7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡...
Transcript of 7!4 *234 .02...l hý 16 ¨ ± c h ¼ ) ¡ ³ ± hÊÓ ª ±¾¸DNA iZ W K ] o G »£/sÝ l hÀ h ¡...
7!4�����*234�����.02�$&� ',�
g_NSNSĔ �Ô¶āÍSÉÑÍ ���ņņ^�ņPQ�
ĐÆŨæ�ƻņEġţőŦŋÜê�
2
ĵļĸŀĻĿŀľĶķĻĹņįįĨįĥǃ�
IJŀĻĿŀľĶķĻĹņǂĩĨĪĥ�
VBNC (Viable but Not Culturable)�
ƩƑƇƛƨŻơƳƶƓ
�¿Üê�
ƂŽƩƴ ƩƑƇƛƨ
ƩƑƇƛƨƯŽƠƯưƶ
¾J�ŨÜê�
£��ƊƶƄƀƴƉƶ�
ŕŷŭţŨy��
ƩƑƇƛƨƯŽƠƯưƶ
ƄƳƶƙƴƅ ŗŷŝDNAď
61,000 26,000
MGSB2 MGSB3
ƄƳƶƴ�
4,000 160 Mb 2.3 Gb 80 Mb
ƊƶƄƀƴƌ ŗŷŝDNAď
48 Mbp 32 Mbp 32 Mbp
MGSB1
ƯŽƠƯưƶƖƶƑ�ƖƶƑƢƶƌ�Ø�
ªtƌƄưƶƙƴƅ�
�ôƀƌƕƯƶƏ 1 / 26,000 Okamura et al. Mar. Biotechnol. (2010) �ôCdß5ƑƴƝƄā 6 / 3,300
in silico +ªtƌƄưƶƙƴƅ�
P�¼ªt)ƣơƓƘ 1 / 120
ƩƑƇƛƨŏŴũ�ôţƭƙƶƄŦĈ�QŐ¹nţőŶň ŘŏŘ….. ƌƄưƶƙƴƅ(ºũlŨýĞţŊŶňņ↓ Ċ �ÛŤÞŮ5Ÿśŝģ(ºƌƄưƶƙƴƅ
�ÐÂNSņÕ]�¿ŤŨ�6ÉÑ (ey14-19fhņNEDO¿ª¢çªÁCo¾À�Ɗƌƕƨ $ąơƳƅƯƨ) �
(ey23-24fh JST A-STEP Ɗƶƍ�ÛƸ�
ŜŨ��
m�©ŨƩƑƇƛƨŻơƳƶƓŨ=г�
• ƊƶƄƀƴƌĊ uHŞœţũ+�ţũŦŋň ņ�Ƹ�ÈĊ ŧųŶPCRţũƭƙƶƄŦŰŨũŦŏŦŏŤŷŦŋň ņņņT�ŦORFţŰªtŐŦŋŰŨŐŊŶň ņņņ�ÈĈ�QŐ�ŒÄŦŶƭƙƶƄŦ¢çŹËřňųşŢ�ÈŨĈ�QŹĕLţőŦŋň
• rŚƄƳƶƙƴƅŇªtƌƄưƶƙƴƅŹrĝŤřŶŲōŧŇ PKSƷƥưƆƓƘ5yċÚƸűNRPSƷěưƤƐƶƨ5yċÚƸŨĈ�QŹƈƶƘřŶaNĈ�QƄƯƌƑƶƷ�100kb)ŹàâřŶŕŤŐţőŦŋň
�
4
�µ)ŨưƌƄ>ĉŨŝůŇ�ƇƛƨKd©Ź�÷�
ĐÆŨæ�ƼņRCAŨ=г�
RCA; Rolling Circle Amplification�ơƯŽƦƶũrandom hexamer Ź�Á�
(Multiple Displacement Amplification)�
[Ŧŋû�ŹKd1ç
·ÄtŦŘ�
1 2 3 4
1
3
(kb)
2.7 kb ƲƶƴĪİĤĴIJıĤÀ¶ŇĤčCũĤĽĵIJĪįĤĦīĨĮĺķħ�ƲƶƴīİĤƚƃƕżƠƈƴƗƳƶƱƷčCŦŘƸ�ƲƶƴĬİĤƲƶƴĪŨ���ĴijĤ¬)¶�ƲƶƴĭİƲƶƴƼŨ���ĴijĤ¬)¶�
X�ŧƈƴƑƧƚƶƊƮƴŹKdřŶň�
PCRŨųŌŧĊ ŹćŪŦŋ�
=Ğõ¨ŧ8œŢ�
• �%Ò�ŏŴŨƈƴƑƧƚƶƊƮƴŹ>ĉřŶň
• ·ÄÇŦKd©ŹÊÓřŶŕŤţŇNM�Ũ®ėêŨKdŹ|ōŶň ņƷ¾JƉƴơƱŇ�¿êŦťŨI5Ƹ�
6
ISOƻƢƴƓY�ŧųŶ¯«hŨÊ��
7
Table KOACH T-500 =�%�/>��
éÉ�i�ÌŨŖ,%ŧųŵŇ ƜŽƁƢƴƓÁŧƂƌƑƦŽƍ�
�%� �����
�1 65�
<"�
ƟƶƘ 9?Ź?ŋŇë�êĒ¤�
ĕʧ ơƯƌƓƔƄžſŻïĜŨĚʧŹĂ°�
Polluted�
Cleaned�KOACHƊƌƕƨŨƊƧƬƲƶƊƮƴ�
ISO1
ISO2
ISO3
ISO4
ISO5
ISO6
ISO7
ISO8
ISO9
+)-�����8���; �
Push
-hoo
d�
Push-hood�
·ÄÇơƯŽƧƴƅŧųŶRCA©�
8
.½� specific primer Ź�Á�
?(:9#�
������
{îŨ·q Ń ·ÄÇĊ Ź�Á→ƻ�QŊŝŵ1×zŨơƯŽƧƴƅ ń 1�Ď5ylŇ2�Ď5y Ņ 30łÖ±/sŨŝůTm�ŧ#ē → ·ÄtŹ}ŝśŶŕŤŧy&
Φ29 DNAƥưƩƯƶƏ�Ďá�C�ď Ö±/sƷěå´ċÚƸ 30 ˚C
WĢ�ƻǁĤ·ÄÇơƯŽƦƶŹÁŋŝpUC19ŨKd�
(A) PC (pUC19添加) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
(B) NC (鋳型なし)
1. ランダム6-mer (ノーマル) 2. ランダム6-mer (ブロッキングDNA) 3.ランダム6-mer (ブロッキングRNA) 4. M13プライマー(市販品) 18-mer 5. M13プライマー(ブロッキングDNA) 6. M13/ 8-mer 7. M13/ 9-mer 8. M13/ 9-mer , high Tm 9. M13/ 10-mer 10. M13/ 10-mer , high Tm 11. M13/ 11-mer
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
特異的プライマーにより、増幅が確認され、非特異増幅が起きていないことから、特異的増幅と考えられる。
WĢ�ƻĤŠšőƷWúƸ�
10
8 9 9h 10 10h 11
EcoRIţ¬)ŗŷŦŋňŲōŧssDNAŐnŴŷŢŋŶ1çtŐģŋň�
8 9h 10 10h 11
2.7 kb
(A) ƻ£/sŹEcoRIţ¬)� (B) Taq DNAƥưƩƯƶƏţƼ�Ď)Řŝ Ƽ£/sŹEcoRIţ¬)�
2.7kbŨƜƴƘŐüůŴŷŇpUC19ŨƭƙƔƗŐƑƴƖƨŧ�źţKdŗŷŝŕŤŐÊüŗŷŝň�
WĢ�ƼǁNèêOėŹÁŋŝ·ÄÇKd�
11
WĢ� ǁ�čCǁpUC19 1pg (Ù3.4x105�QƸĤƹĤE.coli JM109�Ʒ103~104cells) ơƯŽƦƶǁĤblaĈ�QŨĊ ŧFšőøö
Êü�©ǁpUC19·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR (·ÄÇKdÊüƸņKdÀ¶ũ387 bp ņņņņņņņNèê·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCRƷě·ÄÇKdÊüƸKdÀ¶ũ585 bp
(A) pUC19·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR (B)Nèê·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR
300�500�
10h 10 11 12 10h 10 11 12 PC� NC�
10h 10 11 12 10h 10 11 12 PC� NC�
PC:čCŊŵ NC:čCŦŘ
DŽUC19ŨĈ�QŨŮKdŐÊüŗŷŇ®5čCţŰ·ÄÇKdţőŶŕŤŐË<ŗŷŝň�
WĢ�ƽǁ�ƇƛƨƉŽƍţŨ·ÄÇKd�
ƻņƼņƽņƾ�
čC 1. 107cČ (~104cells) 2. 108cČ (~103cells) 3. 109cČ (~102cells) 4. 1010cČ (~10cells)
Pseudomonas PCR primer
Eco-sp PCR primer
ƻņƼņƽņƾ� ƻņƼņƽņƾ� ƻņƼņƽņƾ�PseudomonasŨŮ� mix 1:1� mix 1:1� E.coliŨŮ�čC�
�ŢŨ� ţNèêĈ�QŨKdũóŴŷŚŇƥƋƕżƠƈƴƗƳƶƱţŨŮPseudomonas\·ÄÇKdŐŮŴŷŝŕŤŏŴŇNRPSŹơƯŽƧƴƅƉŽƗŤŘŢ�ƇƛƨKdŐË<ŗŷŝň
WĢ� ǁ� čCǁĤPseudomonas fluorescense ATCC17400�ĤcČŘŝêƷ�~104cells) ����E.coli JM109�ĤcČŘŝêƷ�~104cells) ����6cČ�ºŨ®5êƷ1:1Ƹ ơƯŽƦƶǁĤNRPSĈ�QŨĊ ŧFšőøö
Êü�©ǁPseudomonas\·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCR (·ÄÇKdÊüƸņKdÀ¶ũ617 bp ņņņņņņņNèê·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶPCRƷě·ÄÇKdÊüƸKdÀ¶ũ585 bp
�ÉÑţ1çŧŦşŝŕŤ�
• ·ÄÇơƯŽƦƶŧųŶƻ£/sţƻ�ĎDNAŹ5yŘŇƼ£/sţƼ�ĎDNA5yřŶŕŤţŇƼ�ĎŨ�Q��KdŹ1çŤŘŝň
• NRPS·ÄÇơƯŽƦƶŹÁŋŝRCAŧųşŢŇNRPS�}ê�ŨŮŐKdŗŷŶ૬ÊüŘŝň
• ơƯŽƦƶũ18-merŭţKdŹÊüŘŝňųşŢ+�Ŧ·ÄtŹ}ŝśŶŕŤŐţőŶň
• OėêŐRAŘŢŋŢŰŇ·ÄÇKdŐ1çŤŦşŝň
• Ƈƛƨ�ŨƑƶƇƔƗĈ�QŹơƯŽƧƴƅƉŽƗŤřŶŇ�ƇƛƨKdŨ1çtŐË<ŗŷŝň
�
�{îŨ·qƵm�{îŤŨ¦ă�
14
�{î� m�{î�
ÇĈ�QŨ·ÄÇĊ � ơƯŽƦƶ� Ưƴƒƨ�
18merŭţÊü� ơƯŽƦƶď� ƿ�ǀĤmer� Ç·ÄÇŧKd� ·Ät� řŬŢŨDNAŹKd�
OėƉƴơƱţŰOK ·ÄÇŧKdřŶŝůŧ�
ƊƴƅƱƎƱƦƙƞƬƲƶƊƮƴŐrò�
Ƽ/sţƼ�ĎDNAŹ0nň ŝŞŘŇ�ƇƛƨƉŽƍţŨ Ƽ�Ď)ũ»A�÷�ň�
ƻ/sţƼ�ĎDNAŹ0n�
vVŗŷŶÁĄ�
• �ô$ìƊƶƍŇPKS, NRPSŨÆ� • ƩƑƇƛƨŏŴŨ ÇċÚŨ�Û • Ġ;�Ũp¿¶ƇƛƨŨģwh�� ņƷÏ!"ŇƈƴƑƧƚƶƊƮƴŨ��Ƹ • �ĖtŨưƌƄƵƟưƶŨƉƴơƱþñ ņƷw�ÅŨù�ŦťƸ • ²AžŽƱƌŨKd • �¿p¿¶Ƈƛƨõ�ņ
15
lŨýĞ�
16
�ƇƛƨƌƆƶƱţŨƼ�Ď)ơƳƗƈƶƱŨÊÓ�
ƪƖƱ¾¸DNAũZŗŋŝůŇƻ£/sÝ�lŨÀ¶�ŨơƯŽƧƴƅƉŽƗŐŇ �ƇƛƨƌƆƶƱŨI5ŧ¦Ŭ103�MŋŤãōŴŷŶň mşŢ/sŹ103�ŧjő�ŔŶơƳƗƈƶƱŐròŤŦŶň
Contamination freeŨsingle cell genomicsŐ1çŤŦŶň�
NCðáŰMEMSƖƜŽƌŨøöŰròŨŦŋ single cell manipulation©Ũã�Ĥ�
��ūŨ�k�
ƻƺvVŗŷŶÁĄŧé:ŨŊŶ��ŤŨ�6ÉÑŹc�ň4Ïû�·tŹãxŘŝƑƶƇƔƗKd� ŹÊÓţőŶŤãōŢŋŶň ƼƺpÜ'`{îŹ�řŶ��ŤŇ�ŋ~ŢŨ/sƓƫƴƜƶĐÆŹc�řŶň ƽƺSingle cell genomicsŹíŌ��ũŇƼ�Ď)ŐÊÓŗŷŝlŨŕŨ{îŹ�ÁřŶŕŤţŇ �(ưƶƘ�Ő�¥ŧ8�ŘŇģ(º)Ő@ŷŶŤ�kŗŷŶň
17
�{îŧđřŶÈÇĀÀ¡�
18
• Æ�Ũ7Î ǁ ÇDNAŨ·ÄÇKd© • �ğÃ2 ņņņņĤǁ·ğ2012-261404 • �ğ ǁg_NS • Æ�ä ǁ^�ņPQ
Ŏ=ŋ5Ÿś��
g_NSĤŁÀSƵBDĆ�ƎƴƑƶ�
ÀSUĆ�ƈƶƖżƚƶƑƶĤŁŁŁGĤÿ3 ʼn734-8551 g_b-*ę1-2-3�TELǁĤ(082)257-5918ņ FAXǁ(082)257-1567 E-mailǁ[email protected] �
19