2013-01-06

1

W środowisku naturalnym organizmy są często narażone na działanie złożonej

mieszaniny substancji skażających. Rzadko zdarza się, by któryś ze związków

dominował nad pozostałymi składnikami danej substancji.

Chromatogramy kongenerów PCB w tkankach małża (Macoma baltica) i fokizwyczajnej (Phoca vitulina) z holenderskiego Wadden Sea.

Często toksyczność mieszaniny jest prawie równa sumie toksycznościposzczególnych składników (w mieszaninie każda substancja ma prawie taką samą

toksyczność, jaką miałaby testowana osobno).

W sytuacji, gdy nie mamy dowodów na potencjację lub antagonizm, możemy ocenićtoksyczność mieszaniny związków sumując spodziewane skutki toksyczne każdego

ze składników, np.

mieszanina trzech składników w stężeniach, które badane pojedynczo dałyby

odpowiednio 5%, 10% i 15% śmiertelność, spowoduje śmiertelność 30%, gdyby

toksyczność była tylko addytywna.

W obrębie jednej grupy związków powinno je wyróżniać powinowactwo do miejscadziałania (receptora), i wynikające stąd różnice zależności między dawką i skutkiem

toksycznym.

Jeśli skorygujemy stężenia pojedynczych związków o współczynniki powinowactwa,wtedy wszystkie dane dotyczące toksyczności można dopasować do jednej krzywej

„dawka-reakcja".

W praktyce wykonuje się to z wyliczenia wskaźników toksyczności równoważnej(TEF, ang. toxic equivalency factors) w odniesieniu do najbardziej toksycznego

składnika z grupy związków.

Przykład: wyznaczenie równoważników dioksyny dla mieszaniny

polichlorowanych związków aromatycznych

1. określa się standardową odpowiedź toksyczną (np. 50% śmiertelność),

2. porównuje się, w jakich stężeniach uzyskuje się taki efekt przez:

A. najbardziej toksyczny związek w mieszaninie

B. odpowiadające temu niezbędne stężenie innego związku z tej grupy.

3. Stosunek (A):(B) odpowiada wskaźnikowi toksyczności równoważnej (TEF).

4. wyznacza się udział każdego związku w łącznej toksyczności mieszaniny

równoważnik toksyczności (TEQ; ang. toxic equivalent) dla danego związku.

TEQ wyznacza się mnożąc jego stężenie w próbie ze środowiska (np. wodzie lub

tkance) przez jego wskaźnik toksyczności równoważnej. Wartości TEQ dla

poszczególnych związków można następnie zsumować, uzyskując wielkość

równoważnika toksyczności dla całej mieszaniny, tzn. równoważnej

względem związku referencyjnego.

Przykładem takiego podejścia jest wyliczenie równoważników dioksyny dla

PCDD i koplanarnych PCB, dla których TCDD jest związkiem referencyjnym.

2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioksyna

2013-01-06

2

W przepisach prawnych, gdy sprawa dotyczy toksyczności mieszaniny związków,zazwyczaj zakłada się ich działanie addytywne (o ile nie ma niezbitych dowodów o

działaniu przeciwnym). Oznacza to, że toksyczność mieszaniny związków powinna

być zbliżona do sumy toksyczności jej pojedynczych składników.

Istnieją jednak przypadki, gdzie toksyczność jest znacząco większa niż addytywna.

Dlatego można powiedzieć, że kiedy na organizm działają dwie lub więcejsubstancji, następuje potencjacja toksyczności. Do opisu tego zjawiska stosowany

jest również termin synergizm.

Organizmy PestycydInhibitor

(synergetyk)

Wzrost

toksyczności

Szczepy

owadów

opornych na

piretroidy

CypermetrynaButoksyd

piperonylu< 40x

Owady KarbarylButoksyd

piperonylu< 200x

Ssaki i niektóre

oporne

owady

MalationRóżne związki

fosfoorganiczne< 200x

Oś pionowa oznacza stopień toksyczności związku, a oś pozioma przedstawia składmieszaniny. Maksymalna dawka związku A i B daje taki sam stopień reakcji toksycznej

X. Potencjacja uwidacznia się, gdy toksyczność mieszaniny dwóch związków

przekracza sumę toksyczności poszczególnych składników.

(1) oba związki A i B dają liniową odpowiedź w zakresie dawek 0-4.(2) reakcja na związek A ma charakter liniowy, lecz reakcja na związek B jest

nieliniowa.

Nie można zakładać liniowości na podstawie krzywych reakcji dla pojedynczego

związku. Aby ustalić, czy pojawiła się potencjacja, należy zbadać krzywe

zależności dawka-reakcja dla związków A i B powyżej wielkości dawekzastosowanych w kombinacji.

Problem 1 – liniowość zależności dawka - odpowiedź toksyczna

Van Gestel i Hensbergen w testach na skoczogonkachFolsomia candida stwierdzili, że:

� mieszanina kadmu i cynku działała antagonistycznie

wobec wzrostu� mieszanina kadmu i cynku działała addytywnie w

odniesieniu do reprodukcji

w porównaniu ze skutkami wywoływanymi przez te metalepodawane pojedynczo.

Gdy jeden związek (A) powoduje zmianę metabolizmu innego związku (B), możemywyróżnić dwa typy interakcji:

1. Związek A hamuje system enzymów detoksykujących związek B. Szybkośćdetoksykacji związku B jest dlatego spowalniana przez działanie związku A.

2. Związek A indukuje system enzymów aktywowanych przez związek B. Ze

względu na aktywność związku A wzrasta tempo aktywacji związku B.

Problem 2 – miara toksyczności

Insektycydy piretroidowe, np. cyhalotryna, sąsilnie toksyczne dla pszczół. Często jednak, przy

właściwym prowadzeniu zabiegów w warunkach

polowych nie powodują one wielu szkód.Piretroidy odstraszają pszczoły, w wyniku

subletalnych skutków niskich dawek.

Jednak piretroidy mogą stać się o wielebardziej toksyczne w obecności pewnych

fungicydów hamujących biosyntezę

ergosteroli. Taką potencjację toksycznościprzypisuje się hamowaniu detoksykacji

piretroidów przez system

monooksygenaz.

Benzo(a)piren i niektóre inne rakotwórcze WWA są aktywowane przez indukowalnąformę cytochromu P450 znaną jako P4501A1. Wiele planarnych związków organicznych,

które same nie są rakotwórcze ani mutagenne, może prowadzić do indukcji P4501A1.

WWA, koplanarne PCB i 1,2,7,8-tetrachlorodibenzenodioksyna (TCDD) mogądziałać jako promotory, które nasilają rakotwórcze działanie innych związków. Przez

wzrastające tempo aktywacji karcynogenów mogą także zwiększyć tempo tworzenia

adduktów DNA, to zaś może prowadzić do nasilenia indukowanych chemiczniemutacji.

�W środowisku morskim ryby, ptaki i ssaki mają czasami wyższe poziomy P4501A1 .Jest to związane ze stopniem ekspozycji na działanie zanieczyszczeń takich jak

koplanarne PCB.

�Przypuszcza się, że u osobników z podwyższonym P4501A1 może być większystopień uszkodzeń DNA spowodowany kancerogenami i mutagenami

środowiskowymi.

2013-01-06

3

Trudno przewidzieć oddziaływania zanieczyszczeń na organizmy z możliwą doprzyjęcia precyzją jedynie na podstawie pomiarów stężeń jakiejś substancji w

środowisku abiotycznym.

Do czynników, które wpływają na biologiczną dostępność (biodostępność) związkówchemicznych dla organizmów, należą: wahania temperatury, oddziaływania z innymi

zanieczyszczeniami, rodzaj gleby i osadu, opad deszczu, pH oraz zasolenie.

Odpowiedzi (R) gatunku „a" (A) i „b" (B) na terenach o różnych poziomach skażenia nie są ściślezwiązane ze stężeniami zanieczyszczeń (oś x) w próbach abiotycznych (gleby, powietrza,osadów wodnych) z tych samych terenów. Dużo ściślejsza zależność między gatunkami na tych

samych terenach (C) pozwala znacznie dokładniej przewidzieć reakcję gatunku „b" nazanieczyszczenia na podstawie odpowiedzi gatunku „a" niż na podstawie prób abiotycznych.

Istnieją cztery główne kierunki w monitoringu biologicznych zanieczyszczeńin situ:

1. Monitorowanie wpływu zanieczyszczenia na obecność lub brak gatunków w

jakimś miejscu lub zmian w składzie gatunkowym, znanych również jako

„oddziaływanie na zbiorowiska”;2. Pomiar stężeń substancji zanieczyszczających u gatunków wskaźnikowych lub

„wrażliwych”;

3. Ocena skutków oddziaływania zanieczyszczeń na organizmy i powiązanie ich zestężeniami zanieczyszczeń w tych organizmach oraz innymi wskaźnikami

biotycznymi i abiotycznymi ;

4. Wykrywanie zróżnicowanych genetycznie linii (ras, odmian) gatunków, którerozwinęły odporność na daną substancję zanieczyszczającą.

Inwazyjny pomiar poziomu zanieczyszczeń worganizmach wskazuje ilość zanieczyszczeń w

danym momencie, umożliwiając ocenę ich

oddziaływania na drapieżców. Rozpatrzmy naprzykład gatunek ptaka brodzącego, który

żeruje przede wszystkim na małżach w

estuariach rzecznych. „Krytyczne"(bezpieczne?) stężenia substancji toksycznych

dla ptaków powinny być wyznaczone na

podstawie zawartości toksyn w małżach a nie wosadzie lub wodzie, lub wręcz w ich własnych

tkankach. Małże stanowią zasadnicze ogniwo

szlaku od środowiska abiotycznego do ptakówbrodzących, a jego znaczenie można

monitorować biologicznie poprzez badanie

tych mięczaków.

2013-01-06

4

Skutki ekologiczne i fizjologiczne zanieczyszczeńmogą powodować nieoczekiwane efekty uboczne w

zachowaniu się różnych gatunków.

W Finlandii zanieczyszczenie powietrza pochodzące z

huty miedzi spowodowało zamieranie populacji

gąsienic w sąsiedztwie tego zakładu. Sikory bogatki(Parus major) uzyskują karotenoidy, dzięki którym

mają żółte ubarwienie, właśnie przez żerowanie na

tych gąsienicach. Ptaki żyjące w bezpośredniejbliskości zakładu miały mniej jaskrawe upierzenie niż

ptaki żyjące dalej. Przypuszcza się, że zmniejszy to ich

dostosowanie w kategoriach doboru partnera iprzeżycia.

Podobne rezultaty uzyskano dlaskażonych promieniotwórczo jaskółek

dymówek (Hirundo rustica) z okolic

Czarnobyla, u których musi dojść dokompromisu między zwiększonym

zużyciem karotenoidów w celu zmiatania

wolnych rodników a ich rolą w sygnalizacjiseksualnej .

Odmiany roślin, które charakteryzują się genetyczną odpornością na duże stężenia

metali w glebach, są znane od wielu lat. Także u owadów odporność taka jest dobrze

udokumentowana. Jest ona dziedziczna i powinno się ją odróżniać od tolerancji

fenotypowej, którą mogą mieć wszystkie osobniki danego gatunku (preadaptacja).

Ta ostatnia może obejmować strategie unikania, duże możliwości wydalania lub

obecność enzymów, które rozkładają zanieczyszczenia organiczne.

Tolerancja fenotypowa może być indukowana (np. zwiększona synteza białek

wiążących metale). Genetycznie odrębne odmiany oporne na zanieczyszczenia będą

ewoluowały jednak tylko wtedy, gdy nacisk selekcyjny utrzyma się przez wiele

pokoleń.

Tego rodzaju amplifikację znaleziono u dzikiego szczepu Drosophila, a rozwinęła

się ona prawdopodobnie w odpowiedzi na

opryskiwanie drzew owocowych fungicydami zawierającymi miedź.

Do bezkręgowców lądowych, u których wykazano w doświadczeniach hodowlanych

rozwój odporności genetycznej na duże

stężenia metali, należą dżdżownice. W porównaniu z kontrolą odporne zwierzęta

zazwyczaj przeżywają stężenia metali tylko o

jakieś 30-50% większe. W przypadku metali takich jak miedź i kadm, geny kodujące

metalotioneinę, białko wiążące metal, mogą

być powielone czterokrotnie. Zwierzęta odporne szybciej wiążą metale po ich

wchłonięciu.

Organizmy wykorzystywane w biomonitoringu in situ, powinny spełniaćkryterium „5P”:

1. Podstawowy (ang. Relevant) - jeśli testy ekotoksykologiczne mają miećznaczenie ekologiczne, to powinny wykorzystywać gatunki, które odgrywają

istotną rolę w funkcjonowaniu ekosystemu.

2. Powszechny (ang. Reliable) - pożądane jest, aby gatunek był raczej szeroko

rozpowszechniony, pospolity i łatwy do zebrania, gdyż ułatwi to porównanie

poszczególnych, oddalonych od siebie miejsc.

3. Przeżywający (ang. Robust) - bioindykatory nie powinny ginąć z powodu bardzo

niskich poziomów zanieczyszczeń (z wyjątkiem monitoringu typu 1 opartego nastrukturze zespołów, gdzie ważna jest czułość) i powinny być dostatecznie

wytrzymałe, aby przeżyć w zamknięciu na zanieczyszczonych stanowiskach

polowych.

4. Podatny (ang. Responsive) - organizmy narażone na działanie substancjizanieczyszczającej powinny wykazywać mierzalne reakcje, takie jak większe

stężenia substancji skażającej(-ych) w tkankach (biomonitoring typu 2), zmiany

parametrów takie jak zmniejszenie energetycznego potencjału wzrostu ipłodności, zwiększenie częstości zachorowań lub indukcję odpowiedzi

biochemicznej (biomonitoring typu 3), lub posiadać genetycznie uwarunkowaną

odporność (biomonitoring typu 4).

5. Powtarzalny (ang. Reproducible) - wybrany gatunek poddany w różnych

miejscach takiej samej ekspozycji na zanieczyszczenia powinien wykazywaćpodobne reakcje.

2013-01-06

5

Istotne znaczenie dla wyników analizy chemiczno-toksykologicznej ma sposóbpobrania i następnie przechowywania materiału do badań.

W tym celu zostało wprowadzone postępowanie nazwane Systematyczną Analizą

Toksykologiczną (STA). Jest ono rozumiane jako poszukiwanie nieznanej substancjitoksycznej na tle innych, tworzących matrycę.

Istotnym elementem w oznaczaniu trucizn w materiale biologicznym jest ichwyodrębnienie. Metody wyodrębniania trucizn z materiału biologicznego (tkanki,

narządy, płyny ustrojowe, treść żołądkowa) stanowią integralną część postępowania

analitycznego i są zdeterminowane rodzajem trucizny.Metody wyosabniania dobiera się w ten sposób, aby poszukiwana trucizna nie ulegała

w toku operacji destrukcji, a jednocześnie, aby można było ją wyodrębnić z dużą

wydajnością, co jest szczególnie istotne w badaniach ilościowych.

W zależności od charakteru substancji sposoby wyodrębniania trucizn można

podzielić na:�wyodrębnianie trucizn nieorganicznych z materiału biologicznego;

� wyodrębnianie trucizn organicznych z materiału biologicznego.

Do trucizn metalicznych zalicza się te metale i metaloidy, które w postaci soli, par ipołączeń metaloorganicznych wprowadzone do ustroju w małych ilościach,

powodować mogą zarówno ostre, jak i przewlekłe zatrucia.

W przypadkach śmiertelnych zatruć związkami metali, przedmiotem badań nazawartość składników toksycznych są zwykle wycinki przewodu pokarmowego -

głównie żołądka i jelit, a z narządów miąższowych - wycinki wątroby i nerki.

Przydatnym materiałem są także wymiociny oraz mocz i krew.

Mineralizacja

Proces ten polega na zniszczeniu substancji organicznych w wyniku utleniania przy

jednoczesnym przeprowadzeniu trucizn metalicznych w postać jonową.

Mineralizacja na sucho

Polega ona na spopieleniu badanego materiału w piecu elektrycznym w temperaturzeod 400 do 500°C, po uprzednim usunięciu wody przez odparowanie na łaźni

Wodnej, w suszarce lub pod promiennikiem podczerwieni. Dla przyspieszenia procesu

spopielania do próby dodaje się substancje utleniające, jak np.: kwas azotowy(V),azotan(V) potasu, azotan(V) amonu .

Mineralizacja na mokroNajczęściej stosowanymi odczynnikami do mineralizacji na mokro są mieszaniny

stężonego kwasu siarkowego(VI) z dodatkiem środków utleniających, takich jak

stężony kwas azotowy(V), stały azotan(V) amonu lub perhydrol, mieszaniny kwasusolnego i chloranu(I) potasu, kwasu siarkowego(VI), azotowego(V) i chlorowego(VII).

Metody rozdziału i identyfikacji trucizn metalicznych

Stosuje się chromatografię cienkowarstwową. Szereg trucizn metalicznych łatwo

tworzy barwne związki zespolone, co wykorzystuje się do ich ilościowegowyosabniania i oznaczania metodą kolorymetryczną.

Do wyosabniania metali można również stosować metody ekstrakcyjne. Tok

postępowania ekstrakcyjnego ma umożliwić:�zatężenie badanego składnika (np. kompleksowanie);

�oddzielenie go od innych substancji mogących z nim interferować.

Jako czynniki kompleksujące stosuje się:

� acetyloaceton;

� dietyloditiokarbaminian sodu (DDC);� pirolidynotiokarbaminian amonu (APDC);

� ditizon;

� 8-hydroksychinolinę.Utworzone obojętne kompleksy łatwo ekstrahują się ketonami, np. ketonem

metyloizobutylowym, a także estrami, np. octanem etylu, n-propylu, n-butylu,

Metoda ta może być stosowana do oznaczania metali (np. Pb, Ni, Mn) W moczu ikrwi.

Wśród metod przygotowania próbek techniki ekstrakcyjne stanowią dominującągrupę. Opierają się one na procesach przebiegających na granicy faz: gaz-ciecz czy

gaz-ciało stałe (HS, ang. Head Space), ciecz-ciecz (LLE), ciecz-ciało stałe (SPE) i jej

odmianę na skalę mikro (SPME).

Cennym uzupełnieniem technik ekstrakcyjnych stosowanych w laboratoriach są:

ekstrakcja ultradźwiękami (USG, ang. Ultrasonic Extraction), ekstrakcja w stanienadkrytycznym (ang. supercritical fluid extraction), ekstrakcja mikrofalowa (MES, ang.

Microware Extraction) i przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikami (ASE, ang.

Acceleration Solvent Extraction).

2013-01-06

6

Przygotowanie materiału do oznaczeń należy tak prowadzić, aby zminimalizować

możliwość wystąpienia strat substancji oznaczanej. Straty te spowodowane są

głównie:

• procesami utleniania się związków trujących (trucizny lotne);

•reagowaniem trucizn z materiałem biologicznym (aktywne związki chemiczne);

•rozkładem lub przemianami trucizn, które prowadzą do wytworzenia produktów

nietoksycznych, stanowiących fizjologiczny składnik organizmu;

•koniecznością używania szeregu rozpuszczalników organicznych;

•procesami zagęszczania i oczyszczania wyosobnionych trucizn.

Przygotowanie materiału biologicznego do ekstrakcji

Odbiałczanie i odtłuszczenie

Do odbiałczania można stosować różne substancje: kwas wolframowy, chlorowy(VII),

i trichlorooctowy, alkohol etylowy, mieszaninę alkoholu etylowego i kwasuwinowego, siarczan amonowy, alkaliczny roztwór siarczanu cynku. Odbiałczanie

prowadzi się zazwyczaj w temperaturze podwyższonej 60-100 oC, c0 przyspiesza

proces oraz zwiększa rozpuszczalność w wodzie substancji trudno rozpuszczalnych.Jest to etap konieczny, ponieważ próby ekstrakcji nie spreparowanego, a tylko

zhomogenizowanego materiału biologicznego nastręczają wiele trudności (pienienie,

emulsja), a uzyskane wyciągi są silnie zanieczyszcz0ne.

W celu odbiałczania najczęściej stosuje się metody:

�siarczanowo-amonową,�wolframową (trucizny o charakterze kwaśnym i obojętnym).

Hydroliza

Wiele związków organicznych i ich metabolitów wiąże się w ustroju z białkami , a

także ulega sprzęganiu z kwasem glukuronowym i siarkowym. Przed dokonaniemanalizy należy związki te wyodrębnić w postaci wolnej. W tym celu przeprowadza się

hydrolizę, najczęściej kwaśną. Metodę tę stosuje się do oznaczania środków

uzależniających, np.: morfiny, pochodnych benzodiazepiny, metakwalonu,trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych, salicylanów.

W stosunku do leków zasadowych, takich jak amitryptylina, chloropromazyna,pochodnych benzodiazepin, można używać też enzymu bakteryjnego - proteazy

alkalicznej. Trawienie materiału biologicznego enzymami jest metodą prostą,

posiadającą wiele zalet, jak np.: stosowanie niskiej temperatury nie powodującejrozkładu substancji termolabilnych, unikanie wprowadzania kwasów, brak emulsji w

czasie ekstrakcji oraz większa wykrywalność. Niedogodnością metody enzymatycznej

jest długi czas hydrolizy.

Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi

Często stosowaną w analizie toksykologicznej metodą

wyodrębniania nielotnych organicznych i nieorganicznychzwiązków trujących z materiału biologicznego jest ekstrakcja.

Procesem tym rządzi prawo podziału Nernsta, które mówi, że

substancja rozpuszczona dzieli się pomiędzy dwa niemieszające się rozpuszczalniki w ten sposób, że w stanie

równowagi stosunek stężeń substancji rozpuszczonej w obu

rozpuszczalnikach jest stały w danej temperaturze.

Aparat Soxhleta składa się z układu rurek,które montuje się między kolbę z wrzącymrozpuszczalnikiem i chłodnicę zwrotną

Ekstrakcja do fazy stałej

Ekstrakcja na kolumienkach SPE (ang. Solid Phase Extraction) stanowi obecnie

podstawową technikę stosowaną w rutynowej praktyce laboratoryjnej. Stosowanajest ona do selektywnego wyodrębniania i wzbogacania analitów z naturalnych

matryc gazowych, ciekłych i stałych. SPE jest procesem, w którym następuje rozdział

ksenobiotyku pomiędzy ciekłą fazą ruchomą a adsorbentem, który stanowi stałą fazęstacjonarną.

Do zalet metody w porównaniu z klasyczną ekstrakcją ciecz-ciecz należy:

�wyższa selektywność;�czystość ekstraktów;

�brak emulsji;

�powtarzalność;�krótki czas przygotowywania próbek;

�możliwość wprowadzenia

automatyzacji.

Dobór odpowiedniej kolumienki SPE musi uwzględnić następujące kryteria:

• objętość próbki;

• stopień zanieczyszczenia;• złożoność matrycy;

• właściwości i ilość interesujących nas związków;

• wpływ matrycy lub innych analitów.

2013-01-06

7

1. Do zalet metody SPME należy zaliczyć ograniczenie ilości koniecznych operacjianalitycznych. Tym samym istnieje mniejsze ryzyko popełnienia błędu grubego isystematycznego i znacznie skraca się czas analizy.

2. W odróżnieniu od innych metod wzbogacania analitów, w metodzie SPME całkowiciewyeliminowano zużycie drogich i toksycznych rozpuszczalników. Charakteryzuje się onaograniczeniem wpływu związków utrudniających miarodajne oznaczenie końcowe.3. Technika SPME wymaga częstej kalibracji oraz szczególnej dbałości o czystość włókna

sorpcyjnego. W celu uzyskania powtarzalnych wyników metodą SPME konieczne jest dokładnekontrolowanie i odtwarzanie parametrów procesu sorpcji i desorpcji analitów z włókna.

Wymywanie prądem powietrza (aeracja)

Metoda ta znajduje zastosowanie w stosunku do tych trucizn, których współczynnik

podziału powietrze : woda jest dostatecznie wysoki. W praktyce zamiast powietrzastosuje się często obojętne gazy, np. azot. Dla polepszenia aeracji stosuje się często

ogrzewanie przedmuchiwanego roztworu, dla zwiększenia zaś wydajności

pochłaniania wydzielonego związku oziębia się roztwór pochłaniający (oznaczanie wmoczu lotnych substancji np. disiarczek węgla, dichloroetan).

Wyodrębnianie trucizn za pomocą mikrodyfuzji

Metoda polega na dyfuzji lotnych związków do rozpuszczalnika, do momentu

osiągnięcia stanu równowagi w komorze Conwaya (krew, osocze, mocz).