21
4. DNA podporządkowany człowiekowi – manipulacje DNA
Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i translacji oraz rozwój
biochemii, genetyki i informatyki doprowadziły do wynalezienia metod
pozwalających na manipulowanie informacją zapisaną w DNA, czyli re-
kombinowanie DNA. Jest ono podstawą inżynierii genetycznej. Tworzenie
rekombinowanych cząsteczek DNA jest możliwe dzięki technikom pozwala-
jącym na wyodrębnienie i powielenie fragmentów DNA, a także odczytanie
zapisanej w nich informacji. Techniki te to przede wszystkim: rozcinanie
DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, sekwencjonowanie DNA, che-
miczna synteza DNA, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).
Nożyczki i klej w rękach genetyków
Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje DNA i bardzo
precyzyjnie przecinają obie jego nici w określonym miejscu. Występują
u bakterii, które wykorzystują je do rozcinania obcych cząsteczek DNA.
Zostały odkryte w latach sześćdziesiątych XX wieku, a już kilka lat później
wprowadzono je do badań. Dotychczas scharakteryzowano ponad 3000
enzymów restrykcyjnych.
Enzymy restrykcyjne są niezastąpione przy sekwencjonowaniu DNA,
badaniu struktury chromosomów, izolowaniu poszczególnych genów oraz
tworzeniu nowych cząsteczek DNA. Odcinki DNA łatwiej analizować i pod-
dawać manipulacjom niż długi łańcuch. Łączy się je z powrotem za pomocą
enzymów zwanych ligazami, uzyskując rekombinowany DNA.
4
komórki
DNA izolowanie DNA
z komórek
rearanżacjacięciekopiowanie
Ryc. 4.1. Po wyizolowaniu DNA można kopiować, ciąć i zmieniać.
enzymy restrykcyjne
i ich rola
manipulowanie
w DNA
Ciekawe fakty
Nazwy enzymów restrykcyjnych tworzy się od nazw organizmów, z których
zostały wyizolowane (np. Eco – od Escherichia coli). Oznaczenia cyfrowe
(np. HindIII) informują o tym, że z danego organizmu wyizolowano więcej
niż jeden enzym restrykcyjny.
22
Sekwencjonowanie DNA
Do prawdziwej rewolucji w genetyce doprowadziło wynalezienie techniki
sekwencjonowania DNA, czyli określania kolejności ułożenia nukleotydów.
Jest to jedna z podstawowych metod wykorzystywanych między innymi
w biotechnologii, medycynie sądowej czy diagnostyce chorób genetycz-
nych. Najbardziej znaną metodę sekwencjonowania opracował Frederick
Sanger (tzw. metoda Sangera lub metoda terminacji łańcucha).
G
C
G
C
C
G
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
A
T
. . . .
Bam HI
nazwa
enzymu
EcoRI
HaeIII
Hhal
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
G
C
C
G
C
G
G
C
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
G
C
C
G
G
C
C
G
. . . .
. . . .
. . . .
. . . .
Rozdzielanie chromosomów i odcinanie fragmentów DNA
Cięcie fragmentów na mniejsze segmenty
Cięcie każdego segmentu na małe fragmenty
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Odczytywanie sekwencji nukleotydów w każdym z małych fragmentów DNA dokonywane
w sposób automatyczny w sekwenatorach DNA
10
Zestawianie odczytanych sekwencji małych fragmentów zgodnie z ich znaną względną kolejnością
1
2
3
4
5
sekwencjonowanie
Ryc. 4.3. Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera.
Ryc. 4.2. Miejsca działania wybranych enzymów restrykcyjnych.
23
Enzym Miejsce cięcia Kolor nici
HaeIII GG|CC czerwony
EcoRI G|AATTC zielony
EcoRII |CCTGG żółty
HpaII C|CGG niebieski
etapy
sekwencjonowania
DNA
Pierwszy etap sekwencjonowania DNA obejmuje izolację DNA, rozdzie-
lenie helisy na dwie pojedyncze nici i pocięcie nici na krótkie fragmenty.
Drugi etap polega na kopiowaniu krótkich odcinków DNA, które są kom-
plementarne do nici DNA. Odcinki DNA o różnej długości są odpowiednio
oznaczane (radioaktywnie lub fluorescencyjnie) i segregowane za pomo-
cą elektroforezy. Z wielkości fragmentów wnioskuje się o sekwencji DNA.
Sekwencje poszczególnych odcinków składa się w cały, wyjściowy DNA. Jest
to możliwe, ponieważ końce poszczególnych odcinków zachodzą na siebie
(podobnie jak elementy puzzli). Obecnie sekwencjonowanie DNA zostało
zautomatyzowane (między innymi dzięki nowoczesnym sekwenatorom).
Aby się przekonać, jak działają enzymy restrykcyjne oraz na czym polega
sekwencjonowanie DNA, przeprowadź proste doświadczenie.
Zostań biochemikiem!
Przygotuj cztery różnokolorowe zestawy tej samej sekwencji DNA (ryc. A).
Z każdego zestawu wytnij poszczególne „nici” (ryc. B, C). Następnie nić
każdego koloru przetnij we wskazanych miejscach według zasad działania
enzymów restrykcyjnych podanych w tabeli (kolor nici wskazuje na rodzaj
enzymu stosowanego przy cięciu danej nici).
Wybierz uzyskane fragmenty z nici dwóch kolorów (np. zielony i nie-
bieski lub zielony i żółty) i je wymieszaj. Wykorzystując nakładające się
sekwencje, ułóż wyjściową nić DNA. Uwaga: Nie tworzysz par zasad, tyl-
ko pojedynczą nić – zasady w każdej z nich muszą pasować do siebie, na
przykład w następujący sposób:
GGATCGGTCAATG
AATGCCTA
A B
24
Przez przesuwanie kolejnych części i próbowanie różnych kombina-
cji można zrekonstruować pierwotną nić. Po zakończeniu rekonstrukcji
sprawdź sekwencję z nauczycielem. Czy rekonstrukcja fragmentów nici
uzyskanych za pomocą enzymów restrykcyjnych HaeIII i EcoRII jest moż-
liwa? Przeprowadź podczas lekcji dyskusję na ten temat.
Odwrócić bieg zdarzeń – cDNA
Aby móc wykorzystać bakterie do produkcji białka (np. Escherichia coli
do wytwarzania ludzkiej insuliny), należy do ich komórek wprowadzić
gen, który je koduje. Ponieważ geny człowieka stanowią mieszaninę eg-
zonów i intronów, a bakterie nie potrafią usuwać intronów, gen kodujący
dane białko musi zostać ich pozbawiony. W tym celu wykorzystuje się tak
zwany cDNA (ang. complementary DNA), komplementarny do dojrzałego
mRNA. Aby uzyskać cDNA, należy najpierw wyizolować z komórki całkowi-
tą pulę RNA. Następnie, wykorzystując startery specyficznie rozpoznające
mRNA, odwrotna transkryptaza przeprowadza syntezę cDNA na matrycy
mRNA. Odwrotna transkryptaza przeprowadza syntezę jednoniciowego
DNA na matrycy mRNA z wykorzystaniem deoksytrifosforanów nukle-
otydów (dNTP), dodając je na
zasadzie komplementarności.
Po zsyntetyzowaniu pierwszej
nici mRNA jest degenerowa-
ny. Syntezę drugiej nici prze-
prowadza polimeraza DNA.
Końcowym produktem jest
dwuniciowa cząsteczka cDNA,
której sekwencja odpowiada
mRNA wyizolowanym z kon-
kretnej komórki. W ten sposób
można uzyskać całą kolekcję
cDNA, czyli bibliotekę cDNA.
odwrotna
transkryptaza
5'
5'
3'
3'
cDNATT…
AA…
AA…
DNA o sekwencji
mRNA
wektor
Nowy DNA jest wprowadzany
do wektora
Nić mRNA ulega zniszczeniu,
a na nici cDNA powstaje
druga nić DNA
Odwrotna transkryptaza
wykorzystuje mRNA
jako matrycę do syntezy
komplementarnej nici DNA (cDNA)
Ryc. 4.4. W czasie odwrotnej transkrypcji informacja z mRNA jest
przepisywana na DNA przez enzym – odwrotną transkryptazę.
C D
25
PCR – rewolucja w badaniach genetycznych
W 1984 roku została wynaleziona metoda pozwalająca na powielanie wybra-
nych odcinków DNA. To tak zwana reakcja łańcuchowa polimerazy (w skró-
cie PCR; z ang. Polymerase Chain Reaction). Warunkiem przeprowadzenia
PCR jest znajomość sekwencji nukleotydów sąsiadujących z odcinkiem DNA,
który chcemy powielić (nie musimy znać sekwencji nukleotydów odcinka
powielanego).
W mieszaninie reakcyjnej znajdują się: krótkie odcinki DNA, czyli starte-
ry, zwane też primerami (czyt. prajmerami), które są komplementarne do
sekwencji otaczających kopiowaną sekwencję, nukleotydy (A, T, G, C) oraz
enzym – najczęściej polimeraza Taq. Jeden
cykl reakcji PCR obejmuje następujące etapy:
1. Oddzielenie nici DNA – dwie nici DNA
rozdzielane są przez podgrzanie roztworu
do temperatury 95°C przez 15 sekund.
2. Dołączenie starterów – w wyniku gwał-
townego schłodzenia mieszaniny reakcyjnej
do temperatury 50–65°C startery przyłącza-
ją się do nici DNA.
3. Synteza DNA – mieszaninę reakcyjną
ponownie podgrzewa się do temperatury
72°C. Jest to temperatura odpowiednia do
działania polimerazy Taq, która dołącza
kolejne nukleotydy równocześnie do obu
nici DNA.
Cały cykl jest wielo-
krotnie powtarzany. Po
20 cyklach DNA jest po-
wielony milion razy, a po
30 – miliard i to w czasie
krótszym niż godzina! Co
więcej, metoda PCR jest
obecnie całkowicie zauto-
matyzowana. Urządzenie
służące do przeprowadza-
nia PCR to termocykler.
Ciekawe fakty
Reakcja PCR zachodzi dzięki unikalnym
cechom polimerazy Taq, która jest aktyw-
na w wysokich temperaturach. Enzym ten
wyizolowano z bakterii Thermus aquaticus
(stąd jego nazwa).
Ryc. 4.5. Termocykler.
Ryc. 4.6. Bakterie Thermus aquaticus, z których pocho-
dzi polimeraza Taq, żyją w gorących źródłach (odkryto
je w gorących źródłach Yellowstone).
polimerazy
Podsumowanie
1. Wśród stosowanych w genetyce metod pozwalających na analizę i modyfikacje DNA naj-
powszechniejsze są: rozcinanie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, sekwencjono-
wanie DNA, chemiczna synteza DNA, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).
2. Enzymy restrykcyjne umożliwiają rozcięcie DNA w określonym miejscu. Poprzez połącze-
nie otrzymanych odcinków za pomocą ligaz uzyskuje się rekombinowany DNA.
3. Sekwencjonowanie obejmuje: izolację DNA, pocięcie go na krótkie fragmenty, oznakowanie
ich i posegregowanie oraz poskładanie sekwencji w wyjściową cząsteczkę.
4. Dzięki odwrotnej transkryptazie można sekwencję nukleotydów w mRNA przepisać na
DNA. Uzyskuje się w ten sposób cDNA komplementarny do mRNA.
5. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) pozwala na uzyskanie wielu kopii wybranego od-
cinka DNA. Znalazła ona wiele zastosowań (np. w medycynie, kryminalistyce).
Metoda PCR umożliwia powielenie nawet bardzo małych fragmentów
DNA (stanowiących mniej niż milionową część cząsteczki DNA). Pozwala
to na uzyskanie takiej ilości materiału genetycznego, która umożliwia
jego analizę. Dlatego PCR wykorzystuje się w medycynie (do wykrywa-
nia bakterii i wirusów, np. HIV) oraz w sądownictwie (np. do ustalania
ojcostwa) i kryminalistyce (do znajdowania winnych w sprawach o gwałt
czy zabójstwo). Ponieważ DNA jest cząsteczką bardzo stabilną i może
przetrwać wiele tysięcy lat, PCR wykorzystuje się też do odtwarzania DNA
muzealnego lub znajdowanego w skamieniałościach.
Ciekawe fakty
Odmianą reakcji PCR jest reakcja RT-PCR. W trakcie tej reakcji używa się odwrotnej transkryp-
tazy, a wyjściowym kwasem jest mRNA. Najpierw, na podstawie sekwencji zapisanej w mRNA,
wytwarzany jest cDNA, który następnie jest powielany w trakcie reakcji PCR. Jest to możliwe
dzięki enzymom, na przykład enzymowi wyizolowanemu z bakterii Thermus thermophilus, któ-
ry ma właściwości zarówno polimerazy Taq, jak i odwrotnej traksktyptazy. Enzym ten nazwano
polimerazą Tth. RT-PCR znalazło wiele zastosowań w diagnostyce.
Elektroforeza
Analiza fragmentów DNA uzyskanych w wyniku reakcji PCR czy cięcia en-
zymami restrykcyjnymi opiera się na różnicy w ich wielkości. Standardową
metodą rozdziału cząsteczek DNA o różnych długościach jest elektroforeza.
Metoda ta polega na przemieszczaniu się naładowanych cząsteczek w polu
elektrycznym. Cząsteczki naładowane dodatnio wędrują do elektrody ujemnej,
zaś cząsteczki naładowane ujemnie – do elektrody dodatniej. Elektroforezę
przeprowadza się w żelu będącym siecią porów, przez które cząsteczki DNA
muszą się „przeciskać”. Krótsze (mniejsze) cząsteczki przeciskają się szybciej,
natomiast dłuższe (większe) wędrują przez żel znacznie dłużej. Cząsteczki
o różnej wielkości tworzą na żelu prążki. Prążki DNA uwidacznia się poprzez
dodanie do żelu barwnika, najczęściej bromku etydyny, który wnika pomiędzy
pary zasad DNA i fluoryzuje pod wpływem promieniowania ultrafioletowego.
26
Zadania
1. Wyjaśnij, co oznacza pojęcie rekombinowanie DNA.
2. Wymień metody pozwalające na rekombinowanie DNA.
3. Odpowiedz, w jaki sposób powstaje cDNA i na czym polega jego rola.
4. Przedstaw znaczenie polimerazy Taq w reakcji PCR.
5. Wyjaśnij, do czego służą enzymy restrykcyjne.
6. Przeczytaj poniższy fragment artykułu. Przepisz zamieszczone pod nim zdania do zeszytu.
Obok każdego z nich napisz, czy może być wnioskiem z tekstu (TAK lub NIE).
„Wprowadzenie nowych, bardziej czułych metod diagnostycznych (PCR) pozwoliło wyka-
zać, że zarówno w populacji osób zdrowych, jak i chorych z zakażeniami dróg oddecho-
wych rzeczywisty odsetek osób zakażonych drobnoustrojem Chlamydophila pneumoniae
może być wyższy niż oceniany na podstawie dodatnich wyników badań serologicznych”.
Źródło: R. Krenke, Zakażenia górnych dróg oddechowych wywołane przez drobnoustroje atypowe, „Magazyn otorynolaryngologiczny”, V(20), 2006.
a) Za pomocą PCR możemy wykryć obecność drobnoustrojów, które jeszcze nie zdążyły
wywołać objawów choroby.
b) Dotychczasowe badania dawały wynik dodatni, jeśli drobnoustrój zakaził organizm.
c) Wczesne wykrycie obecności patogenów w organizmie daje ludziom szansę na wyzdro-
wienie lub zastosowanie odpowiedniej terapii.
7. Przedstaw zalety reakcji łańcuchowej polimerazy. Wyjaśnij, dlaczego uznaje się technikę
manipulowania DNA za przełomową w badaniach genetycznych.
8. Przeprowadźcie w klasie burzę mózgów na temat: „Rekombinowanie DNA. Możliwości
wykorzystania”. Sporządźcie notatkę w zeszycie.
9. Spośród podanych poniżej nazw urządzeń wskaż to, które służy do przeprowadzania
reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
a) sekwenator b) ultrawirówka c) termocykler
10. Przeczytaj poniższy tekst.
„W 2004 roku zaprezentowano pierwszy poznany genom ptasi – genom kury. Liczy on 1 mld
par zasad i został zsekwencjonowany podobnie jak poprzednio: DNA losowo pocięto na
kawałki, sekwencjonowano je z osobna, a następnie komputer dopasował końce kawałków
do siebie, składając z nich cały genom. Dzięki temu została wypełniona istotna luka, jeśli
chodzi o strunowce – do tamtej pory znano bowiem genomy człowieka (3 mld par zasad),
myszy, szczura, psa, ryb: rozdymki i fugu (350 i 360 mln) oraz prymitywnego strunowca –
żachwy (180 mln). Dzięki poznaniu genomów zwierząt należących do tak odległych gromad
możliwe będzie prześledzenie przebiegu ewolucji i odpowiedź na tak podstawowe pytania,
jak skąd się wzięła żyworodność, stałocieplność czy zdolność latania”.
Źródło: Genomy, genomy, „Świat Nauki”, Nr 2 (162)/2005.
Na podstawie tekstu omów, jakie znaczenie ma rozwój technik inżynierii genetycznej dla:
a) systematyków i taksonomów,
b) naukowców zajmujących się problemami ewolucji.
27
Top Related