Enzymologia-12

Przemysłowe zastosowania enzymów

14%

32%

10%15%

29%

Mleczarstwo

Detergenty

Tekstylia

PrzetwórstwoskrobiInne

Wykorzystanie enzymów w przemyśle

52%

8%10%

4%

2%

20%4%

Izomeraza glukozowa Enzymy przekształcające sterydy

Acylazy/lipazy Hydantoinazy/karbamoilazy

Termolizyna Beta laktamazy

Inne

Udział różnych rodzajów enzymów stosowanychw przemyśle biotechnologicznym

Enzym Reakcja lub substrat

Źródło enzymu Zastosowanie

Papaina

Renina

Trypsyna, chymotrypsyna

Proteazy grzybowe

Proteazy bakteryjne

Hydroliza białek

Ścinanie mleka

Hydroliza białek

Hydroliza białek

Hydroliza białek

Papaya latex

Żołądki cielęce, białko rekombinowane

Jelita zwierzęce

Aspergillus oryzae

Aspergillus niger

Mucor pusillus

Rhizomucor miehei

Cryptonectria parasitica

Bacillus subtilis

Usuwanie zmętnienia piwa, kruszenie mięsa

Wytwarzanie serów

Kruszenie mięsa, zastosowania medyczne

Kruszenie mięsa, piekarnictwo, piwowarstwo

Serowarstwo

Detergenty, usuwanie żelatyny

Enzymy proteolityczne w przemyśle

Enzym Reakcja

lub substrat

Źródło enzymu Wykorzystanie

Amylaza endohydroliza

wiązań (14) glikozydowych w polisacharydach

Bacillus subtilis

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Scukrzanie skrobi

Egzo (14) glukozydaza

Uwalnianie końcowych reszt glukozowych z polisacharydów

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Rhizopus spp.

Wytwarzanie glukozy ze skrobi

Celulaza Endodydroliza wiązań (14) glikozydowych w celulozie

Aspergillus niger

Trichoderma viride

Przekształcanie celulozy w celobiozę

Poligalakturonaza Hydroliza wiązań glikozydowych w pektynach

Mucor, Borytris, Penicillium, Aspergillus

Ekstrakcja soków owocowych z pulp; klarowanie win i soków

-galaktozydaza Hydroliza laktozy Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Otrzymywanie słodszych, lepiej rozpuszczalnych cukrów

-fruktofuranozydaza Hydroliza sacharozy Aspergillus oryzae

Saccharomyces

Otrzymywanie słodszych, lepiej rozpuszczalnych cukrów

Oksydaza glukozowa Glukoza + O2 glukonolakton + H2O2

Aspergillus niger

Penicillium spp.

Odczynnik do oznaczania glukozy; usuwanie tlenu z majonezu i soków owocowych

Izomeraza glukozowa Glukoza fruktoza Streptomyces spp

Lactobacillus brevis

Produkcja syropów fruktozowych

Zastosowanie enzymów metabolizmu cukrów

Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości, produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu oczyszczenia Enzym y do celów technologicznych, wytwarzane w dużych ilościach (bulk)

Enzym y wysokiej czystości

Niewielki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki masy Surowe preparaty, często poniżej 10% białka Obecność innych enzymów Preparaty otrzymane w wyniku suszenia rozpyłowego lub stężone roztwory Brak stabilizatorów Niewiele etapów oczyszczania Próbki dostępne nieodpłatnie Minimalne zamówienie 1-2 kg

W ysoki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki aktywności enzymu W ysoka czystość, często powyżej 90% Inne enzym y nieobecne, lub ich obecność określona ilościowo Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze siarczanu amonu Obecne stabilizatory W iele etapów oczyszczania, w tym techniki chromatograficzne Brak takich próbek Szeroki zakres dostępnych ilości (poczynając od bardzo niewielkich)

Produkcja enzymów

Enzymy izolowane z roślin Źródło Enzym Zastosowanie Fasola (Canavalia ensiformis) Owoce papaya (Carica papaya) Figi (Ficus carica) Ananas (Ananas comosus) Chrzan (Armoracia rusticana) Migdały (Amygdalus communis) Pszenica (Triticum aestivum) Jęczmień (Hordeum vulgare) Soja (Glycine max)

Ureaza Papaina Ficyna Bromelanina Peroksydaza -glikozydaza Esteraza -amylaza -amylaza

Diagnostyka Piekarnictwo, mleczarstwo, garbarstwo, kruszenie mięsa, usuwanie zmętnienia piwa Kruszenie mięsa Piekarnictwo Diagnostyka Badania naukowe Hydroliza estrów i synteza Piekarnictwo, syropy maltozowe j.w.

Enzymy izolowane z tkanek zwierzęcych

Źródło Enzym Cielęta, bydło rzeźne, owce, trzoda chlewna Jaja kurze Mocz

Diastaza (amylaza), esteraza, lipaza, pepsyna, trypsyna, fitaza, chymozyna (renina), fosfolipaza Lizozym Urokinaza

Produkcja enzymów

Schemat technologiczny wytwarzania enzymu

Enzym (źródło) Zastosowanie---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Proteazy Fragmentacja białek dla celów analizyTrypsyna (cielęca) sekwencyjnej, mapowanie peptydów,Chymotrypsyna (cielęca) ograniczona proteoliza enzymów lubEndoproteinaza Lys-C z L. enzymogenes receptorów w celu badania zależnościEndoproteinaza Glu-C z S. aureus V8 struktura-aktywność

Karboksypeptydazy A, B, C, Y Sekwencjonowanie białek od C-końca

Proteazy restrykcyjneCzynnik Xa (cielęcy lub ludzki)Enterokinaza (cielęca) Rozcinanie rekombinowanych białekProteaza IgA z Neisseria gonorrhoe fuzyjnych

GlikozydazyEndoglikozydaza D i O-glikozydaza z Diplococcus pneumoniae Analiza cukrów i glikoproteinEndoglikozydaza F i N-glikozydaza F zFlavobacterium meningosepticumEndoglikozydaza H ze Streptomyces plicatus

Niektóre enzymy stosowane w analizie biochemicznej

Cechy procesów biotransformacji

-specyficzność reakcji

-regiospecyficzność

-stereospecyficzność

-wysoka wydajność

-łagodne warunki

Metody immobilizacji enzymów

1. Adsorpcja na powierzchni nośnika (alumina, hydroksyapatyt, kaolinit szkło, matryce jonowymienne);

2. Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem (poliakrylamid, nylon, celuloza, dekstran, Sephadex, Sepharose, Agarose, żel krzemionkowy,

kulki szklane). Konieczna aktywacja nośnika;

3. Sieciowanie międzycząsteczkoweCzynniki sieciujące: aldehyd glutarowy, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen;

4. Uwięzienie w matrycy- akrylamid polimeryzowany w roztworze enzymu- żele tworzone in situ w roztworze enzymu;

5. Kapsułkowanie w membranie półprzepuszczalnejliposomy, kapsułki nylonowe, celofanowe, celuloidowe, poliuretanowe.

Metody kowalencyjnejimmobilizacji enzymów

Przykłady procesów przemysłowych prowadzonych z użyciemimmobilizowanych enzymów

Enzym Matryca Metoda immobilizacji

Zastosowanie

Aminoacylaza DEAE-Sephadex Adsorpcja Otrzymywanie

L-aminokwasów

Izomeraza glukozowa Amberlit IRA904 Adsorpcja Otrzymywanie syropu fruktozo-glukozowego

Termolizyna Układ dwufazowy Otrzymywanie aspartamu

-galaktozydaza Krzemionka Adsorpcja Otrzymywanie mleka wolnego od laktozy

Amidaza penicylanowa

Poloakrylamid, celuloza

Uwięzienie w matrycy Otrzymywanie 6-APA

Oksydaza glukozowa

Peroksydaza

Kapsułkowanie Oznaczanie glukozy

Biokataliza w środowiskach niewodnych

(a) homogenna mieszanina woda/rozp. org.(b)układ dwufazowy(c) odwrócone micele(d) zawiesina enzymu w rozpuszczalniku org.(e) kowalencyjnie zmodyf. enzym w rozp. org.

prof. Ernest Sym

zapoczątkował na PG badania w dziedzinie biotechnologii; światowy pionier badań nad katalizą enzymatyczną w układach niewodnych.

Reakcje katalizowane przez monooksygenazy wykorzystywanedo biotransformacji w praktyce przemysłowej

(a) hydroksylowanie alkanów

(b) hydroksylowane arenów

(c) epoksydacja alkenów

(d) utlenianie heteroatomów

(e) utlenianie ketonów do estrów

Enzymatyczne wytwarzanie L-aminokwasów w układzie sprzężonym

NHC(O)R1

R

O

OH

NH2

R

O

NH2

NHR1

R

O

OR2

CO2H

NH2RH

R OH

O ROH

O

O

Acylaza Amidaza Esterazalub proteaza

liazadehydrogenaza

addycja amoniaku do podwójnego wiązania

redukcyjne aminowanie

Biokatalityczna synteza optycznie czynnych aminokwasów

ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIAOPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW

H

hydantoinazaNH

N

O

OH

DL

racemizacja, pH 8

N

O

OH

ONH2

D

NH

N

O

OH

L

amidohydrolaza D

NH2

O

OH

Synteza/biosynteza optycznie czynnych pochodnych glicyny – substratów dla otrzymywania penicylin półsyntetycznych

ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIAOPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW

C CCOOHH

HHOOCNH3

H2N

COOH

CH2COOHH

L

L

H2N

COOH

CH2H

NH3 C CCOOHH

H

+

+

aspartaza

amoniako-liazafenyloalaninowa

synteza chemiczna

NAc-DL-aminokwas

aminoacylazaz Aspergillus oryzae

NAc-D-aminokwas

L-aminokwas + CH3COO-

racemizacja

Biosynteza optycznie czynnych aminokwasów białkowych

Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G

Acylazy penicylinowe

1. Acylaza penicyliny GBakterie Achromobacter spp., Alcaligenes faecalis, E. coli,Bacillus megaterium, Proteus rettgeri, Pseudomonas melanogenes;Drożdże Kluyvera citrophila

2. Acylaza penicyliny VGrzyby strzępkowe Bovista plumbea, Fusarium spp.; PromieniowceActinoplanes spp., Streptomyces levanduae

3. Acylaza amplicylinowa

Obecnie najczęściej stosowane źródło: rekombinowane szczepy E. coli

Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA)

Możliwe metody: hydroliza chemiczna lub enzymatyczna Warunki hydrolizy enzymatycznej

Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pH na poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH lub NaOH. Produkty: 6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się, a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany jako dodatek do nowej fermentacji

Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę enzymatyczną Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia; prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola pH, temperatury; zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych;

Synteza aspartamu z zastosowaniem biotransformacji enzymatycznej

Biotransformacje sterydów