ZDZISAWA LIBUDZISZMIKROBIOLOGICZNE I TECHNOLOGICZNE ASPEKTY PROBIOTYKW

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika dzka, Institute of Fermentation Technology and Microbiology, Technical University of Lodz

Probiotykami nazywamy ywe mikroorganizmy, ktre w postaci preparatw farmaceutycznych lub dodane do ywnoci, korzystnie wpywaj na organizm gospodarza poprzez popraw rwnowagi jego ekosystemu jelitowego. Przewd pokarmowy zdrowego czowieka jest zasiedlony przez okoo 1014 komrek mikroorganizmw reprezentujcych a 400-500 rnych gatunkw. Mikroflora ta kolonizuje blisko 200-400m2 powierzchni nabonka jelitowego. Najliczniejsza populacja zamieszkuje jelito grube, gdzie stanowi okoo 40-50% jego treci (29, 30). Ukad jakociowy i ilociowy mikroflory jelitowej zawiera dominujc przewag mikroorganizmw korzystnych dla jego zdrowia i jest do stabilny. Poyteczna rola wielu grup mikroorganizmw przewodu pokarmowego polega ponadto na uczestniczeniu w trawieniu pokarmw spoywanych przez czowieka, syntezie niektrych witamin, rozkadzie substancji toksycznych, w tym rwnie niektrych substancji rakotwrczych czy prekursorw substancji rakotwrczych. Niektre mikroorganizmy przewodu pokarmowego zdolne s do stymulacji systemu immunologicznego czowieka. Bakterie endogenne przewodu pokarmowego s ponadto konkurencyjne w stosunku do mikroorganizmw chorobotwrczych.W typowej mikroflorze zdrowego, dorosego czowieka liczbowo dominujcymi s gatunki bakterii z rodzaju Bacteroides, stanowice okoo 1011 komrek/g treci jelit. Poza nimi znajduj si rwnie w duych ilociach bakterie z rodzajw Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Escherichia czy Clostridium. Liczba tych bakterii, zalenie od gatunku, siga od 5x108 do 1010/g kau (Rys.1). Stanowi a 99% biomasy jelit czowieka. S to bakterie wzgldnie lub bezwgldnie beztlenowe, fermentujce rda wgla z wydzieleniem rnego rodzaju niskoczsteczkowych kwasw tuszczowych (SCFA). Produkuj rwnie wiele zwizkw istotnych ywieniowo dla czowieka (11, 17, 29, 30). Liczebno dominujcej mikroflory u poszczeglnych ludzi jest jednak znaczco zrnicowana (tab. 1).Ekosystem jelitowy czowieka moe ulega zmianie, a nawet zniszczeniu, jako wynik leczenia chemioterapeutykami, pod wpywem radioterapii, infekcji wirusowych czy bakteryjnych. Ukad mikroflory jest take determinowany warunkami rodowiskowymi, stanem zdrowia, stresem psychicznym oraz cechami osobniczymi czowieka. Bardzo istotny wpyw wywiera rwnie rodzaj diety i jej stan mikrobiologiczny (rys. 2). Drobnoustroje chorobotwrcze dostajce si do przewodu pokarmowego wraz ze spoywan ywnoci lub w efekcie nieprzestrzegania warunkw higieny (Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, enterpatogenne szczepy Escherichia coli czy niektre gatunki Bacillus i Clostridium) mog rozmnaa si lub nawet zasiedla bony luzowe jelit, powodujc rnego rodzaju zatrucia pokarmowe. Tworz ponadto metabolity toksyczne dla czowieka oraz enzymy, ktre mog by odpowiedzialne za powstawanie substancji kancerogennych lub przeksztacanie substancji prokancerogennych w kancerogenne. Liczba mikroorganizmw chorobotwrczych w przewodzie pokarmowym zdrowego czowieka jest z reguy niska, kontrolowana przez pozostae mikroorganizmy i nie stanowi istotnego zagroenia dla jego zdrowia. Tak liczny i rnorodny zesp mikroorganizmw jelitowych czowieka prezentuje ogromny potencja katalityczny w organizmie, ktrego aktywno moe nie zarwno korzyci jak i moe stanowi zagroenie dla zdrowia. Jako niezmiernie wane dla poprawy zdrowia czowieka, oddziaujce zatem na niego probiotycznie, uznaje si bakterie fermentacji mlekowej. Zmniejszony udzia tych bakterii w przewodzie pokarmowym powoduje u ludzi rne objawy, poczwszy od uczucia wzdcia do powanych kopotw trawiennych, stanw chorobowych przewodu pokarmowego i wreszcie do pogorszenia stanu zdrowia czowieka. Podstawy naukowe, takich stwierdze, pooy jednak dopiero w pierwszych latach XX wieku, laureat nagrody Nobla, Ilia Miecznikow. Miecznikow dowodzi, e obecno bakterii mlekowych w przewodzie pokarmowym, w odpowiednio wysokiej liczbie, korzystnie dziaa na zdrowie gospodarza. Efekt ten jest wynikiem regulacji skadu mikroflory jelitowej. Od tego czasu obserwuje si rozwj bada charakteryzujcych zesp mikroflory jelitowej czowieka i jej wpywu na zdrowie, jak rwnie rozwj produkcji nowych wyrobw zawierajcych korzystne dla zdrowia bakterie lub substancje stymulujce ich rozwj. Do bakterii mlekowych zaliczamy gramdodatnie ziarniaki oraz paeczki z rodzajw Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Enterococcus,Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella. Ze wzgldu na produkcj kwasu mlekowego i podobne rodowiska wystpowania do bakterii mlekowych ostatnio zalicza si rwnie rodzaj Bifidobacterium. Bakterie fermentacji mlekowej stanowi wic niejednorodn diagnostycznie grup, ktrej wspln cech jest zdolno beztlenowej fermentacji sacharydw. Bakterie te wykorzystuj zarwno cukry proste, disacharydy jak i niektre oligo- i polisacharydy jako rda wgla. W wyniku fermentacji produkuj od 0.6 do 3% kwasu mlekowego. Zalenie od gatunku bakterii, ale rwnie od warunkw hodowli, wytwarzaj kwas L(+) lub D(-) mlekowy. Kwas L(+) mlekowy, jako identyczny z powstajcym w miniach, jest w peni metabolizowany przez czowieka. Bakterie mlekowe toleruj jednoczenie niskie pH (ok. 3-4 jednostki). Optymalne temperatury ich wzrostu wynosz 20-28oC (gatunki mezofilne) i 37-45oC (gatunki termofilne). Naturalnym rodowiskiem wystpowania bakterii mlekowych poza przewodem pokarmowym czowieka i zwierzt s roliny, mleko oraz bony luzowe jamy ustnej i drg rodnych.Bakterie fermentacji mlekowej s szeroko wykorzystywane w wytwarzaniu ywnoci fermentowanej, nadajc produktom specyficzny smak i aromat oraz, dziki produkcji tzw. substancji antagonistycznych, chroni go przed rozwojem mikroorganizmw zanieczyszczajcych surowce, w tym rwnie patogennych. Te konserwujce waciwoci bakterii mlekowych s znane od tysicy lat i wykorzystywane przez czowieka. Surowcami do produkcji ywnoci fermentowanej mog by warzywa, mleko, miso jak i rne owoce. Modyfikacj (wzbogacenie) mikroflory jelitowej w kierunku bakterii korzystnie oddziaujcych na organizm czowieka powinno si prowadzi poprzez stosowanie odpowiednich preparatw lub produktw ywnociowych zawierajcych ywe bakterie probiotyczne, szczeglnie bakterie fermentacji mlekowej nalece do rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium.Bakterie z rodzaju Lactobacillus obejmuj 103 gatunki, z ktrych grupa acidophilus, casei, paracasei, rhamnosus jest charakterystyczn dla jelit i std stanowi doskonae szczepy proponowane do skadu preparatw i produktw probiotycznych. Rodzaj Bifidobacterium zawiera 32 gatunki, pogrupowane w oparciu cechy metaboliczne i oryginalno ekologiczn. S to mikroorganizmy wystpujce gwnie w przewodzie pokarmowym czowieka i zwierzt. W organizmach ludzi bytuje naturalnie 14 gatunkw tych paeczek. Bifidobakterie stanowi gwn, a nieraz jedyn mikroflor jelitow niemowlt karmionych tylko mlekiem matki i znaczn cz drobnoustrojw zasiedlajcych jelito grube ludzi starszych. Liczba bfidobakterii w jelicie grubym wynosi rednio 1.6x1010 komrek, jednak zalenie od czowieka moe si waha od 8104 do 2.51013. Ilo bakterii z rodzaju Lactobacillus jest tylko nieznacznie nisza i wynosi rednio 4109, w wahaniach od 4104 do 3.21012 komrek (4, 9). Udzia ilociowy tych bakterii w ekosystemie jelitowym jest wic bardzo zmienny i czsto nie wystarczajcy dla zapewnienia waciwego ukadu ekosystemu jelitowego. Nie wszystkie jednak bakterie mlekowe nalece do tych rodzajw wywouj w organizmie czowieka jednakowo nasilony efekt poprawy zdrowia. Waciwoci te s bowiem zwizane ze szczepem, a nie gatunkiem bakterii. Poszukiwania i badania w wielu orodkach naukowych doprowadziy do pozyskania zaledwie kilku (kilkunastu) szczepw probiotycznych, o udokumentowanych klinicznie waciwociach. Kryteria ich selekcji obejmuj aspekty bezpieczestwa, funkcjonalne i technologiczne. Bezpieczestwo szczepu jest okrelone jego pochodzeniem, brakiem powizania z kulturami chorobotwrczymi oraz profilem opornoci na antybiotyki. Aspekty funkcjonalne dokumentuj ich zdolno przeycia w przewodzie pokarmowym, dziaanie immunomodulacyjne, korzystny efekt w mutagenezie kaowej. Szczepy probiotyczne musz spenia ponadto wymagania stawiane przez technologie ich produkcji oraz by zdolne do przeycia i zachowania swoich uzdolnie podczas przechowywania i dystrybucji gotowego wyrobu. List najcenniejszych kultur probiotycznych zamieszczono w tabeli 3. Szczepy te stosowane s ju w wielu krajach jako dodatki do ywnoci lub jako preparaty farmaceutyczne. Udokumentowano w licznych badaniach naukowych (3, 12, 18, 20, 21, 24, 26, 31), e szczepy probiotyczne przywracaj naturalny, waciwie funkcjonujcy ukad mikroflory jelitowej, hamuj rozwj wielu mikroorganizmw chorobotwrczych, zmniejszaj czsto wystpowania biegunek podrnych, agodz przebieg i skracaj czas trwania niektrych biegunek bakteryjnych i wirusowych (np. wywoanych przez Clostridium difficile, Shigella, Salmonella, enterotoksyczne szczepy Escherichia coli czy rotawirusy), zapobiegaj wystpieniu lub agodz przebieg biegunek poantybiotykowych, zmniejszaj nasilenie biegunek popromiennych, likwiduj lub zmniejszaj objawy nietolerancji laktozy, dziaaj hipocholesterolemicznie, mog dziaa leczniczo w encefalopatii wtrobowej, a take normalizuj zaburzenia motoryki jelit u ludzi w podeszym wieku. Interesujce s take badana dokumentujace antagonizm bakterii probiotycznych w stosunku do Helicobacter pylori, bakterii zwizanej z powstawaniem wrzodw odka i dwunastnicy (2, 10).Bakterie probiotyczne wspomagaj specyficzne i niespecyficzne mechanizmy obronne czowieka i zwierzt. Badania wykazay, e dzienne wzbogacenie diety w 109-1012 komrek bakterii probiotycznych ju po kilku tygodniach moe spowodowa wzrost liczby naturalnych komrek bjczych w surowicy krwi, zwikszy aktywno makrofagw i limfocytw. Stwierdzono ponadto zwikszenie poziomu interferonu g i immunoglobuliny A w surowicy krwi. Pojawiy si rwnie informacje dokumentujce, e immunomodulacyjne dziaanie bakterii mlekowych moe dodatkowo zmniejsza reakcje uczuleniowe u ludzi. Wyjania si to zjawisko wzrostem produkcji interferonu g, ktry przeciwdziaa syntezie immunoglobulin E, aktywnych w reakcjach alergicznych (12). Mechanizmy aktywnoci przeciwnowotworowej bakterii mlekowych wynikaj z hamowania w jelitach rozwoju bakterii syntetyzujcych enzymy katalizujace przemiany prekursorw zwizkw kancerogennych do kancerogennych, a take metabolizowania bd wizania (usuwania) zwizkw rakotwrczych pochodzcych z diety lub tworzonych przez bakterie chorobotwrcze w jelitach (19). Udokumentowano ponadto, e bakterie mlekowe zdolne s do wykorzystywania (wizania) nitrozoamin i niektrych innych substancji mutagennych, np. azobarwnikw, mikotoksyn czy pirolizatw aminokwasw (1, 15). W badaniach na zwierztach wykazano take, e mog hamowa rozrost niektrych komrek nowotworowych, np. nowotworu puchliny brzusznej, misaka Sarkoma oraz biaaczki.Szczepy bakterii probiotycznych, aby mogy w stanie ywym dotrze do jelit i speni tam swoj korzystn rol, musz by odporne na wysok kwasowo soku odkowego i obecn w dwunastnicy . Ze wzgldu na rosnc wiadomo roli ukadu mikroflory jelitowej dla zachowania zdrowia czowieka obserwuje si w ostatnich latach bardzo intensywny rozwj produkcji nowych rodzajw ywnoci fermentowanej, zarwno pochodzenia zwierzcego (mleko fermentowane bakteriami probiotycznymi) jak i rolinnego. ywno taka jest kwalifikowana do ywnoci funkcjonalnej, zatem wnoszcej poza efektem odywczym korzystny wpyw na okrelone funkcje organizmu, prowadzc do poprawy stanu zdrowia i dobrego samopoczucia czowieka lub redukowania ryzyka zachorowania. W rozpatrywaniu terapeutycznych wartoci probiotycznych produktw ywnociowych naley jednak pamita, e musi zawiera dostateczn liczb ywych i aktywnych komrek w chwili spoycia. Dla ywnoci funkcjonalnej przyjmuje si minimaln liczb ywej mikroflory probiotycznej wynoszc 105-106 komrk/ml lub g; wykazano bowiem, e dla uzyskania wyranych efektw zdrowotnych niezbdne jest minimalne spoywanie ok. 108 - 109 komrek ywych mikroorganizmw dziennie w mleku fermentowanym (11). Badania kliniczne dotyczce korzystnego dziaania produktw probiotycznych dla zdrowia czowieka s obecnie bardzo intensywnie prowadzone w wielu krajach, w tym rwnie w midzynarodowych projektach badawczych. Wyniki tych prac s publikowane w renomowanych czasopismach naukowych i powinny w peni wyjani mechanizmy dziaania bakterii probiotycznych.Wykorzystanie wiedzy na temat zespou mikrobiocenozy przewodu pokarmowego, udokumentowanie w nim korzystnej funkcji bakterii probiotycznych nabiera coraz wikszego znaczenia w uprzemysowionym wiecie, szerzcych si tzw. chorobach cywilizacyjnych i starzejcych si spoeczestwach. Spoywanie coraz wikszej iloci ywnoci wstpnie przygotowanej (tzw. fast food), zawierajcej czsto zbyt duo tuszczy, a za mao warzyw jest rwnie niewtpliwie czynnikiem, ktry niekorzystnie modyfikuje zesp mikroflory jelitowej czowieka. W przetwrstwie mleczarskim szczepy bakterii probiotycznych wprowadzane s do skadu tradycyjnych szczepionek przeznaczonych do produkcji napojw fermentowanych, serw twarogowych czy te lodw i mroonych deserw, bd te stanowi wyczn mikroflor odpowiedzialn za proces fermentacji. Najwicej bada i nowo opracowanych technologii z uyciem szczepionek jelitowych obserwuje si dla mlecznych napojw fermentowanych. Mleczne napoje fermentowane otrzymane w wyniku fermentacji z udziaem szczepw jelitowych okrelane s jako nietradycyjne (non-traditional) lub nowe (nowej generacji) mleczne napoje fermentowane (new fermented milks). W przypadku zastosowania bakterii jelitowych cznie ze szczepionkami tradycyjnymi otrzymane w wyniku fermentacji nowe produkty fermentowane przyjto kwalifikowa jako napoje II generacji, natomiast produkowane wycznie z wykorzystaniem szczepw jelitowych jako napoje III generacji (5, 7, 28).Szczeglnie intensywny rozwj produkcji nowych napojw fermentowanych jest obserwowany w ostatnim dziesicioleciu, i produkty tego typu, zalenie od kraju stanowi od kilku do kilkudziesiciu procent produktw fermentowanych (14, 25, 32) . Nazwy tych napojw maj z reguy aspekt komercyjny, podkrelajcy zdrowotne wartoci takich produktw. Przedrostki Bio- s aluzj do naturalnego pochodzenia produktu (Biojogurt, Biodrink, Biogarde, Biokys, Biobest i inne), przedrostek Sano odnosi si do zdrowia (Sanoyogurt), Acti- produkt o okrelonej aktywnoci (Actimel, Actifit) lub te maj na celu zaznaczenie rodzaju mikroflory, ktra w tym produkcie jest odpowiedzialna za fermentacj (mleko acidofilne, mleko bifidusowe itp.).Warunkiem wartoci zdrowotnej takich produktw jest obecno ywych, o udokumentowanych cechach probiotycznych, bakterii Lactobacillus lub Bifidobacterium na poziomie nie niszym ni 106 komrek/ml.Produkty fermentowane bakteriami jelitowymi maj inny smak ni napoje tradycyjne, s agodnie kwane i zazwyczaj o niezdecydowanym aromacie. Takie cechy organoleptyczne mog by nieakceptowane przez konsumentw, dlatego te czsto koryguje si smak poprzez dodatek zi, aromatw, dosadzanie, jak rwnie zwikszajc zawarto suchej masy mleka. W najnowszych produktach fermentowanych proponuje si dodatek odpowiednich, tzw. prebiotycznych sacharydw, np. laktulozy, fruktooligosacharydw czy galaktooligosacharydw, selektywnie stymulujcych rozwj bifidobakterii w przewodzie pokarmowym. Nie ma w tej chwili ju wtpliwoci, e mikroflora jelitowa i jej podana modyfikacja z wykorzystaniem preparatw i produktw probiotycznych moe chroni przed schorzeniami jelitowymi oraz moe wpywa na ogln popraw zdrowia gospodarza.Nie ma rwnie wtpliwoci, e niektre sacharydy poprzez stymulacj wzrostu bakterii probiotycznych mog odgrywa istotn rol w funkcjonowaniu przewodu pokarmowego, a szczeglnie jelita grubego. Spoywanie ywnoci probiotycznej i prebiotycznej moe wic zabezpieczy czowieka, przynajmniej czciowo, przed wieloma, tzw. chorobami cywilizacyjnymi oraz poprawi kondycj ludzi w podeszym wieku.Oceniajc zachowanie konsumentw zauwaa si wyrane trendy spoywania ywnoci, ktra jest korzystna dla zdrowia, mona zatem rokowa, e produkty nowych generacji w najbliszych latach stan si dominujcymi na rynku napojw fermentowanych.

Literatura1.Burns A.J., Rowland I.R.: Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics. Curr. Issues Intest. Microbiol., 2000, 1, 13-24

2.Coconnier M.-H., Lievin V., Hemery E., Servin A.L.: Antagonistic activity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 4573-4580

3.Crittenden R.G.: Prebiotics. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 141-156

4.Cummings J.H.: The large intestine in nutrition and disease. Ed. by the Institute Danone, 1997, 1-155

5.Drissen F.M.: New technologies for fermented milks. Bulletin IDF No 277, 1992, 4-16

6.Dunne C., Murphy L., Flynn S. i wsp.: Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models and in human clinical trials. Antonie van Leeuwenhoek, 1999, 76, 279-292

7.Fooks L.J., Fuller R., Gibson G.R.: Prebiotics, probiotics and human gut microbiology. Int. Dairy J., 1999, 9, 53-61

8.Holzapfel W.H., Schillinger U.: Introduction to pre- and probiotics. Food Res. Int. 2002, 35, 109-116

9.Hunger W., Peitersen N.: New technical aspects of the preparation of starter cultures. Bulletin IDF No 277, 1992, 17-21

10.Kabir A.M.A., Aiba Y., Takagi A., Kamiya S., Miwa T., Koga Y.: Prevention of Helicobacter pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model. Gut 1997, 41, 49-55

11.Kleessen B., Bezirtzoglou E., Matto J.: Culture-based knowledge on biodiversity, development and stability of human gastrointestinal microflora. Microb. Ecol. Health Dis., 2000, 12, suppl. 2, 53-63

12.Koebnick C., Wagner I., Ising K., Stern U.: Die Wirkung eines probiotischen Getranks auf gastrointestinale Symptome und das Befinden von Patienten mit chronischer Obstipation. Ernahrungs-Umschau, 2001, 48, 392-396

13.Lee C.H., Salminen S.: The coming age of probiotics. Trends Food Sci. Technol., 1997, 6, 241-245.

14.Lourens-Hattingh A., Viljoen B.C.: Yogurt as probiotic carrier food. Int. Dairy J., 2001, 11, 1-17

15.McCracken V.J., Gaskins H.R.: Probiotics and the immune system. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 85-112

16.O`Brien J., Crittenden R., Ouwehand A.C., Salminen S.: Safety evaluation of probiotics. Trends Food Sci. Technol., 1999, 10, 418-424

17.O`Sullivan M.G., Thornton G., O`Sullivan G.C., Collins J.K.: Probiotic bacteria: myth or reality? Trends Food Sci. Technol., 1992, 3, 309-314

18.Pathmakanthan S., Meance S., Edwards C.A.: Probiotics: A review of human studies to date and methodological approaches. Microb. Ecol. Health Dis., 2000, 12, suppl. 2, 10-30

19.Rafter J.: The role of lactic acid bacteria in colon cancer prevention. Scand. J. Gastroenterol., 1995, 30, 497-502

20.Reid G.: Testing probiotics in clinical trials. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 129-140

21.Rolfe R.D.: The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. J. Nutr. 2000, 130, 396S-402S

22.Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J., Mattila-Sandholm T.: Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotechnol., 2000, 84, 197-215

23.Salminen S.: Uniqueness of probiotic strains. Nutr. Newsletter IDF No 5, 1996, 18-19

24.Salminen S., Ouwehand A., C., Isolauri E.: Clinical application of probiotic bacteria. Int. Dairy J., 1998, 8, 563-572

25.Sanders M.E., Huis in`t Veld J.: Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues. Antonie van Leeuwenhoek, 1999, 76, 293-315

26.Sanders M.E.: Consideration for use of probiotic bacteria to modulate human health. J. Nutr. 2000, 130, 384S-390S

27.Saxelin M., Korpela R.: Lactobacillus GG products with clinical documentation. Nutr. Newsletter IDF 1996, No 5, 35

28.Tamime A.Y., Marshall V.M. & Robinson R.K.: Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria. J. Dairy Sci., 1995, 62, 151-187

29.Tannock G.: A fresh look at the intestinal microflora. (w:) Probiotics: A critical review. red. Tannock G, Horizon Scientific Press, UK, 1999, 5-14

30.Tannock G.W.: Studies of the intestinal microflora: a prerequisite for the development of probiotics. Int. Dairy J., 1998, 8, 527-533

31.YCIMR, Yakult Central Institute for Microbiological Research (red.): Lactobacillus casei strain Shirota intestinal flora and human health. Yakult Honsha Co., Ltd., Tokyo, 1999, 1-288

32.Ziemer J.C., Gibson G.R.: An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspectives and future strategies. Int. Dairy J., 1998, 8, 473-479

Tabela 1. Liczebno dominujcej mikroflory przewodu pokarmowego czowieka (wg 32)

MikroorganizmyZakres (log liczby kom./g s.m.)Bacteroides EubacteriumBifidobacteriumClostridiumLactobacillusRuminococcusPeptostreptococcusPeptococcusStreptococcus (beztlenowe)MethanobrevibacteriumDesulfovubrio9.2-13.55.0-13.34.9-13.43.3-13.13.6-12.54.6-12.83.8-12.65.1-12.97.0-12.37.0-10.35.2-10.9

Tabela 2. Kryteria doboru szczepw probiotycznych (wg 7, 8, 16, 22)

KryteriumWymagane waciwociBezpieczestwoPochodzenie od ludziIzolowany z przewodu pokarmowego zdrowych osobnikwHistoria bezpiecznego stosowaniaBrak informacji o powizaniu z chorobami infekcyjnymi serca lub przewodu pokarmowegoBrak zdolnoci rozszczepiania kwasw ciowychBrak dziaania ubocznegoBrak genw opornoci na antybiotyki zlokalizowanych na elementach niestabilnychFunkcjonalnoKonkurencyjno w stosunku do mikroflory zasiedlajcej ekosystem jelitowyZdolno do przeycia, wzrostu i aktywnoci metabolicznej w miejscu przeznaczeniaOdporno na sole ci (moliwo przeycia w jelitach) Odporno na kwasowo soku odkowegoKonkurencyjno w stosunku do blisko spokrewnionych gatunkwAktywno antagonistyczna w stosunku do patogenw, takich jak Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Helicobacter pyloriOdporno na bakteriocyny, kwasy i inne zwizki antagonistyczne produkowane przez endogenn mikroflor zasiedlajc ekosystem jelitowyAdherencja i zdolno kolonizacji okrelonych miejsc w organizmie czowieka, lub odpowiednio dugi czas przeyciaPrzydatno technologicznaatwo produkcji duej iloci biomasy, wysoka produktywno hodowliOdporno na procedury utrwalania starterw (zamraanie, liofilizacja, przechowywanie)ywotno i stabilno podanych cech bakterii w czasie przygotowania i dystrybucji produktw probiotycznychWysoka przeywalno przechowalnicza bakterii w gotowym produkcieZapewnienie podanych cech organoleptycznych gotowych produktwOdporno na bakteriofagiGenetyczna stabilno

Tabela 3. Szczepy o waciwociach probiotycznych (modyfikowane wg 6, 23, 27)

Szczep Efekty zdrowotne (badania kliniczne)Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53 013)

Kolonizacja przewodu pokarmowego, ochrona przed biegunkami po antybiotykoterapii, leczenie i zapobieganie biegunkom rotawirusowym, leczenie powracajcych biegunek spowodowanych przez Clostridium difficile, ochrona przed ostrymi biegunkami, leczenie choroby Crohna i dziecicego artretyzmu reumatoidalnego, waciwoci antagonistyczne w stosunku do bakterii wywoujcych prchnic zbwLactobacillus casei Shirota Ochrona przed zaburzeniami jelitowymi, leczenie biegunek rotawirusowych, utrzymywanie w rwnowadze mikroflory jelitowej, obnianie aktywnoci enzymw fekalnych, ochrona przed mutagenami pokarmowymi, pozytywne efekty w leczeniu raka pcherza moczowego, wspomaganie ukadu odpornociowego we wczesnych stadiach raka okrnicyLactobacillus casei DN 114 001Stymulacja ukadu odpornociowego, zapobieganie i leczenie infekcji jelitowych, dobra przeywalno w odku i dwunastnicy, zmniejszenie czstoci i skrcenie czasu trwania ostrych biegunek u dzieci; Lactobacillus acidophilus NCFB 1748Obnienie aktywnoci enzymw fekalnych, zapobieganie biegunkom po radioterapii, leczenie obstrukcjiLactobacillus johnsonii La1 (NCC533)Stymulacja ukadu odpornociowego, adhezja do komrek ludzkiego jelita, pozytywne efekty w leczeniu nieytw przewodu pokarmowegoBifidobacterium breve YakultOchrona przed mutagenami pokarmowymi, utrzymanie w rwnowadze mikroflory jelitowej, ochrona przed biegunkamiBifidobacterium bifidumLeczenie biegunek rotawirusowych, utrzymanie w rwnowadze mikroflory jelitowejLactobacillus gasseri ADHObnienie aktywnoci enzymw fekalnych, dobra przeywalno w przewodzie pokarmowym Lactobacillus acidophilus NCFMObnienie aktywnoci enzymw fekalnych, dobra przeywalno w przewodzie pokarmowym

Szkodliwy wpyw Korzystny wpyw na zdrowie czowieka 12 na zdrowie czowieka

Bacteroides

Eubacterium

Produkcja toksyn, substancji kancerogennych, szkodliwych enzymw;

Hamowanie szkodliwych mikroorganizmw, dziaanie immunomodulacyjne, obnienie aktywnoci metabolicznej; Bifidobacterium

9 Lactobacillus

Escherichia coli

Clostridium 7

Enterococcus

Veillonella

5 Staphylococcus

Proteus 3

Ps. aeruginosa

log jtk/g; log CFU/g

Rys. 1. Ukad mikroflory jelitowej (modyfikowane wg 17)

Czynniki rodowiskoweCzowiek

Odporno czowiekaNabonek jelitowyPankreatyna i inne soki trawienneEnzymyKwasy ciowePerystaltyka jelitPH jelitPotencja redoxWiek

Region zamieszkaniaKlimatNawyki kulturowe

Pe

Stres

Choroby

DietaAntybiotyki i inne lekiObce mikroorganizmy

Ekosystem jelitowy

Skad i metabolizm mikroflory jelitowejZalenoci ekologiczne (antagonizm, synergizm)

Rys. 2. Czynniki wpywajce na ukad mikroflory jelitowej czowieka (modyfikowane wg 11)

Streszczenie

Probiotyki s definiowane jako ywe mikroorganizmy, ktre po spoyciu wywieraj korzystny wpyw na organizm czowieka poprzez popraw rwnowagi mikroflory jelitowej. Wikszo szczepw o udokumentowanych waciwociach zdrowotnych naley do rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Cechy probiotyczne bakterii nie s jednak zwizane z rodzajem bakterii, ale z nielicznymi, specjalnie wyselekcjonowanymi szczepami danego gatunku. Kryteria ich selekcji obejmuj aspekty bezpieczestwa, funkcjonalne i technologiczne. Bezpieczestwo szczepu jest okrelone jego pochodzeniem, brakiem powizania z kulturami chorobotwrczymi oraz profilem opornoci na antybiotyki. Aspekty funkcjonalne dokumentuj ich zdolno przeycia w przewodzie pokarmowym, dziaanie immunomodulacyjne, korzystny efekt w mutagenezie kaowej. Szczepy probiotyczne musz spenia ponadto wymagania stawiane przez technologie ich produkcji oraz zdolno przeycia i zachowania swoich uzdolnie podczas przechowywania i dystrybucji gotowego wyrobu. W cigu ostatnich dziesiciu lat przeprowadzono wiele bada dokumentujcych korzystne efekty dziaania probiotykw na zdrowie czowieka. Podkrela si ich znaczenie w stymulacji systemu odpornociowego czowieka, utrzymywaniu i przywracaniu waciwego ukadu endogennej mikroflory jelitowej, obnieniu aktywnoci enzymw fekalnych uczestniczcych w przeksztacaniu substancji prokancerogennych w kancerogenne, Udokumentowano w licznych badaniach naukowych, e szczepy probiotyczne przywracaj naturalny, waciwie funkcjonujcego ukad mikroflory jelitowej, hamuj rozwj wielu mikroorganizmw chorobotwrczych, zmniejszaj czsto wystpowania biegunek podrnych, agodz przebieg i skracaj czas trwania niektrych biegunek bakteryjnych i wirusowych (np. wywoanych przez Clostridium difficile, Shigella, Salmonella, enterotoksyczne szczepy Escherichia coli czy rotawirusy), zapobiegaj wystpieniu lub agodz przebieg biegunek poantybiotykowych, zmniejszaj nasilenie biegunek popromiennych, likwiduj lub zmniejszaj objawy nietolerancji laktozy, dziaaj hipocholesterolemicznie, mog dziaa leczniczo w encefalopatii wtrobowej, a take normalizuj zaburzenia motoryki jelit u ludzi w podeszym wieku. Interesujce s take badana dokumentujace antagonizm bakterii probiotycznych w stosunku do Helicobacter pylori, bakterii zwizanej z powstawaniem wrzodw odka i dwunastnicy. Probiotyczne bakterie fermentacji mlekowej s tradycyjnie powizane z produktami mleczarskimi, ktre s uwaane za najlepsze ich noniki. Artyku omawia podstawy teorii probiozy, korzyci pynce ze stosowania bakterii probiotycznych oraz wykorzystanie tych bakterii w produkcji mlecznych napojw fermentowanych o waciwociach.

Summary

Probiotics are defined as the viable microorganisms that exhibit a beneficial effect on the health of the host by improving its intestinal microbial balance. Promising probiotic strains include the members of genera Lactobacillus and Bifidobacterium. Several aspects, including safety, functional and technological characteristics, have to be taken into consideration in the selection process of probiotic microorganisms. Safety aspects include specifications such as origin, non-pathogenicity and antibiotic resistance characteristics. Functional aspects include viability and persistence in the gastrointestinal tract, immunomodulation, antagonistic and antimutagenic properties. Probiotic strains must be able to be manufactured under industrial conditions and have to survive and retain their functionality during storage of the products. During the past ten years, a large number of extensive scientific research has been carried out to demonstrate the beneficial effects of probiotic lactic acid bacteria in humans. The main reported beneficial effects including: enhanced immune system, balancing of colonic microbiota, reduction of fecal enzymes involved in cancer initiation, tratment of diarrhea associated with travel and antibiotic therapy, control of rotavirus and Clostridium difficile induced colitis and prevention of ulcers related to Helicobacter pylori. Probiotics are also implicated in the reduction of serum cholesterol, the antagonism against food-borne pathogens and tooth decay organisms as well as the amelioration of lactose malabsorption symptoms. Probiotic cultures have been associated historically with cultured milks and dairy products, from which there is substantial evidence for positive effects on human health and general well-being. Future challenges include the incorporation of probiotics in combination with suitable prebiotic substrates to enhance the efficacy of the preparation for clinical use. The paper will cover the rationale of the probiotic theory, several health targets for probiotic bacteria and some probiotic products, mainly dairy products.

LUC DE VUYSTHAMUJCE DZIAANIE PROBIOTYCZNYCH BAKTERII KWASU MLEKOWEGO

Research Group of Industrial Microbiology,Fermentation Technology and Downstream Processing,Department of Applied Biological Sciences.Vrije Univesiteit Brussel, Pleinlaan 2, B-1950 Brussels, BelgiumTel: +32 2 629 32 45Fax: +32 2 629 27 20e-mail: ldvuyst@vub.ac.be

Wstp

Bakterie kwasu mlekowego s tradycyjnie stosowane do produkcji ywnoci fermentowanej, takiej jak: sery, jogurty, fermentowane kiebasy, ciasta na zakwasie, kapusta kiszona, piwo, wino. Wynika to z ich wpywu na waciwoci sensoryczne ywnoci, w ktrej s obecne oraz hamowania procesw zepsucia ywnoci. Mikroorganizmy te s odpowiedzialne za wstpne zakwaszanie surowcw poprzez produkcj kwasu mlekowego (szczepy homo- i heterofermentatywne) i kwasu octowego (szczepy heteroferentatywne). Kwasy organiczne, zwaszcza niezdysocjowane, posiadaj aktywno antymikrobiologiczn. Na ich hamujce dziaanie wpywa take obecno innych kwasw organicznych (np. kwasu mrwkowego), etanolu, dwutlenku wgla, diacetylu, nadltenku wodoru, bakteriocyn i antybiotykw.Ostatnio duo uwagi powica si prozdrowotnym waciwociom niektrych szczepw bakterii kwasu mlekowego (LAB), ktre s nazywane probiotykami. Probiotyki s spotykane na rynku w postaci preparatw ywych komrek lub jako ywno zawierajca w swym skadzie ywe bakterie. Spoycie odpowiedniej iloci takiej ywnoci ma dobroczynny wpyw na zdrowie czowieka. Szczepy posiadajce waciwoci probiotyczne nale do rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. S dodawane do jogurtw i napojw mlecznych lub dostpne jako preparaty farmaceutyczne. Prebiotyki s dodatkami do ywnoci, ktrych korzystne dziaanie na organizm ludzki jest zwizane ze stymulacj wzrostu i aktywnoci niektrych szczepw mikroflory rodzimej lub wprowadzonej z zewntrz wraz ze spoyt ywnoci. Do tego typu substancji zaliczamy, nietrawione oligosacharydy (NDOs) np. fruktooligosacharydy (FOS). Probiotyczne bakterie kwasu mlekowego przyczyniaj si do rwnowaenia naturalnej mikroflory jelitowej, zapobiegania i leczenia biegunek oraz mog chroni przed infekcjami jelit, stymuluj ukad odpornociowy, wykazuj aktywno antymikrobiologiczn. Jednak potwierdzenie tych waciwoci w badaniach naukowych dotyczy tylko niektrych z nich.Szczeglnie wana jest potencjalna zdolno probiotykw do wzmacniania obrony nabonkowej, zwaszcza odkowej i w jelicie cienkim, np. zapobieganie lub zwalczanie infekcji wywoanych przez Helicobacter pylori i Salmonella enterica spp typhimurium. W tym kontekcie dziaanie zdrowotne LAB po wprowadzeniu do mikroflory jelitowej czowieka bdzie zwizane z ujawnieniem si waciwoci antybakteryjnej w stosunku do patogenw, zarwno w hodowlach komrkowych jak i w prbach klinicznych.

Interakcje pomidzy mikroflor rodzim i bakteriami enteropatogennymi

Prawidowa mikroflora w przewodzie pokarmowym odgrywa bardzo wan rol w hamowaniu zasiedlania jelita grubego przez patogeny. Dowiedziono, e bifidobakterie, gwny rodzaj mikroflory jelitowej, Lactobacillus jak i Escherichia coli (jeden z pierwszych rodzajw kolonizujcych jelito czowieka) wywieraj dziaanie antymikrobiologiczne w stosunku do patogenw. Rne mechanizmy umoliwiaj odgrywanie takiej roli, np.:konkurencja o skadniki odywcze,

zapobieganie przyleganiu patogenw, szczeglnie przez konkurowanie o te same receptory w luzwce lub nabonku,produkcja substancji antymikrobiologicznych (inhibitory metabolizmu, bakteriocyny, substancje bakteriocynopodobne lub niebakteriocyny), ktre usuwaj patogeny z przewodu pokarmowego,Poprawienie odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciw patogenom.

Prezentacja bdzie dotyczya potencjau probiotycznych bakterii kwasu mlekowego do produkcji i wydzielania substancji antymikrobiologicznych. Zwizki te mog po kolei ingerowa w mechanizmy adhezji gronych bakterii do nabonka komrek jelita i w ten sposb zapobiega inwazyjnoci.

Produkcja substancji antymikrobiologicznych

Wiadomo, e probiotyczne LAB, zwaszcza szczepy takich gatunkw jak L. acidophilus, L. johnsoni, L. casei, B. animalis, B. bifidus, itd. przyczyniaj si do rwnowagi mikroflory jelitowej. Kolonizacja przez patogeny moe by ograniczona np. dziki produkcji kwasw organicznych, ktre w rezultacie obniaj miejscowo pH rodowiska. Aktywno L. acidophilus i L. casei przeciw H. pylori najprawdopodobniej jest rezultatem zmian pH zwizanych z produkcj kwasu mlekowego i octowego przez te szczepy. Ponadto niezdysocjowany kwas octowy prawdopodobnie odgrywa gwn role w aktywnoci przeciwinfekcyjnej bifidobakterii. W ostatniej dekadzie odkryto, e wikszo szczepw L. acidophilus produkuje bakteriocyny. Ta waciwo ley u podstaw ich znaczenia w ekosystemie przewodu pokarmowego. Do tej pory wyizolowano i oczyszczono kilka bakteriocyn produkowanych przez szczepy, ktre wczeniej wyizolowano z kau. Kilka z nich hamowao wzrost takich patogenw jak E. coli, Salmonella spp., Wrd szczepw stosowanych w przemyle spoywczym nie znaleziono jednak takich, ktre produkowayby bakteriocyny. Tym niemniej stwierdzono, e szczepy probiotyczne posiadaj aktywno antymikrobiologiczn z racji produkcji peptydw o waciwociach inhibicyjnych. Tylko jeden jogurt na rynku zawiera szczep L. acidophilus LA-1, ktry produkuje bakteriocyn (tzw. acidofilina LA-1 o masie 50 kDa). Dua masa molekularna wynikaa z nie oczyszczonego homogenizatu, nie okrelono te aminokwasw i genw odpowiedzialnych za produkcj tej substancji. Bakteriocyny produkowane przez LAB s zwykle aktywne przeciw bakteriom G+. Bakterie G- mog sta si take wraliwe na bakteriocyny tylko wtedy, kiedy struktura ciany komrkowej jest zniszczona. Bardzo wskie spektrum hamowania wzrostu wydaje si by powszechnym zjawiskiem wrd grupy szczepw L. acidophilus produkujcych bakteriocyny. Pozostaje pytanie, czy bakteriocyny odgrywaj rol w przewodzie pokarmowym. Wiele szczepw Lactobacillus produkuje substancje antybakteryjne, kwasowe, o niskiej masie molekularnej, ktrych aktywno przeciwbakteryjna obejmuje bakterie G + i G -. Zwaywszy na t charakterystyk, czci skadowe aktywnoci antybakteryjnej wskazuj na rnice midzy bakteriocynami i mikrocynami. Bakteriocyny produkowane przez Lactobacillus s z definicji substancjami biakopodobnymi, przeciwbakteryjnymi, ktre wykazuj aktywno przeciw bakteriom blisko z nimi powizanymi, natomiast ma lub adnego dziaania hamujcego przeciw innym grupom bakterii. Mikrocyny wytwarzane przez kilka gatunkw z rodziny Enterobacteriaceae, przewanie szczepy E. coli s peptydowymi antybiotykami o niskiej masie molekularnej, niewraliwymi na proteazy, aktywnymi tylko przeciw bakteriom G-. Wspomniane wyej zwizki wymagaj oczyszczenia i dalszej charakterystyki chemicznej.Waciwoci substancji antymikrobiologicznych s czsto mao znane, szczeglnie w przypadku probiotykw stosowanych przemysowo. Przykadowo, szeroko stosowany szczep L. johnsoni LA-1 hamuje adhezj i inwazj przez enterowirulentne bakterie w warunkach in vivo i in vitro, zarwno G + (np. Listeria monocytogenes) i G - (np. Salmonella typhimurium). Produkuje on zoone substancje antybakteryjne, ktre s stosunkowo niewraliwe na proteazy i niezalene od produkcji kwasu mlekowego. Nie obserwuje si tej aktywnoci odnonie naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego, tj. bifidobakterii i laktobacillusw. Jednake pozostae waciwoci substancji wydzielanych przez ten szczep wymagaj dokadniejszego okrelenia. Twierdzi si jednak, e nie s to bakteriocyny. Ostatnio stwierdzono, e supernatant L. johnsoni LA-1 hamowa wzrost H. pylori zmniejszajc ich liczb in vivo u zdrowych wolontariuszy. Dziaanie to mogo wynika tylko czciowo z obecnoci produkowanego przez bakterie kwasu mlekowego. Substancje hamujce wzrost byy ciepodporne, niezalene od stenia mocznika, czy obecnoci komrek LA-1 w medium, ale rozpaday si, kiedy pH supernatantu wzrastao do 6,0. Jest jednak prawdopodobne, e caociowe hamowanie rozwoju patogenw w przewodzie pokarmowym jest zalene od synergicznego dziaania kwasw organicznych, substancji biakowych lub innych czynnikw hamujcych.Dobrze znana jest selektywna stymulacja wzrostu Bifidibacterium spp przez NDOs i FOS, zarwno in vitro jak i in vivo. W dodatku czsto powstrzymywany jest wzrost bakterii patogennych tj. E. coli, Salmonella sp i Clostridium perfringens. Zarwno zwizki o aktywnoci antybakteryjnej (kwasy organiczne i bakteriocyny lub substancje bakteriocynopodone) jak i specyficzna aktywno enzymatyczna (np. fruktozydaza i galaktozydaza) umoliwi selektywny wzrost probiotykw. Ostatnio zcharakteryzowano bakteriocyn produkowan przez B. bifidum, ale bya ona aktywna tylko w stosunku bakterii G+. Stwierdzono zatrzymanie adherencji przez enterotoksyczne szczepy E. coli przez czynniki biakopodobne o wysokiej masie molekularnej, a take przez niezidentyfikowane, lipofilne molekuy z dwch szczepw Bifidobacterium z naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego niemowlt. To ostatnie dziaanie dotyczyo bakterii takich jak S. typhimurium i G-. Podsumowujc podawanie synbiotykw moe prowadzi do wzrostu odpornoci na takie patogeny jak Salmonella enterica spp typhimurium.

Wnioski

Nie jest jeszcze poznana do koca charakterystyka molekularna substancji pochodzcych z probiotycznych bakterii kwasu mlekowego, ktre s odpowiedzialne za hamowanie wzrostu patogennych bakterii w przewodzie pokarmowym. Ponadto nadal istnieje potrzeba wyjanienia czy bakteriocyny s produkowane przez probiotyki, a jeli jest tak naprawd, czy te zwizki mog by odpowiedzialne za inaktywacje bakterii patogennych (G-) w przewodzie pokarmowym. Dziaanie bakteriocynopodobne i antybiotykopodobne, przeciw enterowirulentnym bakteriom wspomaga terapeutyczne dziaanie wyselekcjonowanych od ludzi szczepw Lactobacillus. Wyzwaniem dla przemys spoywczego i farmaceutycznego bdzie przeprowadzenie w wielu orodkach, wielodyscyplinarnego, dobrze zaplanowanego badania klincznego ze lep prb. Badanie to bdzie miao na celu ustalenie zdrowotnych korzyci lub terapeutycznej skutecznoci wybranych szczepw Lactobacillus i Bifidobacterium, stosowanych w ywnoci funkcjonalnej jako bioterapeutyczne dodatki. Unijny projekt PROPATH (nalecy do PROEUHEALTH, czy grupy The Food, GI-tract Functionlity and Human Health), przyczynia si do rozpowszechniania wiedzy o mechanizmach hamowania wzrostu bakterii G-, bakterii patogennych przez probiotyki (Bifidobacterium i Lactobacillus spp). Testuje si dwa patogeny Salmonella enterica spp typhimurium i Helicobacter pylori. W szczeglnoci bdzie badany wzrost bifidobakterii z dodatkiem prebiotykw. Projekt bdzie si dalej zajmowa badaniami klinicznymi zwizanymi z biegunk u dzieci, zespoem nadwraliwoci jelita grubego, chorob wrzodow i zapobieganiem tym chorobom dziki stosowaniu pro- i prebiotykw.

LUC DE VUYSTINHIBITORY EFFECTS OF PROBIOTIC LACTIC ACID BACTERIA

Research Group of Industrial Microbiology, Fermentation Technology and Downstream Processing, Department of Applied Biological Sciences, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, B-1050 Brussels, Belgium. Tel: +32-2-629 32 45. Fax: +32-2-629 27 20. E-mail: ldvuyst@vub.ac.be.

Introduction

Lactic acid bacteria are traditionally applied in the production of fermented foods and beverages such as cheese, yogurt, fermented sausage, sourdough, sauerkraut, beer, and wine, because of their contribution to the sensory qualities of the food and the prevention of food spoilage. These microbes are in particular responsible for the initial acidification of the raw materials through the production of lactic acid (homo- and heterofermentative strains) and acetic acid (only heterofermentative strains). The organic acids, in particular the undissociated molecules, display antimicrobial activies. Also other inhibitory compounds contribute to their antimicrobial potential such as other organic acids (e.g. formic acid), ethanol, carbon dioxide, diacetyl, hydrogen peroxide, bacteriocins, and antibiotics. Recently, a lot of attention is paid to the health-promoting properties of certain lactic acid bacterium strains, some of which have been promoted as probiotics. Probiotics are viable cell preparations or foods containing living bacteria that after consumption of a certain number have beneficial effects on the health of the host. Examples are lactobacilli and bifidobacteria that are applied in yoghurts and fermented milks, or that are supplied as pharmaceutical preparations. Prebiotics are non-digestible food ingredients that affect the host beneficially by selectively stimulating the growth and metabolic activity of a limited number of naturally present or orally introduced bacteria in the colon, particularly bifidobacteria, and thereby improve host health. Examples are non-digestible oligosaccharides (NDOs) such as fructo-oligosaccharides (FOS). Probiotic lactic acid bacteria contribute to the balancing of a normal, healthy, intestinal microflora, and to the prevention and curing of diarrhoea, and may protect against gastrointestinal infections by pathogenic strains, stimulate the immunity system, display anti-carcinogenic activities, etc. However, only a very limited number of these health claims has been approved scientifically. Of particular importance is the potential of probiotics to reinforce mucosal defence, especially at the gastric and small bowel levels, for instance to prevent or combat infections with Helicobacter pylori and Salmonella enterica serovar Typhimurium, respectively. In this context, health-beneficial lactic acid bacterium strains able to be incorporated into the human intestinal microflora, have been shown to display anti-pathogenic effects towards these gastrointestinal pathogens either in cellular or animal models or in clinical trials.

Interaction of the resident microflora and enteropathogenic bacteria

The resident microflora of the gastrointestinal tract plays an important role in inhibiting gut colonisation by incoming pathogens. It has indeed been reported that bifidobacteria, a major species of the colonic microflora, and lactobacilli, a minor species of the gut microflora, as well as Escherichia coli, one of the first bacterial genera that colonise the intestines of humans, exert antimicrobial activity towards pathogens. Different mechanisms enable the gut microflora to play such a role:

(i)the competition for substrates;(ii)the prevention of pathogen adherence by specifically competing for the same receptor sites on the epithelium or mucus, or alternatively by providing an aspecific steric hindrance as a barrier to mucosal colonisation;

(iii)the production of antimicrobial substances (inhibitory metabolites, bacteriocins, bacteriocin-like, or non-bacteriocin substances) to remove pathogens from the intestine;

(iv)an enhancement of the host immune response against pathogens.

This paper will deal with the potential of probiotic lactic acid bacteria to produce secreted antimicrobial substances. Antimicrobials could in turn interfere with the adhesion mechanisms of enterovirulent bacteria to the epithelial cell surface, thereby preventing the severity of invasiveness and hence infection.

Production of antimicrobial substances

It is well known that probiotic lactic acid bacteria, in particular strains of the species L. acidophilus, L. johnsonii, L. casei, B. animalis, B. bifidum, etc. contribute to the stabilisation of the gut microflora. They may avoid the colonisation of pathogenic bacteria, for instance through the production of organic acids, resulting in a decrease of the local pH. Anti-H. pylori activity of L. acidophilus and L. casei most probably results from such a pH alteration and lactic and acetic acids produced by these strains. Moreover, undissociated acetic acid most probably plays a pivotal role in the anti-infectious activity of bifidobacteria. In the last decade, it has been found that a majority of the L. acidophilus strains produce bacteriocins, underlying their potential importance in the complex gastrointestinal ecosystem. Up to now several bacteriocins from strains isolated from faeces have been isolated and purified. Some of them have been shown to inhibit gastrointestinal pathogens such as E. coli and Salmonella spp. However, no bacteriocins were shown among commercially available probiotic strains. Nevertheless, it has been claimed that probiotic strains possess antagonistic activities due to the production of inhibitory peptides. Only one 50-kDa bacteriocin, referred to as acidophilicin LA-1, produced by a L. acidophilus LA-1 strain isolated from a commercial multiple-strain yoghurt starter culture, has been reported recently. This high-molecular-mass protein was not purified to homogeneity, neither was the amino acid or gene sequence determined. In addition, bacteriocins produced by lactic acid bacteria are in general only active towards Gram-positive bacteria. Only when the structure of their cell surface is disturbed, also Gram-negative bacteria can become sensitive. Moreover, a very narrow inhibitory spectrum seems to be common among bacteriocin-producing isolates from the L. acidophilus group. The question remains whether bacteriocins play a role in the gastrointestinal tract. On the other hand, several Lactobacillus strains produce antibacterial, acidic, low-molecular-mass, heat-stable, non-proteinaceous compounds with an inhibitory spectrum including both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Considering these characteristics, the components supporting the antimicrobial activity appear different from bacteriocins and microcins. Indeed, the bacteriocins produced by lactobacilli are by definition proteinaceous antibacterial compounds that exhibit an effect against closely related bacteria and show little or no inhibition against other bacteria. The microcins, produced by some members of the Enterobacteriaceae, mostly E. coli strains, are peptide antibiotics with low molecular mass, insensitive to proteases, and active against Gram-negative bacteria only. Hence, the components mentioned above remain to be purified and chemically characterised. The fact that the nature of the antibacterial substances is often unknown is particularly the case for commercial probiotic lactic acid bacterium strains. For instance, the widespread probiotic L. johnsonii La1 strain inhibits cell adhesion and cell invasion by enterovirulent bacteria both in vitro and in vivo, including both Gram-positive (e.g. Listeria monocytogenes) and Gram-negative (e.g. Salmonella typhimurium) bacteria. It produces an antibacterial compound that is relatively insensitive towards proteases and independent of lactic acid production. No activity has been observed towards the normal intestinal flora such as lactobacilli and bifidobacteria. However, the nature of the antimicrobial component(s) secreted by L. johnsonii La1 remains to be determined. It has been claimed that it is not a bacteriocin. Recently, it has been demonstrated that supernatant of L. johnsonii La1 inhibits the growth of H. pylori in vitro, and decreases H. pylori density in healthy volunteers. The effect could be only partly due to lactic acid. This inhibitory activity was heat resistant, dialyzable, and independent of the presence of urea or La1 cells in the medium but was lost when the pH of the supernatant was raised to 6.0. It is, however, probable that overall inhibition of gastrointestinal pathogens may be due to a synergistic action of organic acids, proteinaceous substances, or other inhibitory agents.Finally, it is well known that NDOs such as FOS selectively stimulate the growth of Bifidobacterium spp., both in vitro and in vivo. In addition, the growth of pathogenic bacteria like Escherichia coli, Salmonella sp. and Clostridium perfringens is often suppressed. Both antimicrobial compounds (organic acids and bacteriocins or bacteriocin-like agents) (inhibiting effect) and specific enzyme activities (for instance fructosidase and galactosidase) enabling their selective growth on prebiotic substrates (stimulating effect) may be responsible for the bifidogenic effect. Recently, a bacteriocin (bifidocin B) from Bifidobacterium bifidum has been characterised, but it was only active towards Gram-positive bacteria. A high-molecular-mass proteinaceous factor was found to inhibit adherence of an enterotoxigenic E. coli strain, and an unidentified lipophilic molecule from two Bifidobacterium strains from resident infant gastrointestinal microflora was found to be antibacterial too, including Gram-negative pathogens like S. typhimurium. Finally, synbiotic administration of bifidobacteria and NDOs may result in an increased resistance to pathogens like S. enterica serovar Typhimurium.

Conclusion

The molecular identity of the compounds derived from probiotic lactic acid bacterium strains which are responsible for the inhibition of gastrointestinal pathogenic bacteria, has not been elucidated. In addition, it still has to be confirmed whether bacteriocins are produced by probiotic lactic acid bacteria, and, if this is the case, whether these compounds may be responsible for the inactivation of (Gram-negative) pathogenic bacteria in the gastrointestinal tract. Bacteriocin-like and antibiotic-like activities support the therapeutic effect of the selected human lactobacilli strains against enterovirulent bacteria. However, the challenge for the food and pharmaceutical industries will be to conduct well-designed, placebo-controlled, multidisciplinary and multicenter clinical investigations to ascertain the health benefits or therapeutic efficacy of selected lactobacilli and bifidobacteria strains to be used as functional foods or biotherapeutic agents. The EC project PROPATH (belonging to the PROEUHEALTH or The Food, GI-tract Functionality and Human Health cluster) contributes to the elucidation of the mechanism of the inhibition of Gram-negative, pathogenic bacteria by probiotic lactic acid bacterium strains (Lactobacillus spp. and bifidobacteria). The two test cases are Salmonella enterica serovar Typhimurium and Helicobacter pylori. Bifidobacteria will be considered in particular when growing on NDOs as prebiotic substrate. The project will further deal with clinical studies related to infants diarrhoea, irritable bowel syndrome, and peptic ulcer disease, to treat or protect against these diseases with approved pro- and prebiotics.

JAN VAN LOOMOLIWOCI PROBIOTYKW I PREBIOTYKW (SYNBIOTYKW) W CELU OBNIENIA RYZYKA NOWOTWORW.

ORAFTI, Tienen, Belgia

Rak

Rak to popularny, oglny termin dla okrelenia nowotworw zoliwych, szeroko opisywanej grupy chorb o nieznanych i prawdopodobnie licznych przyczynach.Na wystpowanie raka wpywa wiele czynnikw. Najwaniejszym z nich jest dieta (powoduje 35% wszystkich zgonw z powodu raka), nastpne czynniki zwizane s ze stylem ycia (tyto 30%, zachowania rozrodcze 7%, i alkohol 3%). Czynnik rodowiskowe powoduj ok. 20% zgonw (infekcje 9%, praca 4%, zanieczyszczenie, produkty przemysowe, leki, czynniki geofizyczne), a czynniki dziedziczne s przyczyn ok. 5% zgonw. Wystpowanie raka u mczyzn jest dwa razy czstsze ni u kobiet. Mczyni najczciej zapadaj na raka puc, a nastpnie raka jelit i prostaty. Kobiety na raka piersi, jelit i puc. Z danych powyszych wynika, e ponad 75% przypadkw nowotworw moe wynika z diety lub stylu ycia. Jednake zmiana zwyczajw ywieniowych u znacznej czci populacji to dugi proces, wymagajcy znacznych wysikw propagandowych, zarwno ze strony rzdowej, jak i producentw.

Inulina i oligofruktoza jako przykady prebiotykw

Prebiotyki, jak np. inulina i oligofruktoza, s naturalnymi skadnikami powszechnie dostpnej ywnoci pochodzenia rolinnego, np. cykorii, cebuli, czosnku, pomidorw, bananw, pszenicy itp. rednie spoycie prebiotykw w zwykej diecie wynosi okoo kilku gramw dziennie (Van Loo i in., 1995).Inulina jest przemysowo otrzymywana z korzeni cykorii przez ekstrakcj gorc wod, rafinacj i suszenie rozpyowe. Jest to zdyspergowana mieszanina liniowych moleku, wszystkich o takiej samej podstawowej strukturze chemicznej, oznaczanej jako G-Fn (gdzie: G to reszta glukozowa, F reszta fruktozowa i n liczba czsteczek glukozy poczonych wizaniem (2-1)). Stopie polimeryzacji (DP) natywnej inuliny z cykorii waha si pomidzy 3 a 65, z wartoci redni (DPav) wynoszc 10. Inulina, ktrej cze o niszym DP zostaa usunita (w wyniku czego DPav wynosi ok. 25), zwana jest inulin o wysokiej wydajnoci (HP-inulin lub inulin High Performance). Olgofruktoza jest otrzymana przez czciow hydroliz enzymatyczn inuliny. Skada si z prostych acuchw G-Fn i F-Fn o DP wahajcym si w granicach 2-8 (z DPav okoo 4). Synergy 1 to inulina o specyficznym rozoeniu dugoci acucha.Wizanie (2-1), czy wszystkie reszty fruktozy w acuchu wglowodanowym, nie moe by hydrolizowane w jelicie krgowcw, take u ludzi. W zwizku z tym inulina i oligofruktoza i HP-inulina nie s trawione w grnej czci jelita i praktycznie w caoci (>90%) docieraj do okrnicy (Ellegard i in., 1997). W tym momencie te nie strawione oligosacharydy ulegaj cakowitej fermentacji. W wyniku tego procesu selektywnie wspomagaj rozwj pewnych grup bakterii. Wrd nich s bifidobakterie i bakterie kwasu mlekowego (LAB), powszechnie uwaane za wskaniki dobrze zrwnowonej mikroflory jelitowej. Ta zmodyfikowana flora jelitowa i metabolity, ktre produkuje wchodz w interakcje z organizmem ludzkim. Te interakcje zachodz przez powierzchni przewodu pokarmowego, z ktrej tylko okrnica ma wielko kortu tenisowego. Wizanie glukozydowe (2-1) czc reszty heksozy jest odpowiedzialne za niestrawno w grnym odcinku przewodu pokarmowego, take w przypadku innych typw wglowodanw prebiotycznych. Selektywno fermentacji, drugi warunek konieczny do nazywania oligosacharydw prebiotykami, jest rna w tych substratach w zwizku z rnymi typami wiza pomidzy innymi rodzajami monosacharydw (Van Loo, 1999).

Waciwoci odywcze

Liczne badania nad prawidowym ywieniem czowieka wskazuj, e spoycie prebiotykw definitywnie zmienia mikroflor jelitow i jej aktywno metaboliczn (Roberfroid i in., Kurse, 2000). Prawdopodobnie jako wynik zmienionego ekosystemu okrnicy wystpuje modulacja metabolizmu lipidowego (Davidson i in., Jackson i in., Brighenti i in., 1999), zwikszona przyswajalno wapnia (Van de Heuvel i in., Coudray i in., Abrams i in., 2002), modyfikacja systemu odpornociowego u maych dzieci (Tschernia i in., Saavedra i in., 2000) i modyfikacja funkcji jelit.Ostatnio przeprowadzone zostay rnorodne badania z wykorzystaniem eksperymentalnych modeli przeciwnowotworowych. Nastpny rozdzia przedstawia rne modele zwierzce stosowane w badaniach raka i wyniki otrzymane przy uyciu pre- i probiotykw.

Waciwoci przeciwnowotworowe prebiotykw

Modele chemoprewencji

W tych modelach zwierzta s prowokowane przez substancje rakotwrcze, ktre indukuj proces karcenogenezy w wybranych organach.Iniekcje zawierajce azometan (AMO) lub dimetylohydrazyn (DMH) stosowane s do wywoywania raka okrnicy, podczas gdy 4-metylonitrozomocznik (MNU) uywany jest w celu spowodowania raka piersi u eskich osobnikw zwierzt laboratoryjnych. Zwierztom podawana jest dieta kontrolna lub dieta zawierajca inulin albo oligofruktoz (dodatek 5-10%). Miernikiem rakotwrczoci wrd tych zwierzt jest rozwj przednowotworowych zmian chorobowych po 2 miesicach lub duszym czasie (33 tyg. do 1 roku). Z danych wynika, e w przypadku stosowania prebiotykw otrzymuje si znaczne zmniejszenie wskanikw karcenogenezy. Efekty chemoprewencyjne zalene s od dawki i staj si bardziej wyrane wraz ze zwikszeniem dugoci acucha fruktanw prebiotykw typu inulinowego (z DPav - 4 na DPav - 25). Efekt ten jest ju widoczny, gdy prebiotyki s podawane jedynie przed wstrzykniciem karcenogenu, czyli w fazie iniekcji. Efekty dziaania prebiotykw w fazie promocji, testowane przez podawanie prebiotykw po wstrzykniciu karcenogenu, okazay si jeszcze wyraniejsze. Redukcja biomarkerw karcenogenezy jest proporcjonalna w caej okrnicy. Wikszo danych zostaa uzyskana w badaniach nad modymi szczurami, ale rezultaty zostay potwierdzone take u dorosych szczurw, ktre stanowi lepszy model populacji ludzkich.Rozwj chemicznie wywoanego raka piersi zosta take znaczco zmniejszony przez karmienie zwierzt poywieniem zawierajcym prebiotyki. Oznacza to, e dziaanie przeciwrakowe nie jest zjawiskiem lokalnym, ale e naley rozpatrywa interakcje w caym organizmie.

Modele wszczepiania komrek nowotworowych

Ten typ eksperymentu polega na wszczepianiu agresywnych i inwazyjnych komrek nowotworowych do mini lub otrzewnej myszy. Zwierzta s karmione odpowiedni diet (kontroln, z prebiotykiem, z probiotykiem) 1-2 tygodnie przed wszczepieniem komrek rakowych. Krzywa miertelnoci, wyraa jak wzrasta rozpito ycia lub redni czas przeycia. Ocena preparatw histologicznych pozwala zwrci uwag na aspekt przerzutowy oraz rozmiar i typ guzw.Dane wskazuj konsekwentnie, e prebiotyki powoduj obnienie krzywej miertelnoci i redukcj wzrostu przeszczepionych, wtrobowych komrek rakowych. To wyranie dowodzi, e brane s pod uwag czynniki caociowe, dla caego organizmu.W innej wersji tego modelu, badano komrki guza z powstaych przerzutw. Zbadano mikroskopowo liczb i morfologi przerzutw w pucach. Okazao si, e u zwierzt karmionych prebiotykami zmiany nowotworowe s tam mniejsze, jeeli chodzi ilo i rozmiar komrek rakowych w porwnaniu do prby kontrolnej (Taper i in., 1997, 1998, 1999, 2000).

Modele predeterminowane genetycznie

U myszy Apc Min guzy rozwijaj si spontanicznie, gwnie w jelicie cienkim, ale tylko kilka w okrnicy. Dowiadczenia z tymi modelami pokazuj, e spoywanie prebiotykw prawie nie redukuje przypadkw guzw w jelicie cienkim, ale zmniejsza ich liczb w okrnicy. (Pierre i in., 1997).Te wyniki dotycz take przypadkw ludzkich, to jest jasne nawet, jeli diet wyjania ponad 75% przypadkw raka, jednak wrodzone waciwoci genetyczne mog odgrywa wan role, w przypadku rozwoju procesu karcenogenezy.

Synbiotyki

W przypadku probiotykw istnieje mniej dowodw bezporedniego hamowania karcenogenezy w modelach dowiadczalnych. Synbiotyki s kombinacj probiotykw i prebiotykw. Podstawowe badania przeciwnowotworowe (badania chemoprewencji Rowlanda i in., 1998) wskazuj, e kiedy prebiotyk - inulina jest poczona z probiotykiem (Bifidobacterium longum) inhibicja przypadkw raka bya synergicznie redukowana.Pocztkow hipotez byo, e prebiotyki s wyselekcjonowan ywnoci, dla probiotykw, ktre jako takie mogy wywiera ten dobroczynny efekt bardziej gruntownie.Pniej wyonia si idea, e prawdopodobnie bezporednia interakcja pomidzy prebiotykiem i probiorykiem nie jest konieczna. Obserwowany synergizm mg by skutkiem dwch odrbnych procesw inhibicyjnych karcenogenezy, kady na swj wasny sposb. Kiedy proces rakotwrczy jest rezultatem kompleksu procesw, oglna inhibicja jest wynikiem poszczeglnych inhibicji kolejnych etapw.

Walidacja danych eksperymentalnych w badaniach interwencji ywieniowej

Powtarzanie i publikowanie spjnych danych pochodzcych z rnych modeli eksperymentalnych, wskazujcych, e prebiotyki maj dziaanie przeciwnowotworowe bdzie trafne tylko wtedy, kiedy zostan potwierdzone w badaniach dietetycznych.W momencie rozpoczcia finansowania bada przez Uni Europejsk naleao przewidzie, e jeli istniej wskazwki, i czenie probiotykw i prebiotykw w synbiotyki moe mie dziaanie przeciwnowotworowe, naley przeprowadzi badania z synbiotykami i takie wanie badania zostay przyjte do finansowania przez EU DG Research.Jeli nie znano mechanizmw i jeli rozdzia bada nie by przekonujcy, odwoywano si do wczeniejszych bada. Projekt SYNCAN by opracowany jako projekt Biomarker. Wybrano trzy grupy biomarkerw po to, aby obj wszystkie moliwe, wczesne wskaniki karcenogenezy. Pod wzgldem produkcji cytotoksycznych i genotoksycznych skadowych w okrnicy i odbytnicy monitoruje si biomarkery immunologiczne, mierzone we krwi, biomarkery genetyczne i luzwkowe oznaczane za pomoc biopsji.Badania nad interwencj ywieniow s sercem projektu SYNCAN. Jest on wspierany przez badania in vitro interakcji pre/probiotykw i przez dowiadczenia na szczurach, tak aby zyska lesze zrozumienie mechanizmw. Zapocztkowane prby z tych dowiadcze s wysyane do sieci BIOMARKER i poddawane analizie. Praca z biomarkerami wymaga dalszej optymalizacji metodologii i wykonywania analizy prbek.

JAN VAN LOOPREBIOTICS + PROBIOTICS (SYNBIOTICS) OPEN PERSPECTIVES TO REDUCE THE RISK FOR CANCER BY DIETARY MEANS.

ORAFTI, Tienen, Belgium

Cancer

Cancer is a popular generic term for malignant neoplasm, an elaborate group of diseases of unknown and probably multiple causes. Several factors affect cancer incidence. The most important one is diet (causing 35% of all cancer deaths), followed by lifestyle factors (tobacco 30%; reproductive behaviour 7% and alcohol 3%). The environment would cause some 20% of all cancer deaths (infections 9%, occupation 4%, pollution, industrial products, medicines, geophysical) and hereditary factors account for about 5% of cancer deaths. The incidence in men is twice as high in men as in women. In men lung cancer is most important followed by intestine and prostate. IN women, breast cancer is most important, followed by intestine and lung. From these statistics, it appears that over 75% of cancers can be influenced by either lifestyle or diet. However, changing dietary habits in a significant part of the population is a lengthy process and requires important efforts from both government and industry to distribute information.

Inulin and Oligofructose as a model for prebiotics

Prebiotics, such as chicory inulin and oligofructose, are natural constituents of many common foodplants including onion, garlic, tomato, banana, wheat etc. The average consumption of prebiotics in the normal human diet has been evaluated at several grams per day (Van Loo et al., 1995).Inulin is industrially obtained from chicory roots by hot water extraction, followed by refining and spray drying. It is a polydisperse mixture of linear molecules, all with the same basic chemical structure which is symbolised as G-Fn (with G: glucosyl moiety, F: fructosyl moiety and n: number of fructose units linked together through (2-1) bonds. The degree of polymerisation (DP) of native chicory inulin ranges between 3 and 65, with an average (DPav) of 10. Inulin, from which the lower DP-fraction has been physically removed, resulting in a DPav of about 25, is called HP-inulin or High Performance inulin. A short chain fraction, called oligofructose is obtained by partial enzymatic hydrolysis of inulin. It is composed of linear G-Fn and F-Fn chains with a DP ranging from 2 to 8 (DPav is about 4). Synergy1 is inulin with a specific distribution of chain lengths.

The (2-1) bond, linking up all fructose moieties in the carbohydrate chain cannot be hydrolysed in the intestine of vertebrates in general and of humans in particular. As such, inulin, oligofructose and HP-inulin escape digestion in the upper intestinal tract and arrive almost quantitatively (>90%) in the colon (Ellegard et al., 1997). At that point, these non digestible oligosaccharides are completely fermented. During fermentation, they selectively promote the growth of certain groups of bacteria. Amongst these are the bifidobacteria and the lactic acid bacteria, organisms considered indicators of a well-balanced intestinal flora. This modified intestinal flora and the metabolites that it produces interact with the human body. This interaction occurs through the surface of the intestinal tract, of which the colon alone has the surface of a tennis court.The (2-1) glucosidic bond linking up hexose moieties is also in other types of prebiotic carbohydrates responsible for their non digestibility in the upper GI tract. The selectivity of fermentation, which is the second condition for an oligosaccharide to be called a prebiotic, differs amongst these substrates due to other types of links between other types of monoses (Van Loo, 1999).

Nutritional properties

Several human dietary intervention studies have shown that consumption of prebiotics dramatically modifies the intestinal flora and its metabolic acitivity (Roberfroid et al., 1998; Kruse, 2000). Probably as a consequence of this modified colonic ecosystem, there is modulation of lipid metabolism (Davidson et al., Jackson et al ; Brighenti et al., 1999), increased calcium absorption (Van den Heuvel et al; Coudray et al; Abrams et al. 2002 ), modulation of the immune system in young children (Tschernia et al 2000; Saavedra et al 2000) and modulation of gut function (Den Hond 2000). Recently, an impressive variety of studies in experimental anticancer models has been performed. The next section describes the different animal models in cancer research and the results obtained with pre- and probiotics.

Anticancer properties of the prebiotics

Chemoprevention models

In these models, the animals are challenged by a carcinogenic substance that induces processes of carcinogenesis in specific organs. Injection with azoxymethane (AOM) or dimethylhydrazine (DMH) is used to induce colon cancers, while 4-methyl nitrosoureum (MNU) is used to induce breast cancer in female test animals. The animals receive either a control diet or a diet containing the inulin or oligofructose (5 to 10% added to the diet). In these animals, the development of either preneoplastic lesions after 2months or tumours after a longer period of time (33w to 1yr) are counted as a measure of carcinogenicity.From these data it was concluded that there is a consequent significant reduction in markers for carcinogenesis. The chemopreventive effects are dose-dependent and become more pronounced with increasing chain length (DPav 4 to DPav 25) of the prebiotic inulin-type fructans. The effect is already observed when prebiotics are only fed before injection of the carcinogens, i.e. during the initiation phase. The effect of prebiotics on the promotion phase, tested by feeding the prebiotic after carcinogen injection, is even more pronounced. The reduction in biomarkers for carcinogenesis is proportional in all parts of the colon. Most of the data were generated with young rats, but they were confirmed in adult rats as well, which would be a better match for what happens in human populations.

The development of chemically induced breast cancer was also significantly suppressed by feeding the animals prebiotic containing food. This indicates that the cancer preventing action is not a local phenomenon, but that systemic effects are involved (Reddy et al 1997, Rowland et al 1998, Verghese et al. 2002 A and B).

Tumour implantation models

In this type of experiments, aggressive and invasive tumour cells are implanted either in the muscle or in the peritoneum of mice. The animals are fed either control, prebiotic or probiotic supplemented food one to two weeks before tumour implantation. Mortality curves, expressed as increase in life span or mean survival time, are monitored. Microscopic histological evaluation allows to draw conclusions on metastatic aspects or size and type of tumour.These data show consistently that prebiotics retard the mortality curves and reduce the growth of transplanted liver tumour cells. This clearly indicates that systemic factors are involved.In another version of this model, the tumour cells were allowed to metastasise (i.p. application). The number and the morphology of the lung metastases were microscopically investigated. It appeared that there are less metastases and that the size of the metastases is smaller in animals fed the prebiotic, compared to the control animals (Taper et al. 1997, 1998, 1999, 2000).

Genetically predetermined models

Apc Min mice spontaneously develop tumours, mainly in the small intestine but also a few in the colon. Experiments with this model have shown that consumption of prebiotics hardly reduce the incidence of tumours in the small intestine, but reduced the number tumours in the colon (Pierre et al. 1997). These results also are relevant for the human situation, as it is clear that even if diet explains over 75% of cancer incidence, inherent genetic properties of the individuals may also play an important role in the ease with which processes of carcinogenesis can proceed.

Synbiotics

For probiotics there is less evidence of direct inhibitory effects of carcinogenesis in experimental models. Synbiotics are a combination of probiotics and prebiotics. Preliminary anticancer research (chemoprevention study by Rowland et al 1998) has revealed that when prebiotic inulin is combined with a probiotic (Bifidobacterium longum) the inhibition of ACF incidence was synergistically reduced. The hypothesis at first was that the prebiotic was a selective food for the probiotic, which as such could exert it's beneficial effects more thoroughly. Later on the idea has grown that probably such a direct interaction between the prebiotic and the probiotic is not really necessary. The synergy which was observed could come from both inhibiting different processes of carcinogenesis on their own way. As carcinogenesis is a result of a complex sequence of processes, overall inhibition is the product of the fractional inhibition of individual steps.

Validation of the experimental data in human dietary intervention studies

The repeated and reproduced and consistent experimental data originating from various experimental models which indicate that prebiotics are anticarcinogenic only are of any relevance if they can be confirmed or validated in human dietary intervention studies.

As EU sponsored research needs to be pre-competitive, and as there were indications that combining prebiotics and probiotics in a synbiotic would have more anticarcinogenic impact, a research proposal with synbiotics was submitted to and accepted for sponsoring by the EU DG Research.

As no mechanisms are known and as at this stage of research it is not wise to organise years-lasting recurrence (of polyps or of tumours) experiments, the SYNCAN project was conceived as a Biomarker project. Three groups of biomarkers were thought to cover all possible early indications of carcinogenesis. These involve immunological biomarkers as measured in the blood, genetic biomarkers and mucosal biomarkers as measured in biopsy and monitoring of produced cytotoxic or genotoxic compounds in the colon (faecal) content.

A human dietary intervention study is the heart of the SYNCAN project. This is supported by an in vitro part to study the pre/probiotic interactions and by a rat study in order to get more insight in mechanisms. Samples originating from these experimental lines are sent to the BIOMARKER network for analysis. The biomarker work involves further optimisation of methodology and performing analysis of samples.

LITERATURE REFERENCESAbrams SA, Griffin IJ (2000) Calcium absorption is increased in adolescent girls receiving enriched inulin. Presentation on the World congress of paediatric gastroenterology hepatology and nutrition, Boston,, August 5-9 2000.

Brighenti F, Casiraghi MC, Canzi E, Ferrari A. (1999) Effect of consumption of a ready-to-eat breakfast cereal containing inulin on the intestinal milieu and blood lipids in healthy male volunteers. Eur. J. Clin. Nutr. 53(9):726-733

Coudray C, Bellanger J, Castiglia - Delavaud C, Rmsy C, Vermorel M, Rayssiguier Y (1997) Effect of soluble or partly soluble dietary fibres supplementation on absorption and balance of calcium, magnesium, iron and zinc in healthy young men. Eur. J. Clin. Nutr., 51(6):375-380.

Davidson M.; Maki K.; Synecki C.; Torri S.A.; Drennan K.B. (1998), "Effects of dietary inulin on serum lipids in men and women with hypercholesterolemia", Nutrition Research, vol.18(3), pp.503-517.

DenHond,EM, Geypens B,Ghoos Y (2000) Effect of high performance chicory inulin on constipation. Nutrition Research 20(5),731-736.

Ellegrd L, Andersson H, Bosaeus I (1997) Inulin and oligofructose do not influence the absorption of cholesterol, and the excretion of cholesterol, Fe, Ca, Mg, and bile acids but increases energy excretion in man. A blinded, controlled cross-over study in ileostomy subjects. Eur. J. Clin. Nutr.,51:1-5.

Jackson KG.; Taylor GR.; Clohessy A., Williams C.M. (1999), The effect of the daily intake of inulin on fasting lipid, inulin and glucose concentrations in middle-aged men and women. Brit. J. Nutr., vol. 82(1), pp. 23-30.

Kruse,HP, Kleessen B Blaut M (1999) Effects of inulin on faecal bifidobacteria in human subjects. Br. J. Nutr.82(5):375-382.

M.Verghese, D.R. Rao, C.B. Chawan, L.L. Williams and L. Shackelford (in the press, B) Dietary inulin suppresses azoxymethane-induced aberrant crypt foci and colon tumors at the promotion stage in Fisher 344 rats. J. Nutr.

M.Verghese, D.R.Rao, C.B. Chawan and L. Shackelford (in the press, A) Dietary inulin suppresses azoxymethane-induced preneoplastic aberrant crypt foci in mature Fisher 344 rats. J. Nutr

Pierre F, Perrin P, Champ M, Bornet F, Meflah K, Menanteau J (1997) Short-chain fructo-oligosaccharides reduce the occurrence of colon tumors and develop gut-associated lymphoid tissue in min mice. Cancer Research Vol 57, pp. 225-228

Reddy D.S.; Hamid R.; Rao C.V. (1997), "Effect of careinogenesis oligofructose and inulin on colonic preneoplastic aberrant crypt foci inhibition", vol.18(7), pp. 1371-1374.

Roberfroid M.; Van Loo J.; Gibson G. (1998), "The Bifidogenic nature of chicory inulin and its hydrolysis products", J. Nutr., vol.128(1), pp.11-19.

Rowland I.R., Rumney C.J., Coutts J.T., Lievense L. (1998), "Effects of Bifidobacterium longum and inulin on gut bacterial metabolism and carcinogen induced aberrant crypt foci in rats. Carcinogenesis, vol.19(2) pp. 281-285.

Saavedra,J. M.; Tschernia,A.; Moore,N.; Abi-Hanna,A.; Coletta,F.; Emenhiser,C. & Yolken,R. H. (1999) Gastro-intestinal function in infants cosuming a weaning food supplemented with oligo-fructose, a prebiotic. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., vol. 29(4); pp. A95

Taper H., Delzenne N., Roberfroid M.B. (1997), "Growth inhibition of transplantable mouse tumours by non digestible carbohydrates", mt. J. Cancer, vol.71, pp. 1109-1112.

Taper H.; Lemort C.; Roberfroid M. (1998); "Inhibition effect of dietary inulin and oligofructose on the growth of transplantable mouse tumor". Anticancer Research vol., 18; pp. 4123-4126.

Taper,H. S.; Roberfroid,M. (1999) Influence of inulin and oligofructose on breast cancer and tumor growth The Journal of Nutrition, vol. 129(7 S); pp. 1488S-1491S.

Taper,H. S.; Roberfroid,M. R. (2000) Inhibitory effect of dietary inulin or oligofructose on the development of cancer metastases Anticancer Research Accepted for publication.

Tschernia,A.; Moore,N.; Abi-Hanna,A.; Yolken,R. H.; Coletta,F.; Emenhiser,C. & Saavedra,J. M. (1999) Effects of long-term consumption of a weaning food supplemented with oligofructose, a prebiotic, on general infant health status J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., vol. 29(4); pp. A58

Van den Heuvel E.; Muys T.; Van Dokkum W., Schaafsma G. (1999); Oligofructose stimulates calcium absorption in adolescents. Am. J. Clin. Nutr., vol.69, pp. 544-548.

Van Loo J.; Coussement P.; De Leenheer L.; Hoebregs H.; Smits G. (1995), "On the presence of inulin and oligofructose as natural ingredients in the Western diet", Critical reviews in food science and nutrition, vol.35 (6), pp. 525-552.

Van Loo J.; Cummings JH.; Delzenne N.; Englyst HN.; Franck A.; Hopkins MJ.; Kok N.; Macfarlane GT.; Newton DF.; Quigley ME.; Roberfroid MR.; van Vliet T.; Van den Heuvel EGH. (1999)"; Functional food properties of non digestible oligosaccharides : a consensus report from the ENDO project (DGXII AIRII-CT94-1095)", Brit. J. Nutr., vol.81, pp.121-132.

WOLFGANG KNEIFELOPRACOWYWANIE NOWYCH PRODUKTW, A KRYTERIA JAKOCI PRE-, PRO- I SYNBIOTYKW.

Department of Dairy Research & Bacteriology,University of Agricultural SciencesGregor Mendel-Str. 33A-1180 Vienna, Arustriatel. + 43-1-47654-6103Fax + 43-1-47654-6122e-mail: kneifel@edv1.boku.ac.au

Dzisiaj pro-, pre- i synbiotyki reprezentuj wan kwesti w dziedzinie ywnoci funkcjonalnej, ktrej potwierdzeniem s ich waciwoci prozdrowotne. Poza wartoci odywcz, ta nowa kategoria ywnoci charakteryzuje si odpowiednio zbalansowanym skadem, co przyczynia si do lepszego funkcjonowania ciaa ludzkiego, w tym do zapobiegania i leczenia chorb. Innymi sowy, ywnoci funkcjonalna jest projektowana i wytwarzana w celu oszacowania korzystnych oddziaywa, poza normalnymi skadnikami i waciwociami ywnoci. Rezultatem tej strategii w ostatnich 5 latach, jest wytwarzanie rozmaitej ywnoci funkcjonalnej, zarwno produktw mniej lub wicej wzbogacanych, jak te zupenie nowych, speniajcych oczekiwania wspczesnej nauki, jak i akceptowane przez konsumentw.Produkty mleczne zawierajce bakterie kwasu mlekowego (LAB) jako ywe skadowe odgrywaj dominujc rol w tym segmencie rynku. Pomimo duej rnorodnoci mlecznych produktw fermentowanych, nadal stwarzajcych znaczce moliwoci innowacji, ktre pozwalaj dalej rozwija t dziedzin. Dobroczynne zastosowanie LAB siga pocztku ubiegego stulecia. Jednak zainteresowanie probiotykami (krtka definicja: korzystne mikroorganizmy) w ywnoci wyrane oywio si od wczesnych lat dziewidziesitych. Chocia probiotyki w paszy zwierzcej s stosowane na szerok skal od lat siedemdziesitych, ich zastosowanie nie jest dobrze znane ywieniowcom. W midzyczasie Komisja Europejska wydaa restrykcyjne regulacje dotyczce probiotykw w paszy dla zwierzt, z jednej strony ze wzgldu na spektrum mikroorganizmw, w tym szeroko stosowanych w ywnoci, z drugiej, z powodu pojawiajcego si problemu opornoci probiotykw na antybiotyki.Innym rodzajem ywnoci funkcjonalnej s prebiotyki, ktre stymuluj dobroczynn mikroflor jelitow, w szczeglnoci bifidobakterie. Prebiotyki stanowi interesujc alternatyw dla bakterii probiotycznych, a nale do heterogennej grupy bonnika pokarmowego (z rodzaju oligo- i polisacharydw). S gwnie pozyskiwane z rolin, ale take z serwatki i coraz czciej dodawane do produktw mleczarskich i innej ywnoci. Stosowane s w celu osignicia tych samych korzystnych efektw, co probiotyki, poprzez wspomaganie rwnowagi mikrobiologicznej w jelitach, ale cukry prebiotyczne mog take poprawia walory sensoryczne i tekstur ywnoci, do ktrej s dodawane, maj ponadto nisk warto kaloryczn. Naturaln kolej rzeczy byo czenie pro- i prebiotykw tworzc tak zwane synbiotyki, ktre mog wywiera dwojakie korzystne dziaanie. Pomimo tych waciwoci, zastosowanie prebiotykw musi by rozwaone bardziej dogbnie, jeli chodzi o obserwowane reakcje na zastosowan dawk substancji. Ostatnie badania wskazuj, e kilka substancji prebiotycznych moe by wykorzystywanych przez wybrane szczepy probiotyczne, a przez inne nie. Jeli produkty synbiotyczne maj by unowoczeniane, zainteresowanie przede wszystkim powinno skupia si na sprawdzeniu sposobw metabolizowania tych wglowodanw przez szczepy stosowane w produktach, aby unikn tworzenia mieszanin nie majcych znaczenia zdrowotnego.Rozwj ywnoci funkcjonalnej nie tylko bierze pod uwag przetwarzanie, ale take optymalizacj technologiczn i waciwoci sensoryczne. Dotyczy on te wzmacniania dziaania biofunkcjonalnego, ktre musi by udowodnione w badaniach klinicznych. Tylko te produkty, ktrych waciwoci s potwierdzone naukowo bd zaakceptowane w przyszoci jako funkcjonalne. W odniesieniu do aktualnej wiedzy na temat ywnoci probiotycznej, producenci powinni udowodni, e produkt finalny (nie tylko zastosowane mikroorganizmy) wywiera pozytywne skutki. To oznacza, e nawet zmiany w recepturze produktu mog wymaga ponownego potwierdzenia waciwoci probiotycznych w innych badaniach klinicznych. Chocia taka sytuacja moe przyczyni si do podjcia bada i promowania roli instytucji naukowych, mona si spodziewa, e producenci ywnoci bd musieli obliczy dokadnie swoje korzyci przed podjciem decyzji o opracowywaniu produktw funkcjonalnych.Oszacowanie jakoci ywnoci pro-, pre- i synbiotycznej jest wanym zadaniem. Wiadomo, e musi by okrelona wyselekcjonowana liczba mikroorganizmw probiotycznych, poniewa udokumentowano, e dziaanie probiotyczne moe by osignite tylko jeeli produkt zawiera du liczb specyficznych bakterii. Z tego powodu, podejmowane wysiki musz by skierowane na rozwijanie metod, dziki ktrym moliwe jest oznaczenie bakterii probiotycznych wrd mieszanej mikroflory produktu. Po drugie potrzebna jest take identyfikacja szczepw w produkcie i zapewnienie, e te specyficzne mikroorganizmy mog przey w rodowisku przewodu pokarmowego, co najmniej do tego miejsca w jelicie, w ktrym ujawnia si ich specyficzne dziaanie. Chocia ta droga mikroorganizmw moe by symulowana w warunkach in vitro (istnieje kilka reaktorw modelowych), prawdziwe zachowanie (in vivo) szczepw musi by ostatecznie badane w testach klinicznych.Innym tematem dyskutowanym gwnie w odniesieniu do probiotykw w karmieniu zwierzt s ich waciwoci opornoci na antybiotyki. Pierwotnie rozwaane je jako cech pozytywn (niektre oporne szczepy probiotykw mog by wykorzystywane w terapii antybiotykowej), lecz istniej dowody, e pewne czynniki opornoci mog by take przenoszone do niepodanych mikroorganizmw drog rnych mechanizmw molekularnych. Dlatego producenci skadnikw pasz probiotycznych musz upewni si, e ich szczepy nie zawieraj moliwych do przeniesienia czynnikw opornoci na antybiotyki. Z powodu tej sytuacji, mona oczekiwa, e ta oporno stanie si w przyszoci wanym problemem w odniesieniu do mikroorganizmw w ywnoci.W tej prezentacji, poruszone wczeniej tematy bd przedstawione szczegowo. Przytoczone zostan przykady i punkty dyskusyjne dotyczce generalnych zasad tworzenia nowych produktw probiotycznych, aspektw kontroli jakoci, bada nad kombinacjami synbiotykw, technik symulacji przechodzenia mikroorganizmw przez przewd pokarmowy, czynnikw wskazujcych na specyficzne ilociowe oszacowanie i techniki identyfikacji, czynnikw opornoci antybiotykowej i innych aspektw bezpieczestwa ywnoci.

WOLFGANG KNEIFELPRODUCT DEVELOPMENT AND QUALITY CRITERIA OF PRO-, PRE- AND SYNBIOTIC FOODS

Department of Dairy Research & Bacteriology,University of Agricultural SciencesGregor Mendel-Str. 33A-1180 Vienna, AustriaTel. +43-1-47654-6103Fax +43-1-47654-6122e-mail: kneifel@edv1.boku.ac.at

Today, pro- pre- and synbiotic foods represent an important issue within the the area of functional foods, which are claimed to possess several health-relevant advantages. In addition to their basic nutritive value, this new food category contains a proper balance of ingredients that enhance the functions of the body, including helping us directly in the prevention and treatment of illness and disease. In other words, the area of functional foods has been created and designed to provide beneficial elements and effects, besides the normal composition and properties of food. Following this strategy, a broad variety of functional foods has been created during the last five years, ranging from more or less supplemented products to innovative ones, which meet both current scientific demands as well as consumers acceptance.Dairy products containing lactic acid bacteria (LAB) as live components are known to play a dominant role in this market segment. In spite of the big diversity of fermented milks, these products still possess a considerable innovation potential, which allows further development of this area. The beneficial use of LAB has its roots in the beginning of the last century. However, probiotics (brief definition: beneficial micro-organisms) in foods undergo some pronounced revival since the early nineties. However, it is not well known among food scientists that another approach, probiotics in animal feeds, has been applied to a large extent even longer, approximately since the seventies. Meanwhile, the European Commission has published restrictive regulations for probiotics in animal feeds, on one hand, because the spectrum of micro-organisms therein used is much broader than in the food area, on the other hand also due to emerging problems with regard to antibiotic resistance properties. Another segment of the functional food area is covered by the so-called prebiotics, which stimulate some beneficial bacteria in the gut, in particular bifidobacteria. Prebiotics have been found to constitute an interesting alternative to probiotic bacteria and belong to the heterogeneous group of dietary fiber of oligo- and polysaccharidic nature. They are mainly of plant, but also of whey origin and increasingly incorporated into dairy products and other foods. Primarily aiming at the same beneficial effects as probiotics by supporting the microbial balance of the intestine, prebiotic sugars may also improve sensory and textural attributes when added to foods. Furthermore, they mainly are of low caloric value. It was quite obvious to combine pro- with prebiotics in so-called synbiotic products, which may exert a twofold beneficial effect. Despite these features, the application of prebiotics has to be considered more in depth, since dose-response side-effects have been discussed. Recent studies have shown that some prebiotic substances can be utilized by certain probiotic strains, but others not. Therefore it would be of interest first to screen the utilisation patterns of the sugars and strains in order to avoid non-relevant mixtures, if synbiotic products will be deveoped.The development of functional foods does not only take into account processing factors, technologicical optimization and sensory parameters. Moreover, it is based on meeting and enhancing certain biofunctional effects, which have to be demonstrated in clinical studies. Only those products will be accepted as functional ones in the future, which provide scientifically certified claims. According to a currently discussed expertise, with probiotic products the manufacturer should prove that the final product (not only the micro-organism used) exerts positive effects. This means that even changes in the formula of the product may result in a new need for having re-confirmed the effects in another clinical study. Although this situation might fertilize some research activities and promote the role of scientific institutions, it can be expected that food producers will have to calculate exactly their benefits before following their decision to develop functional products. Quality assessment of pro-, pre- and synbioti