Podstawy genetyki IVNaprawa DNA, rekombinacja, mutacje

Naprawa DNA• U E. coli częstość błędów polimerazy 1:107 wstawianych

nukleotydów

• Ogólna częstość błędów przy replikacji: 1:1010 – 1:1011 wstawianych nukleotydów

• genom ~4,6⋅106 bp, czyli błąd raz na ~2000 – 20 000 podziałów

• Za zmniejszenie częstości błędów replikacji o 3-4 rzędy wielkości odpowiadają systemy naprawy DNA

Systemy naprawy DNA• Naprawa bezpośrednia (DR) • Naprawa przez wycinanie (ER)

• Naprawa przez wycinanie zasad (BER) • Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)

• Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) • Naprawa pęknięć dwuniciowych (DSBR)

• system łączenia końców niehomologicznych (NHEJ) • rekombinacja homologiczna (HR)

Systemy naprawy DNA

Naprawa bezpośrednia• Naprawa pęknięć jednoniciowych przez ligazę • Odwrócenie reakcji alkilacji

• np. MGMT (metylotransferaza O6-metyloguanino DNA) – usuwa grupy alkilowe z atomu 6 guaniny

• Fotoreaktywacja dimerów cyklobutylowych • fotoliaza DNA

• Występuje u mikroorganizmów i wielu zwierząt, ale brak u ssaków łożyskowych, w tym u człowieka (jej rolę przejmuje system NER – tzw. naprawa ciemna)

• Wspólna cecha – bez resyntezy DNA (udziału polimeraz)

Naprawa przez wycinanie zasad (BER)

• Usunięcie uszkodzonej zasady azotowej przez specyficzną glikozydazę DNA

• Powstaje miejsce AP • Endonukleaza AP oraz fosfodiesteraza usuwają resztkę nukleotydu • Luka wypełniana jest przez polimerazę

Glikozydazy – przykłady (ssaki)

Tabela jest tylko przykładem – nie uczyć się na pamięć!

Nobel 2015 (chemia)

• Tomas Lindahl, za opisanie mechanizmu BER

Naprawa przez wycinanie nukleotydów

• U bakterii dwa systemy

• krótkich łat (wycinane ~12 nt)

• długich łat (wycinane ~ 2 kb)

• U Eukaryota

• wycinane ~25-30 nt

Xeroderma pigmentosum• Pol. skóra pergaminowata i barwnikowa • Choroba genetyczna związana z mutacjami genów kodujących białka systemu

NER (7 grup komplementacji) • U człowieka to NER odpowiada za naprawę fotoproduktów • Działanie światła słonecznego wywołuje liczne przebarwienia i nowotwory skóry • Nie ma lekarstwa – pacjenci muszą całkowicie unikać światła słonecznego

Nobel 2015 (chemia)

• Aziz Sancar, za opisanie mechanizmu NER

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)

• W odróżnieniu od DR, BER i NER nie dotyczy uszkodzeń w DNA, tylko błędów replikacji – wstawionych niewłaściwych nukleotydów (np. błędy wynikające z tautomerii zasad)

• Rozpoznawane zaburzenie podwójnej helisy, błędny nukleotyd wraz z otoczeniem (nawet do 1 kb) usuwany, po czym polimeraza uzupełnia lukę

• Problem: jak rozpoznać, która nić jest rodzicielska (i ma właściwy nukleotyd), a która potomna (z błędem)

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)

• U bakterii nić rodzicielska jest metylowana

• U Eukaryota metylacja też ma znaczenie (u ssaków, u drożdży już nie), ale są też inne mechanizmy (sprzężenie z replikacją, białka naznaczające nić rodzicielską)

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)

Nobel 2015 (chemia)

• Paul Modrich, za opisanie mechanizmu MMR

Naprawa pęknięć DNA• Pęknięcia w jednej nici są łatwe do naprawienia: polimeraza +

ligaza. Białka PARP chronią jednoniciowe fragmenty przed dalszą degradacją

• Pęknięcia dwuniciowe są trudniejsze do naprawienia

• Powstają np. w wyniku działania promieniowania jonizującego

• Blokują replikację, nienaprawione mogą doprowadzić do utraty dużych fragmentów chromosomu podczas podziału

Naprawa pęknięć dwuniciowych

• Łączenie końców niehomologicznych (NHEJ)

• Występuje u Eukaryota, uproszczony wariant może też u bakterii

System SOS u bakterii

• Przy rozegłych uszkodzeniach matrycy (miejsca AP, fotoprodukty, uszkodzone zasady)

• Białko RecA pokrywa matrycę • Polimeraza V z RecA tworzy mutasom • Replikacja zachodzi, ale generuje

wiele błędów

Rekombinacja

Rekombinacja• Procesy pękania i ponownego łączenia łańcuchów nukleotydowych

• Opisana w związku z crossing-over

• Pierwotna funkcja – naprawa pęknięć nici po replikacji, odblokowywanie widełek replikacyjnych

• Crossing-over utrzymuje chromosomy homologiczne razem – ułatwia segregację

• Bardzo ważna funkcja dla zapewnienia ewolucyjnej dynamiki genomu (wtórna)

Typy rekombinacji

• Rekombinacja homologiczna (ogólna) • zachodzi między fragmentami

DNA o znacznej homologii • pomiędzy dwiema cząsteczkami

lub w obrębie jednej • crossing-over, naprawa DNA

Typy rekombinacji

• Rekombinacja umiejscowiona • Zachodzi między cząsteczkami

mającymi jedynie krótki obszar homologii

• Regulowana przez specyficzne enzymy

• Np. integracja genomów fagowych

Typy rekombinacji• Transpozycja

• Przeniesienie fragmentu DNA z jednej pozycji w genomie w inną

• Replikatywna: przenoszona kopia sekwencji

• Konserwatywna: przenoszona sekwencja oryginalna

• Różne mechanizmy (z udziałem DNA i odp. białek, retrotranspozycja za pośrednictwem RNA itp.)

Modele rekombinacji homologicznej

• Holliday

• Meselson-Radding

Konwersja genuZmiana allelu w trakcie mejozy, zmienia rozkład z 2:2 na 3:1. Nie da się

wyjaśnić w modelu Hollidaya.

Model pęknięć dwuniciowych

Model pęknięć dwuniciowychKonwersja genu przez MMR

Możliwe jest wiele sposobów rozcięcia podwójnej struktury Hollidaya, dających wymianę nici, brak wymiany, konwersję itp

Maszyneria rekombinacyjna• Wiele różnych wariantów, niektóre enzymy zachowane od bakterii do

ssaków, inne specyficzne • Kompleks RecBCD – tworzy dwuniciową cząsteczkę z wolnym

jednoniciowym końcem. Helikaza + nukleaza • inne warianty: RecF, RecE

• RecA – wiąże koniec jednoniciowy, inwazja nici • RuvA, RuvB, RuvC – przemieszczanie się rozgałęzienia, rozłączenie

struktury Hollidaya • U eukariontów i niekt. bakterii w rozłączaniu bierze udział topoizomeraza

Rekombinacja i naprawa DNA• Naprawa pęknięć dwuniciowych

• Gdy maszyneria widełek replikacyjnych napotka miejsca z uszkodzeniami DNA, w nici potomnej powstaje luka. Replikacja często się zatrzymuje (kolaps widełek replikacyjnych)

• Naprawa polega na wykorzystaniu nieuszkodzonej cząsteczki potomnej do uratowania replikacji

• Mechanizm rekombinacji homologicznej – główna funkcja

Naprawa pęknięć przez rekombinację

• Postreplikacyjna - w fazie stacjonarnej

• Replikacyjna - zapobieganie kolapsowi replikacji przy pęknięciach matrycy

Naprawa pęknięć dwuniciowych przez rekombinację

• Pęknięcia dwuniciowe często powodowane są przez promieniowanie jonizujące, UV.

• Mutanty defektywne w rekombinacji – większa wrażliwość na promieniowanie (mutanty rad drożdży)

http://afmi1.uaa.alaska.edu/research.html

Naprawa przez rekombinacjęPróba replikacji pękniętej nici – kolaps widełek

Funkcje rekombinacji

• Naprawa pęknięć i utrzymywanie widełek replikacyjnych – najstarsza i podstawowa funkcja

• Pomaga w parowaniu chromosomów homologicznych – u Eukaryota

• Generuje różnorodność genotypów w rozmnażaniu płciowym (Eukaryota) – funkcja wtórna

Rekombinacja umiejscowiona• Przykłady

• Integracja faga (np. λ) do genomu • Wykorzystywana przez ruchome elementy genetyczne (transpozony,

wirusy, niektóre introny) • Specyficzne enzymy – rekombinazy (np. integraza λ) • Wykorzystywana w inżynierii genetycznej (system rekombinazy Cre)

• Delecje warunkowe • Usuwanie markerów selekcyjnych

Transpozycja• Nie jest odrębnym mechanizmem rekombinacji • Proces wykorzystujący rekombinację do przenoszenia fragmentów DNA • Transpozycja DNA

• replikatywna • konserwatywna

• Retrotranspozycja • Przepisanie RNA na DNA – odwrotna transkryptaza • Integracja utworzonego DNA do genomu (integrazy) • Np. retrowirusy, retrotranspozony, niektóre mobilne introny

MutacjeUjęcie genetyczne

Powstawanie mutacji - teorie

• Spontaniczne • powstają przypadkowo, środowisko może wpływać na częstość (np.

mutageny) mutacji, ale nie na to, w którym genie zachodzą

• Indukowane • powstają w konkretnym genie w odpowiedzi na czynnik selekcyjny

Test fluktuacyjny• Pojawianie się mutantów E. coli opornych

na faga T1 • Jeżeli pojawiają się w odpowiedzi na

kontakt z fagiem, to fluktuacje liczby opornych kolonii z każdej hodowli będą niewielkie

• Jeżeli pojawiają się spontanicznie, to liczba opornych kolonii będzie zmienna, zależnie od tego, kiedy w hodowli pojawił się mutant

indukowane spontaniczne

Test fluktuacyjny

indukowane spontaniczneLuria & Delbrück, 1943

Poziom molekularny DNA• Podstawienia (punktowe)

• Tranzycje • zmiana puryny w purynę, pirymidyny w pirymidynę

• Transwersje • zmiana puryny w pirymidynę i vice versa

• Tranzycje są częstsze – tautomeria zasad jest najczęstszą przyczyną błędów replikacji, a prowadzi do tranzycji

• Delecje i insercje • Rearanżacje na dużą skalę

Mutacje – poziom kodu genetycznego

• Podstawienia • Niesynonimiczne

• Zmiany sensu (missense) • Nonsens (nonsense)

• Synonimiczne (ciche) • Mogą niekiedy wpłynąć na fenotyp - efekt częstości wykorzystywania

kodonów synonimicznych

Mutacje – poziom kodu genetycznego

• Zmiany fazy odczytu • zmienia sekwencję i/lub długość kodowanego białka poniżej miejsca

wystąpienia

• Delecje lub insercje w białku • delecje lub insercje wielokrotności 3 nukleotydów • delecje lub insercje eksonów • Deficjencja – rozległa delecja, np. obejmująca cały gen

Mutacje – efekty fenotypowe

• Klasyfikacja Müllera • nullomorfy • hipomorfy • hipermorfy • antymorfy • neomorfy

Nullomorfy• Brak jakiejkolwiek funkcji genu • Tzw. allele null, inna nazwa: amorfy • Nullomorfy:

• transkrypcyjne (brak transkryptu) • translacyjne (brak białka wykrywalnego przeciwciałem) • inaktywacyjne (obecne białko, ale całkowicie nieaktywne) • najpewniejszy sposób na uzyskanie nullomorfa – deficjencja (pełna delecja)

• Często recesywne • Dominacja (lub kodominacja) w przypadku efektu ilości białka -

haploinsuficjencja

Hipomorfy• Obniżona aktywność produktu, niewystarczająca do uzyskania

dzikiego fenotypu homozygoty • Obniżenie ilości produktu lub produkt o obniżonej aktywności

• Np. • obniżona transkrypcja, splicing, stabilność, translacja • obniżona aktywność katalityczna

• Często recesywne

Hipomorfy vs. nullomorfy

• Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana mutacja • Deficjencja jest zawsze nullomorfem • Jeżeli genotyp m/Df daje cięższy fenotyp niż m/m, to m jest

hipomorfem, jeżeli taki sam, to nullomorfem • Wprowadzenie kolejnych kopii allelu m daje fenotyp coraz lżejszy,

przy nullomorfach – bez różnicy

Hipomorfy vs. nullomorfy

• Uzyskanie hipomorfa zamiast nullomorfa może utrudnić analizę fenotypu, ale...

• Hipomorfy mogą być jedynym sposobem na badanie ważnych genów

Hipermorfy

• Fenotyp wynika z: • nadmiaru produktu genu (np. nadekspresja) • nadmiernie wysokiej aktywności produktu

• Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana mutacja • Fenotyp m/+ cięższy niż m/Df; zwykle też m/m cięższy od m/+

Antymorfy• Zmutowany produkt ma działanie antagonistyczne wobec dzikiego • Fenotyp podobny do fenotypu nullomorfa lub hipomorfa, ale z

definicji dominujący • Zwiększenie dawki allelu dzikiego może osłabić (odwrócić) fenotyp • Możliwe odwrócenie (pseudorewersja) przez kolejną mutację

znoszącą ekspresję zmutowanego allelu • Inny termin – mutacje dominujące negatywne (dominant negative)

Antymorfy

“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003

Mutacje w genach podjednostek tubuliny blokujące polimeryzację

Antymorf – zespół Marfana• Dominująca mutacja w genie FBN1 kodującym fibrylinę – białko

tkanki łącznej • Zmutowane białko blokuje polimeryzację białka prawidłowego • Defekty tkanki łącznej, aorty i zastawek serca, wysoki wzrost,

arachnodaktylia • Ok. 1:5 000 osób

Neomorfy• Aktywność genu w niewłaściwym miejscu lub czasie

• np. mutacje heterochroniczne (ekspresja w niewłaściwym czasie) • przykład: chłoniak Burkitta: translokacja fragmentu chromosomu 8 na

14 przenosi gen c-myc pod kontrolę silnego promotora IGHα aktywnego w limfocytach

• Niewłaściwa aktywność, ale nie toksyczna dla produktu dzikiego • Wiele mutantów regulatorowych • Np. białko pozbawione domeny odpowiadającej za regulację

aktywności, konstytutywnie aktywne

Neomorf• Antennapedia (Antp73b) • Sekwencja genu Antp przeniesiona w pobliże promotora genu

ulegającego ekspresji w głowie • Rozwój odnóży na segmencie głowowym

Inne terminologie• Mutacje utraty funkcji (loss-of-function)

• nullomorfy i hipomorfy w klasyfikacji Mullera

• Mutacje nabycia funkcji (gain-of-function) • neomorfy i hipermorfy w klasyfikacji Mullera

• Mutacje dominujące negatywne • antymorfy • niekiedy zaliczane do “nabycia funkcji” albo “utraty funkcji” – częste

niejednoznaczności

Mutacje utraty funkcji

• Null – całkowita utrata funkcji. Np. deficjencja. • Częściowa utrata funkcji (hipomorf). Dotyczy poziomu produktu lub

jego aktywności. • Warunkowe

• np. temperaturo-wrażliwe – utrata aktywności tylko w warunkach restrykcyjnych - np. podwyższona (ts) lub obniżona (cs) temperatura.

• Ważne narzędzie do badania genów, w których mutacje null są letalne

Mutacje letalne• Badane za pomocą alleli warunkowych

• uzyskiwanych naturalnie (poszukiwanie mutantów np. ts) • konstruowanych, przykłady dla drożdży:

• reprymowalne promotory (np. tet-off) • fuzje z sekwencją peptydową powodującą degradację białka w

podwyższonej temperaturze (degron) • uszkodzenia w sekwencji 3’ UTR mRNA: DAmP (decreased abundance

by mRNA perturbation)

Dominacja i recesywność

• Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod kątem • konkretnego fenotypu • poziomu organizacji (komórka vs. organizm)

Dominacja i recesywność• Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod kątem

• konkretnego fenotypu • np. u myszy allel AY – dominujący pod względem koloru, recesywny

letalny

wt (agouti) mutant yellow

agouti × agouti ➔ same agouti agouti × yellow ➔ ½ yellow i ½ agouti yellow × yellow ➔ 2/3 yellow i 1/3 agouti

AA × AA ➔ AA AA × AAY ➔ A AY; AA

AAY × AAY ➔ 1 AYAY; 2 A AY; 1 AA X

Dominacja i recesywność• Poziomu organizacji (komórka vs. organizm)

• np. supresory nowotworów (p53, Rb) • Na poziomie komórkowym recesywne – komórka z jednym allelem

dzikim funkcjonuje prawidłowo • Na poziomie organizmu (rodowody) dominujące – u heterozygot rozwija

się zespół chorobowy częstego występowania rzadkich nowotworów (zespół Li-Fraumeni, retinoblastoma) • u heterozygot prawdopodobieństwo zmutowania jedynej pozostającej kopii w

jednej z bardzo wielu komórek i rozwinięcia się nowotworu jest wysokie

Dominacja i recesywność

• Mutacje nullomorficzne i hipomorficzne (utraty funkcji) z reguły są recesywne • Jeden allel pozostaje aktywny i wytwarza produkt. Ilość produktu

(enzymu) nie jest limitująca (limituje zwykle substrat) • Ponieważ są to najczęstsze mutacje, to większość izolowanych mutacji

jest recesywna

Haploinsuficjencja• Wyjątek: haploinsuficjencja

• Jedna kopia (allel) nie wystarcza do zapewnienia odpowiedniej ilości produktu

• Np. białka rybosomalne • Mutant Minute u Drosophila: heterozygota – opóźniony rozwój,

anomalie rozwojowe; homozygota – letalna • U drożdży stwierdzono dla około 3% (~200) genów • Zdarza się haploinsuficjencja warunkowa – heterozygota objawia

fenotyp tylko w konkretnych warunkach środowiska

Haploinsuficjencja• Rodzinna hipercholesterolemia • Mutacje w genach LDLR (receptor LDL – low density lipoprotein) i

ApoB (apolipoproteina B – część kompleksu LDL odpowiedzialna za oddziaływanie z receptorem)

• Heterozygoty: podwyższony poziom LDL we krwi, miażdżyca, choroby serca ok. 40 r. życia • leczenie: statyny, dieta

• Homozygoty: ciężkie schorzenia serca i naczyń już w dzieciństwie • leczenie: trudne, wysokie dawki statyn, przeszczep wątroby

Haploinsuficjencja warunkowa• Anemia sierpowata

• Mutacje w genie β-globiny • Choroba recesywna, ale w warunkach niskiego ciśnienia (wysoko w

górach) heterozygoty chorują – warunkowa haploinsuficjencja • Dodatkowy fenotyp – odporność na malarię, fenotyp dominujący

Anemia sierpowata

Częstość allelu HbS Występowanie malarii (historyczne)

Znani nosiciele allelu HbS

Lassana Diarra (ex. Real Madryt, ex. rep. Francji)

Ryan Clark (Pittsburgh Steelers)

HbS i sport

• W latach 2004 - 2008 5 przypadków śmierci u zawodników akademickiej ligi futbolu amerykańskiego powiązanych z nosicielstwem anemii sierpowatej • ~2% wszystkich (reszta to inne choroby, urazy i przyczyny niezwiązane

z uprawianym sportem) • ryzyko u nosicieli 37 x wyższe, niż u homozygot dominujących

Źródło: Br J Sports Med. 2012 Apr;46(5):325-30.

Mutacje dominujące

• Haploinsuficjencja nullomorfów i hipomorfów • Hipermorfy • Antymorfy – więcej kopii allelu dzikiego może odwrócić fenotyp • Neomorfy

Podstawy genetyki VInterakcje genetyczne. Genetyczne podstawy biologii

systemów - interaktomika. Genetyczne podstawy rozwoju.

W obrębie jednego genu

Rewersja i pseudorewersja

• Rewersja: mutacja powrotna, w tej samej pozycji przywraca dziki allel

• Pseudorewersja: mutacja w innej pozycji tego samego genu przywraca dziki fenotyp • Np. mutacja blokująca (całkowicie lub częściowo) ekspresję

dominującego allelu antymorficznego lub neomorficznego może przywrócić dziki fenotyp heterozgoty

RewersjaUAU -> UAA -> UAC tyr stop tyr

UGG -> UGA -> CGA trp stop arg

• Dotyczy tego samego kodonu, ale nie musi przywracać tego samego aminokwasu, może dotyczyć tego samego lub innego nukleotydu

• Podstawienia często rewertują, ale rozległe delecje – nigdy (albo bardzo rzadko)

Pseudorewersja

• “Supresja wewnątrzgenowa” • Specyficzna względem allelu

• Narzędzie do badania oddziaływań między aminokwasami wewnątrz białka

Pseudorewersja – badanie struktury białka

Sommers & Dumont,1997, J Mol Biol 266:559-575

Komplementacjam1 +m2

+m1 m2

m1 +m2

+m1 m2

Jest funkcjonalny allel jednego i drugiego genu

Oba allele niefunkcjonalne

Komplementacja wewnątrzgenowa

• Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans komplementują • Mutacje w dwóch niezależnych domenach białka

domena 1 domena I1

domena 1 domena I1

Komplementacja wewnątrzgenowa• Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans komplementują

• Transwekcja – jedna z mutacji w elemencie regulatorowym, który może działać w układzie cis (np. enhancer) • Wymaga parowania chromosomów homologicznych w komórkach

somatycznych w interfazie – nie u wszystkich organizmów. Obserwowane głównie u Drosophila

“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003

Pomiędzy genami

Interakcja genetyczna

• Fenotyp podwójnego mutanta AB nie jest sumą fenotypów mutacji A i B

• Dla ujęcia ilościowego wymagana jest liczbowa miara fenotypu • Np. czas podziału (czas generacji) – czas wymagany do podwojenia

liczby komórek w hodowli

• Ujęcie jakościowe wymaga dobrze zdefinowanych, dyskretnych (0,1) fenotypów – np. letalność

Problem terminu “epistaza”

• Epistaza (“epistasis”), Bateson 1909 – jeden z rodzajów interakcji • w tym znaczeniu stosowane w genetyce klasycznej

• Epistaza (“epistacy”), Fisher 1918 - wszelkie interakcje genetyczne • w tym znaczeniu używane w genetyce populacji i genetyce ewolucyjnej

Interakcje• Łagodzące, pozytywne (alleviating interactions)

• Fenotyp podwójnego mutanta lżejszy, niż przewidywany dla sumowania fenotypów mutantów pojedynczych

• Syntetyczne, pogarszające, negatywne (synthetic, aggravating interactions) • Fenotyp podwójnego mutanta cięższy, niż przewidywany dla

sumowania fenotypów pojedynczych mutantów

Ujęcie ilościowe

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25

• U mikroorganizmów typową miarą dostosowania (fenotypu) jest tempo podziałów • Przy braku interakcji oczekiwane tempo podziałów podwójnego mutanta to iloczyn

wartości mutantów pojedynczych

Ujęcie ilościowe - interakcje syntetyczne

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25

Ujęcie ilościowe – interakcje łagodzące

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25