7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡...

19
7!4*234 .02$&', g_NSNSĔ Ô¶āÍSÉÑÍ ^ PQ

Transcript of 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡...

Page 1: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

7!4�����*234�����.02�$&� ',�

g_NSNSĔ �Ô¶āÍSÉÑÍ ���ņņ^�ņPQ�

Page 2: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

ĐÆŨæ�ƻņEġţőŦŋÜê�

2

ĵļĸŀĻĿŀľĶķĻĹņįįĨįĥǃ�

IJŀĻĿŀľĶķĻĹņǂĩĨĪĥ�

VBNC (Viable but Not Culturable)�

ƩƑƇƛƨŻơƳƶƓ

�¿Üê�

ƂŽƩƴ ƩƑƇƛƨ

ƩƑƇƛƨƯŽƠƯưƶ

¾J�ŨÜê�

£��ƊƶƄƀƴƉƶ�

Page 3: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

ŕŷŭţŨy��

ƩƑƇƛƨƯŽƠƯưƶ

ƄƳƶƙƴƅ ŗŷŝDNAď

61,000 26,000

MGSB2 MGSB3

ƄƳƶƴ�

4,000 160 Mb 2.3 Gb 80 Mb

ƊƶƄƀƴƌ ŗŷŝDNAď

48 Mbp 32 Mbp 32 Mbp

MGSB1

ƯŽƠƯưƶƖƶƑ�ƖƶƑƢƶƌ�Ø�

ªtƌƄưƶƙƴƅ�

�ôƀƌƕƯƶƏ 1 / 26,000 Okamura et al. Mar. Biotechnol. (2010) �ôCdß5ƑƴƝƄā 6 / 3,300

in silico +ªtƌƄưƶƙƴƅ�

P�¼ªt)ƣơƓƘ 1 / 120

ƩƑƇƛƨŏŴũ�ôţƭƙƶƄŦĈ�QŐ¹nţőŶň ŘŏŘ….. ƌƄưƶƙƴƅ(ºũlŨýĞţŊŶňņ↓ Ċ �ÛŤÞŮ5Ÿśŝģ(ºƌƄưƶƙƴƅ

�ÐÂNSņÕ]�¿ŤŨ�6ÉÑ (ey14-19fhņNEDO¿ª¢çªÁCo¾À�Ɗƌƕƨ $ąơƳƅƯƨ) �

(ey23-24fh JST A-STEP Ɗƶƍ�ÛƸ�

ŜŨ��

Page 4: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

m�©ŨƩƑƇƛƨŻơƳƶƓŨ=г�

•  ƊƶƄƀƴƌĊ uHŞœţũ+�ţũŦŋň ņ�Ƹ�ÈĊ ŧųŶPCRţũƭƙƶƄŦŰŨũŦŏŦŏŤŷŦŋň ņņņT�ŦORFţŰªtŐŦŋŰŨŐŊŶň ņņņ�ÈĈ�QŐ�ŒÄŦŶƭƙƶƄŦ¢çŹËřňųşŢ�ÈŨĈ�QŹĕLţőŦŋň

•  rŚƄƳƶƙƴƅŇªtƌƄưƶƙƴƅŹrĝŤřŶŲōŧŇ PKSƷƥưƆƓƘ5yċÚƸűNRPSƷěưƤƐƶƨ5yċÚƸŨĈ�QŹƈƶƘřŶaNĈ�QƄƯƌƑƶƷ�100kb)ŹàâřŶŕŤŐţőŦŋň

4

�µ)ŨưƌƄ>ĉŨŝůŇ�ƇƛƨKd©Ź�÷�

Page 5: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

ĐÆŨæ�ƼņRCAŨ=г�

RCA; Rolling Circle Amplification�ơƯŽƦƶũrandom hexamer Ź�Á�

(Multiple Displacement Amplification)�

[Ŧŋû�ŹKd1ç

·ÄtŦŘ�

1 2 3 4

1

3

(kb)

2.7 kb ƲƶƴĪİĤĴIJıĤÀ¶ŇĤčCũĤĽĵIJĪįĤĦīĨĮĺķħ�ƲƶƴīİĤƚƃƕżƠƈƴƗƳƶƱƷčCŦŘƸ�ƲƶƴĬİĤƲƶƴĪŨ���ĴijĤ¬)¶�ƲƶƴĭİƲƶƴƼŨ���ĴijĤ¬)¶�

X�ŧƈƴƑƧƚƶƊƮƴŹKdřŶň�

PCRŨųŌŧĊ ŹćŪŦŋ�

Page 6: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

=Ğõ¨ŧ8œŢ�

•  �%Ò�ŏŴŨƈƴƑƧƚƶƊƮƴŹ>ĉřŶň

•  ·ÄÇŦKd©ŹÊÓřŶŕŤţŇNM�Ũ®ėêŨKdŹ|ōŶň ņƷ¾JƉƴơƱŇ�¿êŦťŨI5Ƹ�

6

Page 7: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

ISOƻƢƴƓY�ŧųŶ¯«hŨÊ��

7

Table KOACH T-500 =�%�/>��

éÉ�i�ÌŨŖ,%ŧųŵŇ ƜŽƁƢƴƓÁŧƂƌƑƦŽƍ�

�%� �����

�1 65�

<"�

ƟƶƘ 9?Ź?ŋŇë�êĒ¤�

ĕʧ ơƯƌƓƔƄžſŻïĜŨĚʧŹĂ°�

Polluted�

Cleaned�KOACHƊƌƕƨŨƊƧƬƲƶƊƮƴ�

ISO1

ISO2

ISO3

ISO4

ISO5

ISO6

ISO7

ISO8

ISO9

+)-�����8���; �

Push

-hoo

d�

Push-hood�

Page 8: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

·ÄÇơƯŽƧƴƅŧųŶRCA©�

8

.½� specific primer Ź�Á�

?(:9#�

������

{îŨ·q Ń ·ÄÇĊ Ź�Á→ƻ�QŊŝŵ1×zŨơƯŽƧƴƅ ń 1�Ď5ylŇ2�Ď5y Ņ 30łÖ±/sŨŝůTm�ŧ#ē → ·ÄtŹ}ŝśŶŕŤŧy&

Φ29 DNAƥưƩƯƶƏ�Ďá�C�ď Ö±/sƷěå´ċÚƸ 30 ˚C

Page 9: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

WĢ�ƻǁĤ·ÄÇơƯŽƦƶŹÁŋŝpUC19ŨKd�

(A) PC (pUC19添加) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

(B) NC (鋳型なし)

1. ランダム6-mer (ノーマル) 2. ランダム6-mer (ブロッキングDNA) 3.ランダム6-mer (ブロッキングRNA) 4. M13プライマー(市販品) 18-mer 5. M13プライマー(ブロッキングDNA) 6. M13/ 8-mer 7. M13/ 9-mer 8. M13/ 9-mer , high Tm 9. M13/ 10-mer 10. M13/ 10-mer , high Tm 11. M13/ 11-mer

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

特異的プライマーにより、増幅が確認され、非特異増幅が起きていないことから、特異的増幅と考えられる。

Page 10: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

WĢ�ƻĤŠšőƷWúƸ�

10

8 9 9h 10 10h 11

EcoRIţ¬)ŗŷŦŋňŲōŧssDNAŐnŴŷŢŋŶ1çtŐģŋň�

8 9h 10 10h 11

2.7 kb

(A) ƻ£/s­ŹEcoRIţ¬)� (B) Taq DNAƥưƩƯƶƏţƼ�Ď)Řŝ Ƽ£/s­ŹEcoRIţ¬)�

2.7kbŨƜƴƘŐüůŴŷŇpUC19ŨƭƙƔƗŐƑƴƖƨŧ�źţKdŗŷŝŕŤŐÊüŗŷŝň�

Page 11: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

WĢ�ƼǁNèêOė­ŹÁŋŝ·ÄÇKd�

11

WĢ� ǁ�čCǁpUC19 1pg (Ù3.4x105�QƸĤƹĤE.coli JM109�Ʒ103~104cells) ơƯŽƦƶǁĤblaĈ�QŨĊ ŧFšőøö

Êü�©ǁpUC19·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR (·ÄÇKdÊüƸņKdÀ¶ũ387 bp ņņņņņņņNèê·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCRƷě·ÄÇKdÊüƸKdÀ¶ũ585 bp

(A) pUC19·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR (B)Nèê·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR

300�500�

10h 10 11 12 10h 10 11 12 PC� NC�

10h 10 11 12 10h 10 11 12 PC� NC�

PC:čCŊŵ NC:čCŦŘ

DŽUC19ŨĈ�QŨŮKdŐÊüŗŷŇ®5čCţŰ·ÄÇKdţőŶŕŤŐË<ŗŷŝň�

Page 12: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

WĢ�ƽǁ�ƇƛƨƉŽƍţŨ·ÄÇKd�

ƻņƼņƽņƾ�

čC 1.  107cČ (~104cells) 2.  108cČ (~103cells) 3.  109cČ (~102cells) 4.  1010cČ (~10cells)

Pseudomonas PCR primer

Eco-sp PCR primer

ƻņƼņƽņƾ� ƻņƼņƽņƾ� ƻņƼņƽņƾ�PseudomonasŨŮ� mix 1:1� mix 1:1� E.coliŨŮ�čC�

�ŢŨ� ţNèêĈ�QŨKdũóŴŷŚŇƥƋƕżƠƈƴƗƳƶƱţŨŮPseudomonas\·ÄÇKdŐŮŴŷŝŕŤŏŴŇNRPSŹơƯŽƧƴƅƉŽƗŤŘŢ�ƇƛƨKdŐË<ŗŷŝň

WĢ� ǁ� čCǁĤPseudomonas fluorescense ATCC17400�ĤcČŘŝê­Ʒ�~104cells) ����E.coli JM109�ĤcČŘŝê­Ʒ�~104cells) ����6cČ�ºŨ®5ê­Ʒ1:1Ƹ ơƯŽƦƶǁĤNRPSĈ�QŨĊ ŧFšőøö

Êü�©ǁPseudomonas\·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR (·ÄÇKdÊüƸņKdÀ¶ũ617 bp ņņņņņņņNèê·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCRƷě·ÄÇKdÊüƸKdÀ¶ũ585 bp

Page 13: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

�ÉÑţ1çŧŦşŝŕŤ�

•  ·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶƻ£/sţƻ�ĎDNAŹ5yŘŇƼ£/sţƼ�ĎDNA5yřŶŕŤţŇƼ�ĎŨ�Q��KdŹ1çŤŘŝň

•  NRPS·ÄÇơƯŽƦƶŹÁŋŝRCAŧųşŢŇNRPS�}ê�ŨŮŐKdŗŷŶ૬ÊüŘŝň

•  ơƯŽƦƶũ18-merŭţKdŹÊüŘŝňųşŢ+�Ŧ·ÄtŹ}ŝśŶŕŤŐţőŶň

•  OėêŐRAŘŢŋŢŰŇ·ÄÇKdŐ1çŤŦşŝň

•  Ƈƛƨ�ŨƑƶƇƔƗĈ�QŹơƯŽƧƴƅƉŽƗŤřŶŇ�ƇƛƨKdŨ1çtŐË<ŗŷŝň

Page 14: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

�{îŨ·qƵm�{îŤŨ¦ă�

14

�{î� m�{î�

 ÇĈ�QŨ·ÄÇĊ � ơƯŽƦƶ� Ưƴƒƨ�

18merŭţÊü� ơƯŽƦƶď� ƿ�ǀĤmer� Ç·ÄÇŧKd� ·Ät� řŬŢŨDNAŹKd�

OėƉƴơƱţŰOK ·ÄÇŧKdřŶŝůŧ�

ƊƴƅƱƎƱƦƙƞƬƲƶƊƮƴŐrò�

Ƽ/sţƼ�ĎDNAŹ0nň ŝŞŘŇ�ƇƛƨƉŽƍţŨ Ƽ�Ď)ũ»A�÷�ň�

ƻ/sţƼ�ĎDNAŹ0n�

Page 15: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

vVŗŷŶÁĄ�

•  �ô$ìƊƶƍŇPKS, NRPSŨÆ� •  ƩƑƇƛƨŏŴŨ ÇċÚŨ�Û •  Ġ;�Ũp¿¶ƇƛƨŨģwh�� ņƷÏ!"ŇƈƴƑƧƚƶƊƮƴŨ��Ƹ •  �ĖtŨưƌƄƵƟưƶŨƉƴơƱþñ ņƷw�ÅŨù�ŦťƸ •  ²AžŽƱƌŨKd •  �¿p¿¶Ƈƛƨõ�ņ

15

Page 16: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

lŨýĞ�

16

�ƇƛƨƌƆƶƱţŨƼ�Ď)ơƳƗƈƶƱŨÊÓ�

ƪƖƱ¾¸DNAũZŗŋŝůŇƻ£/sÝ�lŨÀ¶�ŨơƯŽƧƴƅƉŽƗŐŇ �ƇƛƨƌƆƶƱŨI5ŧ¦Ŭ103�MŋŤãōŴŷŶň mşŢ/sŹ103�ŧjő�ŔŶơƳƗƈƶƱŐròŤŦŶň

Contamination freeŨsingle cell genomicsŐ1çŤŦŶň�

NCðáŰMEMSƖƜŽƌŨøöŰròŨŦŋ single cell manipulation©Ũã�Ĥ�

Page 17: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

��ūŨ�k�

ƻƺvVŗŷŶÁĄŧé:ŨŊŶ��ŤŨ�6ÉÑŹc�ň4Ïû�·tŹãxŘŝƑƶƇƔƗKd� ŹÊÓţőŶŤãōŢŋŶň ƼƺpÜ'`{îŹ�řŶ��ŤŇ�ŋ~ŢŨ/sƓƫƴƜƶĐÆŹc�řŶň ƽƺSingle cell genomicsŹíŌ��ũŇƼ�Ď)ŐÊÓŗŷŝlŨŕŨ{îŹ�ÁřŶŕŤţŇ �(ưƶƘ�Ő�¥ŧ8�ŘŇģ(º)Ő@ŷŶŤ�kŗŷŶň

17

Page 18: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

�{îŧđřŶÈÇĀÀ¡�

18

•  Æ�Ũ7Î ǁ ÇDNAŨ·ÄÇKd© •  �ğÃ2 ņņņņĤǁ·ğ2012-261404 •  �ğ ǁg_NS •  Æ�ä ǁ^�ņPQ

Page 19: 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡ ¯ } ´ } P G ¨ ± hI5 g l103 M K dã M t w v H m _ b/s y103 gj Q T v ¡ ³ ±

Ŏ=ŋ5Ÿś��

g_NSĤŁÀSƵBDĆ�ƎƴƑƶ�

ÀSUĆ�ƈƶƖżƚƶƑƶĤŁŁŁGĤÿ3 ʼn734-8551 g_b-*ę1-2-3�TELǁĤ(082)257-5918ņ FAXǁ(082)257-1567 E-mailǁ[email protected]

19