Post on 30-Nov-2020
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
1
AUTOREFERAT
Naprawa i utrzymanie mitochondrialnego DNA w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae w sieci powiązań między
mitochondriami i jądrem w modelowej komórce eukariotycznej
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
2
1. Imię i Nazwisko. Aneta Kaniak-Golik 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.
• Magister biologii/ specjalizacja mikrobiologia, Uniwersytet Wrocławski, 1992 r. Praca magisterska pt.: „Adenylate kinase in yeast (AKY2): characterisation of two suppressor
genes of AKY2 deficiency, URA6 and SAK2”.
Tłumaczenie z języka angielskiego: “Kinaza adenylowa w drożdżach (AKY2): charakteryzacja
dwóch genów supresorowych defektu AKY2, URA6 i SAK2”).
Promotor: prof. dr hab. Tadeusz Lachowicz, współ-promotor prof. Wolfhard Bandlow (Institut
für Genetik und Mikrobiologie, Universität München w Monachium, Niemcy)
• Doktor Uniwersytetu Pierre et Marie Curie Paris VI, Paryż (Francja), w zakresie
genetyki komórkowej i molekularnej, 1998 r.
Praca doktorska pt. „Analyse fonctionelle des gènes decouverts par le séquençage génomique
systematique de la levure S. cerevisiae”
Tłumaczenie z języka francuskiego: „Analiza funkcjonalna genów odkrytych w ramach
systematycznego sekwencjonowania genomu drożdży S. cerevisiae”
Promotor: prof. Piotr P. Słonimski
Nostryfikacja powyższego tytułu jako równorzędnego do tytułu doktora nauk biologicznych w
zakresie biologii na Uniwersytecie Wrocławskim, Wydział Nauk Przyrodniczych, 14.06.1999 r.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych.
• 1999-2003: staż podoktorski w laboratorium prof. Marka H. Johnston w Washington
University School of Medicine w St. Louis (USA).
• Od 1.11.2003 r. - 31.10.2012 r. praca na stanowisku adiunkta, a od 1.12.2012 r. do teraz
praca na stanowisku asystenta, w Instytucie Biochemii I Biofizyki PAN w Warszawie.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
3
4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego, Naprawa i utrzymanie mitochondrialnego DNA w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae w sieci powiązań między mitochondriami i jądrem w modelowej komórce eukariotycznej
b) 6 publikacji wchodzących w skład osiągnięcia:
1. Kaniak A.*, Dzierzbicki P.*, Rogowska A.T., Malc E., Fikus M., Cieśla Z. Msh1p
counteracts oxidative lesion-induced instability of mtDNA and stimulates mitochondrial
recombination in Saccharomyces cerevisiae (2009). DNA Repair (Amst). 8: 318-29.
CI 18; IF2009 4,199; MNISW 35.
Byłam autorem korespondencyjnym. *: równy udział autorów.
Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; konstrukcja większości szczepów (szczepy YAK) i plazmidów; opracowanie metody testu na mitochondrialną rekombinację alleliczną w drożdżach S. cerevisiae przy użyciu genu reporterowego ARG8m; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Fig. 7; udział w analizie i interpretacji wyników badań oraz udział w opiece nad pracą doktorantek, Pani Ewy Malc i Pani Agaty Rogowskiej; udział w przygotowaniu manuskryptu i tabel; wykonanie Fig. 7 i koordynacja przygotowania pozostałych rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy. Mój wkład oceniam na 40%.
2. Malc E.*, Dzierzbicki P.*, Kaniak A., Skoneczna A., Cieśla Z. Inactivation of the 20S
proteasome maturase, Ump1p, leads to the instability of mtDNA in Saccharomyces cerevisiae
(2009). Mutat Res. 669: 95-103.
CI 16; IF2009 3,556; MNISW 35.
Byłam autorem korespondencyjnym. *: równy udział autorów.
Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Fig. 4B; udział w analizie i interpretacji wyników badań oraz udział w opiece nad doktorantką, Panią Ewą Malc; udział w przygotowaniu manuskryptu, tabel i rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy. Mój wkład oceniam na 30%.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
4
3. Dzierzbicki P.*, Kaniak-Golik A.*, Malc E., Mieczkowski P., Cieśla Z. The generation of
oxidative stress-induced rearrangements in Saccharomyces cerevisiae mtDNA is dependent on
the Nuc1 (EndoG/ExoG) nuclease and is enhanced by inactivation of the MRX complex (2012).
Mutat Res. 740: 21-33.
CI 8; IF2012 3,902; MNISW 35
Byłam autorem korespondencyjnym. *: równy udział autorów.
Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; konstrukcja większości szczepów (szczepy YAK) i plazmidu pCTA1-kanMX; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Tab. 3, Fig. 4C-D, Fig. 5, Fig. 6B; udział w przygotowaniu manuskryptu, tabel i rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy; napisanie projektu badawczego i kierowanie grantem MSWiN Nr N N303 611038 (zakończony w roku 2015), z którego były finansowane te badania. Mój wkład oceniam na 40%.
4. Kaniak-Golik A., Kuberska R., Dzierzbicki P., Śledziewska-Gójska E. Activation of Dun1 in
response to nuclear DNA instability accounts for the increase in mitochondrial point mutations in
Rad27/FEN1 deficient S. cerevisiae (2017). PLoS One 12(7): e0180153. doi:
10.1371/journal.pone.0180153.
CI 0; IF2016 2,806; MNISW 35
Byłam autorem korespondencyjnym.
Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; napisanie projektu badawczego i kierowanie grantem w ramach konkursu „OPUS 4” (nr 2012/07/B/NZ3/02914; przedłużony do 2018 r.), z którego były finansowane te badania; konstrukcja szczepów i plazmidów wykorzystanych w tej pracy; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Fig. 1 – 4 (Fig. 2 i Fig. 3 we współpracy z Panem dr. Piotrem Dzierzbickim), Tab. 4 - 6; udział w analizie i interpretacji wyników badań; opieka nad doktorantką Panią Renatą Kuberską; udział w przygotowaniu manuskryptu, tabel i rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy. Mój wkład oceniam na 70%.
5. Kaniak-Golik A. and Skoneczna A. Mitochondria-nucleus network for genome stability
(2015). Free Radic Biol Med. 82:73-104.
CI 20; IF2015 5,784; MNISW 40
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
5
Napisałam rozdział „Maintenance of the mitochondrial genome” oraz uczestniczyłam w redakcji pozostałych części artykułu oraz Tab. 1; brałam udział w przygotowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój wkład oceniam na 45%. Współautorka, Pani dr hab. Adrianna Skoneczna (autor korespondencyjny) w swojej habilitacji oceniła jej wkład w tym artykule na 55%.
6. Skoneczna A., Kaniak A., Skoneczny M. Genetic instability in budding and fission yeast –
sources and mechanisms (2015). FEMS Microbiol Rev. 39: 917-67.
CI 10; IF2015 13,687; MNISW 45
Napisałam rozdziały: „Recombination and genomic stability” i „Mitochondria and genome stability”; współuczestniczyłam w pisaniu rozdziału „Mitochondrial influence on the nuclear genome”; przygotowałam Tab. 2; uczestniczyłam w przygotowaniu Tab. 3 oraz rysunków: Fig. 8 i Fig. 9; uczestniczyłam w redakcji pozostałych części artykułu oraz w przygotowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój wkład oceniam na 40%.
Łączny IF publikacji wchodzących w skład osiągnięcia: 33,93; punktów MNiSW: 225: cytowań: 72.
Te sześć prac tworzy całość osiągnięcia naukowego, które omówione jest poniżej.
c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania
WPROWADZENIE
Mitochondria, komórkowe struktury o wymiarach w przekroju średniej wielkości bakterii
(tj. 1-10 µm) otoczone dwiema podwójnymi błonami fosfolipidowymi, są jednymi z
charakterystycznych organelli komórek eukariotycznych, występującymi u wszystkich wolno
żyjących Eukaryota przystosowanych do aerobowych warunków życia. Mitochondria są
strukturami dynamicznymi, które nieustannie łączą się i dzielą, tworząc rozgałęzioną
przestrzenną siatkę rurkowatych kanałów1. Mitochondria, jak wiele struktur komórkowych, nie
mogą powstawać de novo2,3. Nowo powstająca komórka musi odziedziczyć mitochondria od
komórki rodzicielskiej w wyniku podziału już istniejącego kompartmentu w komórce
macierzystej i przeniesienia fragmentu mitochondrium do komórki potomnej w czasie podziału
komórki. Główna funkcja tych organelli jest związana z pozyskiwaniem energii w reakcjach
utleniania pirogronianu do dwutlenku węgla i wody, czemu towarzyszy zużycie tlenu, oraz z
magazynowaniem uwolnionej energii w postaci cząsteczek ATP. Hydroliza ATP umożliwia
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
6
zajście wielu reakcji komórkowych wymagających energii. Produkcja ATP nie jest jednak
jedyną funkcją mitochondrium. W mitochondriach są także zlokalizowane enzymy biorące
udział w syntezie wielu związków: aminokwasów, nukleotydów, witamin, kwasów
tłuszczowych, fosfolipidów, kwasu liponowego jako ko-faktora dehydrogenazy pirogronianowej
i innych enzymów, hemu do koordynacji jonów żelaza Fe2+ w wielu hemobiałkach, ale przede
wszystkim niezbędnych do przeżycia grup prostetycznych Fe-S. Mitochondria produkują nie
tylko swoje białka z grupami Fe-S, wśród których są liczne składniki łańcucha oddechowego i
enzymy, np. akonitaza, ale są też miejscem, z którego jest eksportowany do cytoplazmy związek
zawierający siarkę wymagany do składania tych grup prostetycznych w cytoplazmie dla białek
Fe-S działających w cytoplazmie lub jądrze4.
Błony mitochondrialne dzielą mitochondrium na 4 główne wyspecjalizowane strukturalnie i
funkcjonalnie kompartmenty (oddziały): 1. Błona zewnętrzna (OMM; ang. skrót outer
mitochondrial membrane); 2. Przestrzeń międzybłonowa (IMS; skrót od ang. intermembrane
space); 3. Błona wewnętrzna (IMM; skrót od ang. inner mitochondrial membrane); 4. Macierz
(matriks) mitochondrialna ograniczona IMM. W matriks mitochondrialnej są zlokalizowane
enzymy cyklu Krebsa, które przeprowadzają stopniowe reakcje utlenienia pirogronianu. Błona
wewnętrzna tworzy liczne pofałdowania, wpuklenia, tzw. cristae (łac.), czyli grzebienie
mitochondrialne, które znacznie zwiększają dostępną powierzchnię, na której skupiają się
kompleksy syntazy ATP i kompleksy przenośników elektronów łańcucha oddechowego.
Mitochondrialna błona wewnętrzna, podobnie jak błona tylakoidow w chloroplastach oraz błony
plazmatyczne komórek prokariotycznych, są wyspecjalizowane w reakcjach konwersji energii, w
których dochodzi do chemiosmotycznego sprzężenia aktywności łańcucha przenośników
elektronów generującej gradient protonowy w poprzek nieprzepuszczalnej dla protonów błony z
aktywnością syntazy ATP produkującej w matriks ATP kosztem rozproszenia tego gradientu5.
Jest jeszcze jedno znaczące podobieństwo między chemiosmotycznymi systemami organelli
eukariotycznych i komórkami prokariotycznymi. Wszystkie błony energetyczne, na których
zachodzi produkcja ATP sprzężona z dysypacją gradientów elektrochemicznych generowanych
przez łańcuchy przenośników redoks są związane z własnymi genomami i w bezpośrednim
sąsiedztwie tych błon odbywa się synteza wszystkich lub przynajmniej niektórych składników
chemiosmotycznej maszynerii kodowanych przez te genomy. O ile ta sytuacja nie wydaje się
szczególna dla całych komórek prokariotycznych, o tyle w przypadku organelli energetycznych
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
7
nie jest oczywiste, dlaczego zarówno mitochondria, jak i chloroplasty, posiadają swój własny
wyspecjalizowany wielokopijny genom i lokalny system ekspresji genów. Hipoteza CORR (ang.
co-location for redox regulation; tłumaczenie: ko-lokalizacja dla regulacji redoks) wyjaśnia
zależność funkcji błon bioenergetycznych od genomów zlokalizowanych w bezpośrednim
sąsiedztwie tych błon koniecznością lokalnej regulacji ekspresji genów na lokalne zmiany w
potencjale błon mitochondrialnych6. Brak odpowiedniej regulacji, skutkowałby zaburzeniami
przepływu elektronów i zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS).
Mitochondrialne DNA zostało odkryte na początku lat 60-tych ubiegłego wieku7,8. W
oparciu o obecność w mitochondriach materiału genetycznego Lynn Margulis zaproponowała
teorię endosymbiotycznego pochodzenia tych organelli9,10, potwierdzoną później przez analizy
filogenetyczne na podstawie sekwencjonowania genomów wielu organizmów prokariotycznych i
eukariotycznych, w tym również genomów organellarnych. Obecnie przyjmuje się, że
mitochondria powstały w trakcie ewolucji organizmów żywych około 1,5-2 mld lat temu na
skutek jednokrotnego zdarzenia endosymbiotycznego, w którym endosymbiont zbliżony do
obecnych α-proteobakterii wniknął do innej komórki prokariotycznej podobnej do komórek
współcześnie żyjących archeonów11. Główna zmiana ewolucyjna polegała na redukcji genomu
endosymbionta poprzez utratę genów oraz przejęcie większości genów α-proteobakteryjnego
przodka przez genom gospodarza12. Co ciekawe, pochodzące od mitochondriów beztlenowe
organella (mitosomy i hydrogenosomy), które nie posiadają aktywnego łańcucha oddechowego,
pozbawione są również mtDNA13. W 2010 roku Nick Lane i William Martin sformułowali
hipotezę, że dopiero endosymbioza i w konsekwencji powstanie mitochondrium z własnym
wielokopijnym genomem pozwoliły przekształcić się komórce prokariotycznej w eukariotyczną
przez uwolnienie błony komórkowej od ograniczeń związanych z utrzymaniem w tej lokalizacji
przenośników elektronów i aparatu do chemiosmotycznej syntezy ATP14. Internalizacja
bioenergetycznych błon wraz z genomem, który je „obsługuje”, uwolniła komórki od
ograniczenia związanego z wielkością genomu, umożliwiając wzrost liczby wyrażanych genów.
Co więcej, wzrost wielkości genomu i przyrost liczby białek, które genom koduje, dało z kolei
początek ewolucji coraz bardziej złożonych organizmów: Metazoa i roślin wyższych.
Endosymbiotyczne pochodzenie wyjaśnia też obecność genomów w chloroplastach. Ich historia
ewolucyjna jest jednak znacznie bardziej złożona niż monofiletycznych mitochondriów15.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
8
Genomy mitochondrialne wykazują znaczne zróżnicowanie ewolucyjne, zarówno pod
względem struktury, jak i repertuaru zawartych w nich genów oraz mechanizmów ich
ekspresji16. Regułą jest jednak to, że większość kodowanych w nich białek to kluczowe
podjednostki kompleksów bioenergetycznych – mitochondrialnego łańcucha transportu
elektronów oraz syntazy ATP. Przykładowo, mtDNA ssaków koduje 13 białek, wchodzących w
skład kompleksów I, III i IV mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów oraz syntazy
ATP. Dodatkowo, zawiera 2 geny mitorybosomalnego RNA oraz zestaw 22 genów tRNA,
kodujących niezbędne składniki mitochondrialnego aparatu syntezy białek. Bardzo podobnie
wygląda repertuar genów zawartych w mtDNA odległych ewolucyjnie modelowych drożdży
Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe – najistotniejszą różnicą jest brak
kodowanych mitochondrialnie 7 podjednostek kompleksu I (często traconych niezależnie w
różnych liniach ewolucyjnych grzybów) oraz obecność jednego genu kodującego białko
wchodzące w skład mitorybosomu. Znacznie większe zróżnicowanie repertuaru genów można
spotkać w mtDNA roślin oraz przedstawicieli wczesnych odgałęzień drzewa filogenetycznego
Eukaryota, zbiorczo zaliczanych do Protista – są tam zarówno silnie zredukowane mtDNA
Plasmodium (5 genów), jak i genom mitochondrialny Reclinomonas americana,
prawdopodobnie najbardziej podobny do genomu endosymbiotycznego przodka, zawierający 97
genów, w tym 62 geny determinujące białka17.
Ponieważ to łańcuch oddechowy w mitochondriach jest głównym źródłem ROS w komórce18,
brak właściwej odpowiedzi mitochondrialnego genomu na zmiany potencjału wewnętrznej błony
mitochondrialnej, co przewiduje wymieniona powyżej hipoteza CORR, może doprowadzić do
nadprodukcji ROS, która w komórkach wielu eukariontów, od najprostszych zaczynając,
prowadzi do uruchomienia programowanej śmierci komórki19. Powstające w mitochondriach
ROS są też jednym z głównych czynników prowadzących do powstawania uszkodzeń w DNA
mitochondrialnym. Spośród najprostszych reaktywnych form tlenu, produktów stopniowych
jednoelektronowych redukcji cząsteczkowego tlenu, najbardziej niebezpieczną jest cząsteczka
rodnika hydroksylowego. Jest to jeden z „najbardziej reaktywnych utleniaczy znanych
chemikom”20, który może reagować z praktycznie każdym związkiem w komórce, w tym
również z lipidami i DNA. Rodnik hydroksylowy szczególnie łatwo reaguje z guaniną poprzez
dołączenie się do atomu węgla w pozycji 8. pierścienia, co powoduje przekształcenie zasady
albo w 8-oksoguaninę (8-okso-7,8-dihydro-2’-deoksyyguaninę; skrót 8-oksoGua) z
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
9
zachowaniem układu dwóch pierścieni, albo wręcz prowadzi do otwarcia mniejszego pierścienia
guaniny i powstania 2,6-diamino-4-hydroksy-5-formamidopirymidiny (Fapy-Gua)21. Obecność
obu zmienionych zasad prowadzi do powstania mutacji typu podstawienia o sygnaturze GC do
TA, ponieważ polimerazy często wstawiają naprzeciwko tych zmodyfikowanych zasad
adeninę21,22. Oprócz tego rodnik hydroksylowy jest w stanie reagować z każdą inną zasadą
azotową oraz resztami cukrowymi, w tym również może doprowadzić do bezpośredniego
przerwania łańcucha, a w konsekwencji powstania pęknięć w pojedynczej lub podwójnej nici
DNA23.
Mimo kluczowego znaczenia genomu mitochondrialnego dla fizjologii i ewolucji Eukaryota,
mechanizmy zapewniające stabilność mtDNA – rekombinacja i naprawa uszkodzeń DNA – są
znacznie słabiej poznane, niż te działające w genomie jądrowym. Najdogodniejszym układem do
badania procesów związanych z biologią molekularną i genetyką mitochondriów pozostają
drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae), organizm dla którego opracowano w ciągu
wielu dekad badań proste metody analizy genetycznej, wiele narzędzi do genetycznych
manipulacji i metod do poszukiwania mutantów o najrozmaitszych fenotypach24,25. W badaniach
nad genetyką mitochondriów istotny jest szczególny metabolizm tego organizmu,
wykorzystywany w gospodarce człowieka od zarania dziejów naszego gatunku. Komórki tego
grzyba: 1) fermentują fruktozę lub glukozę do etanolu w obecności tlenu (efekt Crabtree), 2)
rosną w warunkach beztlenowych, 3) są petite-pozytywne, czyli mogą żyć bez funkcjonalnego
mtDNA, zwanego genomem rho+. Dzięki tym szczególnym właściwościom metabolicznym
drożdży S. cerevisiae jesteśmy w stanie łatwo izolować i badać mutanty pozbawione funkcji
oddechowej, także na skutek mutacji w mtDNA.
Wśród zaburzeń genetycznych mitochondriów drożdżowych bardzo częste są rearanżacje
mtDNA, prowadzące do powstania mitochondrialnych przearanżowanych genomów (rho¯), w
których brakuje całych fragmentów mitochondrialnego genomu i które w rezultacie tracą
całkowicie zdolność do wyrażenia niezbędnego dla oddychania zestawu genów kodowanych
przez genom mitochondrialny. Rearanżacje generujące defektywne genomy mitochondrialne
rho– są najczęstszym powodem utraty zdolności do oddychania u drożdży i pojawiania się tzw.
nieoddychających mutantów petite, które tworzą mniejsze kolonie na podłożu z niskim
stężeniem glukozy (0.1%) w porównaniu z koloniami oddychających komórek drożdży rho+26,27.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
10
Ten typ mutacji mitochondrialnego genomu odpowiadałby zatem mutacjom w genomie
jądrowym zwanym po angielsku gross chromosomal rearrangements (skrót: GCR; tłumaczenie:
rozległe rearanżacje chromosomalne), które, podobnie jak w jądrze, powstają w rezultacie
rekombinacji pomiędzy sekwencjami nieallelicznymi, którą czasami nazywa się „błędną” lub
„nieuprawnioną”. Częstość występowania mutantów petite typu rho¯ w różnych szczepach
laboratoryjnych jest cechą zmienną i warunkowaną przez liczne geny jądrowe28, w tym niektóre
polimorficzne29. Uważa się jednak, że u większości szczepów typu dzikiego częstość mutacji
petite typu rho¯ nie przekracza 2%30. Mutanty zupełnie pozbawione mtDNA, tzw. rho0, są
izolowane dosyć rzadko w szczepach typu dzikiego, ale jest wiele genów w genomie S.
cerevisiae, które kodują białka niezbędne do utrzymania mtDNA28,31.
Również dużo rzadsze niż mutanty rho¯, bo wykrywane przy częstościach mniejszych o
cztery do pięciu rzędów wielkości, są mutacje punktowe w mtDNA, których poziom można
oszacować na podstawie częstości pojawiania się mutantów opornych na inhibitory
mitochondrialne, jak przykładowo erytromycynę (mutacje w mitochondrialnym genie 21S
rRNA32,33), czy oligomycynę (mutacje w genach ATP6 i ATP934,35), które wykorzystywaliśmy w
naszych badaniach36-38. Głównym problemem komplikującym interpretację wyników testów z
wykorzystaniem tych i innych antybiotyków jest możliwość selekcji mutacji jądrowych, które
również mogą nadać komórkom drożdżowym cechę oporności na dany antybiotyk. Jednym z
istotnych wątków poruszonych w podjętych przez nas badaniach było zatem opracowanie
wiarygodnych metod planowania i interpretacji eksperymentów mierzących poziom mutagenezy
mtDNA.
Jednym ze sposobów wyjścia poza ograniczenia klasycznych testów na mutagenezę
mitochondrialnego genomu drożdży jest znalezienie innego genu docelowego w mitochondrium.
Do naszych badań nad mutagenezą i naprawą mtDNA używaliśmy szczepów niosących
skonstruowany w laboratorium Toma Foxa, niezwiązany bezpośrednio z oddychaniem,
mitochondrialny gen reporterowy ARG8m 39. Rekodowany (ze względu na różnice w kodzie
genetycznym między genomem mitochondrialnym i jądrem w komórkach drożdży40) ARG8m
wprowadzony do mtDNA drożdży w zastępstwie ORF-u mitochondrialnego genu COX3 i
wyrażony pod promotorem tego genu był zdolny do komplementacji fenotypu auksotrofii
argininowej szczepu, w którym inaktywowano jądrową kopię ARG839. Podobnie było kiedy gen
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
11
reporterowy ARG8m zastąpił ORF innego genu mitochondrialnego COX241. Skonstruowano na
bazie tego reportera trzy interesujące systemy do badania różnych aspektów utrzymania
sekwencji mtDNA: 1) stabilność mikrosatelitarnych powtórzeń w mtDNA422) mutacje typu
frameshift w defektywnym allelu arg8m-143, 3) delecje genu reporterowego między
bezpośrednimi powtórzeniami44. Wykorzystywaliśmy w naszych badaniach nad różnymi genami
kodującymi białka odpowiedzialne za naprawę i utrzymanie mtDNA wszystkie te trzy systemy
eksperymentalne, co opisuję poniżej. W pracy Kaniak et al. (2009)36 opracowaliśmy na bazie
reportera cox3::ARG8m metodę do badania rekombinacji allelicznej mtDNA, którą też użyliśmy
w eksperymentach opisanych w pracy Dzierzbicki et al. (2012)45 oraz Kaniak-Golik et al.
(2017)38.
Głównymi czynnikami warunkującymi integralność genomu mitochondrialnego w
komórkach drożdży S. cerevisiae są: stabilność struktury kompleksu białek z mtDNA, zwanego
nukleoidem 46,47 oraz procesy związane z replikacją, rekombinacją i naprawą uszkodzeń mtDNA.
W omawianych tu naszych badaniach nie testowałam mutantów z zaburzeniami struktury
mitochondrialnego nukleoidu, koncentrując się na trzech podstawowych procesach
warunkujących stabilność sekwencji mtDNA i integralność genomu typu dzikiego w komórkach
drożdży S. cerevisiae:
1) wierności replikacji mtDNA katalizowanej przez mitochondrialną polimerazę DNA,
Mip148,49, homolog ssaczej podjednostki katalitycznej POLG1;
2) procesie naprawy niesparowanych zasad (ang. mismatch repair; w skrócie MMR) dzięki
aktywności białka Msh1, które zapewnia dodatkowy system korygowania błędów
replikacji33 oraz, analogicznie do jądrowych systemów MMR w komórce, służy odrzucaniu
niesparowanych lub częściowo niesparowanych heterodupleksów50 powstających podczas
rekombinacji wielokopijnego mtDNA, która może zachodzić również jako rekombinacja
pomiędzy nieallelicznymi sekwencjami44,51
3) usuwaniu uszkodzeń mtDNA generowanych pod wpływem reaktywnych form tlenu
(generowanych przez łańcuch oddechowy, ale także powstających pod wpływem UV lub
promieniowania jonizującego) i innych genotoksycznych czynników (np. czynniki
metylujące, jak MMS) poprzez system naprawy wycinający zmienione zasady (skrót : BER,
ang. base excision repair). Naprawa typu BER jest wieloetapowa i wielotorowa, wymagająca
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
12
koordynacji aktywności wielu enzymów wśród, których są rozmaite glikozylazy
rozpoznające specyficznie zmodyfikowane zasady i rozpoczynające ciąg reakcji naprawy
poprzez hydrolizę wiązania N-glikozylowego pomiędzy zasadą i deoksyrybozą, są również:
endonukleaza nacinająca powstające w reakcji katalizowanej przez glikozylazy miejsca
bezzasadowe, polimeraza/y DNA oraz ligaza51.
Poniżej przedstawiam cykl prac, w których podjęłam się badania roli różnych mechanizmów
naprawy DNA w utrzymaniu stabilności drożdżowego genomu mitochondrialnego, w
szczególności wobec presji uszkodzeń związanych z działaniem reaktywnych form tlenu.
1. Rola białka Msh1 i rekombinacji homologicznej w zapobieganiu gromadzenia się
mutacji wynikających z uszkodzeń oksydacyjnych w mtDNA - Kaniak et al.
(2009)36.
Białko Msh1, podstawowy element głównego systemu wspomagającego polimerazę
Mip1 w utrzymaniu integralności i sekwencji mtDNA w komórkach S. cerevisiae, jest
mitochondrialnym homologiem bakteryjnych białek MutS zaangażowanych w naprawę
niesparowanych zasad52. Białko wiąże się preferencyjnie do DNA z niesparowanymi zasadami i
hydrolizuje ATP53,54. Brak Msh1 prowadzi do utraty integralności genomów rho+ i
przekształcenia ich w przearanżowane genomy rho¯ 52. Taki fenotyp sugeruje, że Msh1 w
mitochondriach bierze udział w systemie kontroli procesów rekombinacyjnych, podobnie jak
jądrowe homologi MutS50. Białka Msh monitorują jakość heterodupleksów powstających
podczas rekombinacji i przeciwdziałają dokończeniu rekombinacji przy udziale heterodupleksów
zawierających niesparowane zasady (ang. heteroduplex rejection). Poprzez zależny od Msh1
proces odrzucenia niesparowanych lub częściowo niesparowanych heterodupleksów
dochodziłoby do ograniczenia nieallelicznych zdarzeń rekombinacyjnych, które prowadzą do
rearanżacji genomu rho+ i powstania niefunkcjonalnych genomów rho¯. Dodatkowo, częściowy
defekt funkcji Msh1 wiąże się ze zwiększeniem mutagenezy punktowej w mtDNA, co sugeruje,
że Msh1 może brać udział w mitochondrialnej MMR (mtMMR) usuwającej błędy
replikacyjne w mtDNA54. Ścieżka (lub ścieżki), na której działa to białko w mitochondriach nie
została jeszcze poznana - nie znamy czynników białkowych, które współdziałają z Msh1 w
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
13
mtMMR lub odrzuceniu heterodupleksów w czasie rekombinacji prowadzącej do rearanżacji
mtDNA.
W tej pracy opisujemy wyniki doświadczeń, w których spróbowaliśmy odpowiedzieć na
pytanie, czy białko Msh1 bierze udział w przeciwdziałaniu mutagenezie mtDNA wywołanej
przez uszkodzenia oksydacyjne, a jeśli tak, czy białko to działa na tym samym szlaku, co znane
czynniki mitochondrialnego BER zaangażowane w usuwanie oksydacyjnych uszkodzeń w
mtDNA. W tym celu zbadaliśmy genetyczne interakcje pomiędzy mutacją punktową w genie
MSH1 prowadzącą do częściowego defektu kodowanego białka Msh1 (allel msh1-R813W) a
delecjami genów, których brak powoduje zwiększenie poziomu uszkodzeń oksydacyjnych w
mtDNA. Przetestowaliśmy, z jednej strony, delecję wywołującą endogenny stres oksydacyjny w
mitochondrium poprzez inaktywację genu SOD2, który koduje znajdującą się w matriks
mitochondrialnej Mn-zależną dysmutazę ponadtlenkową, oraz, z drugiej strony, delecje genów
OGG1, NTG1 oraz APN1, kodujących mitochondrialne enzymy BER uczestniczące w naprawie
DNA poprzez usuwanie oksydacyjnie zmienionych zasad. Allel genu MSH1, który badaliśmy w
tej pracy, koduje białko Msh1 z pojedynczym podstawieniem w silnie konserwowanej domenie
wiążącej ATP. Mutacja ta została wprowadzona na wzór opisanej wcześniej mutacji w
homologicznym białku jądrowym Msh255,56. Allel msh1-R813W prowadzi do tylko częściowej
utraty funkcji genu. Szczepy niosące ten allel utrzymują mtDNA typu rho+ (choć w porównaniu
ze szczepami typu dzikiego, wykazują wyraźny wzrost częstości powstawania mutantów rho¯,
do czego jeszcze powracam poniżej), oraz w ich mtDNA gromadzą się mutacje wykrywane ze
zwiększoną częstością w testach mutagenezy oporności na oligomycynę lub erytromycynę. Ten
fenotyp msh1-R813W jest zgodny z defektem opisanym dla analogicznego mutanta msh2-
R730W, który okazał się niezdolny do naprawy MMR w czasie rekombinacji DNA jądrowego55.
Wyniki naszych badań przedstawione w tej pracy pokazały synergistyczny wzrost poziomu
mutagenezy OR w szczepie mutanta podwójnego sod2Δ msh1-R813W w porównaniu z
mutantami pojedynczymi, co wskazuje na znaczący udział białka Msh1 w naprawie uszkodzeń
oksydacyjnych prowadzących do mutacji punktowych w mtDNA komórek pozbawionych
dysmutazy Sod2. Ten wniosek jest również zgodny z supresją podwyższonych poziomów
częstości mutantów OR i mutantów ER w szczepie sod2Δ po transformacji plazmidem
centromerycznym z genem MSH1. Efekt supresji sugeruje, że nawet stosunkowo niewielka
nadekspresja MSH1 może zapobiec zwiększonej mitochondrialnej mutagenezie indukowanej
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
14
endogennym stresem oksydacyjnym. Brak dysmutazy Sod2 jednak nie zmienił fenotypu
niestabilności genomów rho+ w mutancie msh1-R813W (26-krotny przyrost częstości mutantów
rho¯ w porównaniu ze szczepem dzikim niezależnie od allelu genu SOD2), co sugeruje, że
mechanizmy powstawania mutacji OR i rho¯ w mutancie msh1-R813W są inne i prawdopodobnie
związane z dwoma niezależnymi funkcjami białka Msh1 w mitochondrium. Z kolei, pomiary
poziomów mutagenezy mitochondrialnej mierzonej częstością pojawiania się mutacji OR w
szczepach podwójnych mutantów niosących allel msh1-R813W oraz jedną z trzech delecji genów
kodujących białka zaangażowane w mtBER, tj. ogg1D, apn1D i ntg1D, pokazały, że glikozylaza
Ogg1 i endonukleaza Apn1 działają na inne uszkodzenia niż ścieżka zależna od Msh1
zapobiegająca utrwalaniu się mutacji OR (przyrosty w podwójnych mutantach jedynie
addytywne), natomiast w tle genetycznym naszych szczepów w warunkach spontanicznych
glikozylaza Ntg1 nie odgrywa znaczącej roli w naprawie uszkodzeń, które prowadzą do mutacji
OR. Jeśli chodzi o stabilność genomów rho+, zależności między badanymi mutacjami były
odmienne. Brak Ntg1 zwiększył około 2-krotnie stabilność genomu rho+ w szczepie msh1-
R813W (tj. zmniejszył poziom częstości mutantów rho¯). Tymczasem, obie delecje ogg1Δ i
apn1D wykazały przeciwną do ntg1D interakcję z allelem msh1-R813W pod względem fenotypu
częstości mutantów rho¯. O ile żadna z pojedynczych inaktywacji OGG1 czy APN1 nie prowadzi
do znaczącej destabilizacji genomu rho+ ponad poziom obserwowany w szczepie typu dzikiego,
o tyle mutanty podwójne, msh1-R813W ogg1D i msh1-R813W apn1D, wykazują synergistycznie
zwiększone poziomy częstości mutantów rho¯, które powstają w wyniku rearanżacji genomu
mitochondrialnego. Te wyniki sugerują, że niektóre czynniki mtBER (glikozylaza Ogg1 oraz
endonukleaza Apn1) działają prawdopodobnie równolegle do ścieżki Msh1, przyczyniając
się do naprawy tych samych uszkodzeń oksydacyjnych, które nienaprawione mogą
prowadzić do rearanżacji mtDNA.
W kontynuacji tych badań planuję sprawdzić, czy synergistyczny przyrost częstości
przearanżowanych genomów rho¯ w msh1-R813W ogg1D i msh1-R813W apn1D zależy od
obecności glikozylazy Ntg1. Badania nad replikacją genomów rho¯ zachowujących sekwencję
ori5 w mitochondriach drożdży pokazały, że glikozylaza Ntg1 rozpoznaje specyficzne
oksydacyjne uszkodzenia indukowane przez działanie nadtlenku wodoru w ori5, przyczyniając
się do powstania pęknięcia podwójnej nici57. Pęknięcie ori5 w mtDNA inicjuje z kolei zależną
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
15
od rekombinacji replikację (RDR; ang. recombination-dependent replication) mtDNA we
współdziałaniu z 5’-egzonukleazą Din7 i mitochondrialną rekombinazą Mhr157,58. Pomimo kilku
publikacji na ten temat, wciąż nie jest jasne, czy replikacja inicjowana przez rekombinację
zależną od rekombinazy Mhr1 jest specyficzna dla replikacji defektywnych genomów rho¯, czy
może mieć znaczenie również dla replikacji genomu typu dzikiego rho+. Dopiero najnowsze
dane sugerują, że replikacja mtDNA w komórkach S. cerevisiae inicjowana przez naprawę
pęknięć podwójnej nici DNA, a nie przez wydłużanie transkryptów syntetyzowanych przez
mitochondrialną polimerazę RNA, jak dotąd uważano59, jest prawdopodobnie dominującą formą
replikacji w mitochondrium60. Jeśli tak rzeczywiście jest, to ścieżka Msh1 monitorująca jakość
heterodupleksów w mitochondrium, jako swego rodzaju punkt kontrolny rekombinacji,
miałaby kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności mitochondrialnego genomu rho+
podczas inicjacji replikacji DNA w mitochondrium.
Kolejny nasz wynik przytoczony w tej publikacji wskazuje, że rola białka Msh1 w punkcie
kontrolnym rekombinacji mtDNA nie musi sprowadzać się tylko do jego prawdopodobnej roli w
odrzucaniu niesparowanych heterodupleksów. Ponieważ przypuszczaliśmy, że mechanizm
rearanżacji mtDNA w mutancie msh1-R813W, których częstość wzrasta po inaktywacji genu
OGG1 lub APN1, związany jest ze zmianą wydajności rekombinacji w tym mutancie,
opracowaliśmy na bazie mitochondrialnego reportera ARG8m test mitochondrialnej
heteroallelicznej rekombinacji dla komórek drożdżowych i sprawdziliśmy efekt nadekspresji
genu MSH1 na częstość rekombinacji wykrywanej tym testem. Pokazaliśmy, że umiarkowana
nadprodukcja białka Msh1 typu dzikiego stymuluje rekombinację alleliczną mtDNA.
Natomiast, nadekspresja alleli kodujących defektywne warianty białka Msh1, Msh1-R813W lub
Msh1-G776D, nie zwiększała częstości rekombinacji allelicznej, chociaż poziomy wszystkich
trzech białek, typu dzikiego i dwóch białek zmutowanych, wykrywanych w komórkach były
zbliżone. Ten wynik wskazuje, że defekt w zmutowanym białku Msh1-R813W nie tylko
zatrzymuje naprawę MMR (zwiększony poziom mitochondrialnych mutacji punktowych), ale
również uniemożliwia stymulację rekombinacji allelicznej przez Msh1. Ta zbieżność sugeruje
możliwość, że inne białka mtMMR, które współdziałają z Msh1 na szlaku MMR, mogą również
być potrzebne do pełnej stymulacji rekombinacji allelicznej mtDNA, co może być wykorzystane
w poszukiwaniach nieznanych jeszcze czynników mtMMR. Dodatkowo, po publikacji
omawianego artykułu pokazaliśmy, że ten sam konstrukt plazmidowy, z którego
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
16
nadprodukowane było białko Msh1 w eksperymentach pokazujących stymulację rekombinacji
allelicznej w mitochondrium, po stransformowaniu do odpowiedniego szczepu reporterowego
obniża częstość rekombinacji między bezpośrednimi powtórzeniami w mtDNA, a zatem
rekombinację niealleliczną. Ten wynik jest z kolei zgodny z proponowaną funkcją Msh1 w
procesie odrzucania heterodupleksów w punkcie kontrolnym rekombinacji zachodzącej w
mitochondrium. Mamy zamiar zweryfikować te wstępne wyniki, szukając czynników
białkowych, które uczestniczą z Msh1 bądź w mtMMR i stymulacji rekombinacji allelicznej,
bądź w zahamowaniu rekombinacji nieallelicznej.
2. Rola systemu kontroli jakości białek w utrzymaniu integralności mtDNA - Malc et
al. (2009)37.
Wątek roli białka Msh1 w zapobieganiu uszkodzeniom mtDNA powstającym na skutek
akumulacji reaktywnych form tlenu (ROS) w mitochondrium pojawił się w kolejnej pracy, w
której badaliśmy wpływ jednego z głównych ogólno-komórkowych systemów kontroli jakości
białek, systemu ubikwityna-proteasom (UPS), na funkcję mitochondrialną związaną z
utrzymaniem integralności i sekwencji mtDNA. UPS rozpoznaje, rozplata, a następnie degraduje
białka, które zostają wcześniej zaznaczone poprzez przyłączenie poliubikwityny61. Białka
degradowane przez UPS to najczęściej białka o krótkim czasie półtrwania, białka regulacyjne m.
in. istotne dla przebiegu cyklu komórkowego lub odpowiedzi na uszkodzenia DNA, ale także
białka, które zostały oksydacyjnie uszkodzone. Testowaliśmy szczepy pozbawione genu UMP1,
kodującego maturazę 20S proteasomu, która jest jednym z czynników regulujących i
ułatwiających stopniowe składanie podjednostek proteasomu62. Komórki pozbawione białka
Ump1 żyją, ale rosną wolno i są termowrażliwe. Pokazaliśmy, że szczep ump1Δ wykazuje
również fenotyp mutatora mitochondrialnego: 1) w hodowlach tego szczepu w warunkach
wzrostu w temperaturze permisywnej częstość mutantów petite z przearanżowanym mtDNA
(rho¯) jest ponad 15 razy wyższa niż w hodowlach szczepu typu dzikiego, 2) poziom
mutagenezy punktowej w mtDNA również wzrasta w tym szczepie: częstość mutantów OR jest
ponad 35-krotnie, a mutantów ER 6-krotnie wyższa od częstości analogicznych mutantów w
szczepie typu dzikiego. Następnie pokazaliśmy, że przy 3-krotnym wzroście poziomu białka
Msh1 w komórkach szczepu ump1Δ częstość mutantów ER zmniejszyła się do poziomu
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
17
obserwowanego w szczepie dzikim, natomiast częstości mutantów OR i petite zmniejszyły się
częściowo (odpowiednio, ponad 3- i 2-krotnie). Zatem, uszkodzenia w mtDNA komórek z
defektywnym proteasomem mogą być całkowicie lub częściowo naprawione przez szlak
zależny od Msh1. Na kolejnym etapie pracy sprawdziliśmy poziom ROS w ekstraktach z
komórek szczepu ump1Δ i szczepu kontrolnego. Wyniki naszych testów pokazały, że defekt
proteasomu na skutek braku białka Ump1 indukuje endogenny stres oksydacyjny w komórkach
drożdży, na co wskazuje 4-krotny wzrost poziomu ROS wykrywany w tych komórkach. Supresja
fenotypu mutatora mitochondrialnego w szczepie ump1Δ stransformowanym plazmidem z
MSH1 nie doprowadziła do supresji zwiększonego poziomu ROS w tym szczepie, co sugeruje,
że wzrost mutacji mitochondrialnych w komórkach ump1D, choć znaczący, nie jest źródłem
stresu oksydacyjnego zaindukowanego przez defekt proteasomu. Rozważaliśmy tę możliwość na
podstawie znanej od dawna propozycji samonapędzajacego się „błędnego koła” gromadzących
się mutacji w mtDNA, które mogą prowadzić do syntezy wadliwych składników łańcucha
oddechowego generujących jeszcze więcej ROS i, w konsekwencji, do powstawania nowych
uszkodzeń w mtDNA, z których część może ulec utrwaleniu w postaci kolejnych mutacji63.
Nasze wyniki nie wskazują, aby taki był mechanizm dodatkowego stresu oksydacyjnego w
komórkach ump1D.
Żeby wyjaśnić jak w warunkach braku Ump1 regulowany jest poziom białka Msh1,
pokazaliśmy, że poziom Msh1 jest przynajmniej 2-krotnie niższy zarówno w ekstraktach
całkowitych komórek ump1Δ, jak i w mitochondriach. Ponieważ system UPS kontroluje wiele
białek regulacyjnych warunkujących poziom transkrypcji wielu genów64, zmierzyliśmy poziom
transkryptu genu MSH1 w szczepie pozbawionym UMP1 w porównaniu ze szczepem
kontrolnym, co pozwoliło wykazać około 2-krotne obniżenie poziomu transkryptu MSH1 w
komórkach ump1D. Na podstawie tych danych wywnioskowaliśmy, że zmniejszony poziom
mRNA MSH1 w komórkach z defektywnym proteasomem prowadzi do obniżenia poziomu
białka Msh1 w mitochondriach, co z kolei w warunkach towarzyszącego stresu oksydacyjnego i
gromadzenia się w mtDNA uszkodzeń pociąga za sobą zaburzenia w kontroli rekombinacji
inicjującej replikację (funkcja zależnego od Msh1 punktu kontrolnego rekombinacji
mitochondrialnej, o czym pisałam powyżej) i w naprawie mtDNA. W konsekwencji,
przynajmniej część defektów utrzymania integralności i sekwencji mtDNA obserwowanych w
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
18
szczepach pozbawionych białka Ump1 wynika z obniżonego poziomu białka Msh1 w
mitochondriach tych szczepów, jednak ogólny stres oksydacyjny i znaczna część niestabilności
genomu rho+ (podniesiona częstość rho¯) oraz zwiększonej mitochondrialnej mutagenezy
punktowej (mutacje OR) jest niezależna od niedoboru Msh1.
Mechanizm zwiększonej mutagenezy mtDNA w komórkach ump1D pozostaje jeszcze do
zbadania, ale ponieważ jest coraz więcej doniesień o ewolucyjnie konserwowanych ścieżkach
specyficznej degradacji białek mitochondrialnych wykorzystującej proteasom (ang.
mitochondria-associated degradation; skrót MAD), jedna zależna od ATPazy Cdc48 (VCP u
ssaków), druga od ATPazy Msp1 (ATAD1 u ssaków)65, wśród mitochondrialnych substratów
tych ścieżek MAD należałoby szukać białek, których gromadzenie się w mitochondriach w
warunkach defektu proteasomu odpowiada za mutagenezę mitochondrialnego genomu
niezależną od Msh1 i stres oksydacyjny w szczepie ump1D.
3. Badanie mechanizmów powstawania i naprawy wywoływanych przez stres
oksydacyjny uszkodzeń, które prowadzą do rearanżacji mtDNA - Dzierzbicki et al.,
(2012)45
Wcześniejsze badania wykazały, że stres wywoływany w mitochondriach przez reaktywne
formy tlenu powoduje powstawanie zarówno mutacji punktowych, jak i rearanżacji genomu
mitochondrialnego. Kolejna praca miała na celu bliższe zbadanie, jak te rearanżacje powstają i
jakie mechanizmy im zapobiegają.
Poszukując warunków stresu oksydacyjnego, w których można powtarzalnie wykryć w
drożdżach niestabilność mtDNA, wypróbowaliśmy dwa związki znane jako czynniki
oksydacyjne w komórkach drożdży: antymycynę A i menadion. Antymycyna A hamuje
przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy na etapie kompleksu III, co powoduje produkcję
anionorodnika ponadtlenkowego w mitochondriach. Z kolei, menadion (2-metylo-1,4-
naftochinon) ulega redukcji katalizowanej przez flawoenzymy komórkowe, które są
zlokalizowane zarówno w błonach mitochondrialnych, jak i w retikulum endoplazmatycznym, i
spontanicznie utlenia się w reakcji z tlenem, generując anionorodnik ponadtlenkowy20. Cykl
redukcji i utleniania może powtórzyć się wielokrotnie, za każdym razem produkując cząsteczki
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
19
ROS. Dodatkowo, menadion i pokrewne związki mogą również hamować aktywność
acetylotranferaz66, które spełniają w komórce szereg różnych funkcji niekoniecznie bezpośrednio
związanych z mitochondriami67. Poglądowo porównując działanie antymycyny i menadionu,
można uogólnić, że antymycyna produkuje rodniki lokalnie w mitochondrium, menadion
natomiast może działać w całej komórce. Zgodne z tym wnioskiem są wyniki wcześniejszych
badań, które pokazały, że menadion w komórkach drożdży powoduje zatrzymanie cyklu
komórkowego w fazie G1 przez nieznany mechanizm, niezależny od białka Rad9, w odróżnieniu
od mechanizmu oddziaływania nadtlenku wodoru na cykl komórkowy drożdży, który działa
przez Rad9, zatrzymując cykl w fazie G268. Natomiast, nie ma danych wskazujących na
zaburzenia regulacji cyklu komórkowego w drożdżach po traktowaniu antymycyną. Na
podstawie tego krótkiego przeglądu podobieństw i różnic w działaniu tych dwóch inhibitorów
generujących w komórkach ROS można przewidywać, że drożdże powinny inaczej odpowiadać
na traktowanie antymycyną w porównaniu z odpowiedzią po menadionie, co potwierdziły
wyniki naszych eksperymentów.
Antymycyna indukowała zwiększenie częstości mutantów z przearanżowanymi genomami
rho¯, jednak tylko w czasie wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla, kiedy oddychanie
było jedynym procesem generującym energię, natomiast traktowanie antymycyną nie zmieniało
częstości punktowej mutagenezy mitochondrialnej. Traktowanie menadionem, na odwrót,
indukowało mutagenezę punktową w mtDNA niezależnie od źródła węgla, ale nie wpływało
znacząco na stabilność genomów rho+. Aby wyjaśnić, te różnice w odpowiedziach na
antymycynę i menadion zmierzyliśmy poziomy ROS i ATP w ekstraktach z komórek szczepu
typu dzikiego dzielących się w podłożu z niefermentowalnym źródlem węgla w obecności
antymycyny lub menadionu. Chociaż oba związki spowodowały podobne wzrosty poziomów
anionorodnika w komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi, tylko antymycyna
zaindukowała znaczący wzrost poziomu nadtlenku wodoru w traktowanych komórkach. Z
drugiej strony, pomiary poziomów ATP w komórkach po traktowaniu antymycyną lub
menadionem w hodowlach rosnących na niefermentowalnym źródle wegla, pokazały wyższy
spadek poziomu ATP po antymycynie niż menadionie, co było do przewidzenia, ponieważ
antymycyna jest bezpośrednim inhibitorem aktywności łańcucha oddechowego. Ponieważ
stwierdziliśmy korelację niestabilności genomów rho+ (wyższą częstość mutantów rho¯) z
podwyższonym poziomem nadtlenku wodoru w komórkach po traktowaniu antymycyną,
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
20
sprawdziliśmy, czy w tych warunkach nadprodukcja katalazy Cta1, jednego z enzymów
detoksyfikujących nadtlenek wodoru w mitochondriach69,70, zwiększy stabilność genomów rho+.
Wyniki naszych eksperymentów potwierdziły to przypuszczenie, co pozwoliło nam sformułować
wniosek, że zaindukowana przez działanie antymycyny niestabilność genomów rho+,
objawiająca się podwyższoną częstością mutantów rho¯, jest wywołana przez gromadzący
się w tych warunkach nadtlenek wodoru w mitochondrium. Choć najbardziej
prawdopodobną cząsteczką ROS bezpośrednio powstającą w wyniku działania antymycyny jest
anionorodnik ponadtlenkowy20, ta cząsteczka ulega szybko dysmutacji na drodze spontanicznej
lub enzymatycznej do nadtlenku wodoru. Ponieważ antymycyna podwyższała poziom nadtlenku
wodoru również w komórkach rosnących na glukozie, ale bez jednoczesnej destabilizacji
genomów rho+, wywnioskowaliśmy, że komórki są w stanie naprawić lub przeciwdziałać
uszkodzeniom w mtDNA wywołanym podwyższonym poziomem nadtlenku wodoru, pod
warunkiem, że mają wystarczająco dużo ATP do przeprowadzenia niezbędnych reakcji naprawy
DNA. Doprecyzowaliśmy, zatem, warunki obniżonej stabilności genomów rho+ pod wpływem
stresu oksydacyjnego wywołanego przez antymycynę jako połączenie podwyższonego poziomu
nadtlenku wodoru z obniżonym bilansem energetycznym mitochondrium. Ponieważ wcześniej
pokazano dla DNA jądrowego drożdży, że menadion w odróżnieniu od nadtlenku wodoru nie
powoduje uszkodzeń typu przecięcia obu nici DNA71, zwane DSB (ang. double-strand break),
obserwowane różnice w mutagenezie mtDNA po antymycynie i po menadionie przypisaliśmy
odmiennym rodzajom uszkodzeń gromadzącym sie w mtDNA pod wpływem antymycyny, w
porównaniu z uszkodzeniami po menadionie. Niestabilność genomów rho+ po antymycynie
może być konsekwencją powstających DSB w mtDNA w wyniku działania nadtlenku
wodoru i następującej potem próbie naprawy tych DSB poprzez system zależnej od
rekombinacji replikacji (RDR). Nasze wyniki są zgodne z tą propozycją. Po pierwsze,
pokazaliśmy poprzez sekwecjonowanie całogenomowe 26 szczepów petite, że nieoddychające
mutanty wyizolowane po traktowaniu antymycyną zawierają z reguły przearanżowane
genomy rho¯ pozbawione dużych partii mtDNA, ale z zamplifikowanymi fragmentami
zawierającymi jedno, dwa lub wyjątkowo trzy sekwencje ori z 4 znanych ori
mitochondrialnych. Po drugie, szczepy pozbawione genów kodujących białka zaangażowane w
naprawę DSB w jądrze, które też funkcjonują w mitochondrium72, Rad50 i Xrs2, po traktowaniu
antymycyną wykazują wyższą częstość mutantów rho¯ niż szczepy typu dzikiego, co sugeruje,
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
21
że brak kompleksu Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) w mitochondrium, podobnie jak w jądrze,
zaburza wydajną naprawę DSB. Pokazaliśmy, że w szczepach rad50Δ i xrs2Δ poziomy
mitochondrialnej rekombinacji allelicznej są niższe niż w szczepach typu dzikiego, co wskazuje
na udział kompleksu MRX w regulacji rekombinacji allelicznej w mitochondriach jako
czynnik przeciwdziałający powstawaniu przearanżowanych genomów rho¯. Podobnie do
wyników w naszej wcześniejszej pracy36, inaktywacja genu kodującego glikozylazę Ogg1 w
szczepie rad50Δ doprowadziła do synergistycznego wzrostu mutantów rho¯ po traktowaniu
antymycyną, pokazując, że mitochondrialne funkcje ścieżki BER zależnej od Ogg1 i ścieżki
kompleksu MRX równolegle przeciwdziałają przekształceniu tych samych uszkodzeń w mtDNA
w mutagennym procesie, który prowadzi do powstania przearanżowanych genomów rho¯. Po
trzecie, znaleźliśmy nukleazę, która bierze udział w procesowaniu uszkodzeń mtDNA po
traktowaniu antymycyną na szlaku, który prowadzi do powstania genomów rho¯. Szczep
pozbawiony mitochondrialnej nukleazy Nuc1 wykazuje znacznie obniżony poziom mutantów
rho¯ zaindukowanych antymycyną, jak również inaktywacja genu NUC1 obniża znacząco
niestabilność genomu rho+ w mutancie rad50Δ. Nukleaza Nuc1 ma aktywność endonukleazy
oraz 5’→3’ egzonukleazy73. Enzym ten jest zlokalizowany w komórkach drożdży w
mitochondriach, ale przemieszcza się do jądra w odpowiedzi na sygnały apoptotyczne74.
Wcześniej przypisano tej nukleazie również udział w homologicznej rekombinacji w
mitochondriach75. Na podstawie wyników naszej pracy proponujemy, że w warunkach stresu
oksydacyjnego wynikającego z gromadzenia się nadtlenku wodoru w mitochondrium
powstają uszkodzenia DNA, które przekształcają się w DSB. Jest bardzo prawdopodobne, że
mitochondrialne ori zawierające skupiska par GC (ang. GC clusters) mogą być również
preferowanymi miejscami, gdzie powstają DSB w wyniku uszkodzeń oksydacyjnych. Zgodnie z
tym przewidywaniem, dla mitochondrialnej sekwencji ori5 pokazano, że pod wpływem
nadtlenku wodoru tworzy się w niej DSB zależne od aktywności glikozylazy Ntg157.
Uszkodzenia powstające po traktowaniu antymycyną byłyby następnie procesowane przez Nuc1
i być może inne egzonukleazy mitochondrialne (np. procesowanie DSB w ori5 jest zależne nie
od Nuc1, a od Din757,58). Wytrawione jednoniciowe zakończenia 3’ mogą ulec sparowaniu z
innymi jednoniciowymi zakończeniami albo mogą zostać sparowane przy udziale rekombinazy z
homologicznym dupleksem (np. na szlaku procesowania DSB w ori5 działa mitochondrialna
rekombinaza Mhr176), dostarczając startera do nowej rundy replikacji zależnej od rekombinacji.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
22
RDR może rozpocząć się w sekwencji allelicznej do nici inwazyjnej, wtedy dojdzie do wiernej
inicjacji replikacji genomu rho+. Kiedy jednak RDR rozpocznie nową rundę replikacji w miejscu
nieallelicznym do nici inwazyjnej, w wyniku tak zainicjowanej replikacji może powstać genom
przearanżowany. Jak pisałam powyżej, do rekombinacji między sekwencjami nieallelicznymi
dochodzi wtedy, kiedy zawodzi mechanizm punktu kontroli rekombinacji zależny od Msh1.
Funkcja tego białka zależy od ATP, zatem przypuszczalnie jest mocno ograniczona w
warunkach deficytu energetycznego w czasie traktowania antymycyną.
W ramach kontynuacji tej pracy pokazaliśmy że, zgodnie z wcześniejszymi
przypuszczeniami, co do niespecyficzności menadionu jako związku napędzającego cykle redoks
w całej komórce, że traktowanie menadionem podnosi w komórkach drożdży nie tylko
mutagenezę punktową mtDNA, ale też mutagenezę jądrowego DNA mierzoną za pomocą
oznaczania częstości mutantów opornych na kanawaninę. Te wstępne wyniki sugerują, że w
wyniku działania menadionu podniesienie poziomu punktowej mutagenezy mitochondrialnej
koreluje ze wzrostem poziomu mutagenezy jądrowego DNA. Dopiero wyniki badań opisanych w
późniejszej publikacji38 wyjaśniły tę korelację, pokazując, że aktywacja jądrowego szlaku kinaz
Mec1/Tel1/Rad53 w odpowiedzi na uszkodzenia DNA może powodować podniesienie
mutagenezy punktowej mtDNA poprzez podniesienie poziomu deoksyrybonukleotydów w
komórce, co jest zależne od aktywności jednej z kinaz efektorowych tego szlaku, Dun1. Te
wyniki są omawiane poniżej.
4. Związek mutagenezy mitochondrialnej z odpowiedzią komórek drożdży na
uszkodzenia genomu jądrowego - Kaniak-Golik et al. (2017)38
W tej pracy kontynuowaliśmy badania nad rolą nukleaz zaangażowanych w utrzymywanie
stabilności mitochondrialnego genomu, koncentrując się na wyjaśnieniu mitochondrialnej roli
nukleazy Rad27 o podwójnej, jądrowej i mitochondrialnej, lokalizacji w komórkach
drożdżowych. Ta konserwowana w ewolucji nukleaza (homolog ludzkiego białka FEN1) spełnia
w jądrze funkcję głównej endonukleazy typu „flap” procesującej struktury pośrednie replikacji
odbywającej się na nici opóźnionej77. Mutanty pozbawione tego białka wykazują całą serię
rozmaitych fenotypów jądrowych i mitochondrialnych związanych ze zmienioną stabilnością
DNA w obu kompartmentach, jednak do tej pory nie było dowodu na bezpośrednią funkcję
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
23
Rad27 w mitochondrium. Wykazaliśmy, że w szczepach pozbawionych tej nukleazy tylko część
mutacji oporności na erytromycynę jest zlokalizowana w mitochondrium. Nawet po
uwzględnieniu tej korekty, inaktywacja RAD27 prowadzi do zwiększonej punktowej
mutagenezy mtDNA, a charakterystyczną sygnaturą mutacyjną dla tej mutagenezy jest
tranzycja GC→AT. Kolejne wyniki naszych badań pokazały, że większość mitochondrialnych
fenotypów w szczepach rad27Δ jest pośrednim efektem związanej z brakiem nukleazy
Rad27 aktywacji jądrowej ścieżki odpowiedzi na uszkodzenia wywołane stresem
replikacyjnym zależnej od kinaz Mec1/Tel1/Rad53. W szczególności, zwiększony poziom
punktowych mutacji w mtDNA w komórkach pozbawionych Rad27 jest w znacznej części
konsekwencją aktywacji kinazy efektorowej Dun1, działającej na wyżej wymienionym szlaku
transdukcji sygnału, oraz wynikającym z tej aktywacji podniesieniem poziomu
deoksyrybonukleotydów (dNTP) w komórce. Pokazaliśmy też, że supresja niestabilności
jądrowego DNA poprzez nadprodukcję egzonucleazy Exo1 odwraca szereg fenotypów
mitochondrialnych związanych z delecją genu RAD27.
Wyniki omawianej pracy wskazują, zatem, że niestabilność jądrowego DNA może
wywołać podniesienie mutagenezy mitochondrialnego DNA. Zgodnie z tym wnioskiem,
pokazaliśmy, że w innym mutancie, pozbawionym helikazy Rrm3 zaangażowanej w
regulację replikacji rDNA, w którym ścieżka DDR również podlega konstytutywnej
aktywacji, podwyższony poziom mitochondrialnej mutagenezy jest zależny od kinazy
Dun1. Dodatkowo wyniki tej pracy wykazały, że Rad27 bierze też bezpośredni udział w
metabolizmie mitochondrialnego DNA, funkcjonując na ścieżce rekombinacji nieallelicznej
między bezpośrednimi powtórzeniami w mtDNA.
Uzyskane w powyższych pracach eksperymentalnych wyniki umieściłam w szerszym
kontekście obszernej literatury dotyczącej badania stabilności genomu jądrowego i
mitochondrialnego w dwóch pracach przeglądowo-koncepcyjnych, omówionych poniżej.
5. Mechanizmy utrzymywania stabilności genomu mitochondrialnego i wpływ
zaburzeń mitochondrialnych na stabilność genomu jądrowego - Kaniak-Golik and
Skoneczna (2015)78
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
24
W tej pracy przeglądowej zostały omówione doniesienia literaturowe wskazujące na
kluczowy udział szlaków biochemicznych zlokalizowanych w mitochondrium w utrzymaniu
genomu jądrowego ze szczególnym uwzględnieniem niezbędnej dla przeżycia komórki ścieżki
mitochondrialnej syntezy grup prostetycznych Fe-S. W pierwszej części artykułu zostały opisane
znane mechanizmy utrzymania i naprawy mtDNA w komórkach S. cerevisiae dotyczące
replikacji mtDNA, organizacji mitochondrialnego genomu oraz udziału poszczególnych ścieżek
naprawy mtDNA w jego stabilności. Uwzględniono również znane czynniki białkowe
odpowiedzialne za utrzymanie i stabilność sekwencji mtDNA w trzech daleko spokrewnionych
organizmach: S. cerevisiae, Candida albicans i człowiek. W drugiej części pracy zostały
przedstawione przykłady wpływu zmienionego metabolizmu mitochondrium na stabilność
genomu jądrowego. Zaburzenia mitochondrialnej funkcji przez: 1) zablokowanie przepływu
elektronów przez łańcuch oddechowy lub 2) brak funkcjonalnego mtDNA, a zatem zupełny
brak aktywnego łańcucha oddechowego (mutanty rho0 lub rho¯) prowadzą do wzrostu
poziomu mutagenezy jądrowego DNA. Co ciekawe, w obu przypadkach mechanizm
powstawania niestabilności genomowego DNA jest inny.
Blokada łańcucha oddechowego wywołuje stres oksydacyjny w komórce, co przyczynia się
do wzrostu niestabilności genomu jądrowego, ale niezależnie od aktywności polimeraz TLS:
Rev1, Rev3 i Rev7, natomiast w drugim przypadku, pomimo obniżenia poziomu ROS w
komórkach, poziom mutagenezy jądrowego DNA wzrasta na skutek aktywacji polimeraz Rev3 i
Rev779. Veatch et al.80 pokazali, że brak mtDNA wywołuje niestabilność genomu jądrowego
poprzez defekt syntezy cytoplazmatycznych grup prostetycznych Fe-S połączony z włączeniem
transkrypcyjnej odpowiedzi na niedobór żelaza. Defekt biogenezy białek Fe-S jest
konsekwencją obniżenia potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej, spowodowanego
brakiem aktywności łańcucha oddechowego, w wyniku czego dochodzi do zaburzeń
mitochondrialnego składania grup Fe-S, zahamowania eksportu z mitochondrium związku
zawierającego siarkę, który jest konieczny do biogenezy cytoplazmatycznych białek Fe-S,
oraz deregulacji metabolizmu żelaza w komórce81. Nie jest znany dokładnie mechanizm,
który jest odpowiedzialny za tę niestabilność, jednak jedną z możliwości jej wytłumaczenia jest
obniżenie poziomu białek z grupami Fe-S koniecznych dla replikacji i naprawy DNA jądrowego,
co powoduje gromadzenie się uszkodzeń w genomie i w konsekwencji aktywację szlaku
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
25
transdukcji sygnału o uszkodzeniu genomu jądrowego, czyli szlaku DDR, który jest jednym z
kanałów komunikacji między obu kompartmentami.
W zależności od etapu, na którym biogeneza mitochondrialnych białek Fe-S jest
zahamowana, włączają się różne mediatory (kinazy) szlaku DDR, przesyłając sygnał aktywacji
do znanej od dawna kinazy efektorowej Dun182. Aktywność tej kinazy odpowiada za jedną z
podstawowych zmian indukowanych po aktywacji szlaku DDR – zwiększenie syntezy
deoksyrybonukleotydów (dNTP). Dzieje się tak głównie (choć nie tylko) poprzez zależną od
Dun1 indukcję transkrypcji genów kodujących podjednostki reduktazy rybonukleotydowej
(RNR) katalizującej limitujący etap syntezy dNTP (więcej o tej odpowiedzi w opisie artykułu
Kaniak-Golik et al., 201738). Co więcej, utrzymanie aktywności RNR jest jedną z głównych
pośrednich funkcji mitochondrium, ponieważ reakcje katalizowane przez ten enzym wymagają
kilku cytoplazmatycznych białek Fe-S, takich jak: monotiolowe glutaredoksyny Grx3/Grx4 jako
źródła żelaza do utworzenia nietypowej rodnikowej grupy prostetycznej (Fe(III)2-Y•),
charakterystycznej dla tego enzymu, oraz, jako źródła elektronów, oksydoreduktazy Dre2
działającej z białkiem Tah1883,84. Synteza tych cytoplazmatycznych białek Fe-S wymaga z kolei
aktywności mitochondrialnego szlaku syntezy grup Fe-S. Kinaza Dun1 jest aktywowana również
w warunkach niedoboru żelaza niezależnie od głównych kinaz szlaku DDR, Mec1 i Rad5385.
Przyszłe badania powinny rozstrzygnąć znaczenie kinazy Dun1 jako głównego regulatora
aktywności RNR w integracji sygnałów, z jednej strony, o poziomie żelaza oraz, z drugiej
strony, o zapotrzebowaniu na dNTP związanym np. ze stresem replikacyjnym.
Bardzo ważną ścieżką łączącą mitochondria i jądro, charakterystyczną dla komórek
eukariotycznych, nawet u organizmów jednokomórkowych, takich jak drożdże, są szlaki
programowanej śmierci komórki. Wymienione powyżej białko Tah18 w warunkach stresu
oksydacyjnego wywołanego przez egzogenny H2O2, jeden z typowych sygnałów pro-
apoptotycznych dla komórek drożdży, uwalnia się z kompleksu z Dre2, które jest białkiem Fe-S,
i ulega translokacji do mitochondrium, gdzie przyczynia się do śmierci komórki przez bliżej
nieznany mechanizm, który obejmuje prawdopodobnie degradację mitochondrium86. Nie
wiadomo, jaki jest związek w komórkach drożdży pomiędzy śmiercią komórek zależną od
translokacji do mitochondrium białka Tah18 a innymi znanymi ścieżkami apoptotycznymi, które
włączają się w odpowiedzi na stres wywołany egzogennym H2O2, zależnymi od białka Aif187
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
26
czy od, omawianej powyżej, nukleazy Nuc174. Przyszłe badania powinny wyjaśnić znaczenie
tych i innych ścieżek apoptotycznych dla funkcjonowania mitochondrium w komórkach S.
cerevisiae jako modelowych komórkach eukariotycznych.
6. Porównanie genomów mitochondrialnych i znanych mechanizmów utrzymania ich
stabilności w komórkach dwóch gatunków grzybów, Saccharomyces cerevisiae i
Schizosaccharomyces pombe - Skoneczna et al., (2015)88
Celem tej pracy przeglądowej było porównanie informacji na temat mechanizmów
utrzymania stabilności genomu jądrowego i mitochondrialnego DNA w komórkach dwóch
odległych ewolucyjnie gatunków grzybów, Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces
pombe (ich linie ewolucyjne oddzieliły się przynajmniej 500 mln lat temu89). Oba organizmy są
badane od dawna jako modelowe jednokomórkowe organizmy eukariotyczne i porównywane do
komórek wyższych Eukaryota. Wyniki tych badań wskazują na wysoki stopień podobieństwa
podstawowych procesów komórkowych, w tym również mechanizmów zapewniających
stabilność obu genomów, we wszystkich organizmach eukariotycznych. Tym niemniej, w
związku z dystansem ewolucyjnym dzielącym te dwa gatunki szczegóły rozwiązań
biochemicznych siłą rzeczy są odmienne. Niewątpliwie, wiele szczegółów biologii komórki
Schz. pombe wykazuje więcej podobieństw do analogicznych struktur i procesów w komórkach
Metazoa niż komórki S. cerevisiae, szczególnie tych dotyczących procesów zachodzących w
jądrze i cytoplazmie (np. białka chromatyny, białka TRF wiążące telomery, ścieżka
interferencyjnego RNA (iRNA), kontrola cyklu komórkowego w przejściu między fazami G2 i
M i inne)89,90. Z drugiej strony, komórki obu gatunków drożdży charakteryzują się
przystosowaniami do fermentacji cukrów. Zarówno S. cerevisiae, jak i Schz. pombe są
organizmami Crabtree-pozytywnymi, czyli produkują alkohol w obecności tlenu i przy wysokim
stężeniu glukozy. Główna metaboliczna różnica między nimi polega na tym, że drożdże
piekarnicze są w stanie utleniać etanol na drodze zależnego od funkcji mitochondrialnej
oddychania i przeprowadzać reakcje glukoneogenezy, natomiast Schz. pombe utraciły w trakcie
ewolucji aktywności glukoneogeniczne i nie mogą wykorzystywać etanolu jako jedynego źródła
węgla91. Jeśli chodzi o skład genów kodowanych w mtDNA, mitochondrialne genomy obu
gatunków drożdży są bardzo podobne. Zarówno S. cerevisiae, jak i Schz. pombe, w odróżnieniu
od komórek ssaczych i roślinnych, nie posiadają genów kodujących podjednostki dehydrogenazy
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
27
kompleksu I w ich mtDNA, ale mogą utleniać w mitochondriach zredukowany NAD+ z cytozolu
dzięki dehydrogenazom NADH, których aktywność nie jest sprzężona chemiosmotycznie z
syntezą ATP92-94. Nie jest wykluczone, że luka w łańcuchu oddechowym tych dwóch gatunków
grzybów wyewoluowała w ich liniach filogenetycznych na zasadzie konwergencji jako
przystosowanie do fermentacji cukrów, ponieważ jest kilka drożdży bliżej spokrewnionych z S.
cerevisiae, u których kompleks jest kodowany w mtDNA, zatem nie wydaje się, żeby brak
kompleksu I był cechą pierwotną95. Mitochondrialny genom Schz. pombe jest dużo mniejszy niż
mtDNA S. cerevisiae (19 kb vs. 85 kb), w czym jest podobny do mtDNA ssaków (16 kb), ale z
drugiej strony mitochondrialne geny obu grzybów, inaczej niż u ssaków, są przerywane
intronami96. Ponadto, wśród gatunków pokrewnych do Schz. pombe występuje duże
zróżnicowanie w wielkości mtDNA (np.: wielkość mtDNA Schz. japonicus jest zbliżona do
wielkości mtDNA z S. cerevisiae, co wynika głównie z amplifikacji rejonów niekodujących97),
co oznacza, że wielkość mtDNA nie jest cechą pierwotną Schz. pombe. Podstawowa różnica
pomiędzy mitochondrialnymi systemami w Schz. pombe i S. cerevisiae polega na tym, że
komórki Schz. pombe są petite-negatywne i nie tolerują dużych delecji mtDNA lub utraty
mtDNA nawet w warunkach laboratoryjnych. Pod tym względem, Schz. pombe różni się nie
tylko od komórek Saccharomyces cerevisiae, ale nawet od komórek ssaczych, ponieważ w
hodowlach laboratoryjnych można utrzymać mysie lub ludzkie komórki rho0 w obecności
dodatku urydyny lub urydyny i pirogronianu, odpowiednio98,99. Dokładne podłoże cechy petite-
negatywności komórek Schz. pombe nie jest znane, ale wyizolowano 6 niesprzężonych mutacji
jądrowych, dotąd jeszcze nieopisanych, które indywidualnie nadają komórkom tego grzyba
tolerancję na utratę całego mtDNA93, z czego można wnioskować, że cecha ta jest złożonym
zjawiskiem, wymagającym dopiero wyjaśnienia. Ciekawe, jest, że w S. cerevisiae mamy do
czynienia z sytuacją odwrotną. Szczepy typu dzikiego są petite-pozytywne, ale delecje
kilkunastu genów nadają komórkom zależność od mtDNA rho+ 100. Identyfikacja genów Schz.
pombe, których mutacje prowadzą do uniezależnienia tych komórek od obecności mtDNA rho+,
powinna w przyszłości przyczynić się do lepszego zrozumienia konserwowanych funkcji
mitochondrium w komórkach eukariotycznych. W związku z petite-negatywnością komórek
Schz. pombe, szczegóły replikacji i innych mechanizmów utrzymania stabilności mtDNA w tych
komórkach nie zostały jeszcze dobrze poznane, ale wiadomo, że w genomie Schz. pombe są geny
kodujące kilka charakterystycznych dla S. cerevisiae czynników niezbędnych dla utrzymania
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
28
genomu mitochondrialnego, które nie występują w komórkach Metazoa. Są to na przykład geny
kodujące: Msh1, o którym była mowa powyżej (homologi mitochondrialne są nieobecne w
komórkach Metazoa, ale występują w komórkach roślin wyższych101), rekombinazę
mitochondrialną Mhr1 oraz mitochondrialną endonukleazę Cce1 (Ydc2), specyficzną dla wiązań
krzyżowych powstających podczas rekombinacji. Chociaż szczegółów aktywności tych białek w
komórkach Schz. pombe jeszcze nie znamy, obecność tych genów wskazuje na znaczący udział
rekombinacji homologicznej w utrzymaniu mtDNA, podobnie jak w mitochondrium S.
cerevisiae i innych grzybów102.
4. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych.
a) Pozostałe osiągnięcia naukowo - badawcze po uzyskaniu stopnia doktora
Publikacje
1. Rempoła B., Kaniak A., Migdalski A., Rytka J., Słonimski P.P. and di Rago J.-P.
Functional analysis of RRD1 (YIL153w) and RRD2 (YPL152w), which encode two
putative activators of the phosphotyrosyl phosphatase activity of PP2A in Saccharomyces
cerevisiae. Mol Gen Genet. 262 (2000): 1081-92.
Mój wkład oceniam na 40%. Współudział w planowaniu i wykonaniu eksperymentów.
2. Rempoła B., Kaniak A., di Rago J. P. and Rytka J. Anaerobic growth of Saccharomyces
cerevisiae alleviates the lethal effect of phosphotyrosyl phosphatase activators depletion.
Acta Biochim Pol. 48 (2001): 1043-9.
Mój wkład oceniam na 40%. Współudział w planowaniu i wykonaniu eksperymentów.
3. Kaniak A., Xue Z., Macool D., Kim J. H. and Johnston M. Regulatory network
connecting two glucose signal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae.
Eukaryot. Cell 3 (2004): 221-231.
Mój wkład oceniam na 50%. Współudział w wykonaniu eksperymentów i przygotowaniu
manuskryptu.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
29
4. Rogowska A.T., Puchta O., Czarnecka A. M., Kaniak A., Stępień P. P., Golik P. Balance
between transcription and RNA degradation is vital for Saccharomyces cerevisiae
mitochondria: reduced transcription rescues the phenotype of deficient RNA degradation.
Mol Biol Cell. 17 (2006):1184-93.
Mój wkład oceniam na 5%. Współudział w analizie szczepów supresorowych.
5. Lipiński K. A., Kaniak-Golik A., Golik P. Maintenance and expression of the S.
cerevisiae mitochondrial genome--from genetics to evolution and systems biology.
Biochim Biophys Acta. 1797 (2010):1086-98.
Mój wkład oceniam na 30%. Napisanie rozdziału 2, pt. “Maintenance of the yeast mitochondrial
genome: replication, recombination, repair and transmission”.
6. Kaliszewska M., Kruszewski J., Kierdaszuk B., Kostera-Pruszczyk A., Nojszewska M.,
Łusakowska A., Vizueta J., Sabat D., Lutyk D., Lower M., Piekutowska-Abramczuk D.,
Kaniak-Golik A., Pronicka E., Kamińska A., Bartnik E., Golik P., Tońska K. Yeast
model analysis of novel polymerase gamma variants found in patients with autosomal
recessive mitochondrial disease. Hum Genet. 134 (2015): 951-66.
Swój wkład oceniam na 10%. Uczestniczyłam w ustawianiu testów mutagenezy
mitochondrialnej drożdży i analizie wyników.
W pracach Rempoła et al. (2000)103i Rempoła et al. (2001)104 zostały opisane wyniki
badań, w których brałam udział jeszcze w czasie pracy doktorskiej w laboratorium prof. Piotra P.
Słonimskiego, w ramach analizy funkcjonalnej dwóch paralogicznych regulatorów fosfataz
PP2A, drożdżowych białek Rrd1 i Rrd2, których geny zostały odkryte w wyniku
sekwencjonowania genomu S. cerevisiae, uczestniczących w regulacji przepływu sygnałów na
przecięciu kilku ważnych konserwowanych w komórkach eukariotycznych szlaków transdukcji
sygnałów, szlaku TOR i szlaków kinaz MAP. Praca Kaniak et al. (2004)105 powstała na
podstawie wyników badań nad ścieżkami wykrywania glukozy w komórkach drożdży, które
przeprowadziłam podczas kilkuletniego stażu podoktorskiego w laboratorium prof. Marka
Johnston w Washington University School of Medicine w St. Louis (USA). W pracach
badawczych, które zostały opisane w publikacji Rogowska et al. (2006)106, brałam udział w
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
30
początkowej analizie genetycznej opisywanych mutacji supresorowych, która została później
rozwinięta, pozwalając na ukazanie konieczności utrzymania w mitochondrium równowagi
miedzy syntezą i degradacją RNA dla efektywnej ekspresji genów mitochondrialnych. W r. 2010
wzięłam udział w napisaniu pierwszej pracy przeglądowej, której część była poświęcona
mechanizmom utrzymania sekwencji i integralności mtDNA w komórkach drożdży S.
cerevisiae107. Brałam udział w jeszcze jednej pracy badawczej o tematyce związanej ze
stabilnością mtDNA w komórkach drożdży, w której zbadano w układzie drożdżowym wpływ
mutacji w mitochondrialnej polimerazie Mip1, odpowiadających mutacjom w ortologicznej
polimerazie POLG1 zidentyfikowanym u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi, na
stabilność genomu mitochondrialnego108. Szczepy z opisanymi w tej pracy allelami drożdżowej
Mip1 planuję wykorzystać w nowym projekcie badawczym, który uzyskał dofinansowanie w
roku 2017 z NCN w ramach OPUS 25.
5. Dane bibliometryczne. W sumie 18 publikacji, z czego po doktoracie 12, w tym w skład osiągnięcia wchodzi 6. Razem
400 cytowań (377 bez autocytowań), z czego prac po doktoracie 278, w tym prac wchodzących
w skład osiągnięcia 72.
Indeks Hirscha 10 (Web of Science v.5.26.2, dn. 6.12.2017).
Sumaryczny IF 71,114, z czego prac po doktoracie 58,04, w tym prac wchodzących w skład
osiągnięcia 33,934. IF z roku publikacji (dla prac sprzed 1997 brano IF1997, a dla pracy z 2017
IF2016).
Wszystkie publikacje są z listy A MNiSW oraz listy JCR. W sumie 540 punktów MNiSW, z
czego prac po doktoracie 400 punktów MNiSW, w tym prac wchodzących w skład osiągnięcia
225 punktów MNiSW (punktacja według aktualnej listy MNiSW na rok 2016).
BIBLIOGRAFIA
Prace habilitantki wchodzące w skład osiągnięcia oznaczone wytłuszczoną czcionką; dla innych prac habilitantki
wyróżnione taką czcionką numery.
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
31
1 Nunnari, J. et al. Mitochondrial transmission during mating in Saccharomyces cerevisiae is determined by mitochondrial fusion and fission and the intramitochondrial segregation of mitochondrial DNA. Molecular Biology of the Cell 8, 1233-1242 (1997).
2 Luck, D. J. Formation of mitochondria in Neurospora crassa. A quantitative radioautographic study. The Journal of Cell Biology 16, 483-499 (1963).
3 Warren, G. & Wickner, W. Organelle inheritance. Cell 84, 395-400 (1996). 4 Lill, R. et al. The role of mitochondria and the CIA machinery in the maturation of cytosolic and nuclear
iron-sulfur proteins. Eur J Cell Biol 94, 280-291, doi:10.1016/j.ejcb.2015.05.002 (2015). 5 Boyer, P. D. The ATP synthase--a splendid molecular machine. Annual Review of Biochemistry 66, 717-
749, doi:10.1146/annurev.biochem.66.1.717 (1997). 6 Allen, J. F. The function of genomes in bioenergetic organelles. Philosophical Transactions of the Royal
Society of London. Series B, Biological sciences 358, 19-37; doi:10.1098/rstb.2002.1191 (2003). 7 Nass, M. M. & Nass, S. Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. I. Fixation and Electron
Staining Reactions. The Journal of Cell Biology 19, 593-611 (1963). 8 Schatz, G., Haslbrunner, E. & Tuppy, H. Deoxyribonucleic Acid Associated with Yeast Mitochondria.
Biochemical and Biophysical Research Communications 15, 127-132 (1964). 9 Sagan, L. On the origin of mitosing cells. Journal of Theoretical Biology 14, 255-274 (1967). 10 Margulis, L. Origin of Eukaryotic Cells. (1970). 11 Spang, A. et al. Complex archaea that bridge the gap between prokaryotes and eukaryotes. Nature 521,
173-179, doi:10.1038/nature14447 (2015). 12 Gray, M. W. Mitochondrial evolution. Cold Spring Harb Perspect Biol 4, a011403,
doi:10.1101/cshperspect.a011403 (2012). 13 Muller, M. et al. Biochemistry and evolution of anaerobic energy metabolism in eukaryotes. Microbiology
and molecular biology reviews : MMBR 76, 444-495, doi:10.1128/MMBR.05024-11 (2012). 14 Lane, N. & Martin, W. The energetics of genome complexity. Nature 467, 929-934,
doi:10.1038/nature09486 (2010). 15 Gray, M. W. & Doolittle, W. F. Has the endosymbiont hypothesis been proven? Microbiological Reviews
46, 1-42 (1982). 16 Burger, G., Gray, M. W. & Lang, B. F. Mitochondrial genomes: anything goes. Trends in Genetics : TIG
19, 709-716 (2003). 17 Lang, B. F. et al. An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature
387, 493-497, doi:10.1038/387493a0 (1997). 18 Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. The Biochemical Journal 417, 1-13,
doi:10.1042/BJ20081386 (2009). 19 Bidle, K. D. & Falkowski, P. G. Cell death in planktonic, photosynthetic microorganisms. Nature Reviews.
Microbiology 2, 643-655, doi:10.1038/nrmicro956 (2004). 20 Bartosz, G. Druga twarz tlenu. (Wydawnictwo Naukowe PWN, 2004). 21 Dizdaroglu, M., Kirkali, G. & Jaruga, P. Formamidopyrimidines in DNA: Mechanisms of formation,
repair, and biological effects. Free Radical Bio Med 45, 1610-1621, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.07.004 (2008).
22 Shibutani, S., Takeshita, M. & Grollman, A. P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature 349, 431-434, doi:10.1038/349431a0 (1991).
23 Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P. & Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med 107, 13-34, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2016.12.049 (2017).
24 Kumar, A. & Snyder, M. Emerging technologies in yeast genomics. Nature Reviews. Genetics 2, 302-312, doi:10.1038/35066084 (2001).
25 Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics 2, 659-668, doi:10.1038/35088500 (2001).
26 Ephrussi, B., Hottinguer, H., and Tavlitzki, J. (1949). Ann. Inst. Pasteur & (Paris) 77. Action de l’acriflovine sur les levures. II-Etude genetique de mutant ‘‘petite colonie’’. Ann. Inst. Pasteur (Paris) 77, 419-450 (1949).
27 Dujon, B. in The molecular biology of the yeast Saccharomyces: life cycle and inheritance 505-635 (Cold Spring Harb. Lab., N.Y., 1981).
28 Contamine, V. & Picard, M. Maintenance and integrity of the mitochondrial genome: a plethora of nuclear genes in the budding yeast. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR 64, 281-315 (2000).
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
32
29 Dimitrov, L. N., Brem, R. B., Kruglyak, L. & Gottschling, D. E. Polymorphisms in multiple genes contribute to the spontaneous mitochondrial genome instability of Saccharomyces cerevisiae S288C strains. Genetics 183, 365-383, doi:10.1534/genetics.109.104497 (2009).
30 Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology 350, 3-41 (2002). 31 Merz, S. & Westermann, B. Genome-wide deletion mutant analysis reveals genes required for respiratory
growth, mitochondrial genome maintenance and mitochondrial protein synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology 10, R95, doi:10.1186/gb-2009-10-9-r95 (2009).
32 Sor, F. & Fukuhara, H. Erythromycin and spiramycin resistance mutations of yeast mitochondria: nature of the rib2 locus in the large ribosomal RNA gene. Nucleic Acids Research 12, 8313-8318 (1984).
33 Vanderstraeten, S., Van den Brule, S., Hu, J. & Foury, F. The role of 3'-5' exonucleolytic proofreading and mismatch repair in yeast mitochondrial DNA error avoidance. The Journal of Biological Chemistry 273, 23690-23697 (1998).
34 John, U. P. & Nagley, P. Amino acid substitutions in mitochondrial ATPase subunit 6 of Saccharomyces cerevisiae leading to oligomycin resistance. Febs Lett 207, 79-83 (1986).
35 Nagley, P., Hall, R. M. & Ooi, B. G. Amino acid substitutions in mitochondrial ATPase subunit 9 of Saccharomyces cerevisiae leading to oligomycin or venturicidin resistance. Febs Lett 195, 159-163 (1986).
36 Kaniak, A. et al. Msh1p counteracts oxidative lesion-induced instability of mtDNA and stimulates mitochondrial recombination in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair 8, 318-329 (2009).
37 Malc, E., Dzierzbicki, P., Kaniak, A., Skoneczna, A. & Ciesla, Z. Inactivation of the 20S proteasome maturase, Ump1p, leads to the instability of mtDNA in Saccharomyces cerevisiae. Mutation Research 669, 95-103, doi:10.1016/j.mrfmmm.2009.05.008 (2009).
38 Kaniak-Golik, A., Kuberska, R., Dzierzbicki, P., Sledziewska-Gojska, E. Activation of Dun1 in response to nuclear DNA instability accounts for the increase in mitochondrial point mutations in Rad27/FEN1 deficient S. cerevisiae. PloS ONE (2017).
39 Steele, D. F., Butler, C. A. & Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 5253-5257 (1996).
40 Fox, T. D. Natural variation in the genetic code. Annual Review of Genetics 21, 67-91, doi:10.1146/annurev.ge.21.120187.000435 (1987).
41 Bonnefoy, N. & Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Molecular & General Genetics : MGG 262, 1036-1046 (2000).
42 Sia, E. A. et al. Analysis of microsatellite mutations in the mitochondrial DNA of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 250-255 (2000).
43 Strand, M. K. & Copeland, W. C. Measuring mtDNA mutation rates in Saccharomyces cerevisiae using the mtArg8 assay. Methods in Molecular Biology 197, 151-157, doi:10.1385/1-59259-284-8:151 (2002).
44 Phadnis, N., Sia, R. A. & Sia, E. A. Analysis of repeat-mediated deletions in the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 171, 1549-1559, doi:10.1534/genetics.105.047092 (2005).
45 Dzierzbicki, P., Kaniak-Golik, A., Malc, E., Mieczkowski, P. & Ciesla, Z. The generation of oxidative stress-induced rearrangements in Saccharomyces cerevisiae mtDNA is dependent on the Nuc1 (EndoG/ExoG) nuclease and is enhanced by inactivation of the MRX complex. Mutation Research 740, 21-33, doi:10.1016/j.mrfmmm.2012.12.004 (2012).
46 Chen, X. J. & Butow, R. A. The organization and inheritance of the mitochondrial genome. Nature Reviews. Genetics 6, 815-825, doi:10.1038/nrg1708 (2005).
47 Kucej, M. & Butow, R. A. Evolutionary tinkering with mitochondrial nucleoids. Trends in Cell Biology 17, 586-592, doi:10.1016/j.tcb.2007.08.007 (2007).
48 Foury, F. Cloning and sequencing of the nuclear gene MIP1 encoding the catalytic subunit of the yeast mitochondrial DNA polymerase. The Journal of Biological Chemistry 264, 20552-20560 (1989).
49 Foury, F. & Vanderstraeten, S. Yeast mitochondrial DNA mutators with deficient proofreading exonucleolytic activity. The EMBO Journal 11, 2717-2726 (1992).
50 Chakraborty, U. & Alani, E. Understanding how mismatch repair proteins participate in the repair/anti-recombination decision. FEMS Yeast Research 16, doi:10.1093/femsyr/fow071 (2016).
51 Kaniak-Golik, A. & Skoneczna, A. Mitochondria-nucleus network for genome stability. Free Radic Biol Med 82, 73-104, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2015.01.013 (2015).
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
33
52 Boiteux, S. & Jinks-Robertson, S. DNA repair mechanisms and the bypass of DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 193, 1025-1064, doi:10.1534/genetics.112.145219 (2013).
53 Reenan, R. A. & Kolodner, R. D. Characterization of insertion mutations in the Saccharomyces cerevisiae MSH1 and MSH2 genes: evidence for separate mitochondrial and nuclear functions. Genetics 132, 975-985 (1992).
54 Chi, N. W. & Kolodner, R. D. The effect of DNA mismatches on the ATPase activity of MSH1, a protein in yeast mitochondria that recognizes DNA mismatches. The Journal of Biological Chemistry 269, 29993-29997 (1994).
55 Chi, N. W. & Kolodner, R. D. Purification and characterization of MSH1, a yeast mitochondrial protein that binds to DNA mismatches. The Journal of Biological Chemistry 269, 29984-29992 (1994).
56 Studamire, B., Price, G., Sugawara, N., Haber, J. E. & Alani, E. Separation-of-function mutations in Saccharomyces cerevisiae MSH2 that confer mismatch repair defects but do not affect nonhomologous-tail removal during recombination. Molecular and Cellular Biology 19, 7558-7567 (1999).
57 Koprowski, P., Fikus, M. U., Mieczkowski, P. & Ciesla, Z. A dominant mitochondrial mutator phenotype of Saccharomyces cerevisiae conferred by msh1 alleles altered in the sequence encoding the ATP-binding domain. Molecular Genetics and Gnomics : MGG 266, 988-994, doi:10.1007/s00438-001-0621-x (2002).
58 Ling, F., Hori, A. & Shibata, T. DNA recombination-initiation plays a role in the extremely biased inheritance of yeast [rho-] mitochondrial DNA that contains the replication origin ori5. Molecular and Cellular Biology 27, 1133-1145, doi:10.1128/MCB.00770-06 (2007).
59 Ling, F. et al. Din7 and Mhr1 expression levels regulate double-strand-break-induced replication and recombination of mtDNA at ori5 in yeast. Nucleic Acids Research 41, 5799-5816, doi:10.1093/nar/gkt273 (2013).
60 Lecrenier, N. & Foury, F. New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man. Gene 246, 37-48 (2000).
61 Prasai, K., Robinson, L. C., Scott, R. S., Tatchell, K. & Harrison, L. Evidence for double-strand break mediated mitochondrial DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research 45, 7760-7773, doi:10.1093/nar/gkx443 (2017).
62 Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T. & Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 192, 319-360, doi:10.1534/genetics.112.140467 (2012).
63 Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A. & Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. The EMBO journal 26, 2339-2349, doi:10.1038/sj.emboj.7601681 (2007).
64 Bandy, B. & Davison, A. J. Mitochondrial mutations may increase oxidative stress: implications for carcinogenesis and aging? Free Radic Biol Med 8, 523-539 (1990).
65 Lipford, J. R. & Deshaies, R. J. Diverse roles for ubiquitin-dependent proteolysis in transcriptional activation. Nature Cell Biology 5, 845-850, doi:10.1038/ncb1003-845 (2003).
66 Braun, R. J. & Westermann, B. With the Help of MOM: Mitochondrial Contributions to Cellular Quality Control. Trends in Cell Biology 27, 441-452, doi:10.1016/j.tcb.2017.02.007 (2017).
67 Vasudevarao, M. D. et al. Naphthoquinone-mediated inhibition of lysine acetyltransferase KAT3B/p300, basis for non-toxic inhibitor synthesis. The Journal of Biological Chemistry 289, 7702-7717, doi:10.1074/jbc.M113.486522 (2014).
68 Lee, K. K. & Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes: one size doesn't fit all. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 8, 284-295, doi:10.1038/nrm2145 (2007).
69 Flattery-O'Brien, J. A. & Dawes, I. W. Hydrogen peroxide causes RAD9-dependent cell cycle arrest in G2 in Saccharomyces cerevisiae whereas menadione causes G1 arrest independent of RAD9 function. The Journal of Biological Chemistry 273, 8564-8571 (1998).
70 Petrova, V. Y., Drescher, D., Kujumdzieva, A. V. & Schmitt, M. J. Dual targeting of yeast catalase A to peroxisomes and mitochondria. The Biochemical Journal 380, 393-400, doi:10.1042/BJ20040042 (2004).
71 Kathiresan, M., Martins, D. & English, A. M. Respiration triggers heme transfer from cytochrome c peroxidase to catalase in yeast mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 17468-17473, doi:10.1073/pnas.1409692111 (2014).
72 Letavayova, L. et al. Relative contribution of homologous recombination and non-homologous end-joining to DNA double-strand break repair after oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair 5, 602-610, doi:10.1016/j.dnarep.2006.01.004 (2006).
73 Kalifa, L. et al. Mitochondrial genome maintenance: roles for nuclear nonhomologous end-joining proteins in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 190, 951-964, doi:10.1534/genetics.111.138214 (2012).
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
34
74 Dake, E., Hofmann, T. J., McIntire, S., Hudson, A. & Zassenhaus, H. P. Purification and properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry 263, 7691-7702 (1988).
75 Büttner, S. et al. Endonuclease G regulates budding yeast life and death. Molecular Cell 25, 233-246 (2007).
76 Zassenhaus, H. P. & Denniger, G. Analysis of the role of the NUC1 endo/exonuclease in yeast mitochondrial DNA recombination. Current Genetics 25, 142-149 (1994).
77 Hori, A., Yoshida, M., Shibata, T. & Ling, F. Reactive oxygen species regulate DNA copy number in isolated yeast mitochondria by triggering recombination-mediated replication. Nucleic Acids Research 37, 749-761, doi:10.1093/nar/gkn993 (2009).
78 Bambara, R. A., Murante, R. S. & Henricksen, L. A. Enzymes and reactions at the eukaryotic DNA replication fork. The Journal of Biological Chemistry 272, 4647-4650 (1997).
79 Rasmussen, A. K., Chatterjee, A., Rasmussen, L. J. & Singh, K. K. Mitochondria-mediated nuclear mutator phenotype in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research 31, 3909-3917 (2003).
80 Veatch, J. R., McMurray, M. A., Nelson, Z. W. & Gottschling, D. E. Mitochondrial dysfunction leads to nuclear genome instability via an iron-sulfur cluster defect. Cell 137, 1247-1258 (2009).
81 Lill, R. et al. The role of mitochondria in cellular iron-sulfur protein biogenesis and iron metabolism. Bba-Mol Cell Res 1823, 1491-1508, doi:10.1016/j.bbamcr.2012.05.009 (2012).
82 Pijuan, J., Maria, C., Herrero, E. & Belli, G. Impaired mitochondrial Fe-S cluster biogenesis activates the DNA damage response through different signaling mediators. Journal of Cell Science 128, 4653-4665, doi:10.1242/jcs.178046 (2015).
83 Zhang, Y. et al. Dre2, a conserved eukaryotic Fe/S cluster protein, functions in cytosolic Fe/S protein biogenesis. Molecular and Cellular Biology 28, 5569-5582, doi:10.1128/MCB.00642-08 (2008).
84 Netz, D. J. et al. Tah18 transfers electrons to Dre2 in cytosolic iron-sulfur protein biogenesis. Nature Chemical Biology 6, 758-765, doi:10.1038/nchembio.432 (2010).
85 Sanvisens, N. et al. Yeast Dun1 kinase regulates ribonucleotide reductase inhibitor Sml1 in response to iron deficiency. Molecular and Cellular Biology 34, 3259-3271, doi:10.1128/MCB.00472-14 (2014).
86 Vernis, L. et al. A newly identified essential complex, Dre2-Tah18, controls mitochondria integrity and cell death after oxidative stress in yeast. PloS ONE 4, e4376, doi:10.1371/journal.pone.0004376 (2009).
87 Wissing, S. et al. An AIF orthologue regulates apoptosis in yeast. The Journal of Cell Biology 166, 969-974, doi:10.1083/jcb.200404138 (2004).
88 Skoneczna, A., Kaniak, A. & Skoneczny, M. Genetic instability in budding and fission yeast-sources and mechanisms. FEMS Microbiology Reviews 39, 917-967, doi:10.1093/femsre/fuv028 (2015).
89 Rhind, N. et al. Comparative functional genomics of the fission yeasts. Science 332, 930-936, doi:10.1126/science.1203357 (2011).
90 Olsson, I. & Bjerling, P. Advancing our understanding of functional genome organisation through studies in the fission yeast. Current Genetics 57, 1-12, doi:10.1007/s00294-010-0327-x (2011).
91 Flores, C. L., Rodriguez, C., Petit, T. & Gancedo, C. Carbohydrate and energy-yielding metabolism in non-conventional yeasts. FEMS Microbiology Reviews 24, 507-529 (2000).
92 Overkamp, K. M. et al. In vivo analysis of the mechanisms for oxidation of cytosolic NADH by Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Journal of bacteriology 182, 2823-2830 (2000).
93 Chiron, S. et al. Studying mitochondria in an attractive model: Schizosaccharomyces pombe. Methods in Molecular Biology 372, 91-105, doi:10.1007/978-1-59745-365-3_7 (2007).
94 Herrero, E., Ros, J., Belli, G. & Cabiscol, E. Redox control and oxidative stress in yeast cells. Biochim Biophys Acta 1780, 1217-1235, doi:10.1016/j.bbagen.2007.12.004 (2008).
95 Merico, A., Sulo, P., Piskur, J. & Compagno, C. Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex. The FEBS Journal 274, 976-989, doi:10.1111/j.1742-4658.2007.05645.x (2007).
96 Schäfer, B. Genetic conservation versus variability in mitochondria: the architecture of the mitochondrial genome in the petite-negative yeast Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics 43, 311-326, doi:10.1007/s00294-003-0404-5 (2003).
97 Bullerwell, C. E., Leigh, J., Forget, L. & Lang, B. F. A comparison of three fission yeast mitochondrial genomes. Nucleic Acids Research 31, 759-768 (2003).
98 Dunn, C. D., Lee, M. S., Spencer, F. A. & Jensen, R. E. A genomewide screen for petite-negative yeast strains yields a new subunit of the i-AAA protease complex. Molecular Biology of the Cell 17, 213-226, doi:10.1091/mbc.E05-06-0585 (2006).
Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat
35
99 Shedge, V., Arrieta-Montiel, M., Christensen, A. C. & Mackenzie, S. A. Plant mitochondrial recombinationsurveillance requires unusual RecA and MutS homologs. Plant Cell 19, 1251-1264,doi:10.1105/tpc.106.048355 (2007).
100 Gerhold, J. M., Aun, A., Sedman, T., Joers, P. & Sedman, J. Strand invasion structures in the invertedrepeat of Candida albicans mitochondrial DNA reveal a role for homologous recombination in replication.Molecular Cell 39, 851-861, doi:10.1016/j.molcel.2010.09.002 (2010).
101 Rempola, B. et al. Functional analysis of RRD1 (YIL153w) and RRD2 (YPL152w), which encode twoputative activators of the phosphotyrosyl phosphatase activity of PP2A in Saccharomyces cerevisiae.Molecular & General Genetics : MGG 262, 1081-1092 (2000).
102 Rempola, B., Kaniak, A., di Rago, J. P. & Rytka, J. Anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiaealleviates the lethal effect of phosphotyrosyl phosphatase activators depletion. Acta Biochimica Polonica48, 1043-1049 (2001).
103 Kaniak, A., Xue, Z., Macool, D., Kim, J. H. & Johnston, M. Regulatory network connecting two glucosesignal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic Cell 3, 221-231 (2004).
104 Rogowska, A. T. et al. Balance between transcription and RNA degradation is vital for Saccharomycescerevisiae mitochondria: reduced transcription rescues the phenotype of deficient RNA degradation.Molecular Biology of the Cell 17, 1184-1193, doi:10.1091/mbc.E05-08-0796 (2006).
105 Lipinski, K. A., Kaniak-Golik, A. & Golik, P. Maintenance and expression of the S. cerevisiaemitochondrial genome--from genetics to evolution and systems biology. Biochim Biophys Acta 1797, 1086-1098, doi:10.1016/j.bbabio.2009.12.019 (2010).
106 Kaliszewska, M. et al. Yeast model analysis of novel polymerase gamma variants found in patients withautosomal recessive mitochondrial disease. Human Genetics 134, 951-966, doi:10.1007/s00439-015-1578-x (2015).
Warszawa, 27.12.2017 Dr Aneta Kaniak-Golik