Analiza proteomiczna profili białkowych w niektórych stanach patologicznych ludzkiego organizmu

Proteomic analysis of protein profiles in some pathological stages of the human organism

Barbara Kossowska1, Ilona Dudka2, Roman Gancarz2,Jolanta Antonowicz-Juchniewicz3

1 Katedra i Zakład Chemii i Immunochemii Akademii Medycznej we Wrocławiu2 Zakład Chemii Medycznej i Mikrobiologii Politechniki Wrocławskiej3 Klinika Chorób Wewnętrznych, Zawodowych i Nadciśnienia Tętniczego Akademii Medycznej we Wrocławiu

Streszczenie

Elektroforezadwuwymiarowa(2-DE)jestpowszechniestosowanąmetodąrozdziałubiałekbada-negoproteomuumożliwiającąichwykrywaniewszerokimzakresiestężeń.PrzygotowaniepróbdoogniskowaniaizoelektrycznegoielektroforezySDS-PAGE,wizualizacjaplambiałkowychde-cydująojakościuzyskiwanychmapbiałkowych.Komputerowaanalizamapproteomupozwalanaporównanieiwykrycieróżnicwbadanychprofilachbiałkowych,awpołączeniuzespektrome-triąmasową(MS)umożliwiaidentyfikacjępojedynczychbiałek.Zapotencjalneźródłonowychbiomarkerówdiagnostycznychuważasięprzedewszystkimniskocząsteczkowefrakcjebiałkowefizjologicznychpłynówustrojowych.Frakcjeteuzyskujesięzwykorzystaniemtechnikchroma-tografiipowinowactwa,immunopowinowactwaimetodąultrafiltracji.Połączeniemetodanalizyproteomicznejimetabonomicznejdostarczazbiorunowychmarkerówprzydatnychwnowocze-snejdiagnostycemedycznej.

Połączenietechniki2-DEispektroskopii1Hrezonansumagnetycznegoumożliwiłymonitorowa-nierozwojułagodnegozaburzeniapoznawczego(MCI)wpełnoobjawowąchorobęAlzheimera(AD).Analizaproteomuwątrobyikrwinekczerwonychpacjentówzezdiagnozowanąschizofreniąwskazujenaprzydatnośćtkaneknarządówobwodowych,anietylkopłynumózgowo-rdzeniowego,wdiagnozowaniutejchoroby.Technikiproteomiczneumożliwiająidentyfikacjęnowychbiomar-kerówchoróbreumatycznychwosoczu,płyniestawowymitkankachstawowych.Nowebiałko-wemarkery(osocza,surowicy,sokutrzustkowego,moczu)choróbnowotworowychumożliwiająwcześniejsządiagnozęimonitorowanieprzebieguchoroby.Analizaproteomumatczynejsuro-wicyipłynówowodniowychwskazujenamożliwośćwykorzystaniawbadaniachprenatalnychbiałkowychmarkerówwrozpoznaniuzespołuDowna.Badaniaproteomiczneumożliwiłyocenęwpływuskażeniaśrodowiskanaukładodpornościowy.

Słowa kluczowe: elektroforeza dwuwymiarowa • mapa białek • analiza proteomiczna • marker

Summary

Two-dimensionalgelelectrophoresis(2-DE)isawidelyusedmethodforseperationoftheproteinsofaproteomeanditenablestheirdetectioninalargeconcentrationrange.SamplepreparationforisoelectricfocusingandSDS-PAGEelectrophoresisaswellasspotvisualizationdeterminesthequ-alityoftheobtainedproteinmaps.Computeranalysisoftheproteomemapsallowscomparisonanddetectiondifferencesinproteinprofiles.Incombinationwithmassspectrometry(MS)itenablesthe

Received: 2009.09.14Accepted: 2009.10.20Published: 2009.11.12

549

Reviewwww.phmd.plPostepy Hig Med Dosw. (online), 2009; 63: 549-563

e-ISSN 1732-2693

-

-

-

-

-

Terminproteomika,czylianalizaproteomu,zostałwprowa-dzonyprzezMarcaR.WilkinsonanakonferencjiwSieniew1994r.Nazwaproteompochodziodangielskiegookreśle-niaPROTeincomplementofthegenOME(składnikbiałko-wykodowanyprzezgenom)[22,67,70,99].Celemproteomikijestpoznanieicharakterystykawszystkichbiałek,którepo-wstająwwynikuekspresjiludzkiegogenomu.W2001r.po-wołanoOrganizacjęProteomuLudzkiego–HUPO(HumanProteomeOrganisation),którejzałożeniemjestkoordynacjabadańproteomicznychwskalimiędzynarodowej.JednymzpodstawowychzałożeńHUPOjestbadaniezmianekspre-sjibiałekwprocesierozwoju,zrozumieniuzłożonegosys-temujakitworząbiałkaorazpoznaniuichroliwprocesachpatologicznychorganizmówżywych[7,22,106].

Sposóbbadaniaproteomuznacząco różni sięodkla-sycznych technikbiochemicznychstosowanychw iden-tyfikacji,badaniuwłasnościifunkcjipojedynczychbia-łek.Proteomikawykorzystujewieletechniksłużącychdo

jednoczesnejanalizysetek lub tysięcybiałek.Białkasątrudnymobiektembadańzewzględunaichprzestrzennąstrukturęiwystępowaniewwielkocząsteczkowychkom-pleksach.Badanieproteomunieograniczasiędootrzy-manialistybiałekznajdującychsięwokreślonejkomórce/tkance.Nabardzodynamicznyobrazproteomuskładająsięm.in.zmianywpojedynczejkomórcezwiązanezjejcyklemżyciowym,rozmieszczeniembiałekwobrębiestrukturko-mórki,czywzajemneoddziaływaniakomórektworzącychtkanki.Proteomikazmierzadopoznaniawszystkichbia-łekpojawiającychsięwdanymorganizmiewciągucałe-gożycia[3,16,33,35,70,110].

Liczbabiałekproteomujestznaczniewiększaniżliczbako-dującychjegenów.DziękiProjektowiPoznaniaLudzkiegoGenomu–HGP(HumanGenomeProject)ustalono,żeludzkigenomzawierawprzybliżeniu30–50tysięcyge-nówkodującychbiałka.Liczbabiałekludzkiegoproteomupoznanychdotejporytookoło500tysięcy,cooznacza,że

identificationofasingleprotein.Low-abundanceproteinsofphysiologicalbodyfluidsareconside-redasthepotentialsourceofdiagnosticbiomarkers.Theseareobtainedbysuchtechniquesasaffini-tychromatography,immunoaffinity,andultrafiltration.Acombinationofproteomicandmetabono-micanalysisprovidesacollectionofnewmarkerswhicharehelpfulinmodernmedicaldiagnostics.

Thecombinationofthe2-DEtechniqueand1HMRSenablesmonitoringmildcognitiveimpa-irment(MCI)andtheevolutionofAlzheimerdisease(AD).Proteomeanalysisoftheliverandredbloodcellsofpatientswithdiagnosedschizophreniaindicatestheimportanceofanalyzingexternaltissue,notonlycerebrospinalfluid,inthediagnosisofthisdisease.Proteomictechni-quesenabletheidentificationofnewbiomarkersinrheumaticdiseasebyanalyzingplasma,arti-cularfluidandtissues.Newproteinbiomarkers(inplasma,serum,pancreaticjuice,urine)ena-bleearliercancerdiagnosisanddiseasemonitoring.ProteomeanalysisofmaternalserumandamnioticfluidcreatesthepossibilitydetectionofproteinmarkersinprenataltestsdiagnosingDown’ssyndrome.Proteomicstudiesenableassessmentoftheinfluenceofenvironmentalcon-taminationontheimmunologicalsystem.

Key words: two-dimensional gel electrophoresis • protein map • proteomic analysis • marker

Full-text PDF: http://www.phmd.pl/fulltxt.php?ICID=898186

Word count: 7071 Tables: — Figures: 2 References: 118

Adres autorki: dr Barbara Kossowska, Katedra i Zakład Chemii i Immunochemii AM, ul. Bujwida 44a, 50-345 Wrocław; e-mail: barbara@immchem.am.wroc.pl

Wykaz skrótów: aCCP –przeciwciała przeciw cytrulinowanym białkom/peptydom (anti-cyclic citrullinated peptide); AD – choroba Alzheimera (Alzheimer’s disease); Ab – b-amyloid (b-amyloid); CSF – płyn mózgowo-rdzeniowy (cerebrospinal fluid); 2D-DIGE – fluorescencyjna elektroforeza różnicowa (two-dimensional fluorescenc difference gel electrophoresis); 2-DE – elektroforeza dwuwymiarowa (two-dimensional gel electrophoresis); HCC – rak wątrobowokomórkowy (hepatocellular carcinoma);1H NMR – protonowy rezonans magnetyczny (proton nuclear magnetic resonance);IEF – ogniskowanie izoelektryczne (isoelectric focusing); MCI – łagodne zaburzenia poznawcze (mild cognitive impairment); mI – mioinozytol (myo-inositol); MS – spektrometria masowa (mass spectrometry); NAA – N-acetyloasparaginian (N-acetylaspartate); OA – choroba zwyrodnieniowa stawów (osteoarthritis); RA – reumatoidalne zapalenie stawów (rheumatoid arthritis);SDS-PAGE – elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z siarczanem dodecylu (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis); TNF-a – czynnik martwicy nowotworów a (tumor necrosis factor a).

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

550

-

-

-

-

-

najedengenprzypadaprawie10różnychwariantówbia-łek.Przyczynątejdysproporcjisąprocesymolekularnegoskładaniapodczastranslacjiipowstawaniainformacyjne-gokwasurybonukleinowegoorazprocesypotranslacyjnejmodyfikacji, takie jakfosforylacjaczyglikozylacja,któ-rewpływająnaostatecznąstrukturębiałka.Pełnaanali-zabiałekzawartychwmaterialebiologicznymmożebyćźródłemwielunowychinformacjiozdrowiupotencjalne-gopacjenta[22].

Wybrane metody analizy proteomu

Wciąguostatnichlatopracowanowielemetodumożliwia-jącychcałościowąanalizęproteomu.Wwykrywaniumar-kerówbiologicznychstosowanesątechnikipozwalającenaporównywaniezłożonychmieszaninbiałkowychiilościowąocenęichposzczególnychskładników.Metodyteumożli-wiająokreśleniezmianekspresjibiałka,modyfikacjipo-translacyjnych,interakcjimiędzybiałkamiiichrozmiesz-czeniawkomórkach.Wproteomiceklinicznej,dlaktórejpodstawowymcelemjestposzukiwanieróżnicwprofilachbiałkowychosóbzdrowychichorych,stosowanesągłów-nieelektroforezadwuwymiarowaispektrometriamasowa[70,84,91,94,96,106,110].Obiemetodyumożliwiająidenty-fikacjępojedynczychbiałek–potencjalnychmarkerówdia-gnostycznych.Analizastatystycznawieluzmiennych,cha-rakteryzującychprofilebiałkowe,pozwalanaidentyfikacjęgrupbiałek,dlaktórychzmianyekspresjimająznaczeniediagnostycznelubprognostyczne[29,111].Schematprze-bieguanalizyproteomicznejprzedstawiaryc.1.

Elektroforeza dwuwymiarowa

Elektroforezadwuwymiarowa(2-DE) jestobecniepo-wszechniestosowanąmetodąrozdziału,pozwalającąna

jednoczesnąseparacjętysięcybiałek.Umożliwiadetekcjębiałekwszerokimzakresiestężeń,zwysokąrozdzielczo-ścią.Elektroforezadwuwymiarowajestźródłeminforma-cjidotyczącychzmianekspresjipojedynczychbiałekba-danychproteomóworazichmodyfikacji[6,42,70].Składasięzdwóchetapów.Pierwszymetapemjestogniskowa-nieizoelektryczne(IEF),wktórymbiałkasąrozdzielanewgradienciepHwzależnościodpunktuizoelektryczne-go(pI),czyliwartościpH,przyktórejładunekwypadkowybiałkajestrównyzero.WogniskowaniuizoelektrycznymstosowanesąpaskiżeliIPGzimmobilizowanymgradien-tempH(immobilizinngPHgradient)gwarantującymwy-sokąrozdzielczośćipowtarzalnośćwyników[85,90,112].DorozdziałubiałekwIEFmożnastosowaćrównieżka-pilaryzżelempoliakryloamidowymzokreślonymgra-dientempH[26].

Wdrugimetapieelektroforezybiałka są rozdzielanezgodniez ichmasącząsteczkowąmetodąSDS-PAGE[6,12,30,42,44,70].Dobierającwdrugimetapieelektro-forezyodpowiedniestężeniaakrylamidulubstosującgra-dient stężeniaakrylamidumożnauzyskiwać rozdziałybiałekopodobnychmasachcząsteczkowych.Precyzyjnezaplanowanieobuetapów2-DEumożliwiauzyskanieob-razunawetkilku tysięcybiałek.Możliwe jestwykryciebiałekwystępującychwbadanejpróbiewilościachfem-tomolowych[12].Opracowanemetodydetekcjiumożli-wiająotrzymaniemapbiałkowychbadanychproteomów[18,33,57,60,62,64,81,86,92,93,114].

Frakcjonowanie białek badanego proteomu

Wbadaniachproteomicznychposzukujesięgłówniemar-kerówzmianpatologicznychwpłynachustrojowych,ta-kichjak:surowica,osocze,ślina,płynmózgowo-rdzeniowy

Ryc. 1. Schemat przebiegu analizy proteomicznej z za-stosowaniem elektroforezy dwuwymiarowej w połączeniu z Western blottingiem i spektro-metrią mas (opracowano na podstawie [104 i 105] – zmodyfikowano)

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

551

-

-

-

-

-

(CSF),płynowodniowy,płynstawowyorazmocz[16,37,40,50,53,60,97,98,102,104,108,112,114].Odrębnykieru-nekbadaństanowianalizaproteomutkanek ikomórek[16,50,60,76].Największynaciskkładziesięnaposzuki-waniebiałkowychmarkerówzmianchorobowychwma-terialebiologicznym,uzyskanymwnieinwazyjnysposób.Znalezienieiidentyfikacjaswoistychbiałkowychmarke-rówmożewspomócklinicznądiagnozę,monitorowanieprzebieguchorobyorazprowadzenieterapii.

Wludzkiejsurowicywystępujewieletysięcybiałek/pepty-dówostężeniuwzakresie35–50×109pg/mldo0–5pg/ml.Dobrzepoznano22białka,stanowiące99%surowiczegopro-teomu,coprzedstawiaryc.2.Pozostały1%białek/peptydów,nazywanypeptydomem,mamasycząsteczkowemniejszeniż10000Da.Większośćztychmałychbiałek/peptydówjesttrudnychdozidentyfikowaniaiwykonaniaanalizyilościo-wej,nietylkozpowoduichmałejilościwsurowicy,aletak-żezewzględunaichtendencjęprzyłączaniasiędobiałektransportujących,takichjakalbumina.Niskocząsteczkowafrakcjasurowiczegoproteomuzawieram.in.:hormony,cy-tokiny,czynnikiwzrostuiproteolitycznefragmentywyso-kocząsteczkowychbiałek.Białkateodgrywająznaczącąrolęwprocesachbiologicznychidlategomogąsięstaćwarto-ściowymibiomarkeramidiagnostycznymi[31,55,105,115].

Huiwsp.[36]wpracyprzeglądowejpoświęconejanalizieproteomuludzkichpłynówfizjologicznychcytują10prac,wktórychusuwanozosocza/surowicy:albuminy,immuno-globulinyIgG,a1-antytrypsynę,fibrynogenihaptoglobi-nęprzedwykonaniemanalizyproteomu.Usunięciezba-danegomateriałubiałekwystępującychwnajwiększychilościachumożliwiaanalizęekspresjibiałek,którychstę-żeniejestniewielkie[11,21,25,31,42,55,87,100,115,116].

Metodyusuwaniabiałekwystępującychwdużych ilo-ściachwbadanymmaterialeopierająsięm.in.natechni-cechromatografiipowinowactwa[2,11],w tymgłówniechromatografiiimmunopowinowactwazwykorzystaniemprzeciwciał[11,42]czyseparacjibiałekwzależnościodmasycząsteczkowejzużyciemodpowiednichmembran[30,55,115,116].

DonajczęściejusuwanychbiałekzsurowiczegoproteomunależąalbuminyiimmunoglobulinyklasyG.Millioniiwsp.[61]rekomendujązestawHSA/IgGRemovalKitdoszyb-kiegousuwaniaalbuminiIgG.Akgoiwsp.[4]opraco-walisyntetycznepolimerycznezłoże,nabaziepolietylenu,

charakteryzującesiępseudoswoistympowinowactwemdoalbuminiIgG.Polimerycznezłożeumożliwiausunięcietychbiałekzludzkiejsurowicy.Złożemnajczęściejsto-sowanymdousuwaniaalbuminzsurowiczegoproteomujestCibraconBlue(wielopierścieniowyanionowyligand).WzestawieProteoPrepBluefirmySIGMAstosowanyjestbarwnikCibraconBlueimmobilizowanydoagarozy.Barwniktenwiążenietylkoalbuminy,alerównieżbiałkazwiązanezalbuminami.Oznaczatopewnestratywbada-nymproteomie[21,25].WzestawieProteoPrepBluefirmySIGMAzastosowanorównieżbiałkoGimmobilizowanedoagarozy,wiążącesięzfragmentemFcimmunoglobu-linklasyG.Inneklasyimmunoglobulinpozostająwma-terialebadanym[25,42].

Dousuwaniabiałekwystępującychwsurowicywnaj-większych ilościachstosowanesą równieżprzeciwciałapoliklonalne.Umożliwiająonewiązanieznacznychilościokreślonychbiałek,przyjednoczesnejminimalizacjiutra-typozostałychskładnikówsurowicy[42].Chromatografiaimmunopowinowactwazzastosowaniemkurzychprzeciw-ciałIgYpozwalanausunięciezludzkiegoosoczaalbumin,IgG,IgA,IgM,fibrynogenu,transferryny,haptoglobiny,a2-makroglobuliny,a1-kwaśnejglikoproteiny,a1-antytrypsyny,apolipoproteinyA-IHDL,apolipoproteinyA-IIHDL,czyn-nikdopełniaczaC3orazapolipoproteinyB[87].

Corazczęściej stosowanąmetodąusuwaniabiałekwy-sokocząsteczkowychzbadanychproteomówjestfiltracjapłynówfizjologicznychprzezmembrany.Wprocesieul-trafiltracjizawieszoneciałastałeisubstancjerozpuszczo-neodużejmasiecząsteczkowejsązatrzymywane,anisko-cząsteczkowebiałka/peptydyprzechodząprzezmembranę[55].Membranyumożliwiająotrzymywaniefrakcjibiał-kowychomasachdo10kDa[7,115],do30kDa[100,116]ido50kDa[30,66].Warunkiprowadzeniaultrafiltracjide-cydująokońcowymskładziefiltratu[30].Udowodniono,żedodanieacetonitryludorozcieńczonejsurowicy lubosoczadokońcowejobjętości20lub25%(v/v)korzyst-niewpływanailośćuzyskiwanychniskocząsteczkowychbiałek/peptydów.Acetonitryljestczynnikiemdenaturują-cymbiałkaimawpływnainterakcjębiałko–białko/pep-tyd.Powodujetouwolnienieniskocząsteczkowychbiałek,związanychzalbuminamilubinnymiwysokocząsteczkowy-mibiałkami.Tłumaczyto15%wzrostilościbiałek,prze-chodzącychprzezmembranęwstosunkudoultrafiltracjibadanegomateriałubezużyciaacetonitrylu[55].Wynikipracwielubadaczywskazują,żewarunkiultrafiltracji,

Ryc. 2. Diagram kołowy białkowego składu ludzkie-go osocza. Dwadzieścia dwa białka stanowią 99% proteomu osocza (opracowano na pod-stawie rysunku z prezentacji zamieszczonej na stronie internetowej: http: //www.plasmapro-teome.org/)

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

552

-

-

-

-

-

zastosowanierozcieńczonejsurowicylubosoczaiodpo-wiednidobórstężeniaacetonitryludecydująowzbogace-niuniskocząsteczkowejfrakcjibiałekprzeznaczonychdoanalizyproteomicznej[30,55,115,116].Metodaultrafiltra-cjiumożliwiłaidentyfikacjęniskocząsteczkowychbiomar-kerów,m.in.rakapłuc[34],rakajajnika[9],rakawątro-bowokomórkowego[69].

Przygotowanie prób do IEF i SDS-PAGE

Obrazmapybadanegoproteomuzależyodwarunkówroz-działubiałekwgradienciepHielektroforezySDS-PAGE.Decydująceznaczeniemaskładbuforówstosowanychwobuwymiarach.

Podstawowymskładnikiemroztworówstosowanychwogni-skowaniuizoelektrycznymwwarunkachdenaturującychjestmocznik.Jestonneutralnymchaotropemdenaturują-cymbiałkaprzezrozerwaniewiązańniekowalencyjnychijonowych.Roztwory,wktórychrozpuszczanesąpróbybiałekzawierająmocznikwstężeniu5,0–9,8M/L.Mocznikwchodzi równieżwskładbuforówrównoważącychżelezbiałkami rozdzielonymiwgradienciepHprzedelek-troforeząSDS-PAGE[33,42,85].Zapobiegająctworzeniusięagregatówbiałkowychdodajesiędoroztworówdena-turującychtiomocznik.Dlapoprawieniarozpuszczalnościbiałekhydrofobowychstosujesięroztwórmocznikaitio-mocznikawstężeniachodpowiednio5–7i2M/L[2,40,68].

PrzedelektroforeząSDS-PAGE,prowadzonąwwarunkachdenaturującychiredukujących,żelezbiałkamirozdzielo-nymiwgradienciepH,równoważysięwodpowiednimbu-forze.BuforopH8,8zawieram.in.czynnikredukujący1,4-ditiotreitol(DTT)orazjodoacetamid.Ditiotreitolsto-sowanywstężeniach20–100mM/Lredukujemostkidi-siarczkowe[33,42,85].Jodoacetamid(stosowanywstężeniu2–4%)alkilujegrupysulfhydrylowecysteinyuniemożli-wiającichreoksydacjęwtrakcieelektroforezySDS-PAGE[40,85,112].WbuforzerównoważącymopH8,8jodoace-tamidmożereagowaćztiomocznikiem.Obniżatowydaj-nośćreakcjialkilowaniagrup–SHcysteiny,comożeprowa-dzićdoodtwarzaniamostkówdisiarczkowych.Dodatkowostwierdzono,żetiomocznikutrudniaopłaszczaniebiałekprzezSDS[42,85].Konsekwencjąobecnościtiomocznikamogąbyć„fałszywe”plamybiałkowe,smugiiciemniej-szetłonamapiebadanegoproteomu[42].

Dodanieamfolindoroztworu,wktórymbiałkaulegająogniskowaniuizoelektrycznemu,minimalizujeagregacjębiałekipoprawiaprzewodnictwoelektrycznewcałymza-kresiepH[42].Amfolinysąniskocząsteczkowymi,am-foterycznymizwiązkamiodużejpojemnościbuforowej.

Wskładroztworu,wktórymbiałkasąrozdzielanewgra-dienciepH,wchodząrównieżdetergentyznaczącowpływa-jącenarozpuszczalnośćbiałek.Dlawarunkówniedenatu-rującychogniskowaniaizoelektrycznegorekomendowanesądetergentyniejonowe:NonidetNP-40iTritonX-100sto-sowanewstężeniach0,4–4%[33,85].

DetergentemstosowanymwIEFidodawanymdobuforurównoważącegoprzedSDS-PAGEjestCHAPS(3-[(3-cho-lamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian)za-wierającyczwartorzędowągrupęamoniowąo ładunku

dodatnimigrupęsulfonowąoładunkuujemnym.CHAPS(zwitterionicdetergent),stosowanywstężeniu4%,jestde-tergentemrekomendowanymdorozpuszczaniabiałekbło-nowych,głównieroślinnych.WpraktyceCHAPSstosu-jesięrutynowowelektroforezie2-D[33,40,85,90,112].

Welektroforezie2-Dznaczącąrolęodgrywajonowyde-tergent–SDS(siarczandodecyluVI).SDSjestdetergen-temdenaturującymbiałko.Stosowanywstężeniu0,1–2%dodawanyjestdobuforurównoważącegoprzedelektrofo-reząSDS-PAGE.Siarczandodecyluopłaszczająccząstecz-kibiałeknadajeimładunekujemny[17,40,85].StosowanieSDSwroztworachdoIEFjestkontrowersyjne[90,112].SiarczandodecyluznakomiciepoprawiarozpuszczalnośćrozdzielanychwgradienciepHbiałek,aleinterferujezichnatywnymładunkiem.Uważasię,żedopuszczalnestęże-nieSDSwroztworzedoogniskowaniaizoelektrycznegobiałekniepowinnobyćwyższeniż0,25%[42,85].

Wizualizacja map białkowych

Wybarwianiebiałekjestetapemkończącymelektroforezę2-D.Najczęściejstosowanebarwnikito:błękitCoomassieBrillantBlueR-250,srebrokoloidalneorazznacznikiflu-orescencyjne.BarwieniebłękitemCoomassiejestrutynowostosowanewdetekcjibiałekrozdzielonychwSDS-PAGE.Metoda ta jest szybka, łatwa,odtwarzalna,alestosun-kowomałoczuła,wykrywabiałkawzakresie10–40ng[33,64,81,104].

Stosowaniesolisrebrawceluwizualizacjirozdzielonychbiałek, jest jednązpopularniejszychmetodbarwienia.Wynikatozwysokiejczułości(0,3–10ng),łatwościwy-konaniainiskiegokosztuodczynników.Mapybiałkowewybarwiasięodczynnikamisrebrowymi,jeśliwanaliziebadanegoproteomuplanowanajestspektrometriamaso-wa[18,33,86,104].

Wproteomiceklinicznejcorazczęściejstosujesięzna-kowaniebiałekfluorescencyjnymibarwnikamicyjanino-wymi(Cy3–zielony,Cy5–czerwony,Cy2–niebieski)[62].Barwnikicyjaninoweznaczniezwiększajączułośćde-tekcjibiałek.Wykrywają0,025–1ngbiałka[57,110,114].ZnacznikiCystosowanesąwdwuwymiarowejfluorescen-cyjnejelektroforezieróżnicowej2D-DIGE(two-dimensio-nalfluorescencedifferencegelelectrophoresis).Technikataumożliwiailościowąanalizęróżnicowąekspresjibia-łekwbadanymmateriale[21,30,33,57,106].Próbybiałekznakowanesąwtechnice2D-DIGEprzedelektroforezą.Zastosowanietrzechbarwników:Cy2,Cy3iCy5umożli-wiarozdziałbiałekwtymsamymżelu,np.dwóchbada-nychsurowicibiałkowychstandardówmascząsteczkowychipunktówizoelektrycznych.Podstawowymcelemtejtech-nikijestwykryciebiałekwykazującychstatystycznieistot-neróżnicewekspresjiwbadanymproteomie.Stwarzatomożliwośćidentyfikacjipotencjalnychbiomarkerów,któ-remogąbyćwykorzystywanewewczesnejdiagnostyce[21,28,30,57,76,106].

Wanalizieproteomicznejznajdujązastosowanie rów-nieżinneznacznikifluorescencyjne,np.SYPROOrange,SYPRORedlubSYPRORuby.Barwnikite,podobniejakbłękitCoomassieBrilantBlueisrebrokoloidalne,sąstoso-wanedoznakowaniabiałekpoelektroforezie2-D.Techniki

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

553

-

-

-

-

-

wykorzystującebarwnikifluorescencyjnesąbardzoczu-łe,aintensywnośćwybarwieniaplambiałkowychkorelu-jezilościąbiałka[33,60,92,93].

Spektrometria masowa

Spektrometriamasowa(MS–massspectrometry)jesttech-nikąumożliwiającąanalizępróbekowysokiejzłożoności.Metodatabyłapoczątkowostosowanatylkodoidentyfika-cjibiałek.Obecniewykorzystywanajesttakżedoilościo-wejocenyichekspresji[22,37,72,96].

Spektrometriamasowaznajdujezastosowaniewbadaniachproteomicznychm.in.oddziaływańmiędzybiałkami,po-translacyjnychmodyfikacji,mapowaniuprzestrzenikomór-kowych.Białkabadanegoproteomu,rozdzielonetechniką2-DE,sąekstrahowanezżelu,poddawaneenzymatyczne-mutrawieniuzużyciemswoistychproteazorazidentyfi-kowanezapomocąMS.Czułość tejmetodyumożliwiarozpoznaniebiałkazpojedynczejplamywżeluwilościponiżej1ng[6,16,30,43,96,106].

Wanalizieproteomunajczęściejsąwykorzystywanedwietechniki,MALDI(matrixassistedlaserdesorption/ioniza-tion)oraztandemowaspektrometriamas(MS/MS-tandemmassspectrometry).MALDIorazMS/MSstosowanesąwpołączeniuzelektroforeządwuwymiarowąlubstano-wiąsamodzielnąmetodę identyfikacjibiałekbadanychproteomów[6,15,30,33,49,71,72,94,96,106,114].Częstostosowanajestrównieżtechnika„shotgun”,umożliwiają-caokreślenieczęściowejsekwencjiiidentyfikacjębiałek[58,59].Uzyskanewidmamasowemappeptydowychmogąbyćporównywanezwidmamizbazdanych,np.Mascot,SEQUEST[6,15,49,54,76,94,96,105].

Bioinformatyka w proteomice

Bioinformatykawykorzystujeprogramykomputerowedorozwiązywaniaproblemówbadawczychiudostępnianiano-wychinformacji.Bioinformatykaproteomicznatonowa,bardzowąskowyspecjalizowanadziedzina.Koncentrujesięnaopracowywaniualgorytmówiprogramówsłużącychdogromadzeniaianalizywynikóweksperymentówprote-omicznych.Znajomośćtychmetodjestniezbędnadopra-widłowejinterpretacjiotrzymanychwyników.

Analizęporównawcząprofilibiałkowychprowadzisięnapróbachpochodzącychodpojedynczychpacjentówlub–znacznieczęściej–napulimateriałupochodzącegoodnie-wielkiejgrupypacjentówkliniczniezdiagnozowanych.Jeśliplanujesięanalizęproteomukilkusetosobowejgrupypa-cjentówwrazzlicznągrupąkontrolnąnależyzaplanowaćanalizęprzesiewowąnabaziewynikówklinicznychobugrup.Matonaceluwybraniepróbnajbardziejreprezenta-tywnychdlabadanychgrup.Najkorzystniejszejestwyko-nanieanalizzzastosowaniemwielualgorytmów.Analizakorelacjimacierzyorazanalizagłównychkomponentówmożezdecydowaćowyborzepróbekprzeznaczonychdoanalizy.Analizaklasterowagrupującaobiektyopodobnychcechach(przyzastosowaniuróżnychalgorytmówimetrykklasyfikujących)możepozwolićnapulowaniepróbgru-pybadanejikontrolnej.Zmniejszatozdecydowanielicz-bękoniecznychanalizdoporównaniaprofilibiałkowychgrupybadanejikontrolnej.Możnastosowaćrównieżinne

metodyzdziedzinyrozpoznawaniaobrazu,takiejak:sie-cineuronowe,nielinioweodwzorowanielubinne[14].

Metodąstosowanąpowszechniewproteomicejestelektro-forezadwuwymiarowa.Zewzględunazłożonośćobrazówżeli2-DEnajłatwiejszajestanalizazpomocąkomputerawyposażonegowodpowiednieoprogramowanie.Istniejekilkakomercyjniedostępnychoprogramowańdoanali-zy2-DE.Najbardziejznane istosowane to:MelanieIII(GenbioiBio-Rad)[10,78],PDQuest(Bio-Rad)[54,112]iZ3(Compugen)[78].Programytepozwalająnaporów-nanieiidentyfikacjęróżnicwprofilachbiałkowych–obec-nośćlubbrakbiałkanażelach,zmianywpoziomieekspre-sji(napodstawieintensywnościwybarwienia),przesunięciepozycjiwystępowaniabiałkawynikającenp.z jegomo-dyfikacji.Programydostosowująplamkidomodeligaus-sowskich,którerozdzielająobszaryplamekzachodzącychnasiebie(napodstawieróżnicgęstości),usuwająsmuże-nieipoprawiajądokładnośćwyznaczaniagęstościplamek[12].Programyprzeprowadzającnormalizację,tzn.usuwa-nieparametrówzmiennychzwiązanychzniedoskonałościąobrazów,pozwalająnaujednolicenieintensywnościplamtychbiałek,którychekspresjanapewnoniezmieniłasięwtrakciewykonywaniaeksperymentu[103].

Seriekrokówdowłaściwejocenyżelimożnapodsumo-waćwnastępującysposób:skanowanie,filtrowanieob-razów,automatycznewykrywanieplam, łączenieprofilibiałkowych,normalizacja,analizaróżnicowa,analizasta-tystyczna.Wkońcowymefekciekażdyżelprzedstawionyjestw trzechwersjach:oryginalny,niezmienionyobraz;przefiltrowanyobraz,któryjestprzefiltrowanąiprzetwo-rzonąkopiąoryginalnegoobrazuorazgaussowskiobraz,któryjestsyntetycznymobrazem,zawierającymgaussow-skiemodeleplam.Programytegotypupozwalająteżnastworzeniesyntetycznegożelu–żeluidealnego(MasterGel),zawierającegogaussowskiemodelewszystkichzi-dentyfikowanychplamwcałymzbiorzeżeli.Żelidealnyjestniezbędnywbadaniuróżnicwekspresjibiałekmiędzyżelami.Wartościpunktówizoelektrycznychimascząstecz-kowychwszystkichplamnażelachmogąbyćoszacowa-neprzezprzypisanieznanychwartościkilkuzidentyfiko-wanychbiałek.Analizastatystycznapozwalanawybranietychplam,któreznaczącoróżnicująporównywaneżelelubgrupyżeli.Wzaawansowanychwersjachprogramówkom-puterowychmożliwe jest równieżporównaniewynikówotrzymanychzkilkuodrębnycheksperymentów[33,56].

proteomika kliniczna

Istotąproteomikiklinicznejjestposzukiwanieróżnicwpro-filachbiałkowychosóbzdrowych ichorych.Uzyskanewynikimogąumożliwićweryfikacjędiagnozylekarskiej,stwarzająnadziejęnaopracowaniemetodumożliwiają-cychszybsządiagnozę,wykryciezmianchorobowychnapoziomiekomórkiprzedwystąpieniemzmianklinicznych,monitorowanieprzebieguleczeniachorobyorazopraco-wywanielekówdlapojedynczychpacjentów.Bardzoczę-stozmianywekspresji,wywołaneprocesemchorobowym,dotycząbiałek,którewystępująwmaterialebiologicznymwznikomychilościach[30,36,100,115].

Porównywanieproteomówosóbchorychizdrowychstwarzamożliwośćpoznaniaprzyczyn,mechanizmówiprzebiegu

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

554

-

-

-

-

-

schorzeń[30,62,70,96,106].Przydatnośćzidentyfikowa-nychbiałekwdiagnostyceposzczególnychjednostekcho-robowychpotwierdzasiętestamiimmunoenzymatyczny-mii/lubWesternblottingiem[15,37,41,43,60,63,80,97].

Intensywnie rozwijana jestproteomikachoróbneurode-generacyjnychipsychicznych[16,22,39,76,84,97,110,114],nowotworowych[33,41,68,70,92,96]orazreumatycznych[24,35,36,53,60,73,83,99,112]. IdentyfikacjanowychmarkerówzespołuDowna technikamiproteomicznymistwarzanadziejęnaudoskonaleniebadańprenatalnych[62,74,102,117].Rozwijanesąbadanianadnowymibio-markeramiprzedklinicznychzmianischorzeńuosóbprze-wleklenarażonychnazanieczyszczeniaśrodowiska,wtymmetaleciężkie[40,51,79].

Wostatnichkilkulatachpowstałypracełącząceanalizępro-teomiczną,wykonywanątechnikąelektroforezy2-Diana-lizęmetabonomicznązzastosowaniemgłównie1HNMR.Metabonomikatonowadziedzinanauki,zajmującasięjako-ściowympomiaremdynamicznejodpowiedziorganizmówżywychnabodźcezewnętrznelubmodyfikacjegenetyczne[65].Głównymitechnikamiwykorzystywanymiwmetabo-nomicesą:spektroskopiarezonansumagnetycznegoispek-trometriamasowa[5].Doniedawnaproteomikaimetabono-mikabyłymetodamistosowanymiosobnodoposzukiwanianowychmarkerówzmianchorobowych.Połączenieobutychmetoduważasiędziśzawysocesynergiczne.Wynikiuzy-skanezzastosowaniaobumetodjednocześniemogądostar-czyćzbiorunowychbiomarkerów,charakteryzującychsięwiększąswoistościąiczułością.Analizastatystycznada-nychprometabonomicznychłączyzłożonezbiorydanych,pochodzącychzrównoleglestosowanych technik2-DEi1HNMR.Jednymzesposobówprzedstawianiawynikówjestwizualizacjarelacjimetabolit-białkowpostacimapko-relacyjnych,obrazującychstopieńzależnościmiędzytymidwomazbiorami[107].

Krótkacharakterystykaaktualnychmetoddiagnostycznychwybranychjednostekchorobowych,wzestawieniuzwyni-kamibadańproteomicznych,wskazujenaudziałproteomikiklinicznejwrozwojunowoczesnejdiagnostykimedycznej.

Proteomika w badaniach choroby Alzheimera i schizofrenii

Chorobyneurodegeneracyjne,takiejakchorobaAlzheimera,Parkinsona,stwardnieniezanikowebocznereprezentująjed-nąznajważniejszychgrupchoróbwstarzejącejsięludz-kiejpopulacji[16].Patogenezatychschorzeńjestniepew-na,adiagnoza,opartagłównienaklinicznejobserwacji,nie jestwystarczająca.Odkrycieswoistychbiałkowychmarkerówmożeumożliwićbadanieprzebieguchorobyiustalenieefektywnejterapii[16].Heterogennośćpopu-lacjipacjentówzeschizofreniąjestjednymzczynników,odpowiedzialnychzaniewielką ilośćbiomarkerów,cha-rakteryzującychtęchorobę[84].

Jednązgłównychprzyczynstarzeniasięorganizmuczło-wiekailicznychchoróbneurodegeneracyjnychjeststresoksydacyjny.Wolnerodnikipowstałepodczasprzemianme-tabolicznychorganizmuatakująróżneskładnikikomórek.Wtrakciestarzeniasięorganizmustwierdzasiępostępują-cegromadzenieuszkodzeńDNAwkomórkachwiększości

tkanek.Zmianydegeneracyjne,wywołanewolnymirodni-kami,objawiająsięklinicznie,gdydysfunkcjaneuronówprzewyższazdolnośćkompensacyjnąmózgu[15,77,80].

Corazczęściejdiagnozachoróbneurodegeneracyjnychuzu-pełnianajestoczynnościowąanalizęobrazowania[109].Charakterystykaproteomu ludzkiegomózgu jestpierw-szymkrokiemwkierunkuzrozumienia jegostrukturyi funkcji.Większośćchoróbneurodegeneracyjnych jestswoistadlaokreślonychregionówmózgu.Mózgniejestłatwodostępnydobadańdiagnostycznych.Próbkiludzkiejkorymózgowejsąpobieraneibadanedopieropośmiert-nie [16,71,114].Spośródpłynówfizjologicznychnajbar-dziejwiarygodnymźródłembiomarkerówdladiagnostykichoróbneurodegeneracyjnych ipsychicznych jestprote-omCSF.Płynmózgowo-rdzeniowynajlepiejodzwiercie-dlazmianychoroboweośrodkowegoukładunerwowego,wywołanechorobamineurodegeneracyjnymiipsychicz-nymi,zewzględunajegoobecnośćwobrębieprzestrze-nipodpajęczynówkowej,komorachmózguorazwkana-lerdzeniakręgowego.Markeryzawartewosoczu,moczuiśliniewdiagnozowaniuchoróbośrodkowegoukładuner-wowegosąznaczniemniejswoiste[16,84].

Choroba Alzheimera

ChorobęAlzheimera(AD)charakteryzujeubytekneuro-nówgłówniewhipokampieiregionachbliskoznimzwią-zanych.Hipokampikoraśródwęchowaulegająuszkodze-niuwADwpierwszejkolejności.WpóźniejszychetapachrozwojuADwewszystkichczęściachkorymózgowejdo-chodzi,m.in.dogromadzeniasięwewnątrzkomórkowychzwyrodnieńwłókienkowychtypuAlzheimera(patologiabiałkatau),akumulacjizewnątrzkomórkowychblaszekamy-loidowych(zaburzonymetabolizmbiałkaApp)[16,47].

Białkotauib-amyloid(Ab–b-amyloid)sąnajlepiejscha-rakteryzowanymimolekularnymibiomarkeramichorobyAlzheimera.StosunekilościowyfosforylowanegobiałkatauistężeniaAbwpłyniemózgowo-rdzeniowymjestswo-istymwskaźnikiemchorobyAlzheimera,umożliwiającymprzewidywanierozwojuzaburzeńpoznawczychodłagod-nych(MCI)dopełnoobjawowejAD[13,46].

Obecnieuważasię,żewdiagnozowaniuADorazłagod-nychzaburzeńpoznawczych(MCI),którezczasemmogąsięrozwinąćwpełnoobjawowądemencjętypuAlzheimera,najbardziejprzydatnesąbadanianeuroobrazowe:tomogra-fiakomputerowa(computed tomography–CT), rezonasmagnetyczny(magneticresonanceimaging–MRI),pozy-tronowaemisyjnatomografiakomputerowa(positronemis-siontomography–PET),emisyjnatomografiakomputero-wapojedynczegofotonu(singlephotonemissioncomputedtomography–SPECT)[48,88,97,109].Innązaawansowa-nąmetodąneuroobrazowaniajestwykorzystaniespecjal-negoznacznika(Pittsburghcompound–B)wbadaniupo-zytronowejemisyjnejtomografiikomputerowej.Badanietoswoiścieoznaczadepozytyb-amyloiduwmózgu[13,109].

Włączenietechnikproteomicznychdobadańdiagnostycz-nychchorobyAlzheimerapozwalaodkryćnowepoten-cjalnemarkeryAD.PracaprzeglądowaZellnera iwsp.[114],obejmującabadaniazostatnichkilkunastulat,pod-sumowujedotychczasowewynikianalizyproteomicznej

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

555

-

-

-

-

-

pacjentówzezdiagnozowanąchorobąAlzheimera.Wtkan-kachróżnychregionówmózguzidentyfikowanodotąd15potencjalnychbiałkowychbiomarkerówAD.Należądonichm.in.:a-enolaza(whipokampie),b5-tubulina(wpła-cieczołowym),mutaza1fosfoglicerolu(whipokampie)iinne.Wpłyniemózgowo-rdzeniowymznaleziono19po-tencjalnychmarkerówADwtymm.in.:a1-antytrypsynę,apopoliproteinęE,b-fibrynogen,transferrytynę.Woso-czupacjentówzADzidentyfikowanodo tejpory tylkodwapotencjalnemarkerybiałkowe[37,114].Hye iwsp.[37]wanalizieporównawczejproteomuosoczapacjentówzchorobąAlzheimeraiosóbwiekowodobranychzgrupykontrolnejwykazaliobecność15białek,którychekspre-sjaznaczącoodróżniałapacjentówzADodosóbzgrupykontrolnej.StosująctechnikęWesternblottinguwytypo-waliztejgrupybiałekdwapotencjalnebiomarkeryAD:a2-makroglobulinę(A2M–a2-macroglobulin)iczynnikdopełniaczaH(CFH–complementfactor).

Thambisettyiwsp.[97],kontynuującbadaniaposzukują-cewosoczubiałkowychmarkerówchorobyAlzheimera,połączyliwynikianalizyspektroskopowej1Hrezonan-sumagnetycznegohipokampa ipomiaruobjętościhi-pokampaopartegonaMRIzanaliząproteomicznąoso-czapacjentówzAD.BadaniatakiewykonanowgrupieosóbzwczesnąchorobąAlzheimeraoraz łagodnymizaburzeniamipoznawczymi(MCI–mildcognitiveim-pairment).Spektroskopia1Hrezonansumagnetycznegohipokampaumożliwiłaoszacowaniewzajemnego sto-sunkudwóchmetabolitów:N-acetyloasparginianudomioinozytolu (NAA/mI–N-acetylaspartate/mio-ino-zytole).RolaN-acetyloasparaginianów (NAA)wmó-zguniezostaładotądostateczniewyjaśniona.Sugerujesię,żebiorąoneudziałwprocesiesyntezybiałekneu-ronalnych,metabolizmieneuroprzekaźnikóworazdo-starczajągrupacetylowychpodczassyntezyzwiązkówtłuszczowych,wchodzącychwskładosłonkimielinowej.Inozytol(I)składasięzczterechsubstancji–fosfatydy-loinozytolu, inozytolupolifosforowego, inozytolumo-nofosforowego,mioinozytolu(mI).Inozytolodpowiadazaregulacjęosmozyiutrzymywanieprawidłowejobję-tościkomórkowej[109].

Acklaiwsp.[1]oznaczalistężeniamI,NAAikreatyninywsubstancjibiałej,szarejihipokampiewgrupiepacjen-tówzAD,MCIorazgrupiekontrolnej.TylkoupacjentówzADstwierdzonoznaczącywzrostmI/NAAwsubstancjiszarejibiałejwporównaniuzgrupąMCIigrupąkontro-lną.Roseiwsp.[82]zbadalikorelacjęmiędzyNAA/mIaatrofiąmózgu(jakopomiarskładuCSFisubstancjisza-rej)upacjentówzAD.KorelacjamiędzyNAA/mIaskła-demCSFbyłasilnieujemna,azależnośćmiędzyNAA/mIaskłademsubstancjiszarejbyłasilniedodatnia.

Thambisettyiwsp.[97]stwierdzili,żestosunekNAA/mIbyłznaczącododatnioskorelowanyzekspresjądwóchsu-rowiczychpotencjalnychmarkerówADiMCI:czynni-kaHukładudopełniacza(CFH)oraza2-makroglobuliny(A2M).Stosowaneprzezzespółbadaczymetodyneuro-obrazowaniapotwierdziłyprzydatnośćdiagnostycznąsuro-wiczychbiałkowychmarkerówADiMCI,wytypowanychzużyciemtechniki2-DE.Badaniateudowodniłyznaczącąrolęanalizyproteomicznejbiałekosoczawdiagnozowa-niuADwpołączeniuztechnikamineuroobrazowania[97].

Schizofrenia

Schizofreniatozaburzeniepsychicznezaliczanedogrupypsychozendogennych.Wynikibadańwskazują,żewpa-togenezietejchorobymająznaczenieczynnikigenetycz-ne,rozwojoweiśrodowiskowe.Molekularnemechanizmyschizofreniipozostająwwiększościprzypadkówniezna-ne[58,84].

Zastosowanie technikproteomicznychumożliwiłopo-równanieosoczowegoproteomupacjentówzezdiagnozo-wanąschizofrenią iosóbzdrowych.Ekspresja łańcuchaa-haptoglobiny,a1-antytrypsyny,składnikaPsurowicze-goamyloidu,b1-mikroglobuliny,antytrombinyIIIibiał-kawiążącegowitaminęDbyłyznaczącowyższeupa-cjentówzeschizofreniąwporównaniuzgrupąkontrolną[22,110].Jiangiwsp.[39],stosująctesametechnikiba-dawcze,udowodniliprzydatnośćoznaczeńapolipoprote-inyAIVwpłyniemózgowo-rdzeniowymjakopotencjal-negomarkeraschizofrenii.

Bardzo interesującymkierunkiembadań,zmierzającymdoidentyfikacjinowychbiałkowychmarkerówschizofre-nii,jestpracaPrabakaranaiwsp.[76].Autorzywykona-lianalizęproteomuwątrobyikrwinekczerwonych(RBC–redbloodcells)pobranychodpacjentówzezdiagnozo-wanąschizofreniąiosóbzgrupykontrolnejzwykorzysta-niemtechniki2D-DIGE.

Analizaróżnicowaproteomuwątrobypacjentówzezdia-gnozowanąschizofrenią iosóbzgrupykontrolnejwy-kazałaobecność14potencjalnychbiałkowychmarkerówschizofrenii.Sześćznichtobiałkazwiązanezestresemoksydacyjnym,wtym:dysmutazaponadtlenkowa[Cu-Zn](SOD1)orazbiałkowiążąceselen(SBP1–selenium-bin-dingprotein).Analizaporównawczaproteomówkrwinekczerwonychpozwoliłanaidentyfikacjęośmiupotencjalnychmarkerówschizofrenii,zczegoczterysąbiałkamistresuoksydacyjnego:białkowiążąceselen(SBP1),transferaza-S-glutationowa(GSTA3–glutathione-S-transferase),tio-redokswperoksydazie(PRDX5–thioredoxinperoxidase)ibiałkaszokucieplnego(70kDa).Wynikiteuzupełnia-jąwcześniejszebadaniazespołuPrabakaranaiwsp.[75]dotyczącetkankimózgowejbadanejpośmiertnie.Autorzypracyudowadniają,żezmianymetaboliczneprowadzącedostresuoksydacyjnegosązwiązanezrozwojemschizo-frenii.Proteomwątroby ikrwinekczerwonychstanowipotencjalneźródłonowychbiałkowychmarkerówschizo-frenii.Wskazujetonaprzydatnośćoznaczaniabiałekpro-teomówtkanekobwodowych,anietylkopłynumózgowo-rdzeniowego,wdiagnozowaniutejchoroby[76].

Proteomika w prenatalnym rozpoznawaniu zespołu Downa

ZespółDownajestzaburzeniemrozwojowymopodłożugenetycznym,należydonajczęstszychautosomalnychmu-tacjigenomowych.Objawiasię licznymizmianamidys-morfotycznymiorazróżnymstopniemupośledzeniapsy-chicznego.Uwiększościchorychwystępująwadyserca,przewodupokarmowego,zaburzeniaodpowiedzi immu-nologicznej.Nieprawidłowości tesąspowodowanenad-miaremmateriaługenetycznego,wynikającegozobecno-ścidodatkowego,całego lubfragmentuchromosomu21

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

556

-

-

-

-

-

(trisomia21)[62,74,102,117].Diagnostykaprenatalnaze-społuDownaopierasięnaoceniekariotypukomórekpło-duuzyskanychzbioptatukosmówkilubamniopunkcji,ba-daniuUSG(ocenaprzeziernościkarkowej).RozpoznaniezespołuDownaoparte jest równieżnapomiarzestężeńkombinacjimatczynychmarkerówsurowiczych,takichjakosoczowebiałkociążowe(PAPP-A–pregnancy-associatedplasmaproteinA),a-fetoproteina(AFP–a-fetoprotein),gonadotropinakosmówkowa(hCG–humanchorionicgo-nadotropin),niezwiązanyestriol(uE3–unconjugatedes-triol)orazinhibinaA[62,74].Metodytewykazująznacznyodsetekfałszywiepozytywnychwyników.Dlategoistnie-jepotrzebadalszegoposzukiwanianieinwazyjnychtestówprenatalnych,pozwalającychrozpoznaćzespółDowna[62].

BadaniaprowadzoneprzezNagallaiwsp.[62]zzastoso-waniemtechnikproteomicznych,pozwoliłynaidentyfika-cjękilkupotencjalnych,nowychsurowiczychbiomarkerówwpierwszymidrugimtrymestrzeciąży.Większośćznichtoglikoproteiny.Zidentyfikowanebiałkaozmienionejgli-kozylacjitom.in.a1-kwaśnaglikoproteina,a2-HSgliko-proteina,globulinawiążącakortyzol(transkortyna)orazglobulinawiążącatyroksynę.

Tsangarisiwsp.[102]badalipłynowodniowypochodzącyodkobietspodziewającychsiędzieckazzespołemDownaorazzprawidłowejciąży.Wtrisomii21stwierdzonopra-wieczterokrotnywzrost ilościPGBM(basementmem-brane-specyfichepariansulfateproteoglycancoreprotein)wgrupiebadanejwporównaniuzgrupąkontrolną.PGBMtoproteoglikan–siarczanheparanuwydzielanydoprze-strzenipozakomórkowejzbłonypodstawnej.Uczestniczywprocesiechondrogenezyirozwojukości.Autorzypracy[102]stwierdzili równieżdwukrotnywzroststężeniaa1-mikroglobuliny(AMBP–a1-microglobulin/bikuninpre-cursor)wpłynieowodniowymodpacjentekspodziewają-cychsiędzieckazzespołemDownawporównaniuzgrupąkontrolną.Białkotojestimmunomodulatorem,uczestniczywmechanizmieobronypłoduprzedmatczynymsystememodpornościowym[102].Wpłynachowodniowychuzyska-nychodprzypadkówzzespołemDownazaobserwowaliprawie40%spadekstężeniaprekursorainsulinopodobne-goczynnikawzrostuwiążącegobiałko(IBP-1–insulin-li-kegrowthfactorbindingprotein1precursor).MarkertenmodulujedziałanieinsulinopodobnychczynnikówwzrostuIiII(IGFI–insulin-likegrowthfactorsI,IGFII–insulin-likegrowthfactorsII)odgrywającychistotnąrolęwpro-cesachwzrostu,rozwoju,metabolizmuiapoptozy[102].

Analizaproteomumatczynejsurowicyipłynówowodnio-wychbardzowyraźniewskazujenapotrzebęrozwojubadańproteomicznych,umożliwiającychwdrożenieoznaczaniazi-dentyfikowanychbiałkowychmarkerówwsurowicyciężar-nychdoprenatalnegorozpoznaniazespołuDowna[62,102].

Proteomika w badaniach chorób reumatycznych

Chorobyreumatycznecharakteryzująsięprzewlekłymizmianamizapalnymiwobrębietkankiłącznej,spowodo-wanyminajczęściej reakcjąautoimmunologiczną.Są tom.in.reumatoidalnezapaleniestawów(RA–rheumatoidarthritis),chorobęzwyrodnieniowąstawów(OA–osteoar-thritis),łuszczycowezapaleniestawów(AP–arthritispso-riatica),młodzieńczeidiopatycznezapaleniestawów(JIA

–juvenileidiopathicarthritis),sklerodermię.Przyczynypo-wstaniatychchoróbsązłożone.Poduwagębierzesiępre-dyspozycjegenetyczne,wiek,płeć,atakżeczynnikiśro-dowiskowe,czyinfekcjebakteryjne[20,118].

Rutynowadiagnostykachoróbreumatycznychopierasięnabadaniachradiologicznychorazbadaniachlaboratoryj-nych,obejmującychoznaczaniestężeniabiałekostrejfazy,m.in.CRP,atakżeocenęskładupozostałychbiałeksuro-wicykrwi.Wrozdzialeelektroforetycznymstwierdzasięzmniejszonąilośćalbumin,azwiększonąglobulina1ia2wostrychstanachzapalnych.Wprzewlekłychzapaleniachobserwujesięwzrostfrakcjig-globulin[73,118].

Reumatoidalnemuzapaleniustawóworazinnymukładowymchorobomtkankiłącznejtowarzyszązaburzeniaprocesówod-pornościowych.Prowadzitodowytworzeniaautoprzeciwciałprzeciwwieluautoantygenom.Oznaczanietychprzeciwciałjestprzydatnediagnostyczniezewzględunaznaczeniepro-gnostyczneiodzwierciedlenieaktywnościprocesuchorobo-wego.Trzyznichmająodpowiedniączułośćiswoistość,abymogłybyćstosowanewcodziennejpraktycediagnostycznejRA:czynnikreumatoidalny(RF–rheumatoidfactor),prze-ciwciałaprzeciwbiałkuwiążącemuimmunoglobulinęorazprzeciwciałaprzeciwcytrulinowanymbiałkom/peptydomaCCP(anti-cycliccitrullinatedpeptide)[35,60].

Przeciwciałaprzeciwcyklicznymcytrulinowanympepty-dom(aCCP)sąwytwarzanewjamiestawowejwproce-sachpatologicznych.Ichstężeniewpłyniestawowymjestwyższeniżwsurowicy[60].Obecnośćprzeciwciałprze-ciwcyklicznymcytrulinowanympeptydommaznaczenieprognostyczneipredykcyjne.PrzeciwciałaaCCPsąbardzoswoistym(>95%)iczułym(65%)markeremRA.Rzadkosąobserwowanewinnychchorobachtkankiłącznej.

EkspresjaprzeciwciałaCCPmożewyprzedzaćobjawycho-roboweokilkalat.UmożliwiaodróżnienieRAzinnymichorobamireumatycznymi,atakżekorelujezagresywniej-szymprzebiegiemRAzeznacznądestrukcjąstawów[118].

Wciążjeszczeniewielewiadomonatematcytrulinacjibia-łek tkanekstawowych i ichautoantygenowości.Matsuoiwsp.[60],stosująctechnikę2-DE,wykryliwhomoge-naciebłonymaziowejpacjentkizezdiagnozowanymRA51cytrulinowanychbiałekreagującychzprzeciwciałamianty-CCP.Cytrulinowanebiałkastanowiły5,2%wszyst-kichbiałekbadanegoproteomu.WspulowanejsurowicypacjentówzRAautorzywykryli30cytrulinowanychbia-łekreagującychzprzeciwciałamianty-CCP,atylkokilkacytrulinowanychbiałekzidentyfikowaliwspulowanejsu-rowicyosóbzdrowych.Niektórezbiałekproteomubłonymaziowejzidentyfikowanodziękizastosowaniuspektro-metriimasowej.Należądonich.:fibrynogeng,prekur-sorasporyny,mutantb-aktyny,podjednostkaa1F-aktyny(CapZa-1)iinne.ZastosowanietestuELISAumożliwiłoocenęzwiązkucytrulinacjiCapZa-1zjegoautoantygeno-wością.Autorzypracyuważają,żecytrulinacjaiautoanty-genowośćbadanegobiałkasązesobązwiązane,aleobiepostaciCapZa-1(cytrulinowanainiecytrulinowana)peł-niąróżnerolewprzebieguRA[60].

Stosowanietechnikproteomicznychwimmunodiagnostycechoróbreumatycznychumożliwiajednoczesneoznaczenie

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

557

-

-

-

-

-

autoprzeciwciałprzeciwwieluantygenompochodzeniajądrowegoicytoplazmatycznego.Pozwalatonaokreśle-niepełnegoprofilunieprawidłowościimmunologicznych.Umożliwitowprzyszłościzdiagnozowaniechorobyreu-matycznejprzedwystąpieniemobjawówklinicznychlubwewczesnymstadiumjejrozwoju.Nowemarkerybiałko-wemogąrównieżumożliwićróżnicowanieschorzeńreu-matycznychlubmonitorowanieetapówrozwojuchorobyiprocesuleczenia[24,36,60,73,112].

Tillemaniwsp.[99],stosująctechnikiproteomiczne,ziden-tyfikowaliwsurowicyipłyniestawowympacjentówzreu-matoidalnymzapaleniemstawów(RA)białkoamyloidowe(SAA–serumamyloidA).Białkoamyloidoweniejestwy-krywaneupacjentówzchorobązwyrodnieniowąstawów(OA).Osoczowebiałkoamyloidowenależydobiałekostrejfazy,działachemotaktycznienaneutrofile,stymulujeichfagocytozęidegranulację,awnastępstwietychprocesówuwolnieniewewnątrzkomórkowychcytokin.Analizapro-teomicznasurowicyosóbzRAumożliwiłarównieżwy-krycieautoprzeciwciałprzeciwbiałkomglikolitycznym:izomerazieglukozo-6-fosfatazyialdolazieA[99].UosóbzrozpoznanąchorobązwyrodnieniowąstawówTillemaniwsp.[99]stwierdziliwpłyniestawowymisurowicywy-sokiemianoautoprzeciwciał rozpoznających izomerazęfosfotriozową(TPI–triosephosphateisomerase).

Yamagiwaiwsp.[112]zastosowalitechnikę2-DEwanalizieprofilibiałkowychpłynówstawowychpacjentówzezdiagno-zowanąchorobązwyrodnieniowąstawów.Powtarzalnośćwy-ników,uzyskanychwanalizachdensytometrycznychotrzy-manychmapbiałkowych,potwierdziłaznaczącododatniakorelacjamiędzytrzemamapamibiałkowymiwykonanymidlapojedynczegopacjenta.Analizaróżnicowamapbiałko-wychpłynówstawowychczterechpacjentówzezdiagnozo-wanąchorobązwyrodnieniowąstawówwskazałanazna-czącądodatniązależnośćmiędzymapamibiałkowymitychpacjentów.Znacząceróżnicewekspresjikilkunastubiałekbadanychproteomówtychczterechpacjentówzezdiagno-zowanymOAwskazują,zdaniemautorów,namożliwośćwykorzystaniaanalizyproteomupłynustawowegom.in.doocenystopniazaawansowaniachoroby,ocenydestrukcjistawówimonitorowaniaodpowiedziorganizmunaterapię.

JednymzrodzajówterapiistosowanychwleczeniuRAoraz innychchorobachstawówjestpodawanieprepara-tówblokującychczynnikmartwicynowotworówa(TNF–tumornecrosisfactor-a)[24].Dryndaiwsp.[24]stosu-jąctechnikę2-DEispektrometrięmasowązidentyfikowa-linowybiałkowymarkerS100A9(MRP14)potencjalnieumożliwiającymonitorowanieterapiianty-TNF-a.Stężenietegobiałkamalejewczasieterapii.Analizaprofilibiałko-wychpacjentówzezdiagnozowanymRAiOAorazspek-trometriamasowapozwoliłyna identyfikację tegobiał-kaorazjegokompleksuS100A8/A9wbadanychpłynachstawowychiosoczach.ZnanajestprozapalnaaktywnośćS100A9.Białkoto i jegokompleks indukująchemotak-sjęneutrofilów[83].Badaniaekspresjitegobiałkaijegokompleksuzwykorzystaniemtechnik immunoenzyma-tycznychwykazały,żejegostężeniewpłyniestawowymkorelujezjegostężeniemwosoczu.Dodatkowoumożli-wiaodróżnieniepacjentówzRAodOAigrupykontrol-nej.PoziomS100A9jestznaczniewyższywpłyniesta-wowymiosoczupacjentówzezdiagnozowanymRAniż

upacjentówzOAorazwgrupiekontrolnej.Wydajesię,żebiałkoS100A9jestpotencjalniebardzodobrymmar-keremdiagnozowaniaiterapiiRA[24].

Białkowe markery chorób nowotworowych

Dozdiagnozowaniachoróbnowotworowychiterapiiprze-ciwnowotworowej istotne jestbadaniezmianekspresjibiałekwczasieprogresjinowotworu.Zastosowaniepro-teomikiwdiagnostycenowotworówumożliwia rozwójwiedzynatematmolekularnegopodłożaprocesukarcy-nogenezy[70,96].Biomarkerywykorzystywanerutyno-wowdiagnostyceonkologicznej tom.in.:antygenswo-istydlaprostaty(PSA)stosowanywrozpoznawaniurakastercza,a-fetoproteina(AFP–a-fetoprotein)wykorzysty-wanawdiagnostycerakawątroby.AntygenCD20nako-mórkachnowotworowychchłoniakówBjestcelemwim-munoterapiichłoniakównieziarniczych[96].

Rozpoznanierakawątrobowokomórkowego(HCC–hepa-tocellularcarcinoma)wewczesnymstadiumjesttrudne,mimożeznanesączynnikiryzyka,doktórychzaliczasięm.in.:przewlekłewirusowezapaleniewątrobytypuBiC,czyalkoholizm.Wpływmająrównieżwiek,płećiskłon-nościgenetyczne.ProteomicznaanalizaróżnicowaSteelaiwsp.[92]białeksurowiczychpacjentówzHCCpozwo-liłana identyfikacjędwóchbiałekzobniżającąsięeks-presjąwrazzrozwojemchoroby.RóżnicemiędzygrupąkontrolnąapacjentamizHCCbyłyistotnestatystycznie.ZidentyfikowanebiałkatofragmentczynnikaC3dopeł-niaczaorazizoformaapolipoproteinyA1(ApoA1–apo-lipoproteinA1)[92,96].BadanianadHCCprowadzoneprzezKennedy’ego[41]pozwoliłynazidentyfikowaniewsurowicyosóbchorychkilkubiałek,któremogąkore-lowaćzmasąguzairutynowooznaczanąa-fetoproteiną.Sątoczteryskładnikiukładudopełniacza,hemoglobina1i2orazdwanowebiałka,któresąbadane.

AnalizasurowiczegoproteomuosóbzarażonychwirusemżółtaczkitypuB(HBV–hepatitisBvirus)orazosóbzezdiagnozowanymnowotworemwątroby(HCC)pozwoli-łanaznalezieniedwóchpotencjalnychmarkerówumożli-wiającychmonitorowanieprocesunowotworzeniauosóbzHBV.Stężeniadwóchzidentyfikowanychbiałek:białkaC3orazizoformyapolipoproteinyAImalejąwrazzko-lejnymietapamirozwojuchorobynowotworowej(HCC)uchorychzHBV[96].

Analizasurowiczychprofilibiałkowychpacjentówzrakiemjelitagrubegoiosóbzezdiagnozowanymgruczolakiemwykazała istnieniesiedmiubiomarkerów, różnicującychobiegrupypacjentówzczułością rzędu89%iswoisto-ścią83%.Zgrupytychbiomarkerówzidentyfikowano3białka:apolipoproteinęA1,apolipoproteinęC1ifragmentłańcuchaalbuminy[32].

ElektroforezadwuwymiarowawpołączeniuzWesternblot-tingiempozwoliłanaidentyfikacjęsurowiczego,poten-cjalnegomarkeragruczolakorakaokrężnicy:a-defensyny.Stwierdzonoznaczniezwiększonypoziomtegopeptyduwsurowicachosóbzezdiagnozowanymgruczolakorakiemokrężnicywporównaniudoosóbzdrowych.Oznaczanietegomarkerastwarza,zdaniemautorówpracy,możliwośćwcze-śniejszegodiagnozowaniagruczolakorakaokrężnicy[63].

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

558

-

-

-

-

-

Technikę2D-DIGEzastosowanowbadaniachproteomuwycinkówtkankowychpobranychodpacjentówzrakiemprzełyku.Analizaróżnicowaumożliwiławykryciewpuliponad1000białekbadanegoproteomu58białekotrzykrot-niewiększejekspresjiwkomórkachstransformowanychnowotworowowporównaniuzgrupąkontrolną.Jednymzezidentyfikowanychbiałekjestglikoproteina96,należącadobiałekszokucieplnego.Glikoproteina96chronistruk-turyifunkcjeinnychbiałek,uczestniczywichwewnątrz-komórkowymtransporcie[96].

Zastosowanietechniki2D-DIGEwanalizieporównawczejliniikomórkowychodkobietzdrowychiodkobietzrozpo-znanątransformacjąnowotworowągruczołupiersiowegoumożliwiłowykryciezmianwkomórkachobjętychpro-cesemkarcynogenezy.StwierdzonownichnadekspresjęL-plastyny(białkawiążącegoaktynę),białka14-3-3b(od-powiedzialnegoza rozwójneuronalny,kontrolęwzrostuicyklukomórkowego),atakżeenzymówmetabolicznych:glutaminazyC,syntetazykarbamoilofosforanowej(CAD–carbamoylphosphatesynthetase-aspartate transcarba-moylase-dihydroorotase)orazreduktazyaldehydowej[27].

Technikiproteomicznepozwoliłynawykrycienowychsu-rowiczychmarkerówrakajajników:transterytryny(biał-katransportowegotyroksynyiretinolu),a-hemoglobiny,apolipoproteinyAIitransferryny.Wpołączeniuzrutyno-wooznaczanymantygenemCA125,mająoneznaczenieprognostycznewrozpoznawaniuwczesnychpostacinowo-tworówogranicznejzłośliwościizłośliwych.Badaniapro-teomicznemoczu,pochodzącegoodkobietzdrowych,zła-godnymizmianamiwprzydatkachorazzrakiemjajnikawykazałyobecnośćneurotoksynyeozynofilowejoaktyw-nościRNA-zyiosteopontyny–markeraprogresywnościprocesunowotworowego.Obabiałkawykazująnadekspre-sjęwrakujajnika[67,101,108,113].

Rakjasnokomórkowynerek(RCC–renalcellcarcinoma)stanowiprawie2%wszystkichnowotworówtegonarządu.Charakteryzujegowysokaśmiertelnośćspowodowanapóź-nymrozpoznaniem.Wykorzystanietechniki2-DEwana-lizieproteomukomórekpochodzącychzusuniętychnerekchorychzrozpoznanymRCC,pozwoliłonawykazanieob-niżonejekspresjienylo-CoAhydratazy,a-dehydrogenazyaldehydowejIorazaminoacylazyI[70].

WbadaniachmoczupacjentówzezdiagnozowanymRCCstwierdzononadekspresjębiałkawiążącegoretinol,anhy-drazywęglanowejIorazb2-mikroglobuliny.Obniżonąeks-presję,wporównaniuzbiałkamiwystępującymiwmoczuosóbzdrowych,stwierdzonodlalektynywiążącejmanno-zęproteazyserynowej2(MASP-2–mannan-bindinglec-tinserinepeptidase2)ikininogenu(składnikawewnątrz-pochodnegotorukrzepnięcia).Lektynawiążącamannozęproteazyserynowej2spełniaważnąrolęwnieswoistejod-powiedziimmunologicznejiaktywacjidopełniaczanadro-dzelektynowej[70].

Wykorzystująctechnikiproteomicznewbadaniachsurowi-cyosóbzezdiagnozowanymnowotworempłuc,stwierdzo-nowzrostekspresjiapolipoproteinyJ(ApoJ–apolipopro-teinJ)orazzmniejszenieekspresjigelsolinyupacjentówzrakiempłucwporównaniudoosóbzdrowych.ApoJjestzwiązanagłówniezlipoproteinamiHDL.Zahamowanie

ekspresjigelsoliny(białkaprzyłączającegosiędoakty-ny)wpływanawzrost ruchliwościkomórek,powodujezaburzeniaarchitekturycytoszkieletukomórki,cosprzy-japrzerzutowaniunowotworu.Analizasurowiczegoprote-omuwykazałarównieżwysokączułośćiswoistośćbiałkawiążącegoretinoloraza1kwaśnejglikoproteinywwykry-waniurakapłuc[68].

Technikiproteomiczneznalazłytakżezastosowanieprzyidentyfikacjinowychbiomarkerówprzewodowegogruczo-lakorakatrzustki(PDAC–pancreaticductaladenocarci-noma),charakteryzującegosięnajgorszymrokowaniemzewszystkichnowotworówprzewodupokarmowego.Wsokutrzustkowymzidentyfikowano170białek.Potwierdzonoprzydatnośćocenyekspresjibiałekzwiązanychzestanemzapalnymtrzustki(PAP–pancreatitis-associatedprotein)wsokutrzustkowym,jakonowychmarkerówPDAC.BiałkaPAP,zaliczanedolektyn,stymulująaktywnośćmakrofa-gów.Wbadaniachzużyciemtechniki2D-DIGEsokutrzust-kowegoosóbzPDACwykazanorównieżwzrostekspre-sjionkogenuDJ-1,metaloproteinazy9macierzy(MMP-9–matrixmetallopeptidase9),prekursoraa1-glikoproteiny(a1-AGP–a1-acidglycoprotein)[98].

Analiza proteomu osób narażonych środowiskowo

Ważnymkierunkiembadańjestwykrywaniezmianwpro-teomieosóbnarażonychnakontaktzeszkodliwymizwiąz-kamichemicznymi[40,52,79],wtymrównieżocenyza-grożeniazdrowiaosóbprzewleklenarażonychnametaleciężkie[51].

Zastosowanietechnikproteomicznychwbadaniachin vitroprzezRaveendranaiwsp.[79]umożliwiłoocenęzmianekspresjibiałekkomórekśródbłonkaaortypo4godzi-nachkontaktuzwodnymekstraktemdymupapierosowe-go.Komórkiśródbłonkaaortystanowiąpierwszą linięobronyścianynaczyniaprzeduszkodzeniami,indukowa-nymidymempapierosowym,któryjestuznanymczynni-kiemmiażdżycorodnym.Stwierdzonozmienionąekspre-sję389białek.Białka,którychstężenieznaczącowzrastałownarażeniunadympapierosowyto:białkaszokuciepl-nego(HSP-70,HSP-27,glikoproteina96),aneksyna6i2,a-aktynina,meozyna,białkowiążącelamininę.Wyraźnezmniejszenieekspresjiwkontakciezsubstancjamizawarty-miwdymiepapierosowymstwierdzonodla:lekkiegołań-cuchamiozyny,propylo-4-hydroksylazy,eukariotycznegoczynnikainicjacjitranskrypcji4A,a-enolazia-tubulin.Autorzypracy[79]uważają,żezastosowanieproteomikiprzybliżabadaczydopoznaniamolekularnychmechani-zmówpatologicznychzmianwludzkimorganizmie,wy-wołanychnarażeniemnadympapierosowy.

Nastałykontaktzniewielkimiilościamiparbenzenuna-rażonychjestwieleosób.Benzenjestskładnikiemdymupapierosowego,benzyny,spalinsilnikówsamochodowych.Długotrwałedziałanieparbenzenuwmałychstężeniachwpływanaukładkrwiotwórczy,prowadzącdo rozwo-juniedokrwistościaplastycznej, leukopenii lub trombo-cytopenii.Wzaawansowanychprzypadkachdochodzidoznacznegozmniejszenialiczbywszystkichelementówmor-fotycznych-pancytopenii,częstopoprzedzającejwystępo-waniebiałaczki.Wmonitorowaniuekspozycjinabenzenoznaczasię jegostężeniewmoczu ikrwiorazpoziom

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

559

-

-

-

-

-

metabolitówbenzenu:kwasuS-fenylomerkapturowego(S-PMA – S-phenylmercapturic acid) i kwasu trans,transmukonowego(t, t-MA–trans, trans-muconicacid)wmoczu[40,52].

Stosująctechnikiproteomicznewbadaniuosoczaosóbpra-cującychwnarażeniunabenzenzidentyfikowano18białekozwiększonejekspresjiwporównaniuzgrupąosóbnie-narażonych.Sześćspośródtychbiałekmaistotnywpływnafunkcjeukładuodpornościowego.Największąróżni-cęstężeńwosoczu,międzygrupąnarażonąikontrolną,stwierdzonodlareceptorablimfocytówT(TCRb–Tcellreceptorchain).Zwiększonaekspozycjanabenzenpowo-dujezahamowanieproliferacjilimfocytówTizwiększe-nieilościreceptoraTCRb.Białkiem,któregoekspresjawosoczuwzrastawkontakcieczłowiekazbenzenemjestimmunofolinaFKBP51.Izoformategobiałka–FKB23tobiałkoregionuzmiennegołańcuchalekkiegoimmunoglo-bulin.ImmunofolinaFKBP51,wiążącsubstancjeimmuno-supresyjne,indukujeodpowiedźimmunologiczną[40,45].

Jednymzgłównychczynnikówskażeniaśrodowiskasąmetaleciężkie:ołów,kadmiarsen.Sąoneszerokoroz-powszechnionewśrodowiskuczłowieka–wpowietrzuatmosferycznym,wodzie,pożywieniuczyglebieimogąpochodzićzarównozeźródełnaturalnych,jakiantropo-genicznych,zwłaszczazprzemysłu.Należypodkreślićznaczenieekspozycjiczynnej ibiernejnadymtytonio-wy,jakoistotnegoźródłanarażenialudzinametalecięż-kie,główniekadm[19].

Arsenikadmsączynnikamikarcynogennymi,azwiąz-kiołowiupotencjalnymiczynnikamikarcynogennymi.Rozwójnowotworówwywołanychekspozycjąnaarsendotyczyprzedewszystkimtkankipłucnejiskóry,obser-wowanesą takżenowotworypęcherza,wątrobyinerek.Długotrwałaekspozycjanaołówpowodujezmianyhemato-logiczne,neurologiczneinefrologiczne.Epidemiologicznedaneopotencjalnejkarcynogennościzwiązkówołowiusąstosunkowonowe.Rakotwórczośćkadmujestdopewne-gostopniapochodnąjegotoksyczności.Dlarozwojuno-wotworuznaczącyjestdługotrwałykontakttkanekzkad-mem,nawetwdawkachnietoksycznych[95].

Lantziwsp.[51]zastosowalitechnikiproteomicznewbada-niachpopłuczynpęcherzykowo-oskrzelowychmyszy(BALF–bronchoalveolarlavagefluid)przewlekleeksponowanychnamałedawkiarsenu.Zapotencjalnebiomarkerynarażenianaarsenuznano:receptorykońcowychproduktówzaawan-sowanejglikacjiRAGE(receptorforadvancedglycationendproducts),transferazęSglutationu(GST–glutathio-ne-S-transferase)orazapolipoproteinęA-1.Ekspresjatychbiałekjestzmniejszonaprzyekspozycjinaarsenwporów-naniuzgrupąkontrolną.Poziomekspresjienolazy1ipe-roxiredoxinu-6jestwyższywgrupienarażonej.

Zmniejszenie poziomu RAGE zaobserwowano takżewplwocinie ludzinarażonychśrodowiskowonaarsenwporównaniuzosobaminienarażonymi[51].Receptorykońcowychproduktówzaawansowanejglikacjiznajdująsięnapowierzchnikomórekśródbłonka,komórekmię-śnigładkichimakrofagów.Łącząsięzzaawansowanymikońcowymiproduktamiglikacji,tworząckompleksyod-powiedzialnezazaburzenia funkcjikomórekśródbłon-kanaczyniowego,zwiększenieprzepuszczalnościnaczyńkrwionośnychorazinicjacjęprocesówzapalnych[23,51].Znaczeniepozostałychbiałek różniącychsięekspresjąumyszynarażonychnaarseninieeksponowanychniezo-stało jeszczeudowodnioneu ludzi.Trwająbadanianadzidentyfikowaniempanelubiałek,umożliwiającegowy-kryciezmianmolekularnychzwiązanychześrodowisko-wymnarażeniemnaniskiedawkiarsenu,ingerującychjużwprzemianymetaboliczneorganizmu,aleniewywołują-cychjeszczeobjawówklinicznych[51].

WzespoleSmallAreaHealthStatisticsUnit (SAHSU)wImperialCollegeLondonprowadzonesąbadanianadtoksycznymiskutkamiprzewlekłegonarażenianakadm.Ichcelemjestzintegrowaniebadańekspozycyjnychikla-sycznychbiomarkerówzmetodamimetabonomicznymi.Dotychczasudałosiępołączyćpotwierdzonemarkeryne-fropatii,w tymN-acetylo-b-D-glukozoaminidazę(NAG–N-acetylb-Dglucosaminidase),zprofilamimetabono-micznymimoczu.Zaobserwowanoznaczącoujemnąko-relacjęmiędzy3-hydroksyizowalerianianeminieznanymmetabolitem(rezonanswregioniedimetyloglicyny)astę-żeniemkadmuwmoczu.Znaczącododatniakorelacjazo-stałazanotowanamiędzywidmem1HNMRmoczuaNAG.Badaniatepozwoląocenićwpływśrodowiskowegoska-żeniakadmemnaludzkiezdrowie(publikacjawprzygo-towaniu)[38,89].

podsumoWanie

Zastosowanietechnikielektroforezydwuwymiarowejwpo-łączeniuzespektrometriąmasstwarzamożliwośćprecyzyj-nejanalizyprofilibiałkowychwróżnychstanachpatolo-gicznychludzkiegoorganizmudostarczającpotencjalnychbiomarkerówwielujednostekchorobowych.Porównaniestosowanychdotychczasmetod,markerówwykorzystywa-nychobecniewdiagnostycemedycznej,zwynikamiana-lizproteomicznychwskazujenaznaczącyudziałnowych,białkowychmarkerówwrozwojunowoczesnejdiagnostykimedycznej.Połączenietechnikproteomicznychimetabono-micznychmożedostarczyćzbiorunowychmarkerów,cha-rakteryzującychsięwiększąswoistościąiczułościąwpo-równaniuzmarkeramibiałkowymi.Możnajeprzedstawićwpostacimatematycznegoprofilu,różnicującegoosobyzdro-weichore,umożliwiającrównieżwykrywaniewludzkimor-ganizmiezmianpatologicznych,ujawniającychsięnapozio-miekomórkowym,przedwystąpieniemzmianklinicznych.

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

560

-

-

-

-

-

piśmiennictWo

[1]AcklN.,IsingM.,SchreiberY.A.,AtiyaM.,SonntagA.,AuerD.P.:HippocampalmetabolicabnormalitiesinmildcognitiveimpairmentandAlzheimer’sdisease.Neurosci.Lett.,2005;384:23–28

[2]AhmedN.,BarkerG.,OlivaK.,GarfinD.,TalmadgeK.,GeorgiouH.,QuinnM.,RiceG.:Anapproachtoremovealbuminfortheproteomicanalysisoflowabundancebiomarkersinhumanserum.Proteomics,2003;3:1980–1987

[3]AhmedN.,RiceG.E.:Strategiesforrevealinglowerabundancepro-teinintwodimensionalproteinmaps.J.Chromatogr.B,2005;815:39–50

[4]AkgoS.,OzkaraS.,UzunL.,YılmazF.,DenizlA.:PseudospecificmagneticaffinitybeadsforimmunoglobulinGdepletionfromhumanserum.J.Appl.PolymerSci.,2007;106:2405–2412

[5]Ala-KorpelaM.:Criticalevaluationof1HNMRmetabonomicsofserumasamethodologyfordiseaseriskassessmentanddiagnostics.Clin.Chem.Lab.Med.,2008;46:27–42

[6]AndersonN.L.,AndersonN.G.:Thehumanplasmaproteome:histo-ry,character,anddiagnosticprospects.Mol.Cell.Proteomics,2002;1:845–867

[7]AristoteliL.P.,MolloyM.P.,BakerM.S.:Evaluationofendogenousplasmapeptideextractionmethodsformassspectrometricbiomarkerdiscovery.J.ProteomeRes.,2007;6:571–581

[8]BalabanovS.,ZimmermannU.,ProtzelC.,ScharfC.,KlebingatK.J.,WaltherR.:Tumour-relatedenzymealterationsintheclearcelltypeofhumanrenalcellcarcinomaidentifiedbytwo-dimensionalgelelec-trophoresis.Eur.J.Biochem.,2001;268:5977–5980

[9]BergenH.R.III,VasmatzisG.,ClibyW.A.,JohnsonK.L.,ObergA.L.,MuddimanD.C.:DiscoveryofovariancancerbiomarkersinserumusingNanoLCelectrosprayionizationTOFandFT-ICRmassspec-trometry.Dis.Markers,2003–2004;19:239–249

[10]BiniL.,LiberatoriS.,PalliniV.:InfectiousDiseases.W:Biomedicalapplicationsofproteomics, red.: J.C.Sanchez,G.L.Corthals,D.F.Hochstrasser.Wiley-VCH,Weinheim2004,225–313

[11]BjorhallK.,MiliotisT.,DavidssonP.:Comparisonofdifferentdeple-tionstrategiesforimprovedresolutionin.proteomicanalysisofhu-manserumsamples.Proteomics,2005;5:307–317

[12]BonarE.,Bierczyńska-KrzysikA.,DubinA.:Elektroforezadwuwy-miarowawżelupoliakryloamidowym.W:Proteomika,red.A.Kraj,J.Silberring.WydziałChemiiUJ,Kraków2004,54–60

[13]BritschgiM.,Wyss-CorayT.:Bloodproteinsignaturefor theearlydiagnosisofAlzheimerdisease.Arch.Neurol.,2009;66:161–165

[14]BultinocP.,DekkerM.:ComputationalMedicinalChemistryforDrugDiscoveryToday.Inc,NewYork2004

[15]CastegnaA.,ThongboonkerdV.,KleinJ.B.,LynnB.,MarkesberyW.R.,ButterfieldD.A.:ProteomicidentificationofnitratedproteinsinAlzheimer’sdiseasebrain.J.Neurochem.,2003;85:1394–1401

[16]CaudleW.M.,PanS.,ShiM.,QuinnT.,HoekstraJ.,BeyerR.P.,MontineT.J.,ZhangJ.:Proteomicidentificationofproteinsinthehumanbra-in:Towardsamorecomprehensiveunderstandingofneurodegenera-tivedisease.ProteomicsClin.Appl.,2008;2:1484–1497

[17]ChenJ.H.,ChangY.W.,YaoC.W.,ChiuehT.Z.,HuangS.C.,ChienK.Y.,ChenA.,ChangF.Y.,WongC.H.,ChenY.J.:Plasmaproteomeofseveralacuterespiratorysyndromeanalyzedbytwo-dimensionalgelelectrophoresisandmassspectrometry.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2004;101:17039–17044

[18]ChevalletM.,LucheS.,RabilloudT.:Silverstainingofproteinsinpo-lyacrylamidegels.Nat.Protoc.,2006;1:1852–1858

[19]ChlebdaE.,Antonowicz-JuchniewiczJ.,AndrzejakR.:Wpływeks-pozycjizawodowejnaołówiarsennastężeniekarotenoidówwsuro-wicyupracownikówhutymiedzi.Med.Pr.,2004;55:389–401

[20]Chorobyreumatyczne.http://www.chorobyreumatyczne.pl/dla_lekarzy.html?fs=small(28.04.2009)

[21]ChromyB.A.,GonzalesA.D.,PerkinsJ.,ChoiM.W.,CorzettM.H.,ChangB.C.,CorzettC.H.,McCutchen-MaloneyS.L.:Proteomicana-lysisofhumanserumbytwo-dimensionaldifferentialgelelectrophore-sisafterdepletionofhigh-abundantproteins.J.ProteomeRes.,2004;3:1120–1127

[22]Dmitrzak-WęglarzM.,HauserJ.:Wykorzystaniebadańproteomicz-nychwposzukiwaniumarkerówbiologicznychdlachoróbpsychicz-nych.Psychiatria,2006;3:118–127

[23]DorzhkoR.,WitkowskaM.:Zaburzeniagospodarkiwęglowodano-wejaryzykochoróbukładusercowo-naczyniowego.Adv.Clin.Exp.Med.,2006;15:911–916

[24]DryndaS.,RingelB.,KekowM.,KühneC.,DryndaA.,GlockerM.O.,ThiesenH.J.,KekowJ.:Proteomeanalysisrevealsdisease-associatedmarkerproteinstodifferentiateRApatientsfromotherinflammatoryjointdiseaseswiththepotentialtomonitoranti-TNFatherapy.Pathol.Res.Pract.,2004;200:165–171

[25]EchanL.A.,TangH.Y.,Ali-KhanN.,LeeK.,SpeicherD.W.:Depletionofmultiplehigh-abundanceproteinsimprovesproteinprofilingcapa-citiesofhumanserumandplasma.Proteomics,2005;5:3292–3303

[26]EncarnacionS.,HernandezM.,Martinez-BatallarG.,ContrerasS.,delCarmenVargasM.,MoraJ.:Comparativeproteomicsusing2-Dgelelectrophoresisandmassspectrometryastoolstodissectstimu-lonsandregulonsinbacteriawithsequencedorpartiallysequencedgenomes.Biol.Proced.Online,2005;7:117–135

[27]GharbiS.,GaffnerP.,YangA.,ZvelebilM.J.,CramerR.,WaterfieldM.D.,TimmsJ.F.:Evaluationoftwo-dimensionaldifferentialgelelec-trophoresisforproteomicexpressionanalysisofamodelbreastcan-cercellsystem.Mol.Cell.Proteomics,2002;1:91–98

[28]GloerichJ.,WeversR.A.,SmeitinkJ.A.,vanEngelenB.G.,vandenHeuvelL.P.:Proteomicsapproachestostudygeneticandmetabolicdisorders.J.ProteomeRes.,2007;6:506–512

[29]GroveH., JørgensenB.M.,JessenF.,SøndergaardI., JacobsenS.,HollungK., IndahlU.,FærgestadE.M.:Combinationofstatisticalapproachesforanalysisof2-DEdatagivescomplementaryresults.J.ProteomeRes.,2008;7:5119–5124

[30]GuoY.,FuZ.,VanEykJ.E.:Aproteomicprimerfortheclinician.Proc.Am.Thorac.Soc.,2007;4:9–17

[31]HarperR.G.,WorkmanS.R.,SchuetznerS.,TimpermanA.T.,SuttonJ.N.:Lowmolecular-weighthumanserumproteomeusingultrafil-tration,isoelectricfocusing,andmassspectrometry.Electrophoresis,2004;25:1299–1306

[32]HermanR.M.,WałęgaP.,SałówkaJ.,KenigJ.:Koloproktologia–po-stępy2006.Med.Prakt.Chir.,2007;1:119–124

[33]HierosimczykA.,DejeansN.,SaydT.,OżgoM.,SkrzypczakW.F.,MazurA.:Plasmaproteomeanalysis:2Dgelsandchips.J.Physiol.Pharmacol.,2006;57:81–93

[34]HoodB.L.,LucasD.A.,KimG.,ChanK.C.,BlonderJ.,IssaqH.J.,VeenstraT.D.,ConradsT.P.,PolletI.,KarsanA.:Quantitativeana-lysisofthelowmolecularweightserumproteomeusing18Ostableisotopelabelinginalungtumorxenograftmousemodel.J.Am.Soc.MassSpectrom.,2005;16:1221–1230

[35]HrycajP.:Nowetestyserologicznewdiagnostycereumatologicznej.Reumatologia,2007;45:369–373

[36]HuS.,LooJ.A.,WongD.T.:Humanbodyfluidproteomeanalysis.Proteomics,2006;6:6326–6353

[37]HyeA.,LynhamS.,ThambisettyM.,CausevicM.,CampbellJ.,ByersH.L.,HooperC.,RijsdijkF.,TabriziS.J.,BannerS.,ShawC.E.,FoyC.,PoppeM.,ArcherN.,HamiltonG.,PowellJ.,BrownR.G.,ShamP.,WardM.,LovestoneS.:Proteome-basedplasmabiomarkers forAlzheimer’sdisease.Brain,2006;129:3042–3050

[38]ImperialCollegeLondonDrJamesEllishttp://www1.imperial.ac.uk/medicine/people/j.ellis/(13.08.2009)

[39]JiangL.,LindpaintnerK.,LiH.F.,GuN.F.,LangenH.,HeL.,FountoulakisM.:Proteomicanalysisofthecerebrospinalfluidofpa-tientswithschizophrenia.AminoAcids,2003;25:49–57

[40]JooW.A.,SulD.,LeeD.Y.,LeeE.,KimC.W.:Proteomicanalysisofplasmaproteinsofworkersexposedtobenzene.Mutat.Res.,2004;558:35–44

[41]KennedyS.:Proteomicprofilingfromhumansamples:thebodyflu-idalternative.Toxicol.Lett.,2001;120:379–384

[42]KimM.R.,KimC.W.:Humanbloodplasmapreparationfortwo-di-mensionalgelelectrophoresis.J.Chromatogr.B,2007;849:203–210

[43]KimS.S.,KimM.H.,ShinB.K.,NaH.J.,ChoiJ.Y.,KeeM.K.,ChongS.A.,NamM.J.:DifferentisoformsofapolipoproteinAIpresenthe-terologouspost-translationalexpressioninHIVinfectedpatients.J.ProteomeRes.,2007;6:180–184

[44]KnepperM.A.:Proteomicsandthekidney.J.Am.Soc.Nephrol.,2002;13:1398–1408

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

561

-

-

-

-

-

[45]Kochel I.,StrządałaL.:RolabiałekwiążącychFK506wregulacjiaktywnościczynnikówtranskrypcyjnychwkomórkachT.Post.Hig.Med.Dośw.,2004,58:118–127

[46]KowalskaA.:Genetykazespołówotępiennych.Część1:Podłożemo-lekularneotępieniaczołowo-skroniowegoiparkinsonizmusprzężone-gozchromosomem17(FTDP-17).Post.Hig.Med.Dośw.,2009;63:278–286

[47]KowalskaA.:Genetykazespołówotępiennych.Część2:Biologiacho-robyAlzheimera.Post.Hig.Med.Dośw.,2009;63:287–295

[48]KozeraD.:Badaniaobrazowemózgu.http://www.neurologiczne.pl/badania_obrazowe_mozgu.htm(04.08.2009)

[49]KrajA.,DylągT.,Górecka–DrzazgaA.,BargielS.,DziubanJ.,SilberringJ.:Desorption/ionizationonsiliconforsmallmolecules:apromisingalternativetoMALDITOF.ActaBiochim.Pol.,2003;50:783–787

[50]LakhanS.E.,KramerA.:Schizophreniagenomicsandproteomics:areweanyclosertobiomarkerdiscovery?Behav.BrainFunct.,2009;5:2

[51]LantzR.C.,LynchB.J.,BoitanoS.,PoplinG.S.,LittauS.,TsaprailisG.,BurgessJ.L.:Pulmonarybiomarkersbasedonalterationsinpro-teinexpressionafterexposuretoarsenic.Environ.HealthPerspect.,2007;4:586–591

[52]LebrechtG.,CzerczakS.,SzymczakW.:Benzen.Dokumentacjapro-ponowanychwartościdopuszczalnychpoziomównarażeniazawodo-wego.Podst.iMet.OcenyŚr.Pr.,2003;35:5–60

[53]LiaoH.,WuJ.,KuhnE.,ChinW.,ChangB.,JonesM.D.,O’NeilS.,ClauserK.R.,KarlJ.,HaslerF.,RoubenoffR.:Useofmassspectro-metrytoidentifyproteinbiomarkersofdiseaseseverityinsynovialflu-idandserumofpatientswithrheumatoidarthritis.ArthritisRheum.,2004;50:3792–3803

[54]LiuX.Y.,YangJ.L.,ChenL.J.,ZhangY.,YangM.L.,WuY.Y.,LiF.Q.,TangM.H.,LiangS.F.,WeiY.Q.:Comparativeproteomicsandcorrelatedsignalingnetworkofrathippocampusinthepilocarpinemodeloftemporallobeepilepsy.Proteomics,2008;8:582–603

[55]Luque-GarciaJ.L.,NeubertT.A.:Samplepreparationforserum/pla-smaprofilingandbiomarkeridentificationbymassspectrometry.J.Chromatogr.A,2007;1153:259–276

[56]MarengoE.,RobottiE.,AntonucciF.,CecconiD.,CampostriniN.,RighettiP.G.:Numericalapproachesforquantitativeanalysisoftwo-dimensionalmaps:areviewofcommercialsoftwareandhome-madesystems.Proteomics,2005;5:654–666

[57]MarougaR.,DavidS.,HawkinsE.:ThedevelopmentoftheDIGEsys-tem:2Dfluorescencedifferencegelanalysistechnology.Anal.Bioanal.Chem.,2005;382:669–678

[58]Martins-de-SouzaD.,GattazW.F.,SchmittA.,RewertsC.,MaccarroneG.,Dias-NetoE.,TurckC.W.:Prefrontalcortexshotgunproteomeana-lysisrevealsalteredcalciumhomeostasisandimmunesystemimba-lanceinschizophrenia.Eur.Arch.PsychiatryClin.Neurosci.,2009;259:151–163

[59]Martins-de-SouzaD.,MaccarroneG.,ReckowS.,FalkaiP.,SchmittA.,TurckC.W.:Shotgunmassspectrometryanalysisof thehumanthalamusproteome.J.Sep.Sci.,2009;32:1231–1236

[60]MatsuoK.,XiangY.,NakamuraH.,MasukoK.,YudohK.,NoyoriK.,NishiokaK.,SaitoT,KatoT.:Identificationofnovelcitrullinatedautoantigensofsynoviuminrheumatoidarthritisusingaproteomicapproach.ArthritisRes.Ther.,2006;8:175–187

[61]MillioniR.,PuricelliL.,IoriE.,TessariP.:Rapid,simpleandeffec-tivetechnicalprocedurefortheregenerationofIgGandHSAaffinitycolumnsforproteomicanalysis.AminoAcids,2008;34:507–509

[62]NagallaS.R.,CanickJ.A., JacobT.,SchneiderK.A.,ReddyA.P.,ThomasA.,DasariS.,LuX.,LapidusJ.A.,Lambert-MesserlianG.M.,GravettM.G.,RobertsC.T.,LuthyD.,MaloneF.D.,D’AltonM.E.:ProteomicanalysisofmaternalseruminDownsyndrome:identifica-tionofnovelproteinbiomarkers.J.ProteomeRes.,2007;6:1245–1257

[63]NamM.J.,KeeM.K.,KuickR.,HanashS.M.:Identificationofde-fensina6asapotentialbiomarkerincolonadenocarcinoma.J.Biol.Chem.,2005;9:8260–8265

[64]NesatyyV.J.,RossN.W.:Recoveryofintactproteinsfromsilversta-inedgels.Analyst,2002;127:1180–1187

[65]NicholsonJ.K,WilsonI.D.:Understanding‘global’systemsbiolo-gy:metabonomicsandthecontinuumofmetabolism.Nat.Rev.DrugDisc.,2003;2:668–676

[66]NobenJ.P.,DumontD.,KwasnikowskaN.,VerhaertP.,SomersV.,HuppertsR.,StinissenP.,RobbenJ.:Lumbarcerebrospinalfluidpro-teomeinmultiplesclerosis:characterizationbyultrafiltration,liquidchromatography,andmassspectrometry.J.ProteomeRes.,2006;5:1647–1657

[67]Nowak-MarkwitzE.,SpaczyńskiM.:Postępywdiagnostycerakajaj-nika.Przegl.Menop.,2006;10:12–16

[68]OkanoT.,KondoT.,KakisakaT.,FujiiK.,YamadaM.,KatoH.,NishimuraT.,GemmaA.,KudohS.,HirohashiS.:Plasmaproteomicsoflungcancerbyalinkageofmultidimensionalliquidchromatogra-phyandtwo-dimensionaldifferencegelelectrophoresis.Proteomics,2006;6:3938–3948

[69]OrviskyE.,DrakeS.K.,MartinB.M.,Abdel-HamidM.,RessomH.,VargheseR.S.,AnY.,SahaD.,HortinG.L.,LoffredoC.A.,GoldmanR.:Enrichmentoflowmolecularweightfractionofserumformassspectrometricanalysisofpeptidesassociatedwithhepatocellularcar-cinoma.Proteomics,2006;6:2895–2902

[70]OżgoM.,SkrzypczakW.F.,HerosimczykA.,MazurA.:Proteomikaafizjologiaipatofizjologianerek.Med.Wet.,2007;63:1146–1150

[71]PanS.,ShiM.,JinJ.,AlbinR.L.,LiebermanA.,GearingM.,LinB.,PanC.,YanX.,KashimaD.T.,ZhangJ.:Proteomics identificationofproteinsinhumancortexusingmultidimensionalseparationsandMALDItandemmassspectrometer.Mol.Cell.Proteomics,2007;6:1818–1823

[72]PattersonS.D.:Massspectrometryandproteomics.Physiol.Genomics,2000;2:59–65

[73]PepysM.B.,HirschfieldG.M.:C-reactiveprotein:acriticalupdate.J.Clin.Invest.,2003;111:1805–1812

[74]Pietrzyk J.J.: Zespół Downa. MP. Pediatria. http://www.mp.pl/artykuly/?aid=11444(07.03.2009)

[75]PrabakaranS.,SwattonJ.E.,RyanM.M.,HuffakerS.J.,HuangJ.T.,GriffinJ.L.,WaylandM.,FreemanT.,DudbridgeF.,LilleyK.S.,KarpN.A.,HesterS.,TkachevD.,MimmackM.L.,YolkenR.H.,WebsterM.J.,TorreyE.F.,BahnS.:Mitochondrialdysfunctioninschizophre-nia:evidenceforcompromisedbrainmetabolismandoxidativestress.Mol.Psychiatry,2004;9:684–697

[76]PrabakaranS.,WengenrothM.,LockstoneH.E.,LilleyK.,LewekeF.M.,BahnS.:2-DDIGEanalysisofliverandredbloodcellsprovi-desfurtherevidenceforoxidativestressinschizophrenia.J.ProteomeRes.,2007;6:141–149

[77]PrzybyszewskiW.M.,Rzeszowska-WolnyJ.:Stresoksydacyjnywpro-cesachprzerostu ikancerogenezygruczołusterczowego.Post.Hig.Med.Dośw.,2009;63:340–350

[78]RamanB.,CheungA.,MartenM.R.:Quantitativecomparisonandeva-luationoftwocommerciallyavailable,two-dimensionalelectrophore-sisimageanalysissoftwarepackages,Z3andMelanie.Electrophoresis,2002;23:2194–2202

[79]RaveendranM.,SenthilD.,UtamaB.,ShenY.,WangJ.,ZhangY.,WangX.L.:Effectofwater-soluble fractionofcigarettesmokeonhumanaorticendothelialcells–aproteomicapproach.Cell.Biol.Toxicol.,2005;21:27–40

[80]ReedT.T.,PierceW.M.,MarkesberyW.R.,ButterfieldD.A.:ProteomicindentificationofHNE-boundproteis inearlyAlzheimerdisease:InsightsintoroleoflipidperoxidatinintheprogressionofAD.BrainRes.,2009;1274:66–76

[81]RoncadaP.,BortolatoM.,FrauR.,SabaP.,FloreG.,SoggiuA.,PisanuS.,AmoresanoA.,CarpentieriA.,DevotoP.:Gatingdeficitsiniso-lation-rearedratsarecorrelatedwithalterationsinproteinexpressioninnucleusaccumbens.J.Neurochem.,2009;108:611–620

[82]RoseS.E.,deZubicarayG.I.,WangD.,GallowayG.J.,ChalkJ.B.,EagleS.C.:SempleJ.,DoddrellD.M.:A1HMRSstudyofprobableAlzheimer’sdiseaseandnormalaging:implicationsforlongitudinalmonitoringofdementiaprogression.Magn.Reson.Imaging,1999;17:291–299

[83]Ryckman C., Vandal P., Rouleau M., Talbot M., Tessier P.A.:ProinflammatoryactivitiesofS100:proteinsS100A8,S100A9andS100A8/A9induceneutrophilchemotaxisandadhesion.J.Immunol.,2003;170:3233–3242

[84]SchwarzE.,BahnS.:Biomarkerdiscoveryinpsychiatricdisorders.Electrophoresis,2008;29:2884–2890

[85]ShawM.M.,RiedererB.M.:Samplepreparationfortwo-dimensionalgelelectrophoresis.Proteomics,2003;3:1408–1417

[86]ShevchenkoA.,WilmM.,VormO.,MannM.:Massspectrometricsequencingofproteinsfromsilver-stainedpolyacrylamidegels.Anal.Chem.,1996;68:850–859

[87]Sigma-Aldrich.http://www.sigmaaldrich.com/life–science/proteomics/protein–sample–preparation/protein–depletion–products/seppro–depletion–resins/seppro–igy14–system.html(18.04.2009)

[88]SławekJ.:Otępieniewzespołachpozapiramidowych.Pol.Przegl.Neurol.,2008;4:129–139

Postepy Hig Med Dosw (online), 2009; tom 63: 549-563

562

-

-

-

-

-

[89]Small Area Health Statistics Unit within the Department ofEpidemiologyandPublicHealthatImperialCollegeLondon.http://www.sahsu.org/index.php(13.08.2009)

[90]SmithM.A.,BainsS.K.,BettsaJ.C.,ChoyE.H.,ZendersE.D.:Useoftwo-dimensionalelectrophoresistomeasurechangesinsynovialfluidfrompatientswithrheumatoidarthritistreatedwithantibodytoCD4.Clin.Diag.Lab.Immunol.,2001;8:105–111

[91]SowellR.,OwenJ.B.,ButterfieldD.A.:ProteomicsinanimalmodelsofAlzheimer’sandParkinson’sdiseases.AgeingRes.Rev.,2009;8:1–17

[92]SteelL.F.,ShumpertD.,TrotterM.,SeeholzerS.H.,EvansA.A.,LondonW.T.,DwekR.,BlockT.M.:Astrategyforthecomparativeanalysisofserumproteomesforthediscoveryofbiomarkersforhe-patocellularcarcinoma.Proteomics,2003;3:601–609

[93]SteinbergT.H.,JonesL.J.,HauglandR.P.,SingerV.L.:SYPROOrangeandSYPRORedProteinGelStains:One-stepfluorescentstainingofdenaturinggels fordetectionofnanogramlevelsofprotein.Anal.Biochem.,1996;239:223–237

[94]SultanaR.,PerluigiM.,ButterfieldD.A.:Oxidativelymodifiedprote-insinAlzheimer’sdisease(AD),mildcognitiveimpairmentandani-malmodelsofAD:roleofAbinpathogenesis.ActaNeuropathol.,2009;118:131–150

[95]Szymańska-ChabowskaA.,Antonowicz-JuchniewiczJ.,AndrzejakR.:Analizastężeńwybranychmarkerówneoplazmatycznychuosóbzawodowonarażonychnaarsenimetaleciężkie.Med.Pr.,2004;55:313–320

[96]TarkowskiB.,GirstunA.:Zastosowaniespektrometriimaswposzu-kiwaniachbiomarkerówchoróbnowotworowych.Kosmos,2005;54:331–343

[97]ThambisettyM.,HyeA.,FoyC.,DalyE.,GloverA.,CooperA.,SimmonsA.,MurphyD.,LovestoneS.:Proteome-basedidentifica-tionofplasmaproteinsassociatedwithhippocampalmetabolisminearlyAlzheimer’sdisease.J.Neurol.,2008;255:1712–1720

[98]TianM.,CuiY.Z.,SongG.H.,ZongM.J.,ZhouX.Y.,ChenY.,HanJ.X.:ProteomicanalysisidentifiesMMp-9,DJ-1andA1BGasovere-xpressedproteinsinpancreaticjuicepancreaticductaladenocarcino-mapatients.BMCCancer,2008;8:241–252

[99]TillemanK.,DeforceD.,ElewautD.:Rheumatology:acloseencoun-terwithproteomics.Rheumatology,2005;44:1217–1226

[100]TirumalaiR.S.,ChanK.C.,PrietoD.A., IssaqH.,ConradsT.P.,VeenstraT.D.:Characterizationofthelowmolecularweighthumanserumproteome.Mol.Cell.Proteomics,2003;2:1096–1103

[101]TomaszewskaK.,NalewajJ.,MarkowskaJ.:Proteomika–nowame-todaoznaczaniamarkerównowotworowych.Rakjajnika.Onkol.Pol.,2005;8:79–81

[102]TsangarisG.T.,KaramessinisP.,KolialexiA.,GarbisS.D.,AntsaklisA.,MavrouA.,FountoulakisM.:ProteomicanalysisofamnioticfluidinpregnancieswithDownsyndrome.Proteomics,2006;6:4410–4419

[103]VanBelleW.,ÅnensenN.,HaalandI.,BruserudØ.,HøgdaK.A.,GjertsenB.T.:Correlationanalysisoftwo-dimensionalgelelectropho-reticproteinpatternsandbiologicalvariables.BMCBioinformatics,2006;7:198

[104]VascottoC.,SalzanoA.M.,D’AmbrosioC.,FruscalzoA.,MarchesoniD.,diLoretoC.,ScaloniA.,TellG.,QuadrifoglioF.:Oxidizedtransthy-retininamnioticfluidasanearlymarkerofpreeclampsia.J.ProteomeRes.,2007;6:160–170

[105]VeenstraT.D.,ConradsT.P.,HoodB.L.,AvellinoA.M.,EllenbogenR.G.,MorrisonR.S.:Biomarkers:miningthebiofluidproteome.Mol.Cell.Proteomics,2005;4:409–418

[106]VerrillsN.M.:Clinicalproteomics:presentandfutureprospects.Clin.Biochem.Rev.,2006;27:99–116

[107]VilasiA.,CutillasP.R.,MaherA.D.,ZirahS.F,CapassoG.,NordenA.W.,HolmesE.,NicholsonJ.K.,UnwinR.J.:CombinedproteomicandmetabonomicstudiesinthreegeneticformsoftherenalFanconisyndrome.Am.J.Physiol.RenalPhysiol.,2007;293:F456–F467

[108]WaksmańskiB.,OlejekA.:Proteomikawprognozowaniuwystąpie-niarakajajnika:rzeczywistośćinadzieje.Przegl.Menop.,2006;10:352–357

[109]WaleckiJ.,Pawłowska–DetkoA.,AdamczykM.:Rolawspółcze-snychmetodobrazowaniawrozpoznaniuimonitorowaniuotępienia.Pol.Przegl.Neurol.,2007;3:69–89

[110]WanC.,LaY.,ZhuH.,YangY.,JiangL.,ChenY.,FengG.,LiH.,SangH.,HaoX.,ZhangG.,HeL.:Abnormalchangesofplasmaacu-tephaseproteinsinschizophreniaandtherelationbetweenschizoph-reniaandhaptoglobin(Hp)gene.AminoAcids,2007;32:101–108

[111]WilkinsM.R.:Biomarker identification: the roleofexperimentaldesign,statistics,anddatasharing.W:ClinicalProteomics.FromDiagnosis toTherapy, red.: J.E.VanEyk,M.J.Dunn.Wiley-VCH,Weinheim2008,113–120

[112]YamagiwaH.,SarkarG.,CharlesworthM.C.,McCormickD.J.,BolanderM.E.:Two-dimensionalgelelectrophoresisofsynovialflu-id:methodfordetectingcandidateproteinmarkersforosteoarthritis.J.Orthop.Sci.,2003;8:482–490

[113]YeB.,SkatesS.,MokS.C.,HorickN.K.,RosenbergF.H.,VitonisA.,EdwardsD.,SlussP.,HanW.K.,BerkowitzR.S.,CramerD.W.:Proteomic-baseddiscoveryandcharacterizationofglycosylatedeosi-nophil-derivedneurotoxinandCOOH-terminalosteopontinfragmentsforovariancancerinurine.Clin.CancerRes.,2006;12:432–441

[114]ZellnerM.,VeitingerM.,UmlaufE.:Theroleofproteomicsinde-mentiaandAlzheimer’sdisease.ActaNeuropathol.,2009;118:181–195

[115]ZhengX.,BakerH.,HancockW.S.:Analysisofthelowmolecularweightserumpeptidomeusingultrafiltrationandahybridiontrap-Fouriertransformmassspectrometer.J.Chromatogr.A,2006;1120:173–184

[116]ZhouM.,LucasD.A.,ChanK.C.,IssaqH.J.,PetricoinE.F.,LiottaL.A.,VeenstraT.D.,ConradsT.P.:Aninvestigationintothehumanserum“interactome”.Electrophoresis,2004;25:1289–1298

[117]ZiętekM.,GrzebieluchW.,Kobierska-BrzozaJ.,MalickaB.,Składnik-JankowskaJ.:WybraneparametryślinyudzieciimłodzieżyzzespołemDowna–doniesieniawstępne.Dent.Med.Probl.,2008;45:165–168

[118]Zimmermann-Górska I.: Choroby reumatyczne. Wyd. PZWL,Warszawa2004

Autorzydeklarująbrakpotencjalnychkonfliktówinteresów.

Kossowska B. i wsp. – Analiza proteomiczna profili białkowych…

563

-

-

-

-

-