Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 1 -

Ćwiczenie 7, 8

Temat: Metody ilościowe w mikrobiologicznych badaniach żywności.

Pobieranie prób do badań

Próbka pobrana do badań mikrobiologicznych powinna być „reprezentatywna” tzn. powinna

odzwierciedlać stan całego badanego produktu. Najczęściej do badań ilościowych pobiera się

10g lub 10cm3 produktu. Produkty płynne należy przed pobraniem próbki dokładnie

wymieszać. Z produktów stałych i sypkich jałowym skalpelem, łyżeczką lub świdrem

pobiera się 10g produktu, przenosi do jałowego woreczka, dodaje się do 90cm3 płynu

do rozcieńczeń i homogenizuje (np. w stomacherze) w celu ujednolicenia próby.

Żywność o spodziewanej dużej liczbie drobnoustrojów (w jednym mililitrze/gramie mogą się

znajdować miliony (106) lub nawet miliardy (10

9) komórek) należy przed posiewem

rozcieńczyć - zwykle stosuje się szeregi 10-krotnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym.

Przygotowanie 10-krotnych rozcieńczeń badanego materiału

Po wymieszaniu próbki badanego materiału płynnego pobiera się jałową pipetą 10 cm3,

przenosi do kolby zawierającej 90 cm3 płynu rozcieńczającego (nie zanurzając pipety

w płynie), dokładnie miesza. W ten sposób otrzymuje się rozcieńczenie 1:10, oznaczane jako

1. Z produktów stałych i sypkich rozcieńczenie 1:10 otrzymuje się na etapie ujednolicania

próby. (patrz pobieranie prób do badań)

Następnie z pierwszego (1:10) rozcieńczenia (dokładnie wymieszanego) przenosi się 1 cm3

do probówki zawierającej 9 cm3 płynu rozcieńczającego (nie zanurzając pipety w płynie).

W ten sposób otrzymuje się rozcieńczenie 1:100, czyli 2.

Po dokładnym wymieszaniu i przeniesieniu nową pipetą szklaną (lub końcówką pipety

automatycznej) 1 cm3 rozcieńczenia 2 do 9 cm

3 płynu rozcieńczającego otrzymuje się

rozcieńczenie 1:1000, czyli 3.

W analogiczny sposób wykonuje się kolejne rozcieńczenia w zalewności od spodziewanego

zanieczyszczenia mikrobiologicznego badanej próby.

Najczęściej stosowane w analizie mikrobiologicznej rozcieńczalniki to :

- płyn fizjologiczny – (0,85% roztwór wodny NaCl)

- płyn Ringera – (mieszanina: wody, chlorków: sodu, potasu, wapnia i dwuwęglanu sodu)

- płyn fizjologiczny z peptonem – ( płyn fizjologiczny z dodatkiem 0,1% peptonu

kazeinowego)

- płyn fizjologiczny z cytrynianem

- płyn fizjologiczny z buforem fosforanowym

Metody oznaczeń ilościowych

W badaniach mikrobiologicznych żywności przeprowadza się oznaczenie liczby m. in.

- bakterii tlenowych mezofilnych

- grzybów

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 2 -

- mikroorganizmów psychrotrofowych

- bakterii kwaszących

- bakterii proteolitycznych

- pałeczek z grupy coli lub całej rodziny Enterobacteriaceae

- paciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus

Do oznaczania liczby drobnoustrojów metodą hodowlaną stosuje się głównie dwie metody:

1) płytkową z użyciem pożywek stałych

a) posiew wgłębny

b) posiew powierzchniowy,

2) oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL)

Ad. 1. Oznaczenie liczby drobnoustrojów metodą płytkową

Metoda oznaczania liczby drobnoustrojów przez posiew na podłoże stałe zakłada, że liczba

powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek w badanej próbie. Wynik podaje

się w jednostkach tworzących kolonie - jtk ( ang. cfu - colony forming units) w 1g lub 1cm3

produktu. .

1 a. Posiewy wgłębne

Posiew do płytki Petriego po 1 cm3 wybranych kolejnych rozcieńczeń w dwóch

powtórzeniach; podłoża: agar odżywczy przy oznaczaniu liczby mezofilnych bakterii

tlenowych lub podłoże wybiórcze, wybiórczo-różnicujące lub różnicujące przy oznaczaniu

liczby wybranych grup drobnoustrojów.

Warunki inkubacji: przy oznaczaniu liczby mezofilnych bakterii tlenowych - 30ºC przez

72 godz., lub optymalne temperatury przy oznaczaniu wybranych grup drobnoustrojów.

Zasada odczytania wyników:

Do odczytu wybiera się płytki z 2 kolejnych rozcieńczeń, na których wyrosło od 30

do 300 kolonii. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm3 lub w 1 g próbki oblicza się wg wzoru:

C

L = ------------------------ · d

(N1 + 0,1N2) , gdzie:

C - suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia

N1 - liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia

N2 - liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia

d - wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu

rozcieńczeniu

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 3 -

przykład:

rozcieńczenie : 2 3 4

liczba wyrosłych koloni na pierwszej płytce > 300 150 15

liczba wyrosłych koloni na drugiej płytce > 300 156 16

337

L = ·1000 = 154181

2+0,1·2

Z uwagi na to, że liczbę drobnoustrojów wyraża się liczbą z jednym miejscem po przecinku

należy dokonać zaokrąglenia zgodnie z regułami matematyki

L = 1,5 x105 jtk/cm

3 lub g

Do odczytu wyników można wybrać jedno rozcieńczenie, policzyć kolonie na płytkach

z równoległych powtórzeń, wyliczyć średnią liczbę kolonii w rozcieńczeniu i przeliczyć

na 1 cm3 lub 1 g próby, mnożąc przez odwrotność rozcieńczenia.

Wynik podaje się w jednostkach tworzących kolonie (jtk) w 1 cm3 lub 1 g produktu

1 b. Posiewy powierzchniowe

Posiewy wykonuje się nanosząc badany materiał na powierzchnię zestalonego podłoża.

UWAGA: Przed posiewem, płytki z pożywką podsuszamy w celu usunięcia kondensatu wody

z powierzchni pożywki. Płytki należy podsuszać w temp. 40ºC przez 30-60 min. W tym celu

umieszcza się płytki w termostacie, otwiera i układa tak, aby denko było oparte na wieczku

płytki; zarówno wieczko jak i denko są odwrócone.

Posiew do płytki Petriego z zestalonym podłożem po 0,1 cm3 wybranych kolejnych

rozcieńczeń próby w dwóch powtórzeniach.

Posiany materiał rozprowadza się jałową, zgiętą bagietką na powierzchni całego podłoża,

aż do wsiąknięcia.

Podłoża: przy oznaczaniu liczby mezofilnych bakterii tlenowych - agar odżywczy, przy

oznaczaniu innych wybranych grup drobnoustrojów podłoże wybiórcze, różnicujące lub

różnicująco-wybiórcze.

Warunki inkubacji: przy oznaczaniu liczby mezofilnych bakterii tlenowych - 30ºC przez

72 godz., przy oznaczaniu innych, wybranych grup drobnoustrojów optymalne temperatury

i czas.

Zasada odczytania wyników:

Do odczytu wybiera się płytki z 2 kolejnych rozcieńczeń, na których wyrosło od 15

do 150 kolonii. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm3 lub w 1 g próbki oblicza się wg wzoru:

C

L = -------------------- d · a

(N1 + 0,1N2) · , gdzie:

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 4 -

C - suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia

N1 - liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia

N2 - liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia

d - wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu

rozcieńczeniu

a - współczynnik posianej ilości materiału, przy posiewie 0,1cm3 a = 10

Do odczytu wyników można wybrać jedno rozcieńczenie, policzyć kolonie na płytkach

z równoległych powtórzeń, wyliczyć średnią liczbę kolonii w rozcieńczeniu i przeliczyć na

1 cm3 lub 1 g próby, uwzględniając liczone rozcieńczenie i posiewaną objętość.

Wynik podaje się w jednostkach tworzących kolonie (jtk) w 1 cm3 lub 1 g produktu

Schemat wykonywania rozcieńczeń i posiewów metodą wgłębną i powierzchniową

Modyfikacje metody płytkowej oznaczania liczby drobnoustrojów

Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą sączenia przez filtr membranowy

Dla prób o niewielkiej liczbie drobnoustrojów (np. napoje, woda wodociągowa) można

zastosować metodę polegającą na przesączeniu badanej próbki (np. objętości 100 cm3) przez

sączek membranowy, a następnie położeniu sączka na podłożu stałym i po okresie inkubacji

policzeniu kolonii wyrosłych na powierzchni sączka.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 5 -

Petrifilmy

Petrifilm składa się z 2 części:

- papierowej podstawy, podzielonej na kwadraty i pokrytej warstwą polietylenu, na której

jest naniesiona pożywka hodowlana (agar odżywczy, podłoże wybiórcze itp.),

- przezroczystej folii propylenowej; zawierającej czynnik żelujący i wskaźnik barwny.

Wykonanie posiewu:

na podstawę z wybranym podłożem nanosi się 1 cm3 produktu lub jego rozcieńczenia,

przykrywa warstwą foliową i odciska folię specjalnym krążkiem (dyfuzorem).

Warunki inkubacji: odpowiednie dla oznaczanej grupy drobnoustrojów.

Odczytanie wyników: po inkubacji liczy się wszystkie charakterystyczne kolonie dla

oznaczanej grupy drobnoustrojów, następnie uwzględniając rozcieńczenie przelicza się liczbę

kolonii na 1 cm3 lub 1 g próby, a wyniki podaje się w jtk w 1 cm

3 lub 1 g produktu.

System płytki spiralnej

W metodzie tej rozcieńczenie jest precyzyjnie rozprowadzane

po powierzchni płytki, tworząc spiralę Archimedesa. System ten znacznie

ogranicza czas analizy i ilość materiałów, ponieważ na jednej płytce

można wykryć mikroorganizmy występujące w liczbie 400-400000

komórek/g lub cm3.

Metoda „Droplete”

Rozcieńczoną próbę miesza się w stosunku 1:9 z upłynnionym podłożem agarowym.

Następnie zaszczepione podłoże nanosi się w postaci kropli, o objętości 0,1cm3, na plastikowe

płytki i po skróconym czasie inkubacji liczy się mikrokolonie za pomocą lupy lub specjalnego

czytnika.

Metody bezpośredniego liczenia drobnoustrojów

Metody te polegają na bezpośrednim liczeniu drobnoustrojów pod mikroskopem.

Mikroskopia fluorescencyjna (DEFT)

Wykonanie oznaczenia obejmuje filtrowanie odpowiednio przygotowanej próby a następnie

barwienie osiadłych na filtrze drobnoustrojów fluorescencyjnym barwnikiem np. oranżem

akrydyny i policzenie liczby bakterii przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Technika ta

pozwala na oznaczenie komórek martwych i żywych.

Liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór

Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem to najczęściej szklane płytki

z wyciętym wgłębieniem, podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni.

Po naniesieniu rozcieńczenia do komory dokonuje się liczenia komórek widocznych

w obrazie mikroskopowym, a następnie przelicza się ich liczbę na 1 cm3 badanego materiału.

Najczęściej stosuje się komory: Thoma, Howarda, Börkera, Fuch Rosenthala.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 6 -

Metody oznaczania liczby drobnoustrojów na podstawie ich aktywności metabolicznej

Testy reduktazowe – są oparte na obserwacjach zmian zachodzących w podłożach w wyniku

aktywności metabolicznej drobnoustrojów. Enzymy bakterii przenoszą atomy wodoru na

barwniki (najczęściej błękit metylenowy, resazuryna, chlorek tetrazoliowy) powodując

zmianę ich barwy. Aktywność enzymów jest zależna od ilości mikroorganizmów, więc

miernikiem ich liczby jest czas, w którym zajdzie zmiana zabarwienia stosowanego barwnika.

Metoda impedymetryczna – polega na pomiarze zmian parametrów elektrycznych środowiska

w wyniku rozwoju drobnoustrojów. Mikroorganizmy podczas wzrostu powodują zmiany

przewodności elektrycznej układu (pożywka wraz z mikroorganizmami), przekształcając

polisacharydy, białka i tłuszcze do dobrze dysocjujących związków takich jak: kwasy

organiczne, aminokwasy i kwasy tłuszczowe. W miarę gromadzenia produktów metabolizmu

następuje obniżenie oporu w czasie przepływu prądu elektrycznego pomiędzy elektrodami

zanurzonymi w hodowli mikroorganizmów, co zostaje zarejestrowane przez instrument

pomiarowy.

Cytometria przepływowa – polega na pomiarze fizycznych oraz niekiedy chemicznych cech

komórek, które są zawieszone w roztworze i pojedynczo przepływają przez sensory optyczne

gdzie są oświetlane źródłem światła, co pozwala na rejestrację ich liczby.

Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) bakterii

Metoda ta jest stosowana do oznaczania tylko nielicznych grup bakterii, które występują

w badanej żywności w niewielkich ilościach lub takich drobnoustrojów, których hodowla

metodą płytkową jest niemożliwa lub utrudniona. Najczęściej metodą tą wykonuje się

oznaczenia pałeczek grupy coli, E. coli lub bakterii fermentacji masłowej i gnilnych

beztlenowców przetrwalnikujących. W badaniach stosuje się albo pożywkę selektywną, albo

specjalne warunki hodowli i pożywki, które zapewniają wykrycie konkretnej badanej grupy

bakterii.

Zasada oznaczenia:

Posiew próbki i jej kilku (minimum trzech kolejnych) rozcieńczeń do pożywek

selektywnych w próbówkach, w trzech równoległych powtórzeniach.

Warunki inkubacji odpowiednie dla badanej grupy bakterii.

Po inkubacji dla każdego posianego rozcieńczenia zapisuje się liczbę prób dodatnich

(w których stwierdzono objawy wzrostu badanej grupy drobnoustrojów); do odczytu wybiera

się 3 kolejne rozcieńczenia; z zapisanych dla nich sekwencji trzech liczb (próby dodatnie)

odczytuje się ze specjalnych tabel wskaźnik NPL, którego wartość mnoży się przez

współczynnik pierwszego z 3 rozcieńczeń wybranych do odczytu – w ten sposób uzyskuje się

wartość NPL w 1 cm3 lub 1 g.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 7 -

PRZYKŁAD:

rozcieńczenie próby: 2 (1:100) 3 (1:1000) 4(1:10000) 5(1:100000)

ilość prób pozytywnych: 3 2 1 0

Z tabel odczytujemy wskaźnik NPL dla sekwencji 210 – wynosi on 1,5. Mnożymy wskaźnik

przez 1000 (odwrotność najniższego wybranego do odczytu rozcieńczenia). NPL wynosi

1500, tj. 1,5·103 jtk/cm

3.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 8 -

Tabela 1. Wskaźniki NPL dla posiewów 3-probówkowych

Liczba wyników dodatnich

w wybranych

3 rozcieńczeniach

Wskaźnik

NPL

Kategorie prawdopodobieństwa przy różnej liczbie

próbek z partii

1 2 3 5 10

0 0 0 <0,30

0 0 1 0,30 3 2 2 2 1

0 1 0 0,30 2 1 1 1 1

0 1 1 0,61 0 3 3 3 3

0 2 0 0,62 3 2 2 2 1

0 3 0 0,94 0 0 0 0 3

1 0 0 0,36 1 1 1 1 1

1 0 1 0,72 2 2 1 1 1

1 0 2 1,1 0 0 0 3 3

1 1 0 0,74 1 1 1 1 1

1 1 1 1,1 3 3 2 2 2

1 2 0 1,1 2 2 1 1 1

1 2 1 1,5 3 3 3 3 2

1 3 0 1,6 3 3 3 3 2

2 0 0 0,92 1 1 1 1 1

2 0 1 1,4 2 1 1 1 1

2 0 2 2,0 0 3 3 3 3

2 1 0 1,5 1 1 1 1 1

2 1 1 2,0 2 2 1 1 1

2 1 2 2,7 0 3 3 3 3

2 2 0 2,1 1 1 1 1 1

2 2 1 2,8 3 2 2 2 1

2 2 2 3,5 0 0 0 0 3

2 3 0 2,9 3 2 2 2 1

2 3 1 3,6 0 3 3 3 3

3 0 0 2,3 1 1 1 1 1

3 0 1 3,8 1 1 1 1 1

3 0 2 6,4 3 3 2 2 2

3 1 0 4,3 1 1 1 1 1

3 1 1 7,5 1 1 1 1 1

3 1 2 12 3 2 2 2 1

3 1 3 16 0 0 0 3 3

3 2 0 9,3 1 1 1 1 1

3 2 1 15 1 1 1 1 1

3 2 2 21 2 1 1 1 1

3 2 3 29 3 3 3 2 2

3 3 0 24 1 1 1 1 1

3 3 1 46 1 1 1 1 1

3 3 2 110 1 1 1 1 1

3 3 3 >110

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 9 -

Wykrywanie obecności drobnoustrojów

W mikrobiologicznej analizie żywności w określonych przypadkach nie oznaczamy liczby

mikroorganizmów tylko stwierdzamy ich obecność w określonej objętości próby np.

w 1; 0,1 g/cm3

itd. Najczęściej wykrywa się obecność pałeczek grupy coli, E. coli,

Enterococcus sp., beztlenowców przetrwalnikujących, i bakterii chorobotwórczych.

Oznaczenie wykonuje się poprzez posiew 1cm3 próby lub/i jej rozcieńczenia

do odpowiedniej pożywki wybiórczej w trzech powtórzeniach. W żywności wykrywa

się również obecność drobnoustrojów chorobotwórczych, najczęściej jednak w objętości 10;

25 g lub cm3. Oznaczenia te są wieloetapowe, zasady tych oznaczeń zostaną przedstawione

na kolejnych ćwiczeniach.

PRZYKŁAD:

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 10 -

Wybrane grupy drobnoustrojów najczęściej oznaczanych w żywności

1. Liczba mezofilnych bakterii tlenowych

Posiew wgłębny; podłoże - agar odżywczy, inkubacja w 30ºC przez 72 godz.

2. Liczba grzybów (drożdży i pleśni)

Posiew wgłębny - podłoże wybiórcze agar z chloramfenikolem (YGC-agar), inkubacja

w 25ºC przez 5 dni. Zazwyczaj po inkubacji osobno liczy się kolonie drożdży i pleśni.

3. Liczba drobnoustrojów psychrotrofowych

Posiew wgłębny– podłoże agar odżywczy, inkubacja:

w 6,5ºC przez 10 dni (metoda standardowa),

w 21ºC przez 25 godz. (metoda szybka).

4. Liczba bakterii kwaszących

Oznaczenie to stosuje się w zasadzie tylko przy oznaczaniu liczby paciorkowców fermentacji

mlekowej w fermentowanych produktach mleczarskich i zakwasach.

Posiew wgłębny lub powierzchniowy - podłoże różnicujące z laktozą i błękitem chińskim

(podłoże wg Demetera), inkubacja w 30ºC przez 72 godz.

Bakterie kwaszące tworzą na tym podłożu ciemnogranatowe kolonie otoczone granatową

strefą zakwaszenia (kolonie paciorkowców są małe, okrągłe i regularne, inne laktozo-

dodatnie bakterie np. pałeczki grupy coli tworzą na tym podłożu znacznie większe kolonie),

kolonie bakterii laktozo-ujemnych (niekwaszących) są zwykle białe, szare lub kremowe.

5. Liczba pałeczek fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus

Posiew wgłębny lub powierzchniowy - podłoże MRS-agar, inkubacja w warunkach

beztlenowych w 37°C przez 72 godziny.

Kolonie pałeczek Lactobacillus sp. mają barwę białą, kremową lub szarą, są okrągłe

najczęściej z równym brzegiem, lekko wypukłe z połyskiem.

6.Oznaczanie drobnoustrojów przetrwalnikujących

Liczbę przetrwalników bakterii tlenowych i beztlenowych oraz ich obecność i NPL oznacza się

w próbach badanej żywności po procesie pasteryzacji w temperaturze 80ºC przez 15 minut. Proces

ten niszczy komórki wegetatywne, a pozostają tylko przetrwalniki.

6a. Oznaczanie liczby przetrwalników Bacillus sp.

Posiew metodą powierzchniową – podłoże agar odżywczy, inkubacja w 30ºC przez 48 godz.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 11 -

Na podłożu wyrastają tylko kolonie Bacillus sp., najczęściej białe lub kremowe, różniące się

wielkością i morfologią.

6b. Oznaczanie beztlenowych laseczek przetrwalnikujących redukujących siarczany

(IV) [siarczyny]

Wykrywanie obecności w 1 cm3 lub w 0,1 cm

3 badanego materiału:

Posiewy w probówkach należy zalać upłynnionym i ostudzonym do temp. ok. 45ºC podłożem

różnicującym, zawierającym siarczan (IV) sodu, cytrynian żelazowo-amonowy

i nadmanganian potasu (do 100 cm3 podłoża dodaje się po 1 cm

3 roztworów każdego

odczynnika). Wymieszać i po zestaleniu zalać warstwą agaru wodnego (2-3 cm), inkubacja

w 37ºC przez 1-4 dni. Kontrola wzrostu co 24 godziny (zaznacza się probówki,

w których pojawiły się czarne kolonie). Wzrost w 2 lub 3 powtórzeniach pozwala na

stwierdzenie obecności przetrwalników beztlenowców redukujących siarczan (IV) w badanej

ilości materiału.

6c. Oznaczanie beztlenowych laseczek przetrwalnikujących sacharolitycznych

(gazotwórczych)

Posiew do probówek zawierających upłynniony i ostudzony do 45ºC agar odżywczy

z glukozą. Probówki należy wymieszać w dłoniach (nie należy w tym celu używać vortexu

lub innego mieszadła, aby uniknąć nadmiernego natlenienia pożywki), inkubacja w 37ºC

przez 48 godz.

Porozrywanie słupka podłoża w 2 lub 3 probówkach świadczy o obecności beztlenowców

gazotwórczych w badanej ilości materiału.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 7,8

- 12 -

Część praktyczna:

Ćwiczenie 7

Z badanego materiału należy wykonać rozcieńczenia 1:10, 1:100, 1:1000 i oznaczyć:

1) Liczbę mezofilnych bakterii tlenowych:

a) metodą wgłębną – posiew po 1cm3 rozcieńczenia 1:1000 w dwóch powtórzeniach.

b) metodą powierzchniową - posiew po 0,1cm3 rozcieńczenia 1:100 w dwóch powtórzeniach.

Podłoże - agar odżywczy; inkubacja 30°C/72 h.

2) Liczbę grzybów:

Posiew wgłębny - podłoże wybiórcze agar z chloramfenikolem (YGC-agar), inkubacja

w 25ºC przez 5 dni. Po inkubacji można liczyć kolonie drożdży i pleśni osobno lub łącznie.

3) Oznaczyć obecność paciorkowców Enterococcus sp. w 0,1 lub 0,01cm3 badanego

materiału. Pożywka wg Burzyńskiej. Inkubacja 37°C/48h.

4) Oznaczyć NPL sacharolitycznych laseczek Clostridium sp. (słupki agaru odżywczego z

glukozą); posiew po 1cm3 rozcieńczeń 1:10, 1:100 i 1:1000 w 3 powtórzeniach. Po posiewie i

wymieszaniu probówki spasteryzować w 80°C/10 min. (+ 5 min. na ogrzanie próbki),

schłodzić pod bieżącą wodą. Inkubacja 37°C/48h.

Ćwiczenie 8

1) Odczytać i zinterpretować wyniki posiewów wykonanych na ćwiczeniu 7.

2) Odczytać NPL pałeczek grupy coli z zestawów znajdujących się na stanowiskach.