doc. Ing. Richard Hrabal, CSc.

NMR laboratoř, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, číslo dveří 42

telefon 220 443 805, e-mail hrabalr@vscht.cz)

základy NMR spektroskopie

přístrojové vybavení

návštěva laboratoře

15. říjen 2015

22. říjen 2015

technologie využití NMR spektroskopie pro řešení prostorové

struktury proteinů

praktické příklady

Oleg Jardetsky

Richard Ernst

Kurt Wüthrich

Hlavní protagonisté

Felix Bloch

Edward M. Purcell

Kurt Wüthrich Nobel Price Winner in Chemistry 2002

G. Wagner, K. Wüthrich. 1982. Sequential resonance assignments in protein 1H nuclear magnetic resonance spectra. Basic pancreatic trypsin inhibitor.

J. Mol. Biol. 155, 347-366.

Co lze pomocí NMR spektroskopie studovat na

biomolekulách?

• identifikace substrátu (kovalentní struktura)

• prostorové uspořádání (vyšší typ struktury, sekundární, terciární…..)

• dynamické vlastnosti (celé molekuly nebo jen vybrané části)

• schopnosti vzájemné interakce, event. interakce s jinými substráty

• struktura komplexů, dynamika a rovnováha

• vynikající metoda pro návrh nových typů léčiv (SAR)

Úvodní poznámky

• NMR spektroskopie využívá magnetických vlastností jader atomů.

• Absorpční (emisní) spektroskopie, podobně jako IČ nebo UV.

Detekuje absorbci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule.

• Aktivní jsou pouze jádra se spinovým kvantovým číslem (I) 0. Tato jádra

mohou absorbovat RF záření.

• Sudé hmotové číslo & sudé atomové číslo I = 0 (12C, 16O)

• Sudé hmotové číslo & liché atomové číslo I = celočíselný (14N, 2H, 10B)

• Liché hmotové číslo I = polovinový (1H, 13C, 15N, 31P)

• Spinové stavy jádra jsou kvantovány.

m = I, (I - 1), (I - 2), … , -I

m je magnetické kvantové číslo.

• Pro 1H, 13C, 15N, 19F, 31P (nejběžnější měřená jádra) platí:

I = 1/2 m = 1/2, -1/2

• To znamená, že tato jádra mohou zaujmout pouze dva stavy (energetické hladiny).

• Další důležitou vlastností částic s nábojem je tzv. magnetický moment (m), který

může být vyjádřen

m = g I h / 2p

• Je to vektorová veličina, která má velikost a směr (nukleární magnet)

• h je Planckova konstanta

• g je gyromagnetický poměr (konstanta), která je závislá na povaze jádra.

• Různá jádra mají různý magnetický moment.

Vliv externího magnetického pole Bo (jádra I = 1/2)

• V základním stavu nejsou jaderné spiny uspořádané a neexistuje mezi nimi žádný

energetický rozdíl. Jsou tzv. degenerované:

• Vlivem silného externího magnetického pole dojde však k jejich uspořádání buď v

souhlasném nebo opačném směru s ohledem na směr magnetického pole:

• Vždy existuje malý přebytek jader uspořádaných souhlasně se směrem externího

magnetického pole než nesouhlasném.

Bo

Bo= 0

Energie a populace spinových stavů

• Vlivem externího magnetického pole dojde k vytvoření dvou hladin, mezi kterými

je rozdíl v energii. Tyto hladiny jsou obsazeny souhlasně a nesouhlasně

orientovanými jadernými spiny:

• Rozdíl v populaci jednotlivých stavů je dán rozdílem v jejich energiích a řídí se

Boltzmanovým rozdělením:

Na / Nb = e DE / kT

• DE pro 1H při 400 MHz (Bo = 9.5 T) je 3.8 x 10-5 Kcal / mol

Na / Nb = 1.000064

• Rozdíl v populacích je velmi malý ve srovnání s ostatními spektroskopickými

metodami.

Bo = 0

Bo > 0 DE = h n

a

b

Zvyšující se rozdíl v populacích obou spinových stavů a a b pro jádro 1H v

závislosti na externím magnetickém poli.

Je-li stav b obsazen 106 spinů, stav a obsahuje106+přebytek.

Bo = 0

21,14 T

900 MHz

9,40 T

400 MHz

2,35 T

100 MHz

16 spinů

64 spinů

135 spinů

Bo

b

a

Energie a citlivost • Energie (jednoho spinu) je přímo úměrná magnetickému momentu jádra a velikosti externího magnetického pole:

E = - m . Bo E(up) = g h Bo / 4p --- E(down) = - g h Bo / 4p

DE = g h Bo / 2p

•Energetický rozdíl mezi oběma stavy určuje intenzitu signálu, tj. citlivost

měřeného jádra),

•Větší magnety (vyšší Bo) způsobují vyšší citlivost NMR přístrojů.

• Jádra s větší gyromagnetickou konstantou g absorbují více energie a jsou tudíž

citlivější. Výsledná citlivost je úměrná m a Na - Nb, a magnetickému toku v RF

cívce, což opět závisí na g, konkrétně g3.

• Přidáme-li k tomu nižší přirozené zastoupení 13C, citlivost tohoto jádra se sníží

dokonce o faktor 6400 vzhledem k 1H.

g13C = 6,728 rad / G

g1H = 26,753 rad / G

1H je ~ 64x citlivější než 13C

jen z důvodu konstanty g

10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 100 102

wavelength (cm)

g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio (NMR)

Energie a frekvence

• Energie je též přímo úměrná frekvenci elektromagnetického záření…

DE = h n

n = g Bo / 2p

DE = g h Bo / 2p

• Pro jádro 1H je tato frekvence při využití komerčně dostupných magnetů

(2,35 – 23,49 T) v rozsahu 100-1000 MHz.

Precesní pohyb jader

• Každé jádro má tzv. moment hybnosti I, který je vlastností všech (nejen

magneticky aktivních jader). Jádro si lze potom představit rotující kolem vlastní z

osy.

• Má-li jádro nenulový magnetický moment (I 0) dostaneme rotující atomový

magnet. Interakcí s externím polem Bo vzniká kroutící moment. Bez ohledu na

původní orientaci vektoru m, tento má vždy snahu orientovat se podle externího

pole Bo.

l

m

Bo Bo

nebo...

m

m

Precesní pohyb jader (pokračování)

• Precesní pohyb je výslednicí interakce síly, která se snaží přimět vektor m k

souhlasné nebo nesouhlasné orientaci s vektorem Bo, a síly udržující jej v rotaci:

• Vektor magnetického momentu vykonává precesní pohyb okolo osy z (směru

externího magnetického pole). Frekvence tohoto pohybu se nazývá Larmorova

frekvence a značí se w:

wo = 2pn

• Tento jev lze přirovnat k pohybu osy otáčejícího se setrvačníku pod vlivem

gravitace.

• Frekvence tohoto precesního pohybu je přímo úměrná rozdílu energií dvou

spinových stavů, což lze odvodit na základě kvantové mechaniky.

Bo

wo m

wo = - g Bo (radiany)

Makroskopická magnetizace

• Nyní je možné zavést pojem makroskopická magnetizace Mo, který je přímo

úměrný rozdílu populací (Na - Nb), kdy byly příspěvky jednotlivých vektorů m

zprůměrovány:

• Každý vektor m může být rozložen na složku v ose z a v rovině <xy>. Distribuce

komponent v rovině <xy> je náhodná, takže se zprůměrují a navzájem vyruší.

Velikost makroskopické magnetizace je potom dána rozdílem populací

spinových stavů a a b (Na – Nb).

• Mezi m and Mo je podstatný rozdíl. Zatímco m je kvantován (může se vyskytovat ve

dvou stavech a a b ), Mo odráží stav celé populace spinů a představuje kontinuum.

Mo

z

x

y y

x

z

Bo Bo

NMR excitace • Nyní potřebujeme, aby systém absorboval energii. Zdrojem je oscilující

elektromagnetické záření s frekvencí wo generované střídavým proudem :

• Je-li frekvence RF pole B1 a precesního pohybu magnetizace Mo stejná, je

dosaženo tzv. rezonanční podmínky a systém absorbuje energii.

• Vzájemnou interakcí RF pole B1 a magnetizace Mo dojde k jejímu překlopení

kolem tohoto pole B1 o úhel b, který odpovídá velikosti dodané energie a době

jejího působení.

B1 = C * cos (wot)

x Bo

Mo

z

i

B1

Vysílač (y)

y

Mo

z

x

i

B1

y

b

Návrat magnetizace Mo zpět do rovnováhy (detekce signálu) • Při absenci excitujícího magnetického pole B1 se Mxy bude snažit přejít zpět na Mo (do výchozího rovnovážného stavu) obnovením původní distribuce populací Na / Nb. Tento jev se nazývá relaxace.

• Oscilace vektoru Mxy vytváří fluktující magnetické pole, které generuje elektrický proud v přijímací cívce:

z

x Mxy

y

z

x

y

Mo rovnováha...

wo

z

x

Mxy

Přijímací cívka (-x)

y

NMR signál

wo

Průběh signálu v přijímací cívce (-x):

I = C * cos (wot)

x x x

y y y

y y y

x x x

t

I

Laboratorní a rotující soustava souřadnic

• Systém koordinát doposud používaný se nazývá laboratorní soustava

souřadná. Jedná se o fixní systém, ve kterém jaderné spiny rotují rychlostí wo,

což znesnadňuje jakoukoliv další analýzu.

• Řešením je souřadná soustava, která sama rotuje rychlostí wo, tzv. rotující

soustava souřadná. Z fyzikálního pohledu odstraníme takto vliv frekvence

generované externím magnetickým polem Bo.

• V rotujícím systému souřadnic se vektor Mxy nepohybuje za podmínky, že jsme v

rezonanci (w pole B1 je přesně frekvence jádra wo). Jsme-li mimo rezonanci,

pohyb vektoru je stále pomalý ve srovnání s rychlostí rotace wo.

z

x Mxy

y

Bo

z

x Mxy

y wo

Laboratorní soustava Rotující soustava

Free Induction Decay (FID)

• Nyní analyzujme signál, který se objeví v přijímací cívce po sklopení vektoru

makroskopické magnetizace do roviny <xy> (p / 2 puls).

• Po aplikaci RF pulsu se vzorek postupně dostane do rovnováhy, t.j. obnoví se

původní obsazení energetických hladin a vektor makroskopické magnetizace se

dostane zpět do osy z, okolo níž vykonává precesní pohyb.

• V rotující soustavě souřadnic w - wo. Relaxace Mo v rovině <xy> je exponenciální.

V příjímací cívce detekujeme zanikající cosinový signál.

čas

w = wo

Mxy

w - wo <> 0

čas

Mxy

w

wo

t

t

FID (pokračování) • V reálném vzorku je mnoho spinových systémů, jejichž frekvence jsou odlišné od

frekvence B1 (carrier frequency). Protože jsme efektivně excitovali všechny tyto

spiny, dostaneme kombinaci signálů a různé frekvenci Free Induction Decay

(FID):

I = f(t)

• Po zpracování Fourierovou transformací dostaneme:

I = f(n)

Základní NMR parametry

• Chemický posun

• Interakční konstanta

• Intenzita signálu

• Počet signálů ve spektru

• Relaxační vlastnosti jádra (NOE)

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5

N

H

H

H

OH CH2 CH3

Chemický posun

• Jestliže má každý druh jádra svoji charakteristickou frekvenci, proč je NMR

spektroskopie tak užitečná?

• Vlivem tzv. chemického okolí dochází ke změnám magnetického pole, které

působí na každé jádro stejného typu. Hovoříme o tzv. efektivním magnetickém

poli Beff, které je tvořeno hlavním magnetickým polem Bo a lokálním

magnetickým polem Bloc.

Beff = Bo - Bloc --- Beff = Bo( 1 - s )

s je tzv. konstanta magnetického stínění.

frekvence wo

vyšší

pole

nižší

pole

velikost stínění s

NMR škála (d, ppm)

• Každý signál ve spektru je charakterizován svou pozicí vyjádřenou ve

frekvenčních jednotkách. Problémem je však skutečnost, že Bloc je mnohem

menší než Bo (rozsah tisíce Hz oproti milionům Hz) a také závislost na velikosti

Bo.

• Proto používáme relativní stupnici (odstranění velké frekvence generované

externím magnetickým polem) a vztahujeme posun každého signálu k signálu

referenčnímu (standardu).

• Potom je pozice signálu stejná pracujeme-li se 100 MHz (2.35 T) nebo 900 MHz

(21,14 T) magnetem.

• Př. Tetramethylsilan (TMS) je standardem jak pro 1H, tak pro 13C spektroskopii.

Je dobře rozpustný, inertní a poskytuje vždy jeden signál.

w - wref d = x 106 ppm (parts per million) wref

H 3 C S i C H 3

C H 3

C H 3

Příklady rozsahů chemických posunů v ppm • 1H ~ 15 ppm:

13C ~ 220 ppm:

0

TMS

ppm

2 10 7 5 15

Alifatické H

Alkoholy, Ha

Olefiny

Aromatické H

Amidy Kyseliny

Aldehydy

ppm

50 150 100 80 210

Alifatické CH3

CH2, CH

Uhlíky v sousedství

alkoholů, ketonů

Olefiny

Aromatika,

konjugované alkeny

C=O v kyselinách,

aldehydech, esterech

0

TMS

C=O v

ketonech

s (HF) < s (HCl) < s (HBr) < s (HI)

Indukční efekt.

• Izolovaný atom 1H má kulově symetrický orbital 1s.

• Nyní přidáme -CH3, čímž získáme methan. Elektronový oblak 1H (kteréhokoliv ze

4 ekvivalentních atomů) se deformuje vlivem elektronegativnějšího atomu uhlíku

(přitahuje elektrony 1s).

• Tímto způsobem se sníží elektronová hustota okolo jader 1H, dojde k jejich

odstínění a posunu k vyšším hodnotám magnetického pole (ppm). Nahradíme-li

jeden z vodíků halogenem, pozorujeme, že čím je příslušný halogen

elektronegativnější, tím dochází k většímu odstínění ostatních jader 1H.

Jinými slovy, s rostoucí elektronegativitou připojeného atomu (skupiny

atomů), klesá stínící konstanta s.

H (1s)

H (1s) C (sp3)

Mezomerní efekt

• NH2 v anilinu vykazuje +M efekt dojde k většímu stínění aromatických protonů,

než v případě benzenu (7.24 ppm). NH2 skupina dodává elektrony do

aromatického systému a ten jich obsahuje více než benzen.

• Z rezonančních struktur je vidět větší elektronová hustota v polohách ortho a para.

Protony v těchto polohách jsou tedy více stíněny a tedy posunuty k nižším

hodnotám ppm.

7.08

6.55

6.70

N

H

H

H

H

H

N

H

H

H

H

H

H H N

H

H

H

H

H

H H N

H

H

H

H

H

H H

Mezomerní efekt (…)

• Na druhé straně, nitrobenzen vykazuje výrazný -M efekt. Všechny aromatické

protony jsou více odstíněny a tím pádem posunuty k vyšším hodnotám ppm než

benzen.

• Opět polohy ortho a para mají tento efekt výraznější.

N

H

H

H

H

H

O O N

H

H

H

H

H

O O N

H

H

H

H

H

O O

N

H

H

H

H

H

O O

7.55

8.15

7.70

Anizotropní efekt

• Jakákoliv chemická vazba je anizotropní, protože je orientována v prostoru.

• Významný jev zejména u násobných vazeb a aromatických kruhů ( π-elektrony)

• Jestliže takovouto vazbu (vazebné elektrony) vložíme do externího magnetického

pole, bude indukovat lokální magnetické pole, které bude také anizotropní.

• Magnetické pole působící na jádra v okolí takovéto vazby bude též anizotropní.

Lokální magnetické pole bude buď zvyšovat nebo naopak snižovat efektivní

magnetické pole. Bude-li tento efekt kladný nebo záporný záleží na pozici

příslušného jádra vůči takovéto vazbě.

C C Bo

„Ring current“ efekt

• Anizotropní efekt aromatického jádra je vytvářen systémem konjugovaných

dvojných vazeb.

• Siločáry indukovaného magnetického pole jsou kolmé k rovině aromatického

kruhu.

• Vodíky v rovině kruhu jsou odstíněny (posun k vyšším hodnotám ppm), zatímco

vodíky nad nebo pod rovinou kruhu jsou stíněné (nižší hodnoty ppm).

Bo

Bring

+ + -

-

„Ring current“ efekt (…)

• Toto je důvod, proč je chemický posun aromatických protonů v rozmezí 6 až 9 ppm:

• Extrémním příkladem tohoto efektu je [18]anulen:

H

H

H 7.27 7.79

7.41

H

H

H

H

H

H

H H

H H

H

H

H

H

H

H H

H

+9.28 -2.99

Spin-spinové interakce

Bo

1Hj 1Hk

13C

( )( )( )kjjkkjkjjk

DD

jk IIeIeIbH

3 Hznmb jk 15012)2,0(

Přímá spin-spinová interakce

kjkj

J

jk IJIH

p2 HzJ jk 250

Nepřímá spin-spinová interakce

Bloc Bloc

Přímá spin-spinová interakce v pevných látkách

)250( HzJ jk )15012( Hzb jk

projeví se v běžném spektru ztráta rozlišení

Bo

Obrázek z: Brinkman A., Dipolar Recoupling in Magic-Angle-Spinning NMR, disertace,

Stockholmská univerzita 2001

statické spektrum

rotace pod magickým

úhlem (54,7), 870 Hz

rotace pod magickým

úhlem (54,7), 12 000 Hz

Hjk Hjk

Hjk Hjk Hjk

Hjk

Hjk

Hjk

Hjk

Hjk

kapaliny z důvodu izotropního pohybu molekul zprůměrování interakce = 0

Přímá spin-spinová interakce v kapalinách

Spin – spinová interakce se neprojeví přímo ve spektrech, nicméně její efekt lze

měřit v podobě tzv. křížové relaxace, což se využívá v experimentech, které

využívají tzv. nukleární Overhauserův efekt (NOESY, ROESY)

H H

rIS < 5-6 Ǻ

Nepřímá spin-spinová interakce

• Energetické hladiny jednotlivých jader jsou též ovlivňovány spinovými stavy jader v

okolí. Toto je nazýváno nepřímou spin-spinou interakcí. Nepřímá interakce je to

proto, že je zprostředkována vazebnými elektrony (na rozdíl od přímé dipól-

dipólové interakce jaderných spinů):

• Magnetický moment jádra polarizuje vazebné elektrony, resp. jejich magnetické

momenty a tato polarizace je přenášena na další jádra.

Bo

1H 1H

C

E = JAB * IA * IB

Nepřímá spin-spinová interakce Interakční konstanta (intenzita a počet čar)

• Každý atom 1H ve skupině CH2 „vidí“ 4 možné stavy atomů 1H v sousední

skupině CH3.

• Naproti tomu každý atom 1H skupiny CH3 „vidí“ 3 možné stavy protonů CH2

skupiny.

• 2 protony skupiny CH2 a 3 protony skupiny CH3 jsou navzájem ekvivalentní.

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

C H 3

O

O

C H 3

1.30 1.20 4.10 4.00

C H 2

Nepřímá spin-spinová interakce

Interakční konstanta (intenzita a počet čar)

• Je-li jádro A v interakci s n jádry (spin ½), která jsou identická je počet čar v

multipletu A roven n + 1 .

• Signál CH2 skupiny se objeví jako kvartet (4 čáry), zatímco CH3 skupina jako

triplet (3 čáry).

• Je-li jádro A v interakci s n jádry, která mají spin I platí pro počet čar multipletu A:

• Vzdálenost jednotlivých čar v multipletu je rovna velikosti interakční konstanty v

Hz. Je stejná v obou multipletech jak CH2, tak CH3 skupiny (7 Hz).

aa

ab ba

bb

aaa

aab aba baa

abb bab bba

bbb

CH3 CH2

m = 2 n I + 1

Interakční konstanta (pokračování)

Interakční konstanta (intenzita a počet čar)

• Z předchozího diagramu lze též odvodit intenzity jednotlivých čar multipletu.

Protože existuje stejná pravděpodobnost, že se systém nalézá v jakémkoliv stavu

(stavy v řádcích jsou energeticky degenerované), poměr intenzit je 1:2:1 pro CH3 a

1:3:3:1 pro CH2 skupinu.

• Obecně lze intenzitu čar získat z koeficientů binomického rozvoje:

• Pro rychlou orientaci slouží tzv. Pascalův trojúhelník.

1 : n / 1 : n ( n - 1 ) / 2 : n ( n - 1 ) ( n - 2 ) / 6 : ...

1

1 1

1 2 1

1 3 3 1

1 4 6 4 1

DRX 500

Avance

SPECTROSPIN

500

Kapitoly z praktické NMR spektroskopie

Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou

měřící sondou, tzv. kryosondou

Computer

25 Bar

Temperature 17K

Temperature 4K

Historické NMR spektrometry

CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 40 MHz (1961), ÚPT Brno

První komerčně dostupný CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 30 MHz (1952), Varian Inc.

600 MHz NMR spektrometr na VŠCHT Praha

Řez supravodivým magnetem

Průřez supravodivým magnetem Pohled shora

Kapalný dusík

(-196oC)

Solenoid

Evakuovaný

plášť

Měřící sonda

Měřený vzorek

y

x

z

Kapalné helium

(-269oC)

Zhasnutí magnetu „quench“

Nárůst velikosti magnetického pole NMR spektrometrů

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1950 1960 1970 1980 1990 2000

Rok uvedení na trh

Praco

vn

í fr

ekven

ce [

MH

z]

2020

1000

1100

1200

1300

2010

900 MHz 1H NMR spektrum lysozymu

900 MHz magnet firmy Oxford Instruments

900 MHz magnet firmy Bruker

První 1 GHz NMR spektrometr Centre de RMN à Très Hauts Champs Lyon, France

Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G: J.Am.Chem.Soc.79, 3289

(1957).

Bruker official website: http://www.bruker-biospin.com/av1000-apps.html

Citlivost a rozlišení se počítají

1 GHz NMR spectrum of 2 mM ubiquitin

40 MHz 1000 MHz

RIKEN Research Institute Yokohama, Japan

Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou

měřící sondou

Computer

25 Bar

Temperature 17K

Temperature 4K

Kryosonda

Chlazená plynným He na teplotu

17 K, předzesilovače na cca 40 K

Kyvety pro kapalinovou NMR spektroskopii.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

500 TBI 600 TCI (cryo)

Srovnání citlivosti 500 MHz sondy TBI a 600 MHz kryosondy

CTCI při měření 1H

620:1 6600:1 1) 500 versus 600 MHz

2) využití kryotechnologie

3) 12 let vývoje technologie

NMR spektroskopie

Sensitivity enhancement: 1.8-fold

Sensitivity between CryoProbe (CP) TCI and Room Temperature (RT) TXI probe

Stabilizace magnetického pole v čase

• Vlivem driftu Bo dochází k postupné změně polohy

měřeného signálu.

• Řešením je systém nazývaný „field lock“.

•Jedná se o jakýsi separátní NMR spektrometr, který pracuje nejčastěji se

signálem deuteria a podle velikosti změny Bo a tedy polohy signálu 2H

koriguje hlavní pole Bo.

C6H12 (bez locku)

Homogenizace magnetického pole v prostoru

• Nehomogenita Bo vzniká vlivem nedokonalé konstrukce magnetu, okolních

feromagnetických předmětů, nehomogenity vzorku…

• Odstraňuje se malými změnami Bo pomocí tzv. korekčních cívek. Tento proces se

nazývá shimování.

• Korekční cívky jsou umístěny okolo hlavní cívky v různých směrech a lze jimi

definovaně modifikovat hlavní pole.

Ukázky: a) špatně naladěný („nashimovaný“) magnet

b) dobře naladěný („nashimovaný“) magnet