1

Obniżanie zawartości bakterii w mleku surowym

Broszura informacyjna o zaletach cytometrii przepływowej

eBook

April 2018

2

WstępTechnologia analityczna, jaką jest cytometria przepływowa od-grywa zasadniczą rolę w poprawie jakości higienicznej mleka już od dziesięcioleci, a obecnie jej znaczenie wyraźnie rośnie. Nowe osiągnięcia technologiczne umożliwiają przeprowadzanie badań w wybranym miejscu (a nie tylko w laboratoriach, jak dotych-czas), przy odbiorze mleka w mleczarni, a nawet bezpośrednio w farmie mlecznej.

Perspektywa szybszych badań przychodzących dostaw sprawia, że dni, w których próbki wskazują na niską jakość higieniczną, bo zawierają setki tysięcy komórek bakterii na mililitr są, całkiem dosłownie, policzone.

Niniejszy e-book zawiera informacje o najnowszych osiągnię-ciach w dziedzinie cytometrii przepływowej w postaci artykułów, łatwych do przyswojenia danych technicznych oraz materiałów wideo.

Mamy nadzieje, że okaże się on przydatny w dążeniu do ograni-czenia liczby bakterii w mleku surowym.

FOSS

3

Artykuł: Jak pokonać bakterie w mleku 4

Korzyści z cytometrii przepływowej 6

Analizator przepływowy od środka 7

Analiza bakteryjna na skalę masową (laboratoria) 8

Analiza bakteryjna w mleczarniach (za dotknięciem przycisku) 9

Na co zwracać uwagę w rozwiązaniach opartych o cytometrię przypływową 11

Urządzenia wykorzystujące cytometrię przepływową firmy FOSS 13

Spis treści

4

Artykuł:

Jak pokonać bakterie w mlekuInformacja o tym, że cytometria przepływowa została ostatnio zatwierdzona jako oficjalna metoda pomiaru liczby komórek bakteryjnych w mleku, to zaledwie jedno z wielu odniesionych w niedawnym czasie zwycięstw na froncie walki z bakteriami w mleku surowym.

Pomimo, iż próbka mleka surowego wygląda identycznie jak 50 lat temu, zawartość bakterii będzie dziś prawdopodobnie znacznie niższa.

Jest to dobra wiadomość zarówno dla konsumentów, jak i dla producentów wyrobów mleczarskich, ponieważ jakość bakteriologiczna mleka to istotny parametr, który wpływa m.in na kwestie takie, jak procesy obróbki termicznej, prognozowanie okresu przydatności do spożycia, a także określanie przydatności mleka surowego do zastosowania w różnych rodzajach produkcji.

Na całym świecie zawartość bakterii w mleku surowym spadała stopniowo przez dziesięciolecia, od setek tysięcy JTK (CFU, jednostek tworzących kolonie) na mililitr w latach siedemdziesiątych, do mniej niż 10 000 JTK współcześnie. W wielu krajach producenci są już w stanie oferować dostawy o jakości na poziomie 5000 jtk/ ml w sposób ciągły.

Urządzenia do analizy metodą cytometrii przepływowej wynaleziono w latach 80, a obecnie metoda ta posiada zatwierdzenie EU-RL w Europie oraz NCIMS/FDA w Stanach Zjednoczonych.

Mimo to walka o obniżanie zawartości bakterii w mleku trwa nadal, a prym na tym polu wiodą szybkie metody analityczne oparte o metodę cytometrii przepływowej, przeznaczone dla mleka surowego.

5

Znaczenie analizy metodą cytometrii przepływowejMetoda cytometrii przepływowej weszła do użycia w analizie mleka na początku lat osiemdziesiątych, kiedy stosowano ją jako rozwiązanie mające zautomatyzować oraz przyśpieszyć tradycyjny proces analityczny.

Podczas gdy metody tradycyjne określają jakość mleka na podstawie Jednostek Tworzących Kolonie, cytometria przepływowa wykorzystuje do tego celu liczbę pojedynczych komórek bakteryjnych, a pomiar trwa poniżej 10 minut (wobec 2 lub 3 dni w przypadku tradycyjnej metody płytkowej).

Szybki dostęp do wyników okazał się bardzo ważny, ponieważ wczesne wykrywanie problemów z higieną w mleku surowym ma istotny wpływ na minimalizację wpływu bakterii na jakość mleka. Pomimo, iż pasteryzacja zabija większość bakterii w mleku, pozostałości ich metabolitów mogą powodować różnice w smaku, zapachu i skutkować hamowaniem procesów enzymatycznych, co z kolei prowadzi do powstawania wad produktu oraz skraca okres jego przydatności do spożycia. Szybsze uzyskanie wyniku umożliwia poinformowanie producentów mleka o ewentualnych problemach, dzięki czemu mogą oni w porę eliminować wycieki, usterki w działaniu aparatury udojowej, a także problemy zdrowotne stad.

Wzrost popularnościNie dziwi zatem, że cytometria przepływowa wzbudziła zainteresowanie laboratoriów zajmujących się badaniem mleka, szczególnie w kontekście zaostrzania przepisów regulujących jakość mleka w wielu krajach oraz wprowadzania coraz bardziej restrykcyjnych urzędowych norm higienicznych.

Na oficjalne zatwierdzenie tej metody przyszło jednak jeszcze poczekać. Mogłoby się wydawać, że rozwiązanie, które pozwoli przyśpieszyć analizę bakteryjną zostanie zatwierdzone bardzo szybko. Jednak certyfikacja urzędowa to długi i skomplikowany proces, który trwa już od około 35 lat.

Jedną z przyczyn tego stanu rzeczy jest konieczność wyjaśniania złożonej natury tego parametru bardzo dużej liczbie osób odpowiedzialnych za podejmowanie decyzji, pochodzących z rozmaitych organizacji przemysłowych i rządowych. Szczególnie problematyczna okazała się korelacja cytometrii przepływowej, zliczającej pojedyncze komórki bakteryjne z metodą stosowaną dotychczas, która podaje wynik w Jednostkach Tworzących Kolonie (CFU). Jest to kwestia, która stała się przyczynkiem do licznych dyskusji, a debaty na ten temat trwają po dziś dzień.

Pomimo wciąż toczących się dyskusji, cytometria przepływowa stała się standardem w zliczaniu bakterii w mleku surowym w wielu krajach. Na przykład, urządzenie BactoScanTM FC+ firmy Foss uzyskało zatwierdzenie zarówno Laboratorium Referencyjnego Unii Europejskiej (EU-RL), jak i Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (NCIMS/FDA). Ponad 90% całego mleka trafiającego do obrotu na terytorium Unii Europejskiej wycenia się według wyników dostarczanych przez analizatory BactoScan.

Kolejnym etapem było przeniesienie metody cytometrii przepływowej do niewielkich urządzeń, które mogą pracować bezpośrednio w mleczarni i kontrolować jakość higieniczną dostaw mleka. Jest to zupełnie nowy rozdział w walce z bakteriami w mleku. Więcej na ten temat na str. 9.

6

Korzyści z cytometrii przepływowejBadanie metodą cytometrii przepływowej trwa zaledwie kilka minut. Jest to znacznie szybsze rozwiązanie niż tradycyjna metoda płytkowa, gdzie czas oczekiwania na wynik pomiaru wynosi od 2 do 3 dni.

Dostępność danych analitycznych jest istotna z punktu widzenia wydajności produkcji w mleczarniach, a co za tym idzie wykorzystania mleka na kolejnych etapach łańcucha produkcji. Na przykład, krótki czas pomiaru liczby bakterii umożliwia szybkie wykrywanie problemów i szybką reakcję mającą na celu zapewnienie odpowiedniej jakości dostaw mleka.

Mleko o wysokiej zawartości bakterii to surowiec, który nie jest mile widziany w produkcji mleczarskiej, szczególnie w kontekście wyrobów takich, jak masło. Pomimo, iż pasteryzacja zabija większość bakterii w mleku, pozostałości ich metabolitów mogą powodować różnice w smaku i skutkować hamowaniem czynności enzymów, co z kolei prowadzi do wad produktu oraz skraca okres jego przydatności do spożycia. W związku z tym w większości systemów rozliczeń płatności za mleko oceniany jest parametr zawartości bakterii.

Szybsze uzyskanie wyniku umożliwia poinformowanie producentów mleka o ewentualnych problemach, dzięki czemu mogą oni w porę eliminować wycieki, usterki w działaniu aparatury udojowej, a także problemy zdrowotne stad.

Cytometria przepływowa to również metoda o bardzo wysokiej stabilności procesu pomiaru. Tradycyjna metoda płytkowa wiąże się z dużą zmiennością pomiędzy poszczególnymi pomiarami, co wynika między innymi z konieczności manualnego przygotowania próbki, czy oceny ilości widocznych kolonii przez człowieka. Dla odmiany, cytometria przepływowa to metoda automatyczna i wykonywana przez urządzenie, co przekłada się na dokładność i powtarzalność pomiarów. Rozwiązanie to umożliwia analizę próbek mleka surowego w sposób bezpośredni, bez wcześniejszego podgrzewania czy rozcieńczania, co mogłoby mieć wpływ na precyzję pomiaru.

Większa precyzja pomiaru dzięki zliczaniu pojedynczych bakterii

Ponieważ cytometria przepływowa opiera się na pomiarze pojedynczych komórek bakteryjnych, a nie kolonii, pozwala uzyskać wyższą efektywność oraz powtarzalność wyników. Inaczej niż w przypadku tradycyjnej metody płytkowej, wynik nie zostanie zniekształcony przez działania użytkownika, a próbki mleka surowego można badać bezpośrednio, bez wcześniejszego podgrzewania i rozcieńczania (co również może mieć wpływ na wynik pomiaru).

Dokładność: typowo Sy,x < 0,25 jednostki logarytmu w całym zakresie pomiaru

Metoda referencyjna: Standardowa metoda płytkowa (IDFStandard 100B: 1991).

7

Analizator przepływowy od środkaFluorescencyjna cytometria przepływowa to metoda, w której wybarwione obiekty zawieszone w cieczy wchodzą w interakcję z wiązką światła o zdefiniowanych własciwościach. Metoda ta umożliwia szybki pomiar liczby komórek bakteryjnych i somatycznych w próbkach mleka, co jest istotne dla celów przetwórstwa żywności.

System dozujący umieszcza komórki pojedynczo w kuwecie przepływowej, w której poddawane są działaniu wiązki światła laserowego.

Metoda zliczania bakterii.Pomiar liczby komórek bakteryjnych wymaga zastosowania inkubacji, podczas której bakterie są wybarwiane, a wszelkie inne składniki mleka, które mogłyby przeszkadzać w pomiarze zostają rozłożone.

1. W procesie inkubacji komórki wybarwia-ne są przy pomocy fluorescencyjnego odczynnika, który wiąże się z ich DNA

2. Precyzyjny system dozujący umieszcza je pojedynczo w kuwecie przepływowej, w której poddawane są działaniu wiązki światła laserowego.

3. Laser wzbudza fluorescencję barwnika, a każda wybarwiona komórka emituje pojedynczy impuls optyczny w momen-cie interakcji z wiązką światła.

4. Detektor o wysokiej czułości wykrywa impuls fluorescencyjny, który jest prze-kładany na sygnał elektroniczny.

5. Układ elektroniczny urządzenia rejestru-je liczbę impulsów i przedstawia je w postaci wykresu PHA.

Pomiar liczby bakterii trwa 9,5 minuty (włącznie z etapem inkubacji).

8

Analiza bakteryjna na skalę masową (laboratoria) Jak wyglądają duże, współczesne laboratoria badające mleko

Na całej powierzchni laboratorium przenośniki taśmowe transportują próbki mleka z i do urządzeń analitycznych, a rzędy plastikowych probówek ustawione są niczym żołnierze maszerujący w zwartym szyku w kierunku analizatorów. Rozwiązania identyfikacyjne oparte na technologii radiowej (RFID) monitorują próbki w sposób automatyczny, dzięki przytwierdzonym do dna probówki chipom, które zawierają wszystkie istotne dane na temat konkretnej próbki. Cytometria przepływowa jest obecnie stosowana przez laboratoria badające mleko surowe na całym świecie i każdego dnia umożliwia przeanalizowanie tysięcy próbek pochodzących z farm mlecznych. Ale jak to możliwe, skoro jedno badanie trwa 9 minut?

Klucz do sukcesu tkwi w pomysłowym podejściu do etapu inkubacji, w ramach którego kolejno pobrane próbki przebywają w systemach inkubacyjnych w tym samym czasie. To jednak jeszcze nie wszystkie potrzeby. Obsługa, badanie i monitorowanie tysięcy próbek również wymaga wydajnych rozwiązań informatycznych, a pomiar liczby bakterii musi często być kojarzony z innymi badaniami, realizowanymi przez poszczególne analizatory obecne w laboratorium.

Współczesne urządzenia do cytometrii przepływowej stają się zatem rozwiązaniami w coraz większym stopniu zintegrowanymi, wyposażonymi w automatyczne podajniki próbek, systemy skanujące oraz oprogramowanie odpowiedzialne za obsługę wszystkich generowanych danych. Jeszcze do niedawna pomiar liczby komórek bakteryjnych metodą cytometrii przepływowej dostępny był wyłącznie w ramach takich wysoce specjalistycznych rozwiązań laboratoryjnych. Obecnie pojawienie się nowych urządzeń stworzonych specjalnie do badań o niższej przepustowości i realizowanych bezpośrednio w mleczarni zmieniło sytuację.

Próbki do celów rozliczeniowych oznaczone są indywidualnym chipem umieszczonym na spodzie probówki.

9

Analiza bakteryjna w mleczar-niach, za dotknięciem przyciskuRosnąca popularność cytometrii przepływowej w laboratoriach mleczarskich w sposób naturalny nasunęła pytania o to, jak udostępnić potencjał takich badań producentom wyrobów mleczarskich, podobnie jak miało to miejsce w przypadku innych rozwiązań analitycznych, jak np. technologia bliskiej podczerwieni. To ostatnie rozwiązanie przyniosło mleczarniom możliwość przeprowadzania szybkich badań bez użycia odczynników chemicznych w prawie wszystkich obszarach kontroli jakości, z wyłączeniem higieny.

Jednak i na tym polu trwają prace nad procesem, który może stanowić nową broń w walce przeciwko bakteriom w mleku surowym.

10

BacsomaticTM - zobacz jak działa

Niewielki (40 x 40 x 40 cm) analizator firmy FOSS stanowi szybką alternatywę dla metod manualnych i półautomatycznych i nie wymaga żadnego kontaktu z odczynnikami chemicznymi. Umożliwia pomiar zarówno komórek bakteryjnych, jak i somatycznych, w ciągu zaledwie 9,5 minuty, a wygodna konstrukcja powoduje, że jest to idealne rozwiązanie zarówno dla mleczarni, dużych gospodarstw, jak i mniejszych laboratoriów badających mleko.

Zastosowana tu metoda cytometrii przepływowej jest identyczna, jak w przypadku urządzeń o dużej przepustowości stosowanych przez laboratoria do badania setek próbek w ciągu godziny, jednak w tym przypadku oferowana jest w formie stworzonej z myślą o mleczarniach, które realizują badania na mniejszą skalę i muszą mieć możliwość badania dostaw mleka, dostarczanych każdego dnia przez cysterny.

Dostęp do szybkich i łatwych do przeprowadzenia badań umożliwia podejmowanie odpowiednich decyzji w kwestii dostaw oraz wykorzystywanie mleka w sposób odpowiedni dla jego jakości higienicznej.

Dzięki pomysłowej konstrukcji możliwa była integracja pomiaru komórek bakteryjnych i somatycznych w ramach jednego, poręcznego urządzenia. W poniższym materiale wideo opowiada o tym zespół, który stworzył to rozwiązanie.

11

Cechy dobrego systemu cyto-metrii przepływowej

1. Powtarzalność wynikówZawartość bakterii opisywana jest wartościami o dużej liczbie zer. Na przykład, 10 000 bakterii w pojedynczym mililitrze to zupełnie normalny wynik dla próbki mleka o wysokiej jakości, a wartość ta może wzrosnąć nawet do 1 000 000 w próbkach o niskiej jakości. W związku z tym, nawet stosunkowo niewielki błąd przenoszenia może mieć znaczący wpływ na wynik kolejnych pomiarów. Aby do tego nie dopuścić, analizator do cytometrii przepływowej musi być wyposażony w skuteczny system płukania układu pomiędzy badaniami. Niektóre bakterie mają ponadto tendencję do zbijania się w klastry, dlatego odpowiednie przygotowanie próbki w układzie analizatora jest bardzo istotne z punktu widzenia osiągnięcia odpowiedniej powtarzalności pomiarów.

2. PrzepustowośćDla laboratoriów zajmujących się badaniem mleka, przepustowość to "być albo nie być" oraz czynnik, od którego zależy skuteczność obsługi klienta oraz dochodowość działalności.

Współczesne analizatory wykorzystujące cytometrię przepływową wyposażone są przez automatyczne systemy podające próbki, dzięki czemu mogą w ciągu godziny przebadać nawet 600 próbek pod kątem zawartości komórek somatycznych i 200 pod kątem zawartości bakterii.

Pomiar liczby komórek bakteryjnych jest bardziej czasochłonny, jak zostało to wyjaśnione w powyższym opisie tej metody analitycznej. Jednak mimo tego, że inkubacja trwa osiem minut, jednoczesne wykorzystanie wielu komór inkubacyjnych pozwala na przeprowadzenie wielu pomiarów równolegle, a tym samym na osiągnięcie satysfakcjonującej przepustowości.

W przypadku mniejszych, poręczniejszych analizatorów konieczne są pewne ustępstwa względem dużych, całkowicie automatycznych systemów, które stosowane są w dużych laboratoriach badających mleko. Nie zmienia to faktu, że czas dostępu do wyników poszczególnych pomiarów nie powinien się różnić, aby możliwe było wykorzystanie tych danych w systemie dostaw - np. do szybkiej kontroli mleka w cysternach.

12

3. WytrzymałośćZapotrzebowanie na wysoką przepustowość wskazuje, że system cytometrii przepływowej musi być w stanie obsłużyć w zasadzie nieprzerwany, naprzemienny przepływ próbek i płynów czyszczących. Elementy analizatora o kluczowym znaczeniu, jak pompy i zawory, muszą być wytrzymałe, a wszelkie czynności serwisowe powinny być możliwie łatwe do przeprowadzenia.

4. Tabela konwersji pojedynczych bakterii (IBC) na jednostki tworzące kolonie (CFU)Analizatory BactoscanTM or BacSomaticTM wyświetlają wyniki w postaci liczby pojedynczych komórek bakteryjnych (ang. individual bactery count - IBC). Jednakże większość laboratoriów ma obowiązek przedstawiania wyników pomiaru w postaci liczby jednostek tworzących kolonie (ang. colony-forming units - CFU), którą można określić metodą tradycyjnego pomiaru płytkowego. W związku z tym, systemy do cytometrii przepływowej powinny zawierać oprogramowanie umożliwiające skorzystanie z tabeli konwersji z IBC na CFU.

5. Przygotowanie odczynnikówJest to metoda badawcza, która wiąże się ze stosowaniem odczynników chemicznych w postaci płynnej (np. do wybarwiania komórek lub czyszczenia układu). Aby zapewnić bezpieczeństwo użytkownika i możliwie ułatwić mu pracę, odczynniki mogą być dostarczane w systemie zamkniętych woreczków, które chronią przed kontaktem substancji ze skórą. Rozwiązanie to umożliwia również automatyczną kontrolę dozowania, co daje pewność, że skład oraz ilość odczynników są zawsze takie same i minimalizuje ryzyko błędu ludzkiego oraz gwarantuje wysoką powtarzalność wyników.

6. Prawdziwy tryb pracy sieciowej po-zwalający efektywniej zarządzać wielo-ma urządzeniami.Gotowość do pracy w sieci to znacznie więcej niż zwykłe połączenie z internetem. Rozwiązania tego rodzaju powinny zapewniać wgląd we "wnętrze" analizatora, by można było kontrolować jego wydajność i stabilność. Jest to również niezbędne z punktu widzenia zdalnego zarządzania i monitorowania zespołem instrumentów z centralnej lokalizacji, na przykład po to, by kontrolować wyniki próbek pilotowych w regularnych odstępach czasu.

13

Analizator BactoScan™ do kontroli jakości higienicznej mleka poprzez pomiar zawartości bakterii w mleku surowym został stworzony w oparciu o sprawdzoną technologię firmy FOSS. Urządzenie to udostępnia wynik analizy w ciągu zaledwie kilku minut, a tym samym pozwala hodowcom oraz laboratoriom mleczarskim wdrażać szybkie działania w celu zachowania i poprawy jakości mleka BactoScan umożliwia przeprowadzenie nawet 200 badań w ciągu godziny.

BacSomatic ™ to pierwszy zintegrowany analizator liczący bakterie i komórki somatyczne na potrzeby weryfikacji jako-ści higienicznej mleka.To małe i łatwe w użyciu urządzenie stanowi szybką alternatywę dla metod manualnych i półautomatycznych, w przypadku których niezbędny jest kontakt użytkownika z odczynnikami. Urządzenie umożliwia precyzyjny pomiar liczby bakterii i komórek somatycznych w czasie krótszym niż 9,5 minuty oraz sam pomiar liczby komórek somatycznych poniżej 1,5 minuty. Wygodna konstrukcja sprawia, że jest to idealne rozwiązanie zarówno dla mleczarni, dużych gospodarstw, jak i mniejszych laboratoriów badających mleko.

Tu dowiesz się więcej o analizatorze BactoScanTM

Tu dowiesz się więcej o analizatorze BacSomaticTM

Produkty firmy FOSS do pomiaru za-wartości bakterii metodą cytometrii przepływowej