonizowania, np. 2M+, 3M2+, 2M3+ itp. Na

szczęście ich intensywność jest zwykle dużo mniejsza niż jonu molekularnego.

ESI

Rozpylanie w polu elektrycznym, czyli elektrosprej polega na wprowadzeniu strumienia

cieczy w silne pole elektryczne (różnica potencjałów 3÷6 kV) pod ciśnieniem atmosferycznym.

Pole powoduje akumulacje ładunków na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę. Strumień

cieczy ulega rozbiciu na drobne, silnie naładowane kropelki. Odparowywanie rozpuszczalnika

powoduje kurczenie się kropelek aż do momentu, gdy odpychanie elektrostatyczne przewyższy siły

spójności cieczy. Spowoduje to rozerwanie kropel na mniejsze kropelki.

17


Takie kaskadowe rozdrabnianie roztworu trwa tak długo, aż pole

elektryczne na ich powierzchni stanie się dostatecznie duże, aby

spowodować desorpcje jonów substancji rozpuszczonej.

Jeżeli analizowana cząsteczka posiada więcej niż jedno miejsce

zdolne do jonizacji, to najczęściej powstają jony o ładunku

wielokrotnym. Widma masowe ESI biopolimerów stanowią

najczęściej serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie

naładowanym pozornym jonom molekularnym [M+zH]z+. Widma

takie nie zawierają praktycznie jonów fragmentacyjnych.

Otrzymanie jonów wielokrotnie naładowanych pozwala na

analizowanie cząsteczek o bardzo dużych masach cząst. za

pomocą analizatorów o znacznie niższym nominalnym zakresie

mas. Należy bowiem pamiętać, że spektrometry mas nie mierzą

masy jonu, lecz stosunek masy do ładunku m/z.

AAnnaalliizzaa wwiiddmm mmaassoowwyycchh

W widmach masowych uzyskanych metodą FAB lub MALDI obserwuje się bezpośrednio

jony molekularne. Dopóki analizujemy peptydy lub produkty hydrolizy białek o m.cz. rzędu kilku

tysięcy Da możemy stosować typowe analizatory i detektory. Przy cząsteczkach o większych

masach należy zastosować oprzyrządowanie specjalne pozwalające określić stosunek m/z z

zadawalającą rozdzielczością.

Problemy tego typu nie pojawiają się przy jonizacji metoda elektrospreju. W metodzie tej

powstają jony wielokrotne, dla których stosunek m/z przypada w klasycznym zakresie. Jednakże

jednoznaczne ustalenie m.cz. na podstawie widma ESI wymaga specjalnego podejścia. Załóżmy, że

jon o zmierzonym stosunku m/z = µ1 posiada ładunek z1. Dla jonu takiego obowiązuje zależność:

18


z1µ1 = M + z1mH

w której mH oznacza masę protonu a M m.cz. analizowanego biopolimeru. Jest to jedno równanie o

2 niewiadomych: z1 i M. Aby uzyskać drugie równanie pozwalające na określenie obu

niewiadomych rozważmy j-ty kolejny pik w kierunku wzrastającego stosunku m/z. Dla tego piku

zmierzona wartość stosunku m/z = µ2 i niesie on ładunek z2 = z1-j:

(z1-j)µ2 = M + (z1-j)mH

Powstały układ równań można rozwiązać ze względu na obie niewiadome:

2 H1

2 1

mz j µ −=

µ − µ ( )1 1 HM z m= µ −

Na powyższym rysunku przedstawiono widmo ESI dla lizozymu z faga λ. Można na nim

zidentyfikować co najmniej 9 pików o masach: 892,4, 939,2, 991,5, 1049,8, 1115,5, 1189,6,

1274,0, 1372,5 i 1486,6. Do układu równań użyjmy dwóch skrajnych pików: j = 8. Otrzymamy

wtedy:

11486,6 1,0073z 8 20,001 201486,6 892,4

−= =

−≅ ( )M 20 892, 4 1,0073 17.827,9= − =

Analogiczne obliczenia przeprowadzić można dla kolejnych pików. Otrzymamy wtedy następujące

wyniki:

z1 = 20 ⇒ M = 17 827,9 z1 = 19 ⇒ M = 17 825,7

z1 = 18 ⇒ M = 17 828,9 z1 = 17 ⇒ M = 17 829,5

z1 = 16 ⇒ M = 17 831,9 z1 = 15 ⇒ M = 17 828,9

z1 = 14 ⇒ M = 17 821,9 z1 = 13 ⇒ M = 17 829,4

z1 = 12 ⇒ M = 17 827,1

Po uśrednieniu powyższych wyników otrzymamy:

wartość średnią m.cz. M= 17 827,9 Da

odch. standardowe M = 2,8 Da

19


20

ęść ąsteczkowe biopolimerów - chem.pg.edu.pl · się zjawisko sedymentacji. Uzyskanie...

Documents

Transcript of ęść ąsteczkowe biopolimerów - chem.pg.edu.pl · się zjawisko sedymentacji. Uzyskanie...