Podstawy genetyki IV - IGiB · jednej z bardzo wielu komórek i rozwinięcia się nowotworu jest...
Transcript of Podstawy genetyki IV - IGiB · jednej z bardzo wielu komórek i rozwinięcia się nowotworu jest...
Podstawy genetyki IVNaprawa DNA, rekombinacja, mutacje
Naprawa DNA• U E. coli częstość błędów polimerazy 1:107 wstawianych
nukleotydów
• Ogólna częstość błędów przy replikacji: 1:1010 – 1:1011 wstawianych nukleotydów
• genom ~4,6⋅106 bp, czyli błąd raz na ~2000 – 20 000 podziałów
• Za zmniejszenie częstości błędów replikacji o 3-4 rzędy wielkości odpowiadają systemy naprawy DNA
Systemy naprawy DNA• Naprawa bezpośrednia (DR) • Naprawa przez wycinanie (ER)
• Naprawa przez wycinanie zasad (BER) • Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)
• Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) • Naprawa pęknięć dwuniciowych (DSBR)
• system łączenia końców niehomologicznych (NHEJ) • rekombinacja homologiczna (HR)
Systemy naprawy DNA
Naprawa bezpośrednia• Naprawa pęknięć jednoniciowych przez ligazę • Odwrócenie reakcji alkilacji
• np. MGMT (metylotransferaza O6-metyloguanino DNA) – usuwa grupy alkilowe z atomu 6 guaniny
• Fotoreaktywacja dimerów cyklobutylowych • fotoliaza DNA
• Występuje u mikroorganizmów i wielu zwierząt, ale brak u ssaków łożyskowych, w tym u człowieka (jej rolę przejmuje system NER – tzw. naprawa ciemna)
• Wspólna cecha – bez resyntezy DNA (udziału polimeraz)
Naprawa przez wycinanie zasad (BER)
• Usunięcie uszkodzonej zasady azotowej przez specyficzną glikozydazę DNA
• Powstaje miejsce AP • Endonukleaza AP oraz fosfodiesteraza usuwają resztkę nukleotydu • Luka wypełniana jest przez polimerazę
Glikozydazy – przykłady (ssaki)
Tabela jest tylko przykładem – nie uczyć się na pamięć!
Nobel 2015 (chemia)
• Tomas Lindahl, za opisanie mechanizmu BER
Naprawa przez wycinanie nukleotydów
• U bakterii dwa systemy
• krótkich łat (wycinane ~12 nt)
• długich łat (wycinane ~ 2 kb)
• U Eukaryota
• wycinane ~25-30 nt
Xeroderma pigmentosum• Pol. skóra pergaminowata i barwnikowa • Choroba genetyczna związana z mutacjami genów kodujących białka systemu
NER (7 grup komplementacji) • U człowieka to NER odpowiada za naprawę fotoproduktów • Działanie światła słonecznego wywołuje liczne przebarwienia i nowotwory skóry • Nie ma lekarstwa – pacjenci muszą całkowicie unikać światła słonecznego
Nobel 2015 (chemia)
• Aziz Sancar, za opisanie mechanizmu NER
Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)
• W odróżnieniu od DR, BER i NER nie dotyczy uszkodzeń w DNA, tylko błędów replikacji – wstawionych niewłaściwych nukleotydów (np. błędy wynikające z tautomerii zasad)
• Rozpoznawane zaburzenie podwójnej helisy, błędny nukleotyd wraz z otoczeniem (nawet do 1 kb) usuwany, po czym polimeraza uzupełnia lukę
• Problem: jak rozpoznać, która nić jest rodzicielska (i ma właściwy nukleotyd), a która potomna (z błędem)
Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)
• U bakterii nić rodzicielska jest metylowana
• U Eukaryota metylacja też ma znaczenie (u ssaków, u drożdży już nie), ale są też inne mechanizmy (sprzężenie z replikacją, białka naznaczające nić rodzicielską)
Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)
Nobel 2015 (chemia)
• Paul Modrich, za opisanie mechanizmu MMR
Naprawa pęknięć DNA• Pęknięcia w jednej nici są łatwe do naprawienia: polimeraza +
ligaza. Białka PARP chronią jednoniciowe fragmenty przed dalszą degradacją
• Pęknięcia dwuniciowe są trudniejsze do naprawienia
• Powstają np. w wyniku działania promieniowania jonizującego
• Blokują replikację, nienaprawione mogą doprowadzić do utraty dużych fragmentów chromosomu podczas podziału
Naprawa pęknięć dwuniciowych
• Łączenie końców niehomologicznych (NHEJ)
• Występuje u Eukaryota, uproszczony wariant może też u bakterii
System SOS u bakterii
• Przy rozegłych uszkodzeniach matrycy (miejsca AP, fotoprodukty, uszkodzone zasady)
• Białko RecA pokrywa matrycę • Polimeraza V z RecA tworzy mutasom • Replikacja zachodzi, ale generuje
wiele błędów
Rekombinacja
Rekombinacja• Procesy pękania i ponownego łączenia łańcuchów nukleotydowych
• Opisana w związku z crossing-over
• Pierwotna funkcja – naprawa pęknięć nici po replikacji, odblokowywanie widełek replikacyjnych
• Crossing-over utrzymuje chromosomy homologiczne razem – ułatwia segregację
• Bardzo ważna funkcja dla zapewnienia ewolucyjnej dynamiki genomu (wtórna)
Typy rekombinacji
• Rekombinacja homologiczna (ogólna) • zachodzi między fragmentami
DNA o znacznej homologii • pomiędzy dwiema cząsteczkami
lub w obrębie jednej • crossing-over, naprawa DNA
Typy rekombinacji
• Rekombinacja umiejscowiona • Zachodzi między cząsteczkami
mającymi jedynie krótki obszar homologii
• Regulowana przez specyficzne enzymy
• Np. integracja genomów fagowych
Typy rekombinacji• Transpozycja
• Przeniesienie fragmentu DNA z jednej pozycji w genomie w inną
• Replikatywna: przenoszona kopia sekwencji
• Konserwatywna: przenoszona sekwencja oryginalna
• Różne mechanizmy (z udziałem DNA i odp. białek, retrotranspozycja za pośrednictwem RNA itp.)
Modele rekombinacji homologicznej
• Holliday
• Meselson-Radding
Konwersja genuZmiana allelu w trakcie mejozy, zmienia rozkład z 2:2 na 3:1. Nie da się
wyjaśnić w modelu Hollidaya.
Model pęknięć dwuniciowych
Model pęknięć dwuniciowychKonwersja genu przez MMR
Możliwe jest wiele sposobów rozcięcia podwójnej struktury Hollidaya, dających wymianę nici, brak wymiany, konwersję itp
Maszyneria rekombinacyjna• Wiele różnych wariantów, niektóre enzymy zachowane od bakterii do
ssaków, inne specyficzne • Kompleks RecBCD – tworzy dwuniciową cząsteczkę z wolnym
jednoniciowym końcem. Helikaza + nukleaza • inne warianty: RecF, RecE
• RecA – wiąże koniec jednoniciowy, inwazja nici • RuvA, RuvB, RuvC – przemieszczanie się rozgałęzienia, rozłączenie
struktury Hollidaya • U eukariontów i niekt. bakterii w rozłączaniu bierze udział topoizomeraza
Rekombinacja i naprawa DNA• Naprawa pęknięć dwuniciowych
• Gdy maszyneria widełek replikacyjnych napotka miejsca z uszkodzeniami DNA, w nici potomnej powstaje luka. Replikacja często się zatrzymuje (kolaps widełek replikacyjnych)
• Naprawa polega na wykorzystaniu nieuszkodzonej cząsteczki potomnej do uratowania replikacji
• Mechanizm rekombinacji homologicznej – główna funkcja
Naprawa pęknięć przez rekombinację
• Postreplikacyjna - w fazie stacjonarnej
• Replikacyjna - zapobieganie kolapsowi replikacji przy pęknięciach matrycy
Naprawa pęknięć dwuniciowych przez rekombinację
• Pęknięcia dwuniciowe często powodowane są przez promieniowanie jonizujące, UV.
• Mutanty defektywne w rekombinacji – większa wrażliwość na promieniowanie (mutanty rad drożdży)
http://afmi1.uaa.alaska.edu/research.html
Naprawa przez rekombinacjęPróba replikacji pękniętej nici – kolaps widełek
Funkcje rekombinacji
• Naprawa pęknięć i utrzymywanie widełek replikacyjnych – najstarsza i podstawowa funkcja
• Pomaga w parowaniu chromosomów homologicznych – u Eukaryota
• Generuje różnorodność genotypów w rozmnażaniu płciowym (Eukaryota) – funkcja wtórna
Rekombinacja umiejscowiona• Przykłady
• Integracja faga (np. λ) do genomu • Wykorzystywana przez ruchome elementy genetyczne (transpozony,
wirusy, niektóre introny) • Specyficzne enzymy – rekombinazy (np. integraza λ) • Wykorzystywana w inżynierii genetycznej (system rekombinazy Cre)
• Delecje warunkowe • Usuwanie markerów selekcyjnych
Transpozycja• Nie jest odrębnym mechanizmem rekombinacji • Proces wykorzystujący rekombinację do przenoszenia fragmentów DNA • Transpozycja DNA
• replikatywna • konserwatywna
• Retrotranspozycja • Przepisanie RNA na DNA – odwrotna transkryptaza • Integracja utworzonego DNA do genomu (integrazy) • Np. retrowirusy, retrotranspozony, niektóre mobilne introny
MutacjeUjęcie genetyczne
Powstawanie mutacji - teorie
• Spontaniczne • powstają przypadkowo, środowisko może wpływać na częstość (np.
mutageny) mutacji, ale nie na to, w którym genie zachodzą
• Indukowane • powstają w konkretnym genie w odpowiedzi na czynnik selekcyjny
Test fluktuacyjny• Pojawianie się mutantów E. coli opornych
na faga T1 • Jeżeli pojawiają się w odpowiedzi na
kontakt z fagiem, to fluktuacje liczby opornych kolonii z każdej hodowli będą niewielkie
• Jeżeli pojawiają się spontanicznie, to liczba opornych kolonii będzie zmienna, zależnie od tego, kiedy w hodowli pojawił się mutant
indukowane spontaniczne
Test fluktuacyjny
indukowane spontaniczneLuria & Delbrück, 1943
Poziom molekularny DNA• Podstawienia (punktowe)
• Tranzycje • zmiana puryny w purynę, pirymidyny w pirymidynę
• Transwersje • zmiana puryny w pirymidynę i vice versa
• Tranzycje są częstsze – tautomeria zasad jest najczęstszą przyczyną błędów replikacji, a prowadzi do tranzycji
• Delecje i insercje • Rearanżacje na dużą skalę
Mutacje – poziom kodu genetycznego
• Podstawienia • Niesynonimiczne
• Zmiany sensu (missense) • Nonsens (nonsense)
• Synonimiczne (ciche) • Mogą niekiedy wpłynąć na fenotyp - efekt częstości wykorzystywania
kodonów synonimicznych
Mutacje – poziom kodu genetycznego
• Zmiany fazy odczytu • zmienia sekwencję i/lub długość kodowanego białka poniżej miejsca
wystąpienia
• Delecje lub insercje w białku • delecje lub insercje wielokrotności 3 nukleotydów • delecje lub insercje eksonów • Deficjencja – rozległa delecja, np. obejmująca cały gen
Mutacje – efekty fenotypowe
• Klasyfikacja Müllera • nullomorfy • hipomorfy • hipermorfy • antymorfy • neomorfy
Nullomorfy• Brak jakiejkolwiek funkcji genu • Tzw. allele null, inna nazwa: amorfy • Nullomorfy:
• transkrypcyjne (brak transkryptu) • translacyjne (brak białka wykrywalnego przeciwciałem) • inaktywacyjne (obecne białko, ale całkowicie nieaktywne) • najpewniejszy sposób na uzyskanie nullomorfa – deficjencja (pełna delecja)
• Często recesywne • Dominacja (lub kodominacja) w przypadku efektu ilości białka -
haploinsuficjencja
Hipomorfy• Obniżona aktywność produktu, niewystarczająca do uzyskania
dzikiego fenotypu homozygoty • Obniżenie ilości produktu lub produkt o obniżonej aktywności
• Np. • obniżona transkrypcja, splicing, stabilność, translacja • obniżona aktywność katalityczna
• Często recesywne
Hipomorfy vs. nullomorfy
• Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana mutacja • Deficjencja jest zawsze nullomorfem • Jeżeli genotyp m/Df daje cięższy fenotyp niż m/m, to m jest
hipomorfem, jeżeli taki sam, to nullomorfem • Wprowadzenie kolejnych kopii allelu m daje fenotyp coraz lżejszy,
przy nullomorfach – bez różnicy
Hipomorfy vs. nullomorfy
• Uzyskanie hipomorfa zamiast nullomorfa może utrudnić analizę fenotypu, ale...
• Hipomorfy mogą być jedynym sposobem na badanie ważnych genów
Hipermorfy
• Fenotyp wynika z: • nadmiaru produktu genu (np. nadekspresja) • nadmiernie wysokiej aktywności produktu
• Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana mutacja • Fenotyp m/+ cięższy niż m/Df; zwykle też m/m cięższy od m/+
Antymorfy• Zmutowany produkt ma działanie antagonistyczne wobec dzikiego • Fenotyp podobny do fenotypu nullomorfa lub hipomorfa, ale z
definicji dominujący • Zwiększenie dawki allelu dzikiego może osłabić (odwrócić) fenotyp • Możliwe odwrócenie (pseudorewersja) przez kolejną mutację
znoszącą ekspresję zmutowanego allelu • Inny termin – mutacje dominujące negatywne (dominant negative)
Antymorfy
“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003
Mutacje w genach podjednostek tubuliny blokujące polimeryzację
Antymorf – zespół Marfana• Dominująca mutacja w genie FBN1 kodującym fibrylinę – białko
tkanki łącznej • Zmutowane białko blokuje polimeryzację białka prawidłowego • Defekty tkanki łącznej, aorty i zastawek serca, wysoki wzrost,
arachnodaktylia • Ok. 1:5 000 osób
Neomorfy• Aktywność genu w niewłaściwym miejscu lub czasie
• np. mutacje heterochroniczne (ekspresja w niewłaściwym czasie) • przykład: chłoniak Burkitta: translokacja fragmentu chromosomu 8 na
14 przenosi gen c-myc pod kontrolę silnego promotora IGHα aktywnego w limfocytach
• Niewłaściwa aktywność, ale nie toksyczna dla produktu dzikiego • Wiele mutantów regulatorowych • Np. białko pozbawione domeny odpowiadającej za regulację
aktywności, konstytutywnie aktywne
Neomorf• Antennapedia (Antp73b) • Sekwencja genu Antp przeniesiona w pobliże promotora genu
ulegającego ekspresji w głowie • Rozwój odnóży na segmencie głowowym
Inne terminologie• Mutacje utraty funkcji (loss-of-function)
• nullomorfy i hipomorfy w klasyfikacji Mullera
• Mutacje nabycia funkcji (gain-of-function) • neomorfy i hipermorfy w klasyfikacji Mullera
• Mutacje dominujące negatywne • antymorfy • niekiedy zaliczane do “nabycia funkcji” albo “utraty funkcji” – częste
niejednoznaczności
Mutacje utraty funkcji
• Null – całkowita utrata funkcji. Np. deficjencja. • Częściowa utrata funkcji (hipomorf). Dotyczy poziomu produktu lub
jego aktywności. • Warunkowe
• np. temperaturo-wrażliwe – utrata aktywności tylko w warunkach restrykcyjnych - np. podwyższona (ts) lub obniżona (cs) temperatura.
• Ważne narzędzie do badania genów, w których mutacje null są letalne
Mutacje letalne• Badane za pomocą alleli warunkowych
• uzyskiwanych naturalnie (poszukiwanie mutantów np. ts) • konstruowanych, przykłady dla drożdży:
• reprymowalne promotory (np. tet-off) • fuzje z sekwencją peptydową powodującą degradację białka w
podwyższonej temperaturze (degron) • uszkodzenia w sekwencji 3’ UTR mRNA: DAmP (decreased abundance
by mRNA perturbation)
Dominacja i recesywność
• Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod kątem • konkretnego fenotypu • poziomu organizacji (komórka vs. organizm)
Dominacja i recesywność• Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod kątem
• konkretnego fenotypu • np. u myszy allel AY – dominujący pod względem koloru, recesywny
letalny
wt (agouti) mutant yellow
agouti × agouti ➔ same agouti agouti × yellow ➔ ½ yellow i ½ agouti yellow × yellow ➔ 2/3 yellow i 1/3 agouti
AA × AA ➔ AA AA × AAY ➔ A AY; AA
AAY × AAY ➔ 1 AYAY; 2 A AY; 1 AA X
Dominacja i recesywność• Poziomu organizacji (komórka vs. organizm)
• np. supresory nowotworów (p53, Rb) • Na poziomie komórkowym recesywne – komórka z jednym allelem
dzikim funkcjonuje prawidłowo • Na poziomie organizmu (rodowody) dominujące – u heterozygot rozwija
się zespół chorobowy częstego występowania rzadkich nowotworów (zespół Li-Fraumeni, retinoblastoma) • u heterozygot prawdopodobieństwo zmutowania jedynej pozostającej kopii w
jednej z bardzo wielu komórek i rozwinięcia się nowotworu jest wysokie
Dominacja i recesywność
• Mutacje nullomorficzne i hipomorficzne (utraty funkcji) z reguły są recesywne • Jeden allel pozostaje aktywny i wytwarza produkt. Ilość produktu
(enzymu) nie jest limitująca (limituje zwykle substrat) • Ponieważ są to najczęstsze mutacje, to większość izolowanych mutacji
jest recesywna
Haploinsuficjencja• Wyjątek: haploinsuficjencja
• Jedna kopia (allel) nie wystarcza do zapewnienia odpowiedniej ilości produktu
• Np. białka rybosomalne • Mutant Minute u Drosophila: heterozygota – opóźniony rozwój,
anomalie rozwojowe; homozygota – letalna • U drożdży stwierdzono dla około 3% (~200) genów • Zdarza się haploinsuficjencja warunkowa – heterozygota objawia
fenotyp tylko w konkretnych warunkach środowiska
Haploinsuficjencja• Rodzinna hipercholesterolemia • Mutacje w genach LDLR (receptor LDL – low density lipoprotein) i
ApoB (apolipoproteina B – część kompleksu LDL odpowiedzialna za oddziaływanie z receptorem)
• Heterozygoty: podwyższony poziom LDL we krwi, miażdżyca, choroby serca ok. 40 r. życia • leczenie: statyny, dieta
• Homozygoty: ciężkie schorzenia serca i naczyń już w dzieciństwie • leczenie: trudne, wysokie dawki statyn, przeszczep wątroby
Haploinsuficjencja warunkowa• Anemia sierpowata
• Mutacje w genie β-globiny • Choroba recesywna, ale w warunkach niskiego ciśnienia (wysoko w
górach) heterozygoty chorują – warunkowa haploinsuficjencja • Dodatkowy fenotyp – odporność na malarię, fenotyp dominujący
Anemia sierpowata
Częstość allelu HbS Występowanie malarii (historyczne)
Znani nosiciele allelu HbS
Lassana Diarra (ex. Real Madryt, ex. rep. Francji)
Ryan Clark (Pittsburgh Steelers)
HbS i sport
• W latach 2004 - 2008 5 przypadków śmierci u zawodników akademickiej ligi futbolu amerykańskiego powiązanych z nosicielstwem anemii sierpowatej • ~2% wszystkich (reszta to inne choroby, urazy i przyczyny niezwiązane
z uprawianym sportem) • ryzyko u nosicieli 37 x wyższe, niż u homozygot dominujących
Źródło: Br J Sports Med. 2012 Apr;46(5):325-30.
Mutacje dominujące
• Haploinsuficjencja nullomorfów i hipomorfów • Hipermorfy • Antymorfy – więcej kopii allelu dzikiego może odwrócić fenotyp • Neomorfy
Podstawy genetyki VInterakcje genetyczne. Genetyczne podstawy biologii
systemów - interaktomika. Genetyczne podstawy rozwoju.
W obrębie jednego genu
Rewersja i pseudorewersja
• Rewersja: mutacja powrotna, w tej samej pozycji przywraca dziki allel
• Pseudorewersja: mutacja w innej pozycji tego samego genu przywraca dziki fenotyp • Np. mutacja blokująca (całkowicie lub częściowo) ekspresję
dominującego allelu antymorficznego lub neomorficznego może przywrócić dziki fenotyp heterozgoty
RewersjaUAU -> UAA -> UAC tyr stop tyr
UGG -> UGA -> CGA trp stop arg
• Dotyczy tego samego kodonu, ale nie musi przywracać tego samego aminokwasu, może dotyczyć tego samego lub innego nukleotydu
• Podstawienia często rewertują, ale rozległe delecje – nigdy (albo bardzo rzadko)
Pseudorewersja
• “Supresja wewnątrzgenowa” • Specyficzna względem allelu
• Narzędzie do badania oddziaływań między aminokwasami wewnątrz białka
Pseudorewersja – badanie struktury białka
Sommers & Dumont,1997, J Mol Biol 266:559-575
Komplementacjam1 +m2
+m1 m2
m1 +m2
+m1 m2
Jest funkcjonalny allel jednego i drugiego genu
Oba allele niefunkcjonalne
Komplementacja wewnątrzgenowa
• Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans komplementują • Mutacje w dwóch niezależnych domenach białka
domena 1 domena I1
domena 1 domena I1
Komplementacja wewnątrzgenowa• Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans komplementują
• Transwekcja – jedna z mutacji w elemencie regulatorowym, który może działać w układzie cis (np. enhancer) • Wymaga parowania chromosomów homologicznych w komórkach
somatycznych w interfazie – nie u wszystkich organizmów. Obserwowane głównie u Drosophila
“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003
Pomiędzy genami
Interakcja genetyczna
• Fenotyp podwójnego mutanta AB nie jest sumą fenotypów mutacji A i B
• Dla ujęcia ilościowego wymagana jest liczbowa miara fenotypu • Np. czas podziału (czas generacji) – czas wymagany do podwojenia
liczby komórek w hodowli
• Ujęcie jakościowe wymaga dobrze zdefinowanych, dyskretnych (0,1) fenotypów – np. letalność
Problem terminu “epistaza”
• Epistaza (“epistasis”), Bateson 1909 – jeden z rodzajów interakcji • w tym znaczeniu stosowane w genetyce klasycznej
• Epistaza (“epistacy”), Fisher 1918 - wszelkie interakcje genetyczne • w tym znaczeniu używane w genetyce populacji i genetyce ewolucyjnej
Interakcje• Łagodzące, pozytywne (alleviating interactions)
• Fenotyp podwójnego mutanta lżejszy, niż przewidywany dla sumowania fenotypów mutantów pojedynczych
• Syntetyczne, pogarszające, negatywne (synthetic, aggravating interactions) • Fenotyp podwójnego mutanta cięższy, niż przewidywany dla
sumowania fenotypów pojedynczych mutantów
Ujęcie ilościowe
Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25
• U mikroorganizmów typową miarą dostosowania (fenotypu) jest tempo podziałów • Przy braku interakcji oczekiwane tempo podziałów podwójnego mutanta to iloczyn
wartości mutantów pojedynczych
Ujęcie ilościowe - interakcje syntetyczne
Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25
Ujęcie ilościowe – interakcje łagodzące
Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25