Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych

De!nicja genu

Region DNA, który określa dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA. Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami. (de!nicja niedoskonała, trudno jednoznacznie zde!niować gen)

Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Współczesne de!nicje odnoszą się do produktu, jakim jest transkrypt, i nie biorą pod uwagę białka

•  Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki. Oto lista genów, które nie pasują do ‘de!nicji odnoszącej się do transkryptu’.

Geny kodujący rybosomowe RNA ( 18S; 5,8 S, 28S ) jest transkrybowany w postaci pre-rRNA 45S, następnie zachodzi rozcinanie cząsteczki RNA na fragmenty odpowiadające poszczególnym rodzajom rRNA. Czy jest więc sens w tej sytuacji odnosić się do ko-transkrybowanych genów, jako do ‘pojedynczego genu’? Zamiast tego, ‘genami’ możemy nazwać odcinki DNA odpowiadające pojedynczym jednostkom funkcjonalnym

•  Trans-splicing: Istnieją geny ‘ w kawałkach’. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA.

•  Geny nakładające się: Niektóre ‘geny’ nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów.

•  Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość informacyjna ‘genu’ jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych ‘genów’

Klasyczne wyobrażenie genu – fragment DNA, który koduje funkcjonalny mRNA

Wszystkie transkrypty mRNA mają niekodujące fragmenty 5’ i 3’ końcowe

Etapy ekspresji/poziomy regulacji

•  struktura chromatyny

•  transkrypcja

•  obróbka i kontrola jakości RNA

•  transport RNA

•  degradacja RNA

•  translacja

•  mody!kacje post-translacyjne

•  degradacja białka

Transkrypcja

•  Przetwarzanie informacji z zapisanej w DNA na zapisaną w RNA

•  Katalizowana przez zależne od DNA RNA-polimerazy

•  Podlega ścisłej regulacji

Regulacja transkrypcji

•  Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji

•  Czynniki cis – sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy)

•  Czynniki trans – białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis)

Czynniki cis

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

•  Enhancery stymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję . •  Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt. •  Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie.

–  Mogą działać na odległość w stosunku do promotora –  Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie

•  Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specy!cznych czynników transkrypcyjnych.

Czynniki trans

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota

•  Polimeraza mitochondrialna

polimeraza produkty wrażliwość na α-amanitynę

Polimeraza I geny rRNA (18S; 28S; 5,8S)

nie wrażliwa

Polimeraza II hn/mRNA, większość snRNA (U1, U2, U4, U5), miRNA

bardzo wrażliwa

Polimeraza III małe RNA: tRNA, snoRNA, 5S rRNA, U6 snRNA

umiarkowanie wrażliwa

CTD- C końcowa domena Pol II, o krytycznym znaczeniu dla transkrypcji

Skład podjednostkowy 3 głównych polimeraz RNA Eukaryota

Polimeraza RNA E.coli Eukariotyczne polimerazy RNA

Podjednostki typu β i β’

Podjednostki typu α

Podjednostki wspólne

Podjednostki specy!czne dla danej polimerazy

Polimeraza II

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA.

Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji.

Do tego celu niezbędna jest obecność OGÓLNYCH CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH

•  U prokariontów geny są ciągłe, tj. kolinearne z ich mRNA. •  U wyższych eukariontów geny są nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mRNA. •  Części genu ulegające ekspresji noszą nazwę eksonów, zaś sekwencje przedzielające

eksony – intronów.

Inicjacja transkrypcji

Podstawowe elementy cis

•  Promotor rdzeniowy – wiąże czynniki ogólne (podstawowe) kompleksu polimerazy II –  element TATA (wiązanie TBP) –  miejsce inicjacji

•  Elementy promotora podstawowego – wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów i zapewniające podstawowy poziom transkrypcji

–  element CAAT –czynniki NF-1 i NF-Y –  element GC – czynnik Sp1 –  oktamer – czynnik Oct1

Inicjacja transkrypcji (czynniki cis DNA)

Inicjacja transkrypcji (czynniki trans - białka)

•  Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie ‘TATA-box’ TBP- składnik ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID

Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Pierwszy etap inicjacji transkrypcji przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID

Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC – preinitiation complex)

Aktywność transkrypcyjna na poziomie podstawowym, jeszcze nie regulatorowym

-30" +1"TATA" Inr"

IIB"

RNA "polimeraza II"

TFIID"}"TBP" TAFs"

IIB"

IIE"Pol IIa"

or TBP"IIA"

IIF"

helicase"protein kinase"IIH"

TATA" Inr"IIA" Pol IIa"IIF"IIE"Kompleks preinicjacyjny"

TATA" Inr"IIA"IIB" Pol IIa"IIF"IIE"ATP - hydroliza"

Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony"

IIH"

IIH" PIC

Aktywowany PIC

TFIIA, B, D,E, H, F – Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF)

Czynniki TAF – składowe TFIID (ang. TBP Associated Factors)

TATA – TATA box – sekwencja TATAAA rozpoznawana przez białko TBP

Inr – sekwencja inicjatorowa rozpoznawana przez białka TAF

CTD

Polimeryzacja pierwszych kilku nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia promotora.

Regulacja inicjacji transkrypcji

Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory

•  Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

•  Specy!czne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

Specy!czne elementy cis promotorów i enhancerów

•  Moduły odpowiedzi na sygnał –  np. moduł CRE – odpowiedź na cAMP (czynnik transkrypcyjny CREB)

•  Moduły specy!czne dla komórek i tkanek –  np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik MyoD; moduł

limfoblastoidalny – czynnik NF-κB •  Moduły rozwojowe

–  np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster

Regulacja kombinatoryczna •  W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów

cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka

Promotor ludzkiego genu insuliny

Alternatywny start transkrypcji

•  Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specy!cznych tkankowo

•  Dzięki temu z jednego powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach

Gen dystrofiny człowieka

móżdżek mięśnie siatkówka kom. Schwanna pozostałe tkanki

kora

Specy!czne czynniki transkrypcyjne

Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji

domena wiążąca DNA

domena odpowiedzialna za dimeryzację

domena aktywująca

domena regulatorowa

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Domeny wiążące DNA

•  Palce cynkowe •  Helisa-skręt-helisa (H-T-H) – np. homeodomena, domena

HMG, domena PAU •  Helisa-pętla-helisa (H-L-H) •  i wiele innych

Domeny wiążące DNA

Homeodomena zawiera domenę HTH (helisa-skręt-helisa)

Palec cynkowy

atlasgeneticsoncology.org/Deep/Images/TFfig2.jpg

Czynnik transkrypcyjny SP1

Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych

Suwak leucynowy •  protoonkogeny rodziny c-Fos i c-Jun •  rodzina CREB – (cAMP response element binding protein)

Represory

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory

•  Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

•  Specy!czne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

•  Koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego –  Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II

Mediator – kompleks białkowy

Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961

©2007 by National Academy of Sciences

Polimeraza II RNA wraz z Mediatorem

Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961

©2007 by National Academy of Sciences

•  niezbędny do regulowanej transkrypcji

•  absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych

•  oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA

•  ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji

Molecular Biology of the Cell Forth Edition

Elongacja transkrypcji genów eukariotycznych jest ściśle związana z obróbką RNA

Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981

Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne

Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS)

Hyperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II i zaznacza przejście od inicjacji do elongacji transkrypcji.

Zatrzymanie w pobliżu promotora i uwolnienie promotora; przejście do fazy produktywnej transkrypcji – jest zależne od fosforylacji CTD

Terminacja i poliadenylacja

CPSF- kompleks białkowy, czynnik specy!czności cięcia i poliadenylacji

Terminacja i poliadenylacja

CstF – czynniki stymulacji cięcia

Poliadenylacja

•  Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA •  Dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące histony

Chromatyna - podstawowy element regulacji

transkrypcji genów eukariotycznych

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/nucleosome.html

http://www.us.elsevierhealth.com/SIMON/Pollard/favorite!gs/W_Earnshaw_favorite_!gures.html

Kolejne stopnie kondensacji chromatyny

Heterochromatyna

konstytutywna – jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów)

fakultatywna – ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego,

W mitozie cały DNA występuje jako heterochromatyna

Euchromatyna – to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie

Dwa podstawowe stany chromatyny

Domeny funkcjonalne i izolatory

•  Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie

•  Białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów)

Izolator

Izolator

Obszary kontrolujące loci

•  LCR (locus control regions) – utrzymują domeny funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie

Chromatyna – preparaty mikroskopowe

• http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus2.htm

Struktura chromatyny

DNA + związane białka 1. Histony (małe, zasadowe) 2. Niehistonowe białka regulatorowe

We wszystkich stanach chromatyny białka są związane z DNA, a różnice strukturalne wynikają z różnego stopnia upakowania

PODSTAWOWE BIAŁKA BUDUJĄCE CHROMATYNĘ TO HISTONY najbardziej konserwowane ewolucyjnie białka u Eucariota

Histony H3 i H4 : bogate w argininy, najbardziej konserwowane ewolucyjnie sekwencje białkowe

Histony H2A i H2B : wzbogacone w lizyny, sekwencje konserwowane ewolucyjnie

Histon H1 : bardzo bogaty w lizyny, sekwencja białkowa słabo konserwowana ewolucyjnie, związany z nukleosomem poza jego rdzeniem

Struktura Krystaliczna Nukleosomu

Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60

Nukleosom zbudowany jest z rdzenia białkowego, z około 147 bp DNA owiniętego wokół rdzenia oraz z 50 bp DNA łącznikowego

Rdzeń składa się z dwóch kopii każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4

Poza rdzeniem nukleosomu dołączony jest histon H1

DNA

histon H1

histon H2A

histon H2B

histon H3

histon H4

http://fermat-2.cer.jhu.edu/~as410610/lecture_pdf/What_is_the_organization_of_a_eukaryote_.PDF

Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961

©2007 by National Academy of Sciences

Proces transkrypcji genów eukariotycznych zachodzi w chromatynie.

Regulacja dostępności chromatyny

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Mody!kacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji

Kowalencyjne mody!kacje histonów rdzeniowych

Nukleosom

Zasadowe N- i C-końce histonowe wystają na zewnątrz nukleosomu, ponad DNA owinięty na oktamerze białkowym. Są miejscem wielu potranslacyjnych mody!kacji

Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 809-814 (October 2003) Timeline: Chromatin history: our view from the bridge Donald E. Olins1 & Ada L. Olins

•  Fosforylacja •  Acetylacja •  Metylacja •  ADP-rybozylacja •  Ubikwitynylacja •  Sumoylacja

Mody!kacje histonów rdzeniowych

Nature Cell Biology Vol, 5 May, 2003

Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:172–183

S/T

P

S/T kinazy

fosfatazy

fosforylacja

K

Ac K acetylacja

Acetylotransferazy histonowe (HAT)

Deacetylazy histonowe (HDAC)

K/R K/R

Me

metylacja metylazy

demetylazy

Enzymy mody!kujące histony rdzeniowe zależnie od ich aktywności mogą być aktywatorami bądź represorami transkrypcji

Po-translacyjne mody!kacje histonów

wg. B.Turner, Cell 2002

Mechanizm działania mody!kacji potranslacyjnych białek histonowych

Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny

acetylacja

deacetylacja

Chromatyna staje się dostępna dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz

Mody!kowane histony rekrutują specy!czne białka rozpoznających określone mody!kacje

Tony Kozaurides, Cell 128 (2007) 693-705

Mody!kowane histony hamują wiązanie białek z danym rejonem chromatyny

Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981

Typowy wzór modyfikacji histonowych na aktywnym transkrypcyjnie genie

Mody!kacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji

Remodeling (przebudowywanie) struktury chromatyny

Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych

Aktywność kompleksów przebudowujących chromatynę zależy od ATP, w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA.

Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji)

Kompleksy przebudowujące chromatynę zależne od ATP składają się z wielu białkowych podjednostek

Drożdżowy SWI/SNF

11 białek

potrzebny do ekspresji genów decydujących o typie koniugacyjnym drożdży (switching), oraz ekspresji genów regulujących metabolizm

sacharozy (sucrose non-fermenting) niektóre supresory mutacji swi/snf są mutacjami w genach kodujących histony aby aktywować transkrypcję regulowanych przez siebie genów kompleks SWI/SNF oddziałuje z chromatyną

kompleks jest ATPazą

SWI/SNF – wielo-podjednostkowy kompleks remodelujący chromatynę

ATP - zależna przebudowa chromatyny

Chromatin remodeling: insights and intrigue from single-molecule studies Bradley R Cairns Nature Structural and Molecular Biology 14: 989-996, 2007

Ślizganie lub przesunięcie oktameru histonowego w nowe miejsce, odsłonięcie DNA

Usunięcie oktameru histonowego z obszaru DNA

Chromatin remodeling: insights and intrigue from single-molecule studies Bradley R Cairns Nature Structural and Molecular Biology 14: 989-996, 2007

Usunięcie dimerów H2A-H2B, pozostawienie jedynie centralnej części oktameru – tetrameru l H3-H4, odsłonięcie DNA i destabilizacja nukleosomu

ATP - zależna przebudowa chromatyny

Zastąpienie dimerów– wymiana dimeru H2A-H2B na dimer zawierający histon H2B i wariant H2A.Z (Htz1 in S. cerevisiae)

Metylacja DNA wpływa na strukturę chromatyny i reguluje proces transkrypcji genów eukariotycznych

Mechanizm metylacji DNA

Metylacja DNA przyłączenie grupy metylowej do cytozyny (u ssaków metylacji podlegają sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków ) • powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny • może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych • może powstawać de novo

metylacja DNA a struktura chromatyny podtrzymywanie metylacji DNA

Przykład ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metylacji DNA)

From Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161

Lcyc kontroluje symetrię góra-dół kwiatu; u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji

Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym

Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegajace na dziedziczeniu zmian w ekspresji genów, które są niezależne od zmian w sekwencji DNA

Metylacja DNA jest znacznikiem epigenetycznym decydującym o prawidłowym zachodzeniu piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten powstaje w rozwijającym się oocycie i jest niezbędny do utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 – koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny) Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju.

Metylacja DNA odgrywa podstawową rolę w inaktywacji chromosomu X. Dzięki inaktywacji jednego z chromosomów X, u samic tak jak i u samców aktywna jest tylko jedna kopia genów sprzężonych z płcią.

Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy jest usuwana

http://www.epigenome.org/

http://www.mecp2.org.uk/

Podstawowe mody!kacje zmieniające strukturę chromatyny

•  kowalencyjne mody!kacje histonów, np. acetylacja lub metylacja

•  ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny- zmiana konformacji nukleosomów lub ich pozycji względem DNA, np. poprzez przesunięcie oktameru histonów wzdłuż nici DNA

•  Metylacja DNA