1

I Wydział Lekarski 16.02.2010/23.02.2010 II Wydział Lekarski 18.02.2010

Ćwiczenie 15

Wirusy DNA

I. Seminarium: Właściwości ogólne i patogeneza zakaŜeń wybranych wirusów DNA w

powiązaniu z ich chorobotwórczością

II. Do wykonania:

1. Izolacja wirusa z materiał klinicznego (keratoconjunctivitis) w hodowli

komórkowej

2. Diagnostyka mononukleozy zakaźnej – odczyn „monospot” (wykrywanie

przeciwciał heterofilnych – nieswoista diagnostyka serologiczna)

3. Diagnostyka mononukleozy zakaźnej – ciąg dalszy: wykrywanie przeciwciał

przeciw antygenom VCA, EA i EBNA-1 wirusa EBV przy uŜyciu metody ELISA

– serologiczne odczyny swoiste

4. Diagnostyka serologiczna w przypadku reaktywacji zakaŜenia EBV

5. Odczyn ELISA w diagnostyce zakaŜeń parwowirusem B19 – wykrywanie

przeciwciał i antygenu wirusa w surowicy krwi

6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakaŜeń adenowirusami

III. Demonstracje:

1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mózgowo–rdzeniowych i mózgu –

zastosowanie metody multiplex-PCR. Sekwencje starterów, układy kontrolne. 2. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porównania sekwencji nukleotydów z

uŜyciem programu BLASTN

/dr n. med.

Maciej Przybylski/

2

1. Izolacja wirusa z materiału klinicznego na hodowli komórkowej

Opis przypadku:

Do okulisty zgłosiła się 52-letnia kobieta uskarŜająca się na zaczerwienienie spojówek, łzawienie, uczucie

piasku pod powiekami. Objawy te pojawiły się u niej poprzedniego dnia. W badaniu przedmiotowym lekarz

stwierdził przekrwienie spojówek, łzawienie oraz pojedyncze, punktowe, niecharakterystyczne ubytki nabłonka

rogówki. Pobrano wymaz ze spojówek. Materiał poddano wstępnej obróbce typowej dla badań

wirusologicznych.

Do wykonania:

(Uwaga: wszystkie czynności związane z hodowlami komórkowymi wykonujemy przy zachowaniu jalowości)

1. Zlać poŜywkę wzrostową znad hodowli komórkowej (Vero – hodowla komórek nabłonkowych z nerki

małpiej, wraŜliwa na zakaŜenie zarówno herpeswirusami jak i adenowirusami)

2. Ze stojących na lodzie probówek z materiałem klinicznym umieszczonym w poŜywce utrzymującej pobrać

1 ml i przenieść do probówki z hodowlą

3. Obserwacja efektu cytopatycznego po 24 h (na jutrzejszym ćwiczeniu)

Do wykrywania antygenów wirusowych w zakaŜonej hodowli komórkowej moŜna stosować odczyn

immunoperoksydazowy, odczyn immunofluorescencji lub testy immunoenzymatyczne.

2. Diagnostyka serologiczna mononukleozy zakaźnej

Opis przypadku (pacjent 1):

Osiemnastoletni męŜczyzna zgłosił się do lekarza z powodu bólów gardła, osłabienia i wysokiej gorączki. W

badaniu przedmiotowym lekarz stwierdził powiększenie migdałków, powiększenie węzłów chłonnych szyi,

bolesność palpacyjną wątroby oraz powiększenie śledziony.

W obrazie krwi stwierdzono umiarkowaną leukocytozę (12 500 leukocytów/mm3) oraz obecność limfocytów

atypowych.

Po rozpoznaniu wstępnym mononukleozy zakaźnej lekarz zdecydował się na wykonanie serologicznych testów

diagnostycznych, które potwierdziłyby diagnozę wstępną.

Odczyn Monospot (wykrywanie przeciwciał heterofilnych):

W przebiegu mononukleozy zakaźnej wzrost miana przeciwciał heterofilnych często występuje juŜ w pierwszym

tygodniu od pojawienia się objawów klinicznych.

Do wykrywania przeciwciał heterofilnych stosuje się testy aglutynacyjne z uŜyciem stabilizowanych krwinek

baranich zawierających antygeny heterofilne (test Paula-Bunnela-Davidsohna - PBD) krwinek końskich (test

„monospot”) lub lateksu opłaszczonego antygenem heterofilnym (test MZ).

.

Do wykonania:

Na szkiełkach podstawowych sprawdzić reakcje surowic kontrolnych (dodatniej i ujemnej) z lateksem MZ.

Następnie wykonać właściwe badanie z surowicą pacjenta.

3

3. Odczyn ELISA w diagnostyce mononukleozy zakaźnej – poszukiwanie swoistych przeciwciał (c.d.

punktu 2.)

Wykrycie w surowicy swoistych przeciwciał skierowanych przeciw antygenom wirusa Epsteina-Barr stanowi

potwierdzenie zakaŜenia. W odniesieniu do do objawów klinicznych, wyników testów laboratoryjnych i

wyników testów nieswoistych (P-B-D, test lateksowy MZ, monospot) ułatwia postawienie jednoznacznej

diagnozy mononukleozy zakaźnej.

Swoista odpowiedź humoralna w mononukleozie zakaźnej:

W przebiegu mononukleozy zakaźnej jako pierwsze pojawiają się przeciwciała anty-VCA (przeciw antygenowi

kapsydu), nieco później anty-EA (przeciw antygenowi wczesnemu), przy czym przeciwciała te nie pojawiają się

u wszystkich ludzi, u których występują objawy mononukleozy zakaźnej. Jako ostatnie pojawiają się

przeciwciała anty-EBNA (przeciw antygenowi jądrowemu). Utrzymujące się długotrwale wysokie miano

przeciwciał anty-EBNA charakterystyczne jest dla zakaŜeń przewlekłych wywołanych przez EBV oraz dla

zmian limfoproliferacyjnych o etiologii EBV.

4. Zastosowanie odczynu ELISA do wykrywania swoistej odpowiedzi humoralnej (IgM, IgG) wobec

antygenów EBV w przypadku reaktywacji zakaŜenia latentnego (pacjent 2)

Oprócz diagnostyki w przypadku podejrzenia mononukleozy zakaźnej, która jest najpowszechniejszą formą

objawową ostrego pierwotnego zakaŜenia EBV w populacji immunokompetentnej, swoiste testy serologiczne

mogą być pomocne w ocenie statusu odpowiedzi humoralnej w przypadkach zakaŜeń pacjentów z grup ryzyka w

4

odniesieniu do cięŜkich postaci zakaŜeń EBV. U pacjentów poddanych immunosupresji, z wrodzonymi

zaburzeniami immunologicznymi oraz u pacjentów cierpiących na nowotwory, zarówno zakaŜenia pierwotne jak

i wynikajace z reaktywacji latentnego EBV mogą prowadzic do szeregu zespołów klinicznych takich jak zespoły

limfoproliferacyjne, chroniczne aktywne zakaŜenie EBV lub zespoły zbliŜone do mononukleozy, lecz o

cięŜszym przebiegu.

5. Odczyn ELISA w diagnostyce przełomu aplastycznego związanego z zakaŜeniem parwowirusem B19

Opis przypadku

Z powodu powtarzających się od kilku dni krwawień z nosa, matka zdecydowała się przyprowadzic do

przychodni 8-letniego chłopca. W wywiadzie stwierdzono w okresie ostatnich dwóch tygodni postępujące

zmniejszenie aktywności ruchowej, senność, brak apetytu i utrzymującą się podwyŜszoną temperaturę ciała

(37,5°C) przy wieczornym pomiarze.

W badaniu przedmiotowym z odchyleń stwierdzono bladość skóry oraz drobne wybroczyny na błonach

śluzowych jamy ustnej i gardła.

Wykonano badanie laboratoryjne krwi. Stwierdzono niedokrwistość normocytową, znacznie zmniejszoną liczbę

retikulocytów, granulocytopenię z względną limfocytozą oraz małopłytkowość.

Stwierdzono takŜe znacznie wydłuŜony czas krwawienia, wzrost stęŜenia Ŝelaza w surowicy i zwiększone OB.

Na podstawie wyników badań klinicznych i laboratoryjnych stwierdzono zmniejszoną czynność krwiotwórczą

szpiku. Jako jedną z moŜliwych przyczyn uznano zakaŜenie parwowirusem B19. Lekarz zlecił wykonanie badań

serologicznych: oznaczenie przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 w klasach IgM i IgG oraz oznaczenie

antygenu wirusa B19 we krwi pacjenta.

Przebieg zakaŜenia pierwotnego parwowirusem B19

5

*)TAC – transient aplastic crisis

DO WYKONANIA W ODCZYNACH ELISA (do punktów 3, 4, 5) :

Do wszystkich opisanych dołków dodać po 50 µl chromogenu (tetrametylbenzydyny – TMB). Następnie pasek

inkubować przez 10 min. w temp. pokojowej w ciemności.

Po inkubacji naleŜy przerwać reakcję enzymatyczną dodając do wszystkich dołków po 50 µl 0,5N roztworu

H2SO4.

Wynik naleŜy odczytać nie później niŜ pół godziny po przerwaniu reakcji.

6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakaŜeń adenowirusami

Opis przypadku:

U 20 – letniego męŜczyzny przebywającego na oddziale chirurgii, w ósmej dobie po wykonanym zabiegu

splenektomii, pojawiły się objawy zapalenia płuc. U chorego występował napadowy suchy kaszel, płytki oddech

i podwyŜszona temperatura ciała (38,8°C przy wieczornym pomiarze). Z wywiadu wynika, Ŝe pacjent miewał

juŜ zapalenia płuc (ostatnio dwa lata temu). Pacjent pali papierosy. W badaniu osłuchowym stwierdzono szmery

oddechowe w dolnej lewej części klatki piersiowej. W badaniu radiologicznym w dolnym płacie płuca lewego

stwierdzono kilka obszarów nacieczonych śródmiąŜszowo.

Lekarz, biorąc pod uwagę wirusową etiologię zakaŜenia, zlecił laboratoryjną identyfikację czynnika

etiologicznego. Pośród innych badań mikrobiologicznych, wykonano badanie polegające na izolacji wirusa z

popłuczyn oskrzelowych w hodowlach komórkowych. Po obróbce, materiał posiano na hodowle komórkowe

wraŜliwe na zakaŜenie wirusami oddechowymi (paramyksowirusy, ortomyksowirusy, adenowirusy). Po trzech

dniach w linii komórkowej A549 (linia wraŜliwa na zakaŜenie adenowirusami) pojawił się nasilony efekt

cytopatyczny. W pozostałych liniach efekt cytopatyczny nie wystapił. Z komórek hodowli wykonano rozmaz na

szkiełkach podstawowych, z przeznaczeniem do odczynu immunoperoksydazowego z uŜyciem surowicy

wzorcowej (przeciwciała monoklonalne przeciw białkom heksonów adenowirusów, swoiste wobec wszystkich

typów adenowirusów wywołujących zakaŜenia u człowieka)

Wykonanie odczynu:

UWAGA: Na kaŜdym stole jest przygotowany preparat z utrwalonymi komórkami zakaŜonymi adenowirusem.

Wirus został poddany inaktywacji.

Uwaga! Dotknięcie okrągłego pola na szkiełku doprowadzi do starcia komórek! Nie dotykać!

1. Na preparat utrwalony na szkiełku podstawowym nakroplić 20 µl wzorcowej surowicy (Buteleczka z

ciemnego szkła podpisana „Chromogen IP”). 2. Inkubować przez 10 minut w 37°C w komorze wilgotnej 3. Szkiełko umieścić w szklanym kominku do płukania, zalać zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej

(PBS), płukać przez dwie minuty, delikatnie poruszając szkiełkiem. Po wyjęciu z kominka szkiełko delikatnie osuszyć bibułą.

4. Na preparat nakroplić 20 µl chromogenu, inkubować przez 5 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej.

5. Powtórzyć punkt 3. 6. Odczytać pod mikroskopem świetlnym (w pow. 400x)

6

DEMONSTRACJA:

1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu – zastosowanie testu multiplex

PCR (demonstracja)

Opis przypadku:

Do izby przyjęć szpitala rejonowego przywieziono 37-letniego męŜczyznę z temperaturą 39°C, dreszczami,

silnym bólem głowy, nudnościami i wymiotami.

W badaniu przedmiotowym stwierdzono zamroczenie, zaburzenia równowagi, lekki niedowład połowiczy oraz

tachykardię.

Pobrano krew i płyn mózgowo-rdzeniowy do badań ogólnych imikrobiologicznych.

Badanie laboratoryjne płynu mózgowo-rdzeniowego wykazały umiarkowaną pleocytozę, poziom glukozy i

białka w normie. Na podstawie wyników badań zdecydowano się wykonać równieŜ badanie wirusologiczne

płynu mózgowo-rdzeniowego metodą multiplex-PCR pod kątem wirusa opryszczki.

Badanie wykonano wg. procedury:

I. Ekstrakcja DNA z próbki materiału klinicznego (200 µl płynu mózgowo-rdzeniowego) II. Amplifikacja DNA metodą reakcji łańcuchowej polimeryzacji

III. Detekcja zamplifikowanych fragmentów DNA (rozdział elektroforetyczny produktów PCR w Ŝelu

agarozowym)

Zdj ęcie Ŝelu po elektroforezie:

7

Oznaczenia:

100 bp M: znacznik długości produktu - 100 par zasad

K (-): kontrola ujemna (DNA człowieka, wolne od DNA HSV)

HSV 1 TK-, HSV 2 TK-: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierające zmutowany gen kinazy

tymidynowej, oporne na acyklowir

HSV 1 TK+, HSV 2 TK+: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierające prawidłowy gen kinazy

tymidynowej, wraŜliwe na acyklowir

P M-R: badany płyn mózgowo - rdzeniowy

Długość produktów: HSV-1 (gen polimerazy DNA): 469 pz

HSV-2 (gen polimerazy DNA): 390 pz

Kinaza tymidynowa: 1200 pz

3. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porównania sekwencji nukleotydów z uŜyciem programu BLASTN

1. W komputerze na sali ćwiczeń: w programie “notatnik” otworzyć plik sekwencji “adenowirus.fas”

zawierający sekwencję produktu PCR przeprowadzonego ze starterami swoistymi dla

adenowirusów (plik znajduje się na pulpicie).

2. Zaznaczyć całą sekwencję nukleotydów i skopiować ją (ctrl+c).

3. Otworzyć okno przeglądarki. Powinna być widoczna strona internetowa NCBI BLAST (basic local

alignment search tool – podstawowa wyszukiwarka lokalnych sekwencji komplementarnych).

4. W sekcji “Basic BLAST” wybrać program “nucleotide blast”

5. Wkleić skopiowaną sekwencję do okna “Enter accesion number, gi or FASTA sequence” (ctrl+v)

6. Sprawdzić, czy:

a. Wybrana jest baza danych “nucleotide collection (nr/nt)”

b. Zaznaczono opcję “highly similar sequence”

c. Zaznaczono opcję “Show results in a new window”

7. Nacisnąć przycisk “BLAST”, w przegladarce pojawi się okno wyników. Poczekać, aŜ program

przeszuka bazę danych.

8. Na podstawie podobieństwa sekwencji badanej i zestawu sekwencji z bazy danych zidentyfikować

typ wirusa. Określić stopień podobieństwa najbardziej zbliŜonej sekwencji.

Zidentyfikowany typ adenowirusa:

Podobieństwo: [%]