ĆWICZENIE 29. BIOKATALIZATORY I ICH ZASTOSOWANIE W PRZEMYŚLE

ĆWICZENIE 30. BIOKATALITYCZNA INWERSJA SACHAROZY W PRZEPŁYWOWYCH

REAKTORACH KOLUMNOWYCH

OSOBY PROWADZĄCE:

mgr inż. Katarzyna Jodko (pok.134, konsultacje: środy 1030-1130, czwartki 1300-1400)

dr hab. Grzegorz Litwinienko (pok. 132, konsultacje: środy 1030-1130, czwartki 1300-1400)

LITERATURA:

1. Atkins, P. W. Równowaga chemiczna. W: Chemia fizyczna. PWN 2007, 201-227.

2. Atkins, P. W. Szybkość reakcji chemicznych. W: Chemia fizyczna. PWN 2007, 735-763.

3. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. i L. Stryer. Enzymy. Podstawowe pojęcia i kinetyka.

W: Biochemia. PWN 2007, 189-228.

4. Ishikawa, T., Karnkowska, A., Lilpop, J. i J. Urbański. Słodki świat enzymów. Szkoła

Festiwalu Nauki (materiały dostępne na stronie: www.sfn.edu.pl).

5. Walory, J., Pilarek, M., Kalinowska, M. i H. Jaworowska-Deptuch. Kinetyka reakcji

enzymatycznej. W: Biochemia. Ćwiczenia laboratoryjne. Oficyna Wydawnicza PW 2003,

44-60.

6. Adamczak, M. Biokataliza i jej zastosowanie. W: Podstawy biotechnologii przemysłowej.

Red. W. Bednarski i J. Fiedurek. WNT 2007, 317-378.

7. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., i V. Rodwell. rozdz. I.8-I.11 w: Biochemia

Harpera, Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 1995, str. 82-118

8. Malepszy, S. Zabiegi technologiczne zwiększające produkcję metabolitów wtórnych.

W: Biotechnologia roślin. PWN 2001, 331-334.

2

Wymagania do ćwiczeń:

1. Definicje: szybkość / rzędowość / cząsteczkowość / stała równowagi reakcji chemicznej,

równanie Arrheniusa, reguła van’t Hoffa, energia aktywacji, kataliza homogeniczna

i heterogeniczna (przykłady), opis oddziaływań katalizatora z substratem, biokataliza,

biokatalizator, enzym, rybozym, kofaktor, enzymy allosteryczne, teoria kompleksu

aktywnego.

2. Właściwości enzymów / biokatalizatorów: aktywność, wydajność syntezy produktu, liczba

obrotów enzymu, selektywność substratowa i typu reakcji.

3. Mechanizm działania enzymów: modele opisujące działanie enzymów, klasyfikacja

enzymów.

4. Kinetyka Michaelisa-Menten – założenia i wyprowadzenie równania, sens fizyczny stałych

obecnych w równaniu, możliwe uproszczenia, sposób wyznaczania parametrów

charakteryzujących enzym.

5. Regulacja reakcji enzymatycznych: inhibicja kompetytywna i niekompetytywna, wpływ

parametrów intensywnych na szybkość reakcji enzymatycznej.

6. Techniki instrumentalnej analizy ilościowej (spektroskopia UV-Vis, prawo Lamberta-

Beera, sporządzanie krzywej wzorcowej, przeliczanie stężeń).

7. Dodatkowo studenci są proszeni o wybranie dowolnego enzymu i samodzielne (pisemne!)

opracowanie jego charakterystyki w oparciu o dostępne bazy literaturowe. Opracowanie to

powinno obejmować – numer wg klasyfikacji E.C., typ katalizowanej reakcji, znaczenie

katalizowanego procesu w organizmie, struktura centrum aktywnego (wraz z kofaktorem,

jeżeli występuje), ewentualne inhibitory i mechanizm ich działania. Postuluje się, żeby

studenci z jednej grupy wybierali różne enzymy do scharakteryzowania.

3

Poniższy wstęp zakłada znajomość podstawowych definicji i pojęć kinetyki chemicznej,

z którymi student zapoznał się podczas kursu chemii fizycznej. Ponadto, studenci są proszeni

o zapoznanie się z materiałem dotyczącym enzymów prezentowanym na wykładzie Elementy

Biotechnologii (Wykłady nr 3-5).

I. BIOKATALIZA

Procesy biochemiczne, przebiegające w organizmach żywych, są kontrolowane przez

biokatalizatory – naturalnie występujące cząsteczki przyspieszające bądź hamujące przebieg

reakcji, do których zaliczamy enzymy, hormony i witaminy (często pełniące funkcję

koenzymów). W analogii do procesów przebiegających in vivo, podejmowane są próby

przemysłowego wykorzystania materiału biologicznego do wydajnego prowadzenia reakcji

chemicznych. Zabieg taki określa się mianem biokatalizy, a zachodzącą pod wpływem

materiału biologicznego reakcję – biotransformacją lub biokonwersją.

Rolę biokatalizatora w procesach przemysłowych mogą pełnić całe komórki (w formie

zawiesiny lub immobilizowane), ekstrakt komórkowy lub enzymy o różnym stopniu

oczyszczenia, wolne lub immobilizowane. Zastosowanie hormonów (zaliczanych do

naturalnych biokatalizatorów) do przemysłowego prowadzenia reakcji chemicznych nie jest

możliwe, gdyż regulują one procesy zachodzące w komórce tylko za pośrednictwem

specyficznych receptorów, obecnych we wnętrzu komórek lub umieszczonych śródbłonowo.

Biokatalizatory stosowane są w przemyśle na coraz większa skalę - obecnie już około

130 procesów z użyciem enzymów lub komórek mikroorganizmów zostało opracowanych dla

skali produkcji przewyższającej 100 kg. Enzymy znajdują zastosowanie głównie w przemyśle

spożywczym (przemysł piekarniczy, browarnictwo, gorzelnictwo, mleczarstwo, przemysł

mięsny), przy produkcji detergentów (biodetergentów), w przemyśle papierniczym oraz

w medycynie (w tym w diagnostyce genetycznej).

II. ENZYMY

Enzymy to związki wielkocząsteczkowe wykazujące właściwości katalityczne,

umożliwiające prawidłowe tempo przemian metabolicznych w organizmach żywych

i wirusach. Wykazano wpływ enzymów na przebieg wszystkich szlaków anabolicznych

i katabolicznych w komórce. Przykładowo, fundamentalna w procesach oddychania

komórkowego i oddychania płucnego reakcja:

CO2 + H2O H2CO3 (1)

4

przebiega 107 – razy szybciej w obecności enzymu anhydrazy węglanowej. Działanie enzymu

umożliwia więc wydajne usunięcie dwutlenku węgla, który powstaje w procesach

metabolicznych poprzez rozpuszczenie go we krwi, a następnie uwolnienie go z krwi do

wnętrza pęcherzyków płucnych. Śmiało możemy więc powiedzieć, że aktywność katalityczna

anhydrazy węglanowej warunkuje efektywną wymianę gazową.

II.1. Budowa enzymów

II.1.1. Rybozymy jako pozostałość „świata RNA”

Niemal wszystkie enzymy są białkami. Jednak w „świecie RNA” (hipotetycznym,

wczesnym etapie rozwoju życia na Ziemi) rolę katalizatorów prawdopodobnie pełniły

cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA). W latach 80., Thomas Cech i Sidney Altman

niezależnie odkryli cząsteczki RNA wykazujące aktywność katalityczną - rybozymy (za co

w 1989 roku otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii). Cech udowodnił, że proces

splicingu RNA u jednokomórkowego orzęska Tetrahymena thermophila polega na

autokatalitycznym wycinaniu intronów. Katalityczne właściwości RNA wynikają ze

zdolności przyjmowania przez te cząsteczki skomplikowanych struktur, umożliwiających

idealne przestrzenne dopasowanie do siebie enzymu i substratu katalizowanej reakcji.

Obecnie wiemy, że rybozymy występują w komórkach wszystkich organizmów i uczestniczą

przede wszystkim w mechanizmach syntezy białek (na przykład rRNA, wchodzący w skład

rybosomów, katalizuje reakcję tworzenia wiązań peptydowych miedzy aminokwasami).

Odkrycie cząsteczek RNA o właściwościach katalitycznych potwierdza przedstawioną wyżej

hipotezę „świata RNA”. Należy w tym miejscu podkreślić, że w „świecie RNA” kwas

rybonukleinowy obok funkcji katalitycznej, pełnił też rolę nośnika informacji genetycznej,

czego pozostałością we współczesnym świecie są retrowirusy (w tym wirus HIV). Postuluje

się, że cząsteczkę, która jest jednocześnie nośnikiem informacji i katalizuje swoje własne

przemiany, można uznać za pierwszą, niekomórkową formę życia na Ziemi.

II.1.2. Enzymy białkowe

Jak już wspomniano, podstawową rolą enzymów w organizmie jest katalizowanie

przebiegu ściśle określonych reakcji metabolicznych. Wobec tego, najbardziej istotnymi

właściwościami enzymów, warunkującymi prawidłowe pełnienie przez te cząsteczki swojej

funkcji, będą siła katalityczna (aktywność) i selektywność (specyficzność). Porównywanie

aktywności różnych enzymów stało się możliwe po wprowadzeniu przez Międzynarodową

Unię Biochemiczną międzynarodowej jednostki standardowej U. Jest to ilość enzymu,

która katalizuje przemianę 1µmola substratu w czasie 1 minuty w temperaturze 30ºC,

5

w odpowiednim dla danego enzymu pH i przy optymalnym stężeniu substratu. Wyrażana jest

w µmol/min. Inne jednostki aktywności, które wciąż używane są w analizach biochemicznych

to: aktywność właściwa, aktywność molekularna (inaczej liczba obrotów enzymu) i katal.

Selektywność enzymu dotyczy zarówno katalizowanej reakcji (selektywność typu reakcji)

jak i substratów biorących w niej udział (selektywność substratowa). Selektywność

substratowa enzymu polega na wybraniu spośród wielu podobnych substancji tylko tej

właściwej, która będzie podlegała procesowi enzymatycznemu. Ten typ selektywności jest

efektem precyzyjnego dopasowania trójwymiarowej struktury enzymu do cząsteczki

substratu. Łańcuch polipeptydowy zbudowany z dwudziestu różnych aminokwasów zapewnia

większą selektywność niż cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest kombinacją tylko

czterech typów nukleotydów. Z powodu większej różnorodności białek, to właśnie te

biocząsteczki stanowią główny materiał z którego zbudowana jest większość znanych

enzymów. Selektywność typu reakcji oznacza, że spośród wielu możliwych reakcji, jakim

ulegać może substrat, enzym katalizuje tylko jeden, ściśle określony proces. Efektem

selektywności enzymu jest właściwie brak zachodzenia reakcji ubocznych.

Wiele enzymów jest aktywnych (albo wykazuje podwyższoną aktywność) tylko

w obecności niebiałkowych cząsteczek – kofaktorów. W przypadku tych enzymów, ich

białkową część określamy mianem apoenzymu, a tworzony aktywny kompleks (apoenzym +

kofaktor) – holoenzymem. W roli kofaktorów mogą występować cząsteczki nieorganiczne,

jony metali, lub małocząsteczkowe związki organiczne. W oparciu o chemiczny charakter

kofaktora i moc wiązania, które tworzy z białkową częścią enzymu, w niektórych

opracowaniach kofaktory podzielono na dwie grupy:

- koenzymy, małe cząsteczki organiczne, które w sposób specyficzny łączą się

z apoenzymem; często są wiązane tylko na czas reakcji i uwalniane wraz z jej

produktami.

- grupy prostetyczne są silnie (często kowalencyjnie) związane z apoenzymem; w tej roli

mogą występować jony metali, małe cząsteczki nieorganiczne bądź organiczne.

Reakcja katalityczna zachodzi w miejscu aktywnym enzymu, czyli w obszarze

wiązania substratu i ewentualnych kofaktorów. W enzymach białkowych miejsce aktywne

składa się z reszt aminokwasowych, zwanych grupami katalitycznymi enzymu, które biorą

bezpośredni udział w zachodzącej reakcji. Miejsce aktywne enzymu jest często opisywane

jako „szczelina” w strukturze enzymu, w którą wpasowują się substraty biorące udział

w reakcji. Pełni ono dwojaką funkcję: selekcjonuje cząsteczki, które mogą brać udział w

reakcji, a ponadto umożliwia właściwe ułożenie reagenta / reagentów względem siebie.

6

Miejsce aktywne często jest tworzone przez reszty aminokwasowe oddalone od siebie w

sekwencji aminokwasowej – dopiero przybranie przez białko odpowiednio „zwiniętej”

trzeciorzędowej struktury powoduje zbliżenie tych reszt do siebie i utworzenie miejsca

aktywnego. Ponadto, miejsce aktywne przeważnie zajmuje jedynie małą część w strukturze

cząsteczki enzymu – gdy jednak weźmiemy pod uwagę, jak odległe aminokwasy biorą udział

w jego tworzeniu, jasne stanie się, że reszta cząsteczki jest niezbędna do przyjęcia przez

enzym właściwej struktury, pełniąc rolę rusztowania dla miejsca aktywnego. Za wiązanie

substratu w miejscu aktywnym, w zależności od chemicznego charakteru substratu i reszt

aminokwasowych tworzących miejsce aktywne, odpowiedzialne mogą być: oddziaływania

elektrostatyczne i hydrofobowe, wiązania wodorowe oraz siły van der Waalsa.

II.2. Modele ilustrujące działanie enzymów

Enzymy w sposób wysoce specyficzny wiążą substraty reakcji i ustawiają je

w odpowiedniej konformacji przestrzennej, sprzyjającej zajściu katalizowanego procesu.

W 1890 roku Hermann Emil Fischer podjął próbę opisania zjawiska specyficzności

substratowej enzymów przy użyciu modelu „zamka i klucza”. Zgodnie z założeniami

modelu, enzym (a dokładniej jego miejsce aktywne) i substrat doskonale odpowiadają sobie

przestrzennie. To dopasowanie jest warunkiem, po pierwsze, wzajemnego rozpoznania

substratu i enzymu, a następnie - zajścia katalizowanej reakcji. Według modelu „zamka i

klucza” (ang. lock and key model – Rysunek 1a), specyficzność substratowa enzymu zależy

od precyzyjnego ułożenia atomów w miejscu aktywnym, które oddziałują z przylegającą do

nich cząsteczką substratu. Obecnie wiemy, że postulowany przez Fischera1 model nie

tłumaczy w sposób właściwy zachodzącego procesu. Dopasowanie przestrzenne, zgodne z

modelem „zamka i klucza” uniemożliwiałoby bowiem efektywne obniżenie energii aktywacji

zachodzącej reakcji (czyli w zasadzie blokowałoby działanie enzymu, patrz rozdział II.3).

Zgodnie z kolejnym modelem, zaproponowanym w 1958 przez Daniela E. Koshlanda

Juniora2, struktury przestrzenne miejsca aktywnego i substratu wykazują względem siebie

powinowactwo (umożliwiające ich wzajemne rozpoznanie), ale dopiero podczas wiązania

substratu, kształt miejsca aktywnego nieznacznie zmienia się i idealnie dopasowuje

przestrzennie do substratu. Nieznaczne zmiany konformacyjne w strukturze miejsca

aktywnego są źródłem naprężeń wiązań w strukturze enzymu, co obniża energię aktywacji

katalizowanej reakcji chemicznej. W modelu zaproponowanym przez Koshlanda, określanym 1 H. E. Fisher ostatecznie został laureatem Nagrody Nobla w dziedzinie chemii, ale za prace dotyczące syntezy cukrów i puryn, a nie za prace nad mechanizmem działania enzymów. 2 Daniel E. Koshland Jr. był dziedzicem fortuny Levi Straussa

7

mianem „indukowanego dopasowania” (ang. induced fit model – Rysunek 1b), enzymy

traktowane są jako dynamiczne struktury przestrzenne, które mogą zmieniać swoją

konformację w obecności substratu.

Rysunek 1. Mechanizm wiązania substratu (substratów) przez enzym. Na rysunku przedstawiono schematycznie reakcję rozpadu substratu S do produktów P1 i P2., zachodzącą w obecności enzymu. Proces przedstawiono za pomocą modelu „zamka i klucza” (A), zgodnie z którym miejsce aktywne enzymu jest komplementarne do kształtu substratu i modelu „indukowanego dopasowania” (B), według którego wiązanie substratu pociąga za sobą zmiany konformacyjne w obrębie enzymu.

II.3. Mechanizm działania enzymów

Żeby zrozumieć mechanizm działania enzymów, rozważmy hipotetyczną reakcję

przemiany substratu S w produkt P, katalizowaną przez enzym E:

S PE

(2)

Enzym E w tym samym stopniu obniża barierę aktywacyjną reakcji tworzenia produktu P, co

reakcji ponownej przemiany produktu P w substrat S, a zatem równocześnie przyspiesza

reakcje zachodzące w obydwu kierunkach. Wobec tego obecność enzymu nie zmienia stanu

równowagi zachodzącej reakcji chemicznej, opisanego przez stałą równowagi K, a jedynie

przyspiesza jego osiągnięcie. Stała równowagi K zależy od standardowej entalpii swobodnej

reakcji zgodnie z zależnością:

∆−=

RTGK

0

exp (3)

8

Standardowa entalpia swobodna reakcji 0G∆ jest z kolei różnicą pomiędzy standardową

entalpią swobodną produktu 0PG i standardową entalpią swobodną substratu 0

SG . Ponieważ

obecność enzymu nie wpływa na wartość standardowych entalpii swobodnych związków

biorących udział w reakcji ( 0PG i 0

SG ), nie może też zmienić wartości 0G∆ , a co za tym idzie

– nie może wpłynąć na położenie stanu równowagi określonego przez stałą równowagi K.

Przebieg zachodzącej reakcji można jednak opisać za pomocą innego parametru –

entalpii swobodnej aktywacji ‡G∆ (w literaturze częściej określanej mianem energii aktywacji

Gibbsa, lub po prostu energii aktywacji). Parametr ten to różnica pomiędzy entalpią

swobodną stanu przejściowego reakcji ‡TSG a standardową entalpią swobodną substratu 0

SG .

Stanem przejściowym reakcji TS‡ (ang. transition state) będzie najrzadziej występujący stan,

w którym mogą się znaleźć związki uczestniczące w reakcji, charakteryzujący się najwyższą

wartością entalpii swobodnej. Stan ten należy sobie wyobrazić jako jeden z etapów na drodze

przemian prowadzących od substratu S do powstania produktu P, zatem równanie (2)

przyjmuje postać:

S TS P (4)

Osiągnięcie stanu przejściowego TS‡, czyli najmniej korzystnego etapu przemiany, wymaga

dostarczenia do układu energii niezbędnej do pokonania bariery energetycznej pomiędzy

substratem a stanem przejściowym. Po osiągnięciu stanu przejściowego następuje jego

samorzutne przekształcenie w produkt reakcji3. Działanie enzymów polega na obniżaniu

energii aktywacji dla katalizowanej reakcji poprzez stabilizację stanu przejściowego (czyli

obniżenie entalpii swobodnej i zwiększenie prawdopodobieństwa jego wystąpienia – Rysunek

2). Stabilizacja stanu przejściowego reakcji jest możliwa np. poprzez zmianę środowiska

reakcji (substrat reakcji zostaje ukryty w „szczelinie” miejsca aktywnego, która stabilizuje

stan przejściowy reakcji). Warto tu podkreślić, że centrum aktywne często utworzone jest

przez hydrofobowe reszty aminokwasowe. Wobec tego, w przypadku reakcji zachodzących w

cytoplazmie (będącej złożonym koloidem wodnym), wejście substratu w „szczelinę” miejsca

aktywnego wiąże się ze zmianą środowiska z hydrofilowego na hydrofobowe, co może

sprzyjać tworzeniu stanu przejściowego.

3 Omawiany tu model jest bardzo uproszczony i zakłada istnienie tylko jednego stanu przejściowego. W rzeczywistości na współrzędnej reakcji można czasem wyodrębnić kilka stanów przejściowych a przejście jednego w drugi jest możliwe po pokonaniu dodatkowych barier energetycznych. Można wtedy powiedzieć, że metastabilne struktury (TS1)‡, (TS2)‡ , (TS3)‡ są pewnymi lokalnymi maksimami energetycznymi.

9

Rysunek 2. Mechanizm działania enzymów. Na rysunku przedstawiono jak zmienia się energia swobodna G podczas przemiany substratów S w produkty P, zachodzącej przez stan przejściowy TS‡(2), charakteryzujący się najwyższą wartością entalpii swobodnej. Enzymy ułatwiają tworzenie stanu przejściowego – w ich obecności reakcja zachodzi przez stan przejściowy TS‡(1).

II.4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

Najprostszy model matematyczny opisujący kinetykę reakcji enzymatycznej

zaproponowali w 1913 roku: niemiecki biochemik, Leonor Michaelis i Maud Leonora

Menten4. Forma matematyczna zaproponowanego przez nich równania kinetycznego,

znanego jako równanie Michaelisa-Menten, okazała się na tyle uniwersalna, że została

potem wykorzystana do opisu kinetyki wzrostu mikroorganizmów5.

Model Michaelisa-Menten zakłada, że etapem pośrednim w procesie przekształcenia

substratu S w produkt P jest utworzenie kompleksu aktywnego enzym-substrat E-S. Na

istnienie stanu przejściowego w postaci kompleksu E-S wskazuje fakt „wysycania” enzymu

w obecności wysokiego stężenia substratu. Oznacza to, ze jeżeli prowadzimy eksperyment

przy stałym stężeniu enzymu, to na początku zwiększanie stężenia substratu powoduje wzrost

szybkości reakcji. Jednak po przekroczeniu pewnego stężenia granicznego, dalsze

zwiększanie stężenia substratu nie przyspiesza już zachodzącej reakcji. Jest to efektem

wykorzystania wszystkich miejsc aktywnych w strukturze enzymu. Wówczas, kolejne

kompleksy E-S mogą być tworzone tylko po rozpadzie już istniejących kompleksów,

4 M. L. Menten (1876-1960) jako jedna z pierwszych kobiet w Kanadzie zdobyła stopień doktora medycyny. Ponieważ nie mogła pracować naukowo w swoim kraju (tytuł lekarza otrzymała na Uniwersytecie w Toronto w 1911 roku na podstawie wyników badań prowadzonych w Chicago), zdecydowała się na emigrację do Niemiec, gdzie w 1916 roku obroniła pracę doktorską właśnie pod kierunkiem Michaelisa. Potem pracowała naukowo w Stanach Zjednoczonych a dopiero od 1950 roku w Kanadzie. 5 Równanie Monoda (Monod, J. The growth of bacterial cultures. A. Rev. Microbiol. 3, 371-394, 1949).

10

prowadzącym do uwolnienia cząsteczek enzymu. Ponadto, istnienie stanu przejściowego E-S

zostało wykazane metodami krystalograficznymi i spektroskopowymi.

Enzym po związaniu substratu (substratów) ustawia je w optymalnej orientacji

przestrzennej do zajścia katalizowanej reakcji. Zgodnie z założeniami modelu Michaelisa-

Menten, po odwracalnej reakcji tworzenia kompleksu aktywnego E-S, następuje jego

nieodwracalny rozpad do produktu P i enzymu E:

E+S E-S E+Pk+1

k-1

k2

(5)

Szybkości reakcji cząstkowych tego procesu wynoszą:

][][][][

22

11

11

SEkvSEkvSEkv

−=−=⋅=

−−

++

(6)

Szybkość zużywania substratu S przedstawia równanie:

][][][][1111 SEkSEkvv

dtSd

−−⋅=−=− −+−+ (7)

podczas gdy szybkość tworzenia produktu P jest równa:

][][22 SEkv

dtPd

−== (8)

Zmiany stężenia kompleksu E-S w czasie przedstawia zależność:

][][][][][211211 SEkSEkSEkvvv

dtSEd

−−−−⋅=−−=−

−+−+ (9)

Gdy szybkość tworzenia kompleksu E-S (równa v+1) jest równa szybkości jego rozpadu w

obydwu kierunkach (v-1+v2), to stężenie kompleksu aktywnego E-S nie zmienia się:

0][=

−dt

SEd (10)

W tak zdefiniowanym stanie ustalonym (stacjonarnym) możliwe jest rozwiązanie równań (7)

i (8). Zauważmy, że w rozpatrywanym układzie enzym występuje w formie wolnej E

i w formie kompleksu aktywnego E-S. Wobec tego, całkowite stężenie enzymu w układzie:

][][][ 0 SEEE −+= (11)

Z równań (9-11) otrzymujemy wyrażenie na stężenie kompleksu aktywnego E-S:

][][

][][ 0112

1 ESkkk

SkSE+−

+

++=− (12)

11

Po wstawieniu tej zależności do równania (7) lub (8), otrzymujemy wyrażenie na szybkość

prowadzonej reakcji enzymatycznej (wyrażoną jako szybkość zużywania substratu S lub

szybkość powstawania produktu P). Zgodnie z założeniem o stanie ustalonym, szybkość

zużywania substratu jest równa szybkości powstawania produktu - patrz równania (9) i (10):

][][

][0

112

21 ESkkk

SkkV+−

+

++= (13)

Kolejne założenia, o stałości stężenia E0 w trakcie procesu i znacznym nadmiarze substratu S

w stosunku do ilości enzymu6 pozwalają nam uprościć równanie (13) do formy

zaproponowanej przez Michaelisa i Menten:

][][

][

][][][

][][ max

1

121

102

112

102 SK

SVS

kkk

k

SkEkSkkk

SkEkVM +

=

+

+×=

++×=

+

−+

+

+−

+ (14)

gdzie 1

12

+

−+=

kkkK M stała Michaelisa

][ 02max EkV = maksymalna szybkość reakcji, kiedy [E-S]=[E0], czyli gdy cały

enzym jest zaangażowany w tworzenie kompleksu - proszę porównać z równaniem (8)

Stała Michaelisa ma wymiar stężenia i z równania (14) wynika, że dla [S] = KM, szybkość

katalizowanej reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej:

max21 ][ VVKS M =⇔= (15)

Wobec tego, prowadząc serię pomiarów szybkości procesu enzymatycznego dla różnych

stężeń substratu można wyznaczyć stałą Michaelisa, która jest takim stężeniem substratu, przy

którym szybkość katalizowanej reakcji osiąga połowę wartości maksymalnej (Rysunek 3) 7.

6 [S] >> [E0] – proszę się zastanowić, w którym momencie wykorzystano to założenie? 7 Dokładniejsze wyznaczenie parametrów równania Michaelisa-Menten jest możliwe po przekształceniu tego równania do postaci Lineweavera-Burke’a, Hanesa lub Eadie-Hofstee’a (po dobraniu odpowiedniego układu współrzędnych otrzymujemy wykresy liniowe).

12

Rysunek 3. Szybkość reakcji enzymatycznej V w funkcji stężenia substratu S dla procesu przebiegającego zgodnie z modelem Michaelisa-Menten. Na wykresie przedstawiono sposób wyznaczenia wartości stałej KM oraz uproszczone formy równania Michaelisa-Menten właściwe dla skrajnych stężeń substratu S.

Stała KM jest odwrotnie proporcjonalna do powinowactwa enzymu do substratu - jej małe

wartości świadczą o dużym powinowactwie. Na Rysunku 3 przedstawiono jak szybkość

reakcji V zależy od stężenia substratu S. Na krzywej możemy wyróżnić dwa obszary

kinetyczne. Dla bardzo niskich stężeń substratu, równanie (14) można uprościć do postaci:

][ ][ max SKV

VKSM

M =⇔⟨⟨ (16)

Przy niskich stężeniach substratu proces przebiega zatem zgodnie z mechanizmem reakcji

I-rzędowej. Z kolei, przy wysokich stężeniach substratu, następuje całkowite „wysycenie”

enzymu i reakcja zachodzi z szybkością maksymalną dla danego stężenia enzymu:

max ][ VVKS M =⇔⟩⟩ (17)

Należy zaznaczyć że równanie Michaelisa-Menten nie jest właściwe do opisu enzymów

allosterycznych, czyli enzymów wielojednostkowych, zawierających kilka miejsc aktywnych

w obrębie jednej cząsteczki. W przypadku tego typu enzymów, cząsteczki substratu wiązane

są kolejno do miejsc aktywnych, przy czym związanie substratu z jednym miejscem może za

sobą pociągać zmiany konformacyjne w obrębie enzymu, które ułatwiają wiązanie substratów

do następnych miejsc aktywnych.

II.5. Regulacja procesów enzymatycznych

Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od ilości substratu (zgodnie z równaniem

Michaelisa-Menten, jeżeli stężenie enzymu jest stałe). Przy nadmiarze substratu, enzym ulega

13

„wysyceniu” i szybkość reakcji można zwiększyć przez dodanie nowej porcji enzymu.

W obszarze maksymalnej szybkości reakcji, jej postęp zależy bowiem liniowo od stężenia

enzymu:

][ 02max EkVV == (18)

Zależność ta wykorzystywana jest przy oznaczaniu stężenia enzymów w próbkach

biologicznych, w celach diagnostycznych.

Ponadto, enzymy podlegają regulacji za pomocą wysoce specyficznych mechanizmów

kontroli (z wykorzystaniem tak zwanego centrum allosterycznego) oraz niespecyficznie,

w efekcie zmieniających się parametrów układu takich jak odczyn pH, temperatura, siła

jonowa i innych.

Centrum allosteryczne jest miejscem w strukturze biocząsteczki, do którego wiązane

są inhibitory bądź aktywatory danego enzymu. Istnienie tego miejsca warunkuje szybką

odpowiedź enzymu na zmieniające się warunki środowiska. Jest to szczególnie ważne

w przypadku enzymów regulujących kluczowe dla organizmu procesy, gdyż czyni z enzymu

precyzyjną maszynę, przyspieszającą dany cykl biochemiczny dokładnie wtedy, gdy jest to

potrzebne. Zapobiega to niepohamowanemu wzrostowi stężenia metabolitów (co, w myśl

zasady Dosis facit venenum może być zabójcze dla organizmu) a przede wszystkim zapobiega

marnotrawieniu energii na prowadzenie procesów, które są zbędne. I tak, w przypadku

szlaków metabolicznych, rolę inhibitorów często pełnią ich końcowe produkty, które na

zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego hamują enzym katalizujący pierwszą reakcję danego

szlaku (w czym znowu przejawia się oszczędność natury).

Inhibicja może być nieodwracalna - polegać na trwałym związaniu cząsteczki

inhibitora (I) z enzymem, bądź może mieć charakter odwracalny, kiedy utworzony kompleks

enzym-inhibitor (E-I) szybko dysocjuje. Zjawisko inhibicji nieodwracalnej jest

wykorzystywane w działaniu niektórych antybiotyków – na przykład penicylina blokuje

transpeptydazę – enzym niezbędny do syntezy bakteryjnych ścian komórkowych.

Podczas inhibicji odwracalnej cząsteczka inhibitora jest czasowo wiązana

z miejscem aktywnym enzymu bądź z innym centrum allosterycznym. W inhibicji

o charakterze kompetytywnym, inhibitor, charakteryzujący się podobną strukturą do

substratu, rywalizuje z nim o miejsce w centrum aktywnym:

14

W zależności od stosunku stężeń substratu i inhibitora, jeden z tych związków wygrywa

rywalizację o miejsce aktywne. Przy dużym nadmiarze substratu wpływ inhibicji

kompetencyjnej może być całkowicie zniesiony.

W inhibicji niekompetytywnej w strukturze enzymu istnieją oddzielne miejsca

wiązania substratu i inhibitora, jednak cząsteczka ze związanym inhibitorem zmienia swoją

konformację tak, że niemożliwe jest już wiązanie substratu, lub związany substrat nie może

być przekształcony w produkt reakcji:

W inhibicji niekompetytywnej tworzone są dwa typy kompleksów enzym - inhibitor:

kompleks E-I, w którego skład wchodzą cząsteczka enzymu i inhibitor, oraz kompleks E-I-S

powstający, gdy z cząsteczką enzymu jest równocześnie związany inhibitor i substrat.

Aktywność enzymów zależy również od intensywnych parametrów środowiska.

I tak, przebieg reakcji enzymatycznych, podobnie jak wszystkich reakcji chemicznych, silnie

zależy od temperatury, co jest efektem zmiany aktywności biorących w niej udział

cząsteczek. Wpływ temperatury T na szybkość reakcji chemicznej k opisuje równanie

sformułowane przez Svante Arrheniusa, szwedzkiego chemika, w 1889 roku8:

8 Oprócz ww. równania, na cześć Arrheniusa zostały też nazwane: laboratorium na Uniwersytecie Sztokholmskim i … krater na księżycu. Wynika to z wszechstronnych zainteresowań naukowca, który zajmował się również toksykologią, geologią, astronomią i astrofizyką. Należałoby tu również wspomnieć o czynnym zaangażowaniu Arrheniusa w tworzenie Narodowego Instytutu Biologii Ras w Uppsali (Statens Institut för

E

+ S

+ I

E-I

E-S P + E

forma zdezaktywowana enzymu

E

+ S

+ I

E-I

E-S

E-I-S

P + E

+ I

+ S formy

zdezaktywowane enzymu

15

( )RTEAk a /exp −⋅= (19)

Gdzie A – stała (czynnik przedwykładniczy)

Ea – energia aktywacji

R – stała gazowa

Zgodnie z regułą van’t Hoffa, wzrost temperatury o każde 10°C powoduje 2-4-krotny wzrost

szybkości reakcji. Oczywiście, w przypadku reakcji enzymatycznych nie jest możliwe

nieograniczone zwiększanie temperatury, gdyż prowadziłoby to do dezaktywacji enzymu9.

Enzymy białkowe są szczególnie wrażliwe na denaturację termiczną, która prowadzi do

zniszczenia ich trzeciorzędowej struktury, kluczowej dla działania miejsca aktywnego.

Rysunek 4. Wpływ temperatury na aktywność enzymu. Na wykresie przedstawiono jak szybkość reakcji enzymatycznej zmienia się wraz ze wzrostem temperatury, zaznaczono temperaturę optymalną Topt dla przebiegu reakcji enzymatycznej oraz temperaturę maksymalną Tmax, po przekroczeniu której następuje denaturacja enzymu.

W przypadku enzymów wykorzystywanych przemysłowo, kiedy regulacja szybkości reakcji

przy pomocy temperatury wydaje się być kuszącym rozwiązaniem, postuluje się stosowanie

Rasbiologi). Badania prowadzone w Instytucie wywarły duży wpływ na rozwój nazistowskiej eugeniki i stanowiły „naukowe” uzasadnienie dla programu sterylizacyjnego, realizowanego w Szwecji w latach 1936-1976 (21 tysięcy przymusowych sterylizacji!) 9 Nawet niewielkie zmiany temperatury mogą powodować dramatyczny wzrost lub spadek aktywności enzymów, odczuwalny wyraźnie przez organizm – długotrwałe stany gorączkowe lub stany osłabienia organizmu wynikają ze zmiany temperatury ciała tylko o ±2°C! Już tak niewielkie zmiany w temperaturze znacząco wpływają na funkcjonowanie organizmu jako całości. Dalsze obniżanie temperatury ciała prowadzi do hipotermii, czyli przechłodzenia. Ostre objawy hipotermii, w tym sztywność mięśni i utrata świadomości, pojawiają się, gdy temperatura ciała spadnie do 30°C. Dalsze wychłodzenie, poniżej 28°C prowadzi do śmierci, której bezpośrednią przyczyną jest zbyt niska temperatura serca i mózgu. Wychłodzenie organizmu zachodzi znacznie (ok. 20-razy) szybciej w wodzie, ze względu na jej większe przewodnictwo cieplne. Szacuje się, że czas przeżycia człowieka w wodzie o temperaturze poniżej 10°C wynosi tyle minut ile temperatura wody! Doskonale tłumaczy to zasięg jednej z największych tragedii morskich – na pokładzie zatopionego transatlantyku Titanic zginęło ponad 1500 osób. W nocy 14/15.04.1912, kiedy doszło do tragedii, temperatura wody spadła bowiem do 0°C, co znacząco obniżyło szanse przeżycia pasażerów statku.

16

enzymów wyizolowanych z organizmów termofilnych. Cały metabolizm termofili jest

dostosowany do wysokich temperatur i ich białka są stabilne w temperaturach sięgających

80°C (a nawet 105°C dla hipertermofili!).

Czynnikiem istotnym dla szybkości reakcji enzymatycznej jest też stężenie jonów

wodorowych w mieszaninie reakcyjnej. W zależności od odczynu środowiska różny jest

bowiem stopień dysocjacji reszt aminokwasowych, co bezpośrednio wpływa na

oddziaływanie enzymu z substratem (poprzez zmianę konformacji całego enzymu lub zmianę

właściwości jego miejsca aktywnego). Skrajne wartości pH mogą nawet doprowadzić do

denaturacji enzymu.

Rysunek 5. Wpływ pH na aktywność enzymu. Na wykresie przedstawiono jak zmiany pH wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Zaznaczono optymalną wartość pH – pHopt, przy której reakcja przebiega najszybciej oraz zakresy pH, w których zachodzi denaturacja enzymu. Enzymy działają więc najefektywniej w ściśle określonym przedziale pH, zależnie od ich

struktury i charakteru oddziaływań enzym-substrat. Umożliwia to na przykład regulację

aktywności enzymów działających w przewodzie pokarmowym (enzymy aktywne w silnie

kwaśnym pH żołądka, jak pepsyna czy lipaza żołądkowa, są dezaktywowane w dwunastnicy,

która zawdzięcza swoje alkaliczne środowisko sokowi trzustkowemu).

III. Immobilizacja enzymów

III.1. Zalety i wady procesu immobilizacji

Jak już wspomniano, enzymy mogą być stosowane w przemyśle w formie zawiesiny

(o różnym stopniu czystości) lub w postaci immobilizowanej. Immobilizacja jest procesem

polegającym na uwięzieniu enzymu w pewnej określonej przestrzeni. Enzym

immobilizowany powinien charakteryzować się aktywnością katalityczna i być przeznaczony

do wielokrotnego stosowania.

17

Termin enzym immobilizowany został precyzyjnie zdefiniowany dopiero w 1971

roku, w wiele lat po pierwszym praktycznym wykorzystaniu procesu immobilizacji. Już w

XVII wieku do produkcji kwasu octowego z etanolu używano bowiem bakterii Acetobacter

umieszczonych na wiórach bukowych. Z kolei enzymu immobilizowanego użyto po raz

pierwszy podczas I wojny światowej – wobec deficytu kwasu siarkowego przeprowadzono

reakcję inwersji sacharozy w obecności inwertazy immobilizowanej na węglu aktywnym

(otrzymanym poprzez zwęglenie kości).

Immobilizacja enzymów umożliwia zwiększenie wydajności procesów

biotechnologicznych10. Wydajność procesu możemy zdefiniować poprzez wydajność syntezy

produktu, czyli stosunek masy otrzymanego produktu w stosunku do masy substratu. Wzrost

wydajności procesu jest możliwy, ponieważ immobilizacja zwiększa trwałość enzymów

i ułatwia ich odzyskiwanie z mieszaniny reakcyjnej, co z kolei umożliwia ich wielokrotne

używanie w procesach prowadzonych w układach okresowych lub ciągłych. Enzymy

immobilizowane charakteryzują się zwiększoną stabilnością w zmieniających się warunkach

pH i temperatury oraz w środowisku rozpuszczalników organicznych.

Z drugiej strony, w trakcie procesu immobilizacji może nastąpić częściowa

dezaktywacja enzymu. Enzym immobilizowany często charakteryzuje się niższą aktywnością

niż enzym „wolny” pracujący w tych samych warunkach11 (aktywności enzymu nie należy

mylić z ostateczną wydajnością prowadzonego procesu). Może to wynikać ze sterycznego

zablokowania centrum aktywnego, niewłaściwych naprężeń w obrębie cząsteczki enzymu a

także mechanicznych uszkodzeń enzymu. Nie do pominięcia są też opory dyfuzyjne, które

zmniejszają efektywne stężenie substratu docierającego do katalizatora, i tym samym

ograniczają szybkość zachodzącej reakcji. Należy tez pamiętać o kosztach samej

immobilizacji, które muszą być uwzględnione w analizie ekonomicznej całego procesu.

10 Immobilizacja może też wpływać na wzrost wydajności procesów prowadzonych w obecności homogenatów komórkowych i całych komórek. Na przykład wydajność reakcji redukcji kodeinonu do kodeiny pod wpływem wyciągu z maku lekarskiego (Papaver somniferum) rośnie z 60% (reakcja w zawiesinie) do 70% (biokatalizator unieruchomiony w żelu alginianowym) a nawet do ponad 80% wskutek immobilizacji biokatalizatora w piance poliuretanowej. Kodeina (metylomorfina) jest substancją czynną o działaniu przeciwbólowym i przeciwkaszlowym. Podczas II wojny światowej była używana jako substytut morfiny. Immobilizacja komórek na nośnikach jest z kolei wskazana w produkcji metabolitów wtórnych. Zagęszczenie komórek wywołane immobilizacją imituje warunki panujące w tkankach roślinnych (gradient pożywki i metabolitów, zwiększona odporność na uszkodzenia mechaniczne). I tak, wzrost produkcji alkaloidów purynowych zaobserwowano po immobilizacji komórek Coffea arabica w alginianie wapnia. 11 Immobilizacja może też wpływać na wzrost aktywności enzymów – taki efekt zaobserwowano w przypadku enzymów katalizujących reakcje stereoselektywnej estryfikacji i transestryfikacji, po ich unieruchomieniu metodą sieciowania kryształów enzymu.

18

Alternatywną w stosunku do immobilizacji metodą unieruchomienia enzymów, może

być prowadzenie procesu w reaktorze membranowym, gdzie przestrzeń zajęta przez enzym

jest ograniczona przez półprzepuszczalną membranę.

III.2. Metody immobilizacji enzymów

Metoda immobilizacji i właściwy dobór nośnika determinują właściwości katalityczne

związanego enzymu. Decydując się na określony typ nośnika należy zwrócić uwagę zarówno

na właściwości biochemiczne samego enzymu (w tym jego wielkość, charakter grup

funkcyjnych, aktywność oraz pH- i termostabilność), typ katalizowanej reakcji, jak

i charakterystykę fizykochemiczną nośnika (jego stabilność chemiczną i wytrzymałość

mechaniczną, dostępne grupy funkcyjne, porowatość, stopień rozwinięcia powierzchni).

W zależności od wybranej metody immobilizacji, enzym może być zaadsorbowany na

nośniku lub związany z nim wskutek oddziaływań elektrostatycznych. Jest to immobilizacja

fizyczna. Enzym może również być immobilizowany chemicznie: tworzyć z nośnikiem

wiązanie kowalencyjne lub być uwięziony w sieci tworzonej przez czynniki sieciujące.

Trzeci rodzaj immobilizacji, immobilizacja mechaniczna, polega na unieruchomieniu

enzymu w matrycy lub jego okapsułkowaniu. Podstawowe metody immobilizacji zostały

przedstawione na Rysunku 6.

Rysunek 6. Główne metody immobilizacji enzymów: A) immobilizacja fizyczna; B) immobilizacja chemiczna; C) immobilizacja mechaniczna.

Immobilizacja fizyczna jest efektem niespecyficznych oddziaływań pomiędzy

enzymem a nośnikiem, które są efektem sił van der Waalsa, oddziaływań elektrostatycznych,

19

oddziaływań hydrofobowych i powstawania wiązań wodorowych. Siła tych oddziaływań jest

w ewidentny sposób zależna od środowiska (siły jonowej medium, odczynu pH, stopnia

rozwinięcia powierzchni nośnika). Pociąga to za sobą łatwość desorpcji enzymu i ograniczoną

trwałość wobec zmieniających się warunków środowiska.

Zdecydowaną zaletą immobilizacji chemicznej nad immobilizacją opartą na

oddziaływaniach niespecyficznych jest jej większa trwałość. Wiązanie kowalencyjne może

być tworzone bezpośrednio pomiędzy grupami funkcyjnymi enzymu i nośnikiem albo

powstawać z udziałem łącznika. Cząsteczki łącznika są niezbędne w procesie sieciowania

(określane są wówczas mianem czynników sieciujących). Spośród metod immobilizacji

mechanicznej na szczególną uwagę zasługuje kapsułkowanie enzymów w sztucznych

liposomach, czyli pęcherzykach lipidowych, co umożliwia łatwą inkorporację enzymu

w błony biologiczne.

IV. Podstawowe informacje o inwertazie

Inwertaza (właściwie β-fruktofuranozydaza, E.C. 3.2.1.26) jest enzymem z klasy

hydrolaz (podklasa: glikozydazy), który katalizuje reakcję rozkładu sacharozy do glukozy

i fruktozy - łatwo przyswajalnych cukrów prostych. U człowieka, na wewnętrznej

powierzchni komórek nabłonkowych wyściełających jelito cienkie, występują dwa typy

enzymów umożliwiających przeprowadzenie dwucukrów do łatwo wchłanialnych cukrów

prostych – oprócz inwertazy, stwierdzono obecność laktazy – enzymu, który katalizuje

reakcję hydrolizy laktozy do glukozy i galaktozy. Z kolei inwertaza obecna w ślinie pszczół,

umożliwia im przeprowadzenie cukrów złożonych obecnych w nektarze kwiatowym do

postaci monocukrów, warunkując tym samym proces wytwarzania miodu.

Inwertaza jest wykorzystywana do celów komercyjnych głównie w przemyśle

spożywczym (w cukiernictwie). Przykładem może być produkcja czekoladek z nadzieniem.

Nadzienie w formie stałej, o dużej zawartości sacharozy i z dodatkiem inwertazy, jest

pokrywane warstwą czekolady. W trakcie kilkudniowego (a czasami nawet

kilkutygodniowego) procesu „dojrzewania” następuje hydroliza sacharozy, prowadząca do

uwolnienia cukrów prostych - w efekcie tego procesu nadzienie zostaje upłynnione.

Do celów przemysłowych, inwertaza jest otrzymywana z komórek drożdży.

Najwyższą aktywność tego enzymu stwierdzono w pH 4.5 i w temperaturze 60°C.

20

ĆWICZENIE 29/30 INSTRUKCJA WYKONANIA Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie procesu ciągłej produkcji cukru inwertowanego będącego mieszaniną glukozy i fruktozy. Proces ten prowadzony jest metodą chemiczną (na złożu jonitowym) lub biokatalityczną (na złożu zawierającym inwertazę drożdżową) w mikroskali w reaktorach kolumnowych z ciągłym dozowaniem roztworu substratu. Integralną częścią ćwiczenia jest wykonanie złoża zawierającego inwertazę unieruchomioną na żelu alginianowym. Osoby wykonujące ćwiczenie badają wpływ rodzaju katalizatora, temperatury oraz objętościowego natężenia przypływu na wydajność procesu inwersji sacharozy. Detekcja glukozy w mieszaninie poreakcyjnej odbywa się metodą wstrzykowej analizy przepływowej FIA (ang. Flow Injection Analysis) z użyciem odczynnika zawierającego oksydazę glukozową oraz peroksydazę (metoda Trindera, nazwa komercyjna zestawu: Glucose GOD-PAP). W trakcie laboratorium osoby, które zgodnie z planem zajęć wykonują ćwiczenie 30, są odpowiedzialne za proces przebiegający w reaktorach kolumnowych, podczas gdy osoby, które wykonują ćwiczenie 29, przygotowują złoże zawierające immobilizowany enzym i przeprowadzają inwersję sacharozy w układzie okresowym. Uczestnicy laboratorium zobowiązani są zapoznać się z przebiegiem obydwu prowadzonych doświadczeń (również z informacjami zawartymi w tym skrypcie) - wyniki eksperymentów omawiane są wspólnie.

Rysunek 1. Schemat zestawu do prowadzenia reakcji inwersji sacharozy w reaktorach kolumnowych z unieruchomionym katalizatorem z zaznaczonym modułem analitycznym.

bioreaktor reaktory chemiczne

krany

produkt wzorzec

woda

roztwór zasilający

pompa zasilająca

reagent

pompa FIA

pętla reakcyjna

odbiór reagenta

odbiór produktu

przepływowa kuwetka optyczna

MODUŁ FIA (WSTRZYKOWEJ ANALIZY PRZEPŁYWOWEJ)

21

Sprzęt Odczynniki Zestaw reaktorów kolumnowych CEU (zestaw zawiera termostat, reaktory, pompę perystaltyczną, układ wstrzykowej analizy przepływowej, komputer z oprogramowaniem) pompa perystaltyczna Butelki 1 L 3 szt. Butelki 100 mL 5 szt. Zlewki 100 mL 5 szt. kolba miarowa 0,5 L 1 szt. pipeta 20,00 mL 1 szt. pompka do pipety 1 szt. cylinder 100 mL 1 szt. cylinder *)500 mL 1 szt. miniaturowy lejek 1 szt. zlewka*) 150 mL 1 szt. zlewka*) 1 L 1 szt. zlewka szklana 1 L 1 szt. zlewka szklana 600 mL 1 szt. zestaw do sączenia próżniowego

roztwór HCl (stęż. 2 M) roztwór sacharozy (stęż. 7,6 g/L) roztwór CaCl2 (stęż. 2M) glukoza odczynnik Trindera (do analizy glukozy) jonity DOWEX alginian sodu inwertaza drożdżowa lub drożdże kwas octowy octan sodu

*sprzęt polipropylenowy, używany tylko do roztworów wodnych Opis obsługi aparatury oraz kolejność wykonywanych czynności – proces przebiegający w reaktorach kolumnowych.

1. Sporządzić następujące roztwory: roztwór A: sacharoza o stężeniu 7,6 g L-1 (3 L) roztwór B: kwas solny 2 M (1 L) roztwór C: glukoza o stężeniu 2,0 g L-1 (500 mL) Z roztworu C sporządzić w kolbce miarowej po 100 mL roztworów glukozy o następujących stężeniach 1,0, 0,75, 0,5 i 0,25 g L-1 i przelać do podpisanych buteleczek o pojemności 100 mL z nakrętkami zawierającymi otwory do wężyków teflonowych. Wszystkie wymienione powyżej roztwory odgazowywać przez 5 minut na myjce ultradźwiękowej. W ten sam sposób odgazować 1 L wody destylowanej.

2. Zapoznać się ze schematem przedstawionym na Rysunku 1 oraz oznaczeniami na Rysunku 2. Sprawdzić ustawienie kranów i prześledzić drogę cieczy, począwszy od naczynia, z którego jest pobierana, przez pompę zasilającą (3), reaktory (4), zawory sterujące kierunkiem cieczy pompowanej do reaktorów i wypływającej z reaktorów (6) aż do naczynia odbierającego produkt (Rysunek 2).

22

Rysunek 2. Schemat zestawu do prowadzenia reakcji w układzie przepływowym - widok z przodu: (1) włącznik główny; (2) panel sterujący; (3) pompa perystaltyczna zasilająca (dozująca substrat); (4) szklane reaktory kolumnowe z płaszczami grzejnymi; (5) trzeci, opcjonalny reaktor z biokatalizatorem; (6) zawory dozujące i odbierające; (7) trójdrożny zawór sterujący wejściem do wstrzykowego analizatora przepływowego (FIA); (8) pompa dozująca reagenty i ciecz nośną do FIA; (9) przepływowa kuweta optyczna; (10) zawór FIA; (11) pętla reakcyjna; (12) kuweta optyczna (tylko wtedy, gdy nie ma zestawu FIA); (13) zawory odpowietrzające; (16) łaźnia termostatu.

3. Włączyć komputer z oprogramowaniem rejestrującym parametry procesu.

4. Zapoznać się z obsługą panelu sterującego (oznaczony jako 2 na Rysunku 2), sposobem regulacji natężenia objętościowego przepływu i innych parametrów procesu. Schemat panelu sterującego przedstawiono na Rysunku 3. Upewnić się, że termostat jest wyłączony (TEMPERATURE CONTROL PUMP CIRCULATOR, przełącznik 3 w pozycji „0”). Podobnie, wyłączona powinna być pompa zasilająca reaktor (FEED PUMP, przełącznik 7a) i pompa zasilająca analizator przepływowy (FIA PUMP, przełącznik 6a)

23

A) B)

Rysunek 3. (A) Schemat panelu sterującego: ekran wyświetlający wartość absorbancji, rejestrowanej w module FIA (1); regulator zerowania absorbancji (2); kontroler termostatu (4); włącznik termostatu (3); ekran wyświetlający temperaturę (5); włącznik pompy FIA (6a); regulacja szybkości pompowania FIA (6b); przycisk maksymalnej prędkości pompowania (6c); włącznik pompy zasilającej reaktory (7a); regulacja szybkości pompowania (7b); gniazdko wyjścia sygnału absorbancji (8). (B) Wygląd ekranu kontrolera termostatu: przyciski umożliwiające wprowadzenie żądanej temperatury (19a-19c).

5. Włączyć zasilanie całego urządzenia (włącznik 1 na Rysunku 2).

6. Ustawić temperaturę termostatu: wcisnąć lewy przycisk (oznaczony jako 19a na Rysunku 3) aż ukaże się napis SP (set point), wtedy posługując się przyciskami 19b i 19c doprowadzić wyświetlaną wartość temperatury do wartości pożądanej.

7. Włączyć termostat (przycisk 3 na Rysunku 3).

8. URUCHOMIENIE REAKTORÓW Końcówkę wężyka pompy zasilającej włożyć do butelki z roztworem 2M HCl. Upewnić się, że wężyk dotyka dna butelki i jest nieruchomy. Sprawdzić drożność układu (zawór zasilający reaktor oraz zawór odprowadzający roztwór z reaktora powinny być otwarte). Podstawić naczynie odbierające roztwór produktu. Włączyć pompę zasilającą reaktor. Po przepompowaniu 400 mL roztworu wykonać czynności opisane w punkcie 15.

9. URUCHOMIENIE MODUŁU ANALITYCZNEGO – sporządzenie krzywej wzorcowej. Wężyki pompy zasilającej FIA (Rysunek 1 i 2) podłączyć do trzech buteleczek zawierających: wodę destylowaną oraz uprzednio przygotowane roztwory: reagenta i glukozy (wzorca) o najniższym stężeniu (0,25 g L-1). Sprawdzić ustawienie kranu (oznaczony jako 7 na Rysunku 2) i ustawić go w pozycji umożliwiającej pobieranie roztworu wzorca. Wężyki z odprowadzeniem roztworów (wychodzące z pętli FIA) włożyć do zlewki zbierającej przereagowane substraty.

1 2

5

6b

4

3

6a 6c

7a

7b

8

24

10. Skontrolować poziomy zanurzenia wężyków teflonowych pobierających roztwory. Włączyć pompę FIA, ustawić odpowiednią szybkość pompowania (Rysunek 3, przyciski 6a i 6b).

11. Przed rozpoczęciem pomiarów absorbancji wzorcowego roztworu glukozy, ustawić pokrętłem 2 (Rysunek 3) wartość absorbancji równą zero. Włączyć komputerową ciągłą rejestrację absorbancji (punkty pomiarowe w odstępie czasu 2s).

12. POMIARY ZAWARTOŚCI GLUKOZY. Przestawić pokrętło pętli FIA z pozycji LOAD do pozycji INJECT. Czynność ta spowoduje zmieszanie roztworu nośnego z roztworem reagenta i roztworem badanym (lub roztworem wzorca). Zasadę działania pętli mieszającej przedstawiono na Rysunku 4. Pokrętło powinno znajdować się w pozycji INJECT przez 60 s, następnie należy je przestawić do pozycji LOAD. Obserwować zmiany absorbancji na wykresie powstającym na monitorze komputera. Zanotować maksymalną wartość absorbancji. Pomiar powtórzyć kilkukrotnie aż do uzyskania powtarzających się wyników.

Rysunek 4. Obieg cieczy w pętli FIA w pozycji LOAD (roztwory nie mieszają się ze sobą) i w pozycji INJECT (trzy roztwory mieszają się ze sobą zawsze w takich samych proporcjach).

13. Zatrzymać pompę FIA. Zamienić roztwór wzorca na roztwór o wyższym stężeniu. Włączyć pompę, odczekać kilka minut i powtórzyć czynności z punktu 12. Wykonać pomiary dla każdego przygotowanego roztworu glukozy. Wykonać również pomiar dla roztworu sacharozy (pobrać roztwór zasilający reaktory, stężenie glukozy powinno wynosić zero).

14.

W programie Excel wykreślić krzywą kalibracyjną (wykres absorbancji w funkcji stężenia glukozy).

15. ZMIANA POMPOWANEJ CIECZY ZASILAJĄCEJ REAKTORY. Skontrolować poziom roztworu HCl zasilającego reaktory. Jeśli ubyło 400 mL, zatrzymać pompę zasilającą (przycisk 7a na Rys. 3). Zamienić butelkę z HCl na butelkę zawierającą

25

odgazowaną wodę destylowaną. Włączyć pompę. Pompować wodę aż roztwór wypływający z reaktorów nie będzie wykazywał odczynu kwaśnego (sprawdzać papierkiem wskaźnikowym). Jeśli wyciek z reaktorów jest obojętny, zmienić roztwór zasilający reaktory – rozpocząć pompowanie roztworu sacharozy. Wyznaczyć natężenie objętościowe przepływu roztworu sacharozy zbierając przez 10 minut roztwór produktu do cylindra o objętości 100 mL- odczytać objętość cieczy i zanotować natężenie przepływu w mL/min.

16. Po upływie 15 minut od czasu rozpoczęcia dozowania roztworu sacharozy zmienić ustawienie kranu (oznaczonego jako 7 na Rysunku 2) w pozycję umożliwiającą pobieranie do analizy roztworu produktu wypływającego z kolumny.Dokonać analizy zawartości glukozy w produkcie reakcji wykonując czynności opisane w punkcie 12. Pomiar powtórzyć kilkukrotnie aż do ustalenia się stałej wartości absorbancji.

17. Obliczyć stężenie glukozy i wydajność procesu inwersji dla danej temperatury i natężenia przepływu. Wyniki przedstawić w postaci: RODZAJ KATALIZATORA: TEMPERATURA REAKCJI: NATĘŻENIE OBJĘTOŚCIOWE PRZEPŁYWU: PRZYCHÓD

[g/godz] ROZCHÓD [g/godz]

sacharoza glukoza

wydajność:

18. Powtórzyć czynności z punktów 16-17 zmieniając temperaturę procesu, rodzaj katalizatora, natężenie objętościowe przepływu lub stężenie surowca. UWAGA: Dla procesu prowadzonego z użyciem immobilizowanej inwertazy, konieczne jest wykonanie czynności z pkt. 20.

19. Bioreaktor kolumnowy przepłukiwany jest tylko wodą destylowaną! Immobilizowana inwertaza wykazuje optymalne działanie w pH 4,8, dlatego roztwór sacharozy powinien być zakwaszony kwasem octowym do pH 4,5-5,5. UWAGA: Roztwór ten może być skierowany tylko do bioreaktora, nie do reaktorów z żywicą jonowymienną.

20. Do opisu ćwiczenia załączyć krzywą kalibracyjną, odczytane wartości absorbancji i obliczone stężenie glukozy przy określonych warunkach reakcji. Sporządzić bilans materiałowy dla jednej godziny ruchu ciągłego dla poszczególnych typów reaktorów (chemicznego, z żywicą jonowymienną oraz biokatalitycznego, z unietuchomioną inwertazą) oraz dla różnych warunków prowadzenia procesu. Obliczyć wydajności dla jednej godziny ruchu ciągłego.

26

Immobilizacja biokatalizatorów w alginianie wapnia.

Jedną z technik unieruchamiania enzymów lub całych komórek jest ich immobilizacja w sieci tworzonej przez polimer (czynnik sieciujący). W trakcie tego ćwiczenia inwertaza jest u nieruchomiona w alginianie wapnia (soli kwasu alginowego). Kwas alginowy jest liniowym polimerem, złożonym z monomerów kwasu D-mannuronowego i L-guluronowego, połączonych wiązaniem β-1-4 glikozydowym (Rysunek 5). W obecności jonów dwuwartościowych (w tym jonów wapnia) następuje wytrącanie alginianu wapnia z jednoczesnym sieciowaniem tego polimeru, prowadzącym do utworzenia trójwymiarowego żelu, w którym mogą zostać uwięzione cząsteczki enzymów bądź całe komórki. Metoda ta jest szeroko stosowana, ponieważ nie prowadzi do uszkodzenia immobilizowanych biokatalizatorów. Przy użyciu alginianu wapnia otrzymuje się złoża, którymi wypełnia się bioreaktory. Ponadto, alginian jest powszechnie używany w produkcji tzw. „sztucznych nasion”, czyli zarodków somatycznych ukrytych w ochronnej kapsułce zbudowanej z polimeru.

Proces unieruchamiania biokatalizatorów w alginianie wapnia polega na wymieszaniu materiału biologicznego z płynnym alginianem sodu, a następnie wkropleniu otrzymanej zawiesiny do roztworu zawierającego jony wapnia.

Rysunek 5. Kwas alginowy – liniowy polimer będący składnikiem ścian komórkowych alg. Instrukcja sporządzenia złoża zawierającego immobilizowany enzym. UWAGA: każda grupa ćwiczeniowa korzysta z preparatu przygotowanego przez poprzednią grupę studencką (ćwiczenie rozpoczyna się od czynności opisanych punktami 6-7, natomiast w trakcie ćwiczenia należy przygotować preparat dla następnej grupy, wykonując czynności z punktów 1-5).

1. Rozpuścić 0,5 g inwertazy w 300 mL wody destylowanej, delikatnie mieszając na mieszadle magnetycznym.

2. Do roztworu inwertazy dodać 15 g alginianu sodowego – mieszać aż do uzyskania jednorodnego, mętnego roztworu (ok. jedną godzinę ).

3. Na mieszadle magnetycznym ustawić zlewkę 1 L, nalać 500 mL 0,2 M roztworu CaCl2, zmontować układ do wkraplania alginianu (wężyk z pompy perystaltycznej powinien być ok. 20 cm ponad lustrem cieczy).

4. Rozpocząć powolne wkraplanie roztworu alginianu sodu zawierającego inwertazę do roztworu chlorku wapnia. Obserwować wytrącanie się perełek alginianu wapnia.

5. Po zakończonym wkraplaniu pozostawić zawiesinę na jeden dzień.

27

6. Zdekantować roztwór CaCl2. Dwukrotnie zalać perełki alginianu (zawierającego unieruchomioną inwertazę) wodą destylowaną (2 ×500 mL), odsączyć.

7. Napełnić bioreaktor kolumnowy złożem zawierającym immobilizowaną inwertazę, uzupełnić wodą destylowaną, a następnie rozpocząć przepłukiwanie złoża wodą destylowaną. Dalej postępować jak w instrukcji dotyczącej pracy na reaktorach przepływowych.

Inwersja sacharozy w układzie okresowym.

W alginianie wapnia można immobilizować całe komórki mikroorganizmów i celem tej części ćwiczenia jest sprawdzenie, czy unieruchomione komórki są nadal aktywne. Komórki drożdży naturalnie wytwarzają inwertazę, zatem skuteczność procesu immobilizacji można ocenić, sprawdzając czy drożdże unieruchomione w alginianie wapnia są w stanie przeprowadzać charakterystyczne dla nich reakcje biochemiczne.

W wyniku hydrolizy sacharozy powstają równomolowe ilości glukozy i fruktozy, tzw. cukier inwertowany. Sacharoza wykazuje dodatnią skręcalność właściwą (+66,5°), podobnie jak glukoza (+53,3°), jednak ujemny znak skręcalności właściwej fruktozy (-133,5°) powoduje, że cały roztwór po hydrolizie ma przeciwny (inwersja) znak skręcalności niż roztwór wyjściowy. W poniższym eksperymencie postęp reakcji hydrolizy sacharozy jest śledzony poprzez monitorowanie zmiany skręcalności optycznej przesączu pobranego znad złoża zawierającego immobilizowane komórki drożdży. Badanie wpływu immmobilizacji na aktywność drożdży składa się z trzech testów. I. Komórki drożdży immobilizowane w alginianie wapnia, traktowane roztworem sacharozy

(właściwe doświadczenie). II. Komórki drożdży immobilizowane w alginianie wapnia, traktowane wodą (kontrola 1). III. Złoże alginianu wapnia (bez drożdży) traktowane sacharozą (kontrola 2). Przebieg doświadczenia: 1. Przygotować 50 mL 2% roztworu alginianu sodu w wodzie, pozostawić na mieszadle

magnetycznym do rozpuszczenia. 2. 3 g chlorku wapnia rozpuścić w 200 mL wody destylowanej. 3. Sporządzić zawiesinę 1 g drożdży w 10 mL ciepłej wody destylowanej. 4. W zlewce 25 mL wymieszać 12 mL alginianu sodu i 3 mL zawiesiny drożdży

(w wariancie III mieszamy 12 mL alginianu sodu z 3 mL wody destylowanej bez dodawania zawiesiny drożdży).

5. Nabrać przy pomocy strzykawki 15 mL zawiesiny otrzymanej w pkt 4, wkraplać powoli (dokładnie po kropli) do 75 mL roztworu chlorku wapnia.. Pozostawić kulki w roztworze chlorku wapnia na około 10 minut, następnie odsączyć i przemyć wodą destylowaną.

6. Przygotować 100 mL 5% roztworu sacharozy. Sprawdzić jego skręcalność optyczną posługując się polarymetrem.

7. Umieścić otrzymane złoża w probówkach, uzupełnić odpowiednim roztworem (wodą lub roztworem sacharozy) do objętości 30 mL.

8. Monitorować przebieg reakcji poprzez pomiar skręcalności optycznej przesączu znad złoża. Pierwszy pomiar przeprowadzić zaraz po uzupełnieniu probówek wodą/sacharozą, kolejne w odstępach 30 minut. Każdorazowo po pomiarze zlewać pobrany do analizy przesącz z powrotem do probówki.

28

Wstrzykowa analiza przepływowa Wstrzykowa analiza przepływowa FIA (ang. Flow Injection Analysis) jest automatyczną metodą analizy, w której próbka pobierana z przepływowego układu reakcyjnego jest automatycznie mieszana z pompowanym w sposób ciągły nośnikiem oraz z reagentem wywołującym reakcję analityczną. W pętli reakcyjnej następuje tworzenie kompleksu lub derywatyzacja substancji do postaci wykrywanej przez detektor (np. spektrofotometrycznie). Idea procesu została przedstawiona na Rysunku 6.

czas

DETEKTOR

PETLAREAKCYJNA

NOSNIK

REAGENT(odczynnik analityczny)

PRODUKT

SUBSTRAT

Rysunek 6. Zasada działania FIA.

Mała część próbki jest wstrzykiwana do nośnika, który jest mieszany z jednym lub kilkoma odczynnikami. Schemat układu mieszającego przedstawiono na Rysunku 7.

Rysunek 7. FIA: wygląd i schemat układu pobierającego i mieszającego reagent, badaną próbkę i roztwór

nośnika. Zasada działania została wyjaśniona na Rysunku 4.

29

Ponieważ reakcja analityczna wymaga dokładnego zmieszania reagentów lub może nie następować od razu, mieszanina przechodzi przez pętlę reakcyjną. Odpowiedni dobór długości pętli reakcyjnej w stosunku do jej średnicy gwarantuje optymalne wymieszanie substratów reakcji. Barwa mieszaniny wypływającej z pętli reakcyjnej jest rejestrowana przez detektor. Odstęp czasu pomiędzy wstrzyknięciem próbki do nośnika a rejestracją zmiany barwy może wynosić od kilkudziesięciu sekund do kilku minut. W metodzie FIA nie jest konieczne osiągnięcie stanu równowagi, o wiele ważniejsze jest, aby mieszanina zawsze docierała do detektora po upływie takiego samego czasu od momentu zmieszania reagentów, dlatego podczas analizy musi być zachowana stała prędkość przepływu wszystkich mieszanych cieczy. Spełnienie tego warunku jest konieczne do zapewnienia powtarzalności i dokładności analizy. Zaletami FIA są: krótki czas trwania analizy, możliwość analizowania procesów w trybie on-line, prowadzenie skomplikowanej analizy (wymagającej mieszania kilku reagentów) metodą ciągłą, prostota czynności wykonywanych przez operatora urządzenia, możliwość prowadzenia wielu analiz w krótkim czasie, niewielkie zużycie odczynników. Dzięki tym zaletom, automatyczna metoda wstrzykowej analizy przepływowej jest wszechstronnie stosowana tam, gdzie wymagana jest duża liczba automatycznych analiz oraz w miejscach, gdzie istnieje konieczność monitorowania parametrów w sposób cykliczny w niewielkich odstępach czasu: do kontroli przebiegu procesów przemysłowych, w laboratoriach medycznych i biologicznych. Zasada oznaczania glukozy Metoda polaga na przeprowadzeniu reakcji enzymatycznej z kolorymetryczą detekcją produktu. W trakcie reakcji glukoza jest utleniana przez oksydazę glukozy (GOD) do glukonolaktonu w obecności tlenu atmosferycznego: GOD glukoza + O2 glukonolakton + H2O2 powstający w tej reakcji nadtlenek wodoru reaguje w obecności peroksydazy (POD) z 4-aminofenazonem i fenolem tworząc 4-(para-benzochino-monoimino)-fenazon: POD 2 H2O2+ 4-aminofenazon + fenol 4-(p-benzochino-monoimino)-fenazon+ 4H2O Produkt tej reakcji ma purpurową barwę i wykazuje maksimum absorbancji w 510 nm. Przy zachowaniu stałości stężenia wszystkich pozostałych reagentów, intensywność zabarwienia jest zależna tylko od zawartości glukozy. Zestaw enzymatyczny używany w ćwiczeniu (GLU, Glukoza GOD-PAP firmy Roche) jest używany w laboratoriach chemii klinicznej do analiz zawartości glukozy w surowicy i osoczu krwi. Zakres pomiarowy wynosi 0,11 – 25 mmol glukozy/L (2-450 mg/dL) Literatura: Trinder P. Determination of Glucose in Blood using Glucose Oxidase with alternative oxygen acceptor. Ann. Clin. Biochem. 1969, 6, 24-27. Tietz N. W. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. Philadelphia, Pa: WB Saunders Company, 1995, 268-273.