„„Z czego skZ czego skłłada siada sięę zielezieleńń ppóól i lasl i lasóóww””Chromatografia cieczowa jako technika Chromatografia cieczowa jako technika

analityczna i technika otrzymywania substancjianalityczna i technika otrzymywania substancji---- podstawy i gpodstawy i głłóówne zasady stosowania wne zasady stosowania ––

NajwaNajważżniejsze informacje wprowadzajniejsze informacje wprowadzająącece

-- Chromatografia Chromatografia -- technika rozdzielania substancji / cztechnika rozdzielania substancji / cząąstekstek w w ukukłładach ciecz adach ciecz –– ciaciałło stao stałłe, albo ciecz e, albo ciecz -- cieczciecz

-- Znaczenie rozdzielania Znaczenie rozdzielania -- rozdzielirozdzielićć = zidentyfikowa= zidentyfikowaćć, oznaczy, oznaczyćć-- Techniki chromatograficzne Techniki chromatograficzne -- LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC)LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC)-- Mechanizmy fizykochemiczne Mechanizmy fizykochemiczne -- NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC, ...NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC, ...

Warunek konieczny rozdzieleniaWarunek konieczny rozdzieleniaKonkurencja oddziaKonkurencja oddziałływaywańń sorpcyjnych o porsorpcyjnych o poróównywalnych energiach, w wnywalnych energiach, w ukukłładzie: faza stacjonarna adzie: faza stacjonarna –– faza ruchoma faza ruchoma –– substancje rozdzielane substancje rozdzielane

-- Zastosowania Zastosowania -- skskłładniki roadniki rośślin, plin, płłynynóów fizjologicznych,w fizjologicznych,monitoring monitoring śśrodowiska, kontrola jakorodowiska, kontrola jakośści,ci,kontrola proceskontrola procesóów technologicznych,w technologicznych,polidyspersyjnopolidyspersyjnośćść polimerpolimeróów, ... , w, ... , ale takale takżże:e:

rozdzielanie grupowe, przygotowanie prrozdzielanie grupowe, przygotowanie próóbek do analizy, bek do analizy, wyznaczanie parametrwyznaczanie parametróów fizykochemicznych substancji, ...w fizykochemicznych substancji, ...

Prof. dr hab. inż. Marian Kamiński

MiMichaichaiłł CwietCwiet (1872(1872--1919)1919)

““Like light rays in the Like light rays in the spectrum, the different spectrum, the different components of a pigment components of a pigment mixture, obeying a law, are mixture, obeying a law, are resolved on the calcium resolved on the calcium carbonate column and then carbonate column and then can be qualitatively and can be qualitatively and quantitatively determined. I quantitatively determined. I call such a preparation a call such a preparation a chromatogram and the chromatogram and the corresponding method the corresponding method the chromatographic method.chromatographic method.””

Odkrywca techniki kolumnowejOdkrywca techniki kolumnowej

„Klasyczna” technika kolumnowa

ELUENT

ELUAT, substancje rozdzielane

StR – czas retencji

M

MR

ttt

k−

=MR

MR

tttt

kk

−−

==1

2

1

2α2

54,5 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

h

R

wtN

k –współczynnik retencji- współczynnik rozdzieleniaα

N-liczba półek teoretycznych

22

2

11

41 N

kkRS ⋅+

⋅−

⋅=α

α

Rs -rozdzielczość pików-zależność „teoretyczna”

tM – czas martwy kolumny - retencjasubstancji niesorbowanej, wnikającejdo porów wypełnienia kolumny

Informacje „niesione” z chromatogramem i podstawowe zależności

Rs=(tRn+1 – tRn) / ½(Sn+1 + Sn)- zależność „obliczeniowa”

Kilka podstawowych pojKilka podstawowych pojęćęćUkUkłład chromatograficzny ad chromatograficzny (faza stacjonarna (faza stacjonarna –– faza ruchoma faza ruchoma ––okreokreśślone oddzialone oddziałływania sorpcyjne / mechanizmy separacji)ywania sorpcyjne / mechanizmy separacji)Retencja substancji Retencja substancji (spowolnienie elucji (spowolnienie elucji -- wzglwzglęędem dem „„uu””););

SelektywnoSelektywnośćść rozdzielania rozdzielania (stopie(stopieńń zrzróóżżnicowania retencji);nicowania retencji);

SprawnoSprawnośćść rozdzielania rozdzielania (miara dyspersji stref substancji);(miara dyspersji stref substancji);

PrPręędkodkośćść „„uu”” [mm/s], [mm/s], natnatężężenie przepenie przepłływu eluentu ywu eluentu „„ww”” [mL/min][mL/min]

OpOpóór przepr przepłływu w kolumnie ywu w kolumnie ΔΔP [P [MPaMPa] = 32 ] = 32 uu**LcLc**ηη / dp/ dp22

Kolumna o dKolumna o dłługougośści ci ((LcLc)), , śśrednicy rednicy (dc)(dc), wype, wypełłnienie ziarniste nienie ziarniste ((dpdp, d, A), d, A) / / „„monolitycznemonolityczne”” ((dmdm, d, A), d, A)

Sorbent Sorbent -- ziarnistoziarnistośćść, pory wewn, pory wewnąątrztrz--ziarnowe i miziarnowe i mięędzydzy--ziarnowe, porowatoziarnowe, porowatośćść ((εεwzwz , , εεmzmz , , εεTT)), powierzchnia sorpcyjna , powierzchnia sorpcyjna (A (A -- nawet do 750 mnawet do 750 m22/g)/g)Detekcja i detektoryDetekcja i detektory (st(stężężeniowe , masowe);eniowe , masowe);

CzuCzułłoośćść i liniowoi liniowośćść detekcji;detekcji;Zasady postZasady postęępowania analitycznego powania analitycznego (metoda krzywej kalibracyjnej (metoda krzywej kalibracyjnej –– w tym w tym -- punktpunktóów ograniczajw ograniczająących, wzorca wewncych, wzorca wewnęętrznego, dodatku wzorca, trznego, dodatku wzorca, normalizacji)normalizacji)

Mechanizmy separacjiMechanizmy separacji

Warunki RP Warunki RP –– hydrofobowohydrofobowośćśćWarunki NP Warunki NP –– polarnopolarnośćść, polaryzacja, , polaryzacja, dyspersja, widyspersja, wiąązania wodorowezania wodorowe;;Warunki IC Warunki IC –– wymiana jonwymiana jonóówwWarunki wykluczania (chromatografii Warunki wykluczania (chromatografii żżelowej) elowej) –– zrzróóżżnicowanie drnicowanie dróóg i g i czasu dyfuzji skczasu dyfuzji skłładnikadnikóów prw próóbkibkiInne: Inne: HIC,LILHIC,NPHIC,LILHIC,NP--w,LEC,AC,ECw,LEC,AC,EC,...,...

Kolumna do chromatografii Kolumna do chromatografii cieczowejcieczowej

-- Rurka o bardzo gRurka o bardzo głładkiej adkiej śściance, o ciance, o śśrednicy (rednicy (dc)dc), wype, wypełłniona niona sorbentem o przecisorbentem o przecięętnej (tnej (śśredniej) wielkoredniej) wielkośści ziaren ci ziaren ((dpdp)) i di dłługougośści ci warstwy wypewarstwy wypełłnienia nienia ((LcLc) ) –– kolumny kolumny „„klasyczneklasyczne””, , mikropakowanemikropakowane, kapilarne , kapilarne „„otwarteotwarte””, preparatywne, procesowe, preparatywne, procesowe;;

--WypeWypełłnienie powinno bynienie powinno byćć uułłoożżone rone róównomiernie w przekroju wnomiernie w przekroju poprzecznym, zapewniajpoprzecznym, zapewniająąc c „„ttłłokowyokowy”” profil przepprofil przepłływu;ywu;

(u(u≠≠ f (dc))f (dc))

--WypeWypełłnienie unienie ułłoożżone w sposone w sposóób stabilny, zapewniajb stabilny, zapewniająący brak cy brak „„osiadaniaosiadania”” zzłłoożża; W celu stabilizacji wypea; W celu stabilizacji wypełłnienia kolumny nienia kolumny preparatywnej stosowane spreparatywnej stosowane sąą takie takie „„zabiegizabiegi””, jak dynamiczna , jak dynamiczna kompresja osiowa zkompresja osiowa złłoożża (DAC), albo/i kompresja radialna a (DAC), albo/i kompresja radialna (promieniowa) wype(promieniowa) wypełłnienia.nienia.

WypeWypełłnienie ziarniste kolumny HPLCnienie ziarniste kolumny HPLC

WypeWypełłnienie monolitycznenienie monolityczne

DYSPERSJA MASY w KOLUMNIE

Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny – wzrasta H i spada N

Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H),tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych – tym wyższa sprawność

rozdzielania - także - kolumny

Dyspersja strefDyspersja strefzjawisko niekorzystne, zjawisko niekorzystne, jednak, nieuniknionejednak, nieuniknione

Zjawiska powodujZjawiska powodująące dyspersjce dyspersjęę-- Dyfuzja Dyfuzja „„wirowawirowa”” (A);(A);-- Dyfuzja molekularna (B);Dyfuzja molekularna (B);-- Opory przenoszenia masy (C)Opory przenoszenia masy (C)1.1. w fazie ruchomej (Cm),w fazie ruchomej (Cm),2.2. w fazie stacjonarnej (Cs)w fazie stacjonarnej (Cs)

RRóównanie wnanie VanVan DeemterDeemter’’aa, ,

H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u

albo bardziej adekwatne dla albo bardziej adekwatne dla LCLC––rróównaniawnania: : KnoxKnox’’aa, lub , lub GiddingsGiddings’’aa

CBAH +=min

BCAH +=min

CBuopt =

ZaleZależżnonośści najprostsze, aktualne dla CGC ci najprostsze, aktualne dla CGC –– w przypadku w przypadku HPLC, tylko w przybliHPLC, tylko w przybliżżeniu i co do zasadyeniu i co do zasady

Instrumentalizacja chromatografiiInstrumentalizacja chromatografii–– aparatura chromatograficzna aparatura chromatograficzna --

NaleNależży zapewniy zapewnićć::-- StaStałłe e (w, u = (w, u = constconst)),, albo zmienne w funkcji czasu, albo zmienne w funkcji czasu,

zaprogramowane natzaprogramowane natężężenie przepenie przepłływu eluentuywu eluentu(u, w = (u, w = f(tf(t)))), o zaprogramowanej , o zaprogramowanej –– stastałłej ej (elucja (elucja

izokratyczna)izokratyczna), , albo zmiennej w funkcji czasu albo zmiennej w funkcji czasu --zawartozawartośści poszczegci poszczegóólnych sklnych skłładnikadnikóóww eluentu eluentu (elucja gradientowa) (elucja gradientowa)

orazoraz-- stastałąłą ((T=constT=const, warunki izotermiczne), warunki izotermiczne), , albo zmiennalbo zmiennąą, ,

zaprogramowanzaprogramowanąą w funkcji czasu w funkcji czasu ((T=f(tT=f(t), warunki ), warunki „„gradientu temperaturygradientu temperatury””) ) –– temperaturtemperaturęę separacji. separacji.

Instrumentalizacja chromatografiiInstrumentalizacja chromatografii–– aparatura chromatograficzna aparatura chromatograficzna --

NaleNależży taky takżże:e:-- ZapewniZapewnićć czuczułąłą, wystarczaj, wystarczająąco co

uniwersalnuniwersalnąą, albo wysoce specyficzn, albo wysoce specyficznąą ( oraz, ( oraz,

o ile to moo ile to możżliwe)liwe) liniowliniowąą w szerokim zakresie w szerokim zakresie ststężężeeńń detekcjdetekcjęę obecnoobecnośści i zawartoci i zawartośści ci rozdzielanych substancji w eluacie rozdzielanych substancji w eluacie wypwypłływajywająącym z kolumny,cym z kolumny,

-- Celowe jest, Celowe jest, dodatkowododatkowo, stosowanie systemu , stosowanie systemu przeprzełąłączania kolumn i zapewnienie czania kolumn i zapewnienie momożżliwoliwośści stosowania przepci stosowania przepłływu ywu zwrotnego w kolumnie chromatograficznejzwrotnego w kolumnie chromatograficznej

SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO – etap kondycjonowania kolumny

SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO - etap rozdzielania substancji

Schemat aparatu pompowego PGSchemat aparatu pompowego PG

D

Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu HPLC do zastosowaHPLC do zastosowańń w dydaktyce w dydaktyce –– elucja izokratycznaelucja izokratyczna

Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu HPLC do zastosowaHPLC do zastosowańń w dydaktyce w dydaktyce –– elucja gradientowaelucja gradientowa

SYSTEM PRZESYSTEM PRZEŁĄŁĄCZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEPCZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEPŁŁYWU ZWROTNEGOYWU ZWROTNEGO

Thin Layer: 1889Thin Layer: 1889Chromatografia planarna Chromatografia planarna –– cienkowarstwowa (TLC), bibucienkowarstwowa (TLC), bibułłowa (PC)owa (PC)

FAZA RUCHOMA

FAZA RUCHOMA

a

b

cd

daRf =1

dbRf =2

dcRf =3

k= ( 1/Rf ) - 1

Detekcja Detekcja –– Detektory w HPLC / Detektory w HPLC / TLCTLC

Detektor chromatograficzny Detektor chromatograficzny –– przepprzepłływowy instrument ywowy instrument analityczny o znikomej objanalityczny o znikomej objęętotośści naczyci naczyńńka pomiarowego;ka pomiarowego;Nie istnieje dotychczas w peNie istnieje dotychczas w pełłni uniwersalny detektor w LC, ni uniwersalny detektor w LC, ststąąd stosuje sid stosuje sięę wiele rwiele róóżżnych;nych;Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowoZnaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowośści ci odpowiedzi detektora we wspodpowiedzi detektora we wspóółłczesnej HPLC;czesnej HPLC;UV (200UV (200--400nm)/ UV400nm)/ UV--VIS (200VIS (200--800 nm) i szczeg800 nm) i szczegóólne lne znaczenie detektora typu DAD (znaczenie detektora typu DAD (diodediode arrayarray detectordetector))RID (RID (refractiverefractive indexindex detectordetector))LLSD (laser LLSD (laser lightlight scatteringscattering detectordetector) ) FLD (FLD (fluorescencefluorescence detectordetector))ElEl--D (D (electrochemicalelectrochemical detectordetector, typ , typ amperometrycznyamperometryczny))CD (CD (coductometriccoductometric detectordetector -- supresjasupresja jonjonóów eluentu)w eluentu)LCLC--MS, MS, LCLC--MSMS--MSMS (mas (mas -- spectrometryspectrometry))inne (FTIR, NMR, LCinne (FTIR, NMR, LC--FID, Radiometryczny, Polarymetryczny, FID, Radiometryczny, Polarymetryczny, Pomiaru momentu dipolowego, ....)Pomiaru momentu dipolowego, ....)Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika derywatyzacji postderywatyzacji post--kolumnowej w przypadku HPLC kolumnowej w przypadku HPLC

Nowoczesna detekcja i detektoryNowoczesna detekcja i detektory-- UVUV--DADDAD, LC, LC--MS, GCMS, GC--MS MS --

PojPojęęcie absorpcji cie absorpcji śświatwiatłła, prawo absorpcji a, prawo absorpcji śświatwiatłła: a: [[--lg(Ilg(I//IIoo)]= )]= lg(Ilg(Ioo//I)=I)=ABS=kABS=k * * c c ** llWidmo, jakie informacje niesie widmo ?Widmo, jakie informacje niesie widmo ?Chromatogram detektora Chromatogram detektora UVUV--DADDAD -- kilkadziesikilkadziesiąąt t chromatogramchromatogramóów jednoczew jednocześśnienieNajwygodniejsze Najwygodniejsze -- odwzorowanie poziomicoweodwzorowanie poziomicoweWnikliwa analiza przebiegu widma umoWnikliwa analiza przebiegu widma umożżliwia liwia identyfikacjidentyfikacjęę substancji o charakterystycznym substancji o charakterystycznym przebiegu widma przebiegu widma -- jednoczejednocześśnie nie -- na podstawie na podstawie retencji i cech widmaretencji i cech widmaProblem Problem –– widmo widmo „„wwłłasneasne”” skskłładnikadnikóów eluentu w eluentu

ChromatogramChromatogramWykres zaleWykres zależżnonośści stci stężężenia substancji w eluacie wypenia substancji w eluacie wypłływajywająącym z kolumnycym z kolumny

w funkcjiw funkcji objobjęętotośści elucji, a gdy natci elucji, a gdy natężężenie przepenie przepłływu eluentuywu eluentu

jest stajest stałłe e (w, u = (w, u = constconst) ) –– w funkcji czasu w funkcji czasu

Opis kaOpis każżdego chromatogramu powinien zawieradego chromatogramu powinien zawieraćć::-- cel badania, dane o prcel badania, dane o próóbce, kolumnie, warunkach elucjibce, kolumnie, warunkach elucji(sk(skłładniki i skadniki i skłład eluentu , albo skad eluentu , albo skłładniki eluentu i program elucji), adniki eluentu i program elucji), -- zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program dzastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program dłługougośści fali,ci fali,-- nazwy substancji odpowiadajnazwy substancji odpowiadająących pikom chromatograficznym cych pikom chromatograficznym

Zasady opisu chromatogramu HPLC / TLCZasady opisu chromatogramu HPLC / TLC

- Co to jest i co szczegCo to jest i co szczegóólnego przedstawia ?lnego przedstawia ? (np. (np. „„Chromatogram rozdzielania skChromatogram rozdzielania skłładnikadnikóów w metanolowego ekstraktu rometanolowego ekstraktu rośśliny z gatunku liny z gatunku Dionea,Dionea, otrzymany w warunkach ukotrzymany w warunkach ukłładu faz adu faz odwrodwróóconych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego progconych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego programu elucjiramu elucji””, , chromatograf MERCKchromatograf MERCK--HITACHI, HITACHI, LaChromLaChrom););- PrPróóbka, warunki rozdzielania, warunki detekcjibka, warunki rozdzielania, warunki detekcji--PrPróóbka: .... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu libka: .... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu liśści ..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztwci ..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztwóórrmieszaniny wzorcmieszaniny wzorcóów w MeOH o stw w MeOH o stężężeniu kaeniu każżdego skdego skłładnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.; adnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.;

-- Kolumna i wypeKolumna i wypełłnienie kolumny (np. nienie kolumny (np. „„Lichrocart 125 x 4 mm Lichrocart 125 x 4 mm i.d., Lichrospher RP 18e 5 umi.d., Lichrospher RP 18e 5 um));;-- Eluent / program elucji (np. eluent: MeOHEluent / program elucji (np. eluent: MeOH--H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A: H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A: woda dejonizowana + 0.75% v/v TFA, eluent B: woda dejonizowana + 0.75% v/v TFA, eluent B: MeOHMeOH--AcCNAcCN--THFTHF 45/45/4545/10 v/v+0.75% TFA, /10 v/v+0.75% TFA, program elucji: 0 do 5 min program elucji: 0 do 5 min -- 5% B, 5 do 25 min 5% B, 5 do 25 min –– 5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min 5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min –– 95% B;95% B;

--PrzepPrzepłływ i ewentualnie ciyw i ewentualnie ciśśnienie (np. 1.5 ml/min, (9.5 nienie (np. 1.5 ml/min, (9.5 -- 17 17 MPaMPa));));--Detektor i warunki detekcji (np. detektor UVDetektor i warunki detekcji (np. detektor UV--VIS typ DAD, LVIS typ DAD, L--7450A MERCK, albo detektor 7450A MERCK, albo detektor UVUV--254 nm z kuwet254 nm z kuwetąą o czuo czułłoośści 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10 ci 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10 mVmV) itp., itd. ) itp., itd. Piki chromatograficznePiki chromatograficzne: (powinna by(powinna byćć informacja o kainformacja o każżdym piku, np. 1 dym piku, np. 1 –– beta karoten, 2 1OHbeta karoten, 2 1OH--naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5, naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5, 77--9. substancje nieznane, 6. 19. substancje nieznane, 6. 1--CH3 CH3 Naftalen, itp., itd. ...)Naftalen, itp., itd. ...)Warunki szczegWarunki szczegóólne i informacje dodatkowelne i informacje dodatkowe (je(jeśśli dotyczy ...).li dotyczy ...).W ten sposW ten sposóób powinien byb powinien byćć opisany kaopisany każżdy dy chromatogramchromatogram zazałąłączony do sprawozdania czony do sprawozdania laboratolaborato--ryjnegoryjnego, w pracy naukowej, albo raporcie z bada, w pracy naukowej, albo raporcie z badańń. Ka. Każżdy wydruk raportu powinien miedy wydruk raportu powinien miećć opis opis danych, ktdanych, któóre zawiera, more zawiera, możże to bye to byćć w czw częśęści zrealizowane w formie zastosowania symboli i ci zrealizowane w formie zastosowania symboli i wyjawyjaśśnienia znaczenia symboli. Kanienia znaczenia symboli. Każżdy raport powinien zawierady raport powinien zawieraćć teteżż informacjinformacjęę o wykonawcy o wykonawcy badania oraz datbadania oraz datęę i czas wykonania badania.i czas wykonania badania.

Widmo-piren –Funkcja analizy

jakościowej

Chromatogram – program dł. FaliFunkcja analizy ilościowej

Chromatogram detektora UV-DAD– odwzorowanie poziomicowe

ABS=f(t, λ)

ABS-f(t)

ABS=f(λ)

PrzykPrzykłłady zastosowaady zastosowańń LC LC -- HPLC TLCHPLC TLC

-- rozdzielanie grupowe i przygotowanie prrozdzielanie grupowe i przygotowanie próóbek do analizybek do analizy-- rozdzielanie rozdzielanie „„szczegszczegóółłoweowe”” i oznaczanie ski oznaczanie skłładnikadnikóóww-- otrzymywanie substancji otrzymywanie substancji -- preparatywne / procesowepreparatywne / procesowe

Biologia, fizjologia, farmakognozja, Biologia, fizjologia, farmakognozja, farmakologia; farmacja, produkcja lekfarmakologia; farmacja, produkcja lekóów;w;Biochemia, biologia molekularna, genetyka;Biochemia, biologia molekularna, genetyka;Kontrola i zanieczyszczenia Kontrola i zanieczyszczenia żżywnoywnośściciEkologia, monitoring Ekologia, monitoring śśrodowiska naturalnegorodowiska naturalnegoKontrola jakoKontrola jakośści surowcci surowcóów i produktw i produktóów w Kontrola procesowa, Kontrola procesowa, w tymw tym, laboratoryjna, laboratoryjnaMedycyna, weterynaria, analityka klinicznaMedycyna, weterynaria, analityka klinicznaBiotechnolgiaBiotechnolgia, przemys, przemysłł farmaceutycznyfarmaceutyczny

PrzykPrzykłład chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji ad chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji produktu naftowego z zastosowaniem detektora produktu naftowego z zastosowaniem detektora UVUV--VIS/DADVIS/DAD

Setki, a nawet tysiące substancji w każdej grupie

Widok pasm kilku skWidok pasm kilku skłładnikadnikóów ekstraktu w ekstraktu acetonowego trawy przez szklanacetonowego trawy przez szklanąą śściancianęękolumny HPLC typu CN, eluent kolumny HPLC typu CN, eluent –– heksan heksan ––

MTBE MTBE -- THF; kolejnoTHF; kolejnośćść pasm pasm -- od dood dołłu: u: produkt rozkprodukt rozkłładu chlorofilu, chlorofil A, adu chlorofilu, chlorofil A,

carotenoidycarotenoidy--II, chlorofil B, , chlorofil B, carotenoidycarotenoidy--IIII

ІІ kierunekkierunek

ΙΙ przepprzepłływuywu

ΙΙ eluentueluentu

νν od god góóry ry

νν do dodo dołłuu

Warunki rozdzielania Warunki rozdzielania

–– Kolumna 150x3mm, Kolumna 150x3mm, SeparonSeparon CN 5 um ,eluent: CN 5 um ,eluent: heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v), prheksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v), próóbka 30 uL bka 30 uL

ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowaekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa

NatNatężężenie przepenie przepłływu eluentu w=0.8 mL/minywu eluentu w=0.8 mL/min

Chromatogram Chromatogram UVUV--DADDAD powstapowstałły podczas rozdzielania ekstraktu y podczas rozdzielania ekstraktu izolowanego z trawy za pomocizolowanego z trawy za pomocąą acetonu. Warunki rozdzielania: acetonu. Warunki rozdzielania:

Kolumna Kolumna EurospherEurospher CN, 7um; eluent heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 CN, 7um; eluent heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v)(v/v/v)

MonitoringMonitoring śśrodowiska rodowiska –– oznaczanie zawartooznaczanie zawartośści WWAci WWA

1 2 3 4

5

6

7

Kolumna Lichrospher RP 18 125mmx4mm 5μm, CH3CN-H2O 75-25 v/v, 1.5 mL/min, UV-DAD 220-400 nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3-naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren.

Metody kalibracjiMetody kalibracji-- Metoda krzywej kalibracyjnej Metoda krzywej kalibracyjnej ((externalexternal standard)standard)--Metoda wzorca wewnMetoda wzorca wewnęętrznego trznego ((internalinternal standard)standard)-- Metoda normalizacji Metoda normalizacji ((NormalizationNormalization))---- uproszczona uproszczona ((simplifiedsimplified)),,---- ze wspze wspóółłczynnikami czynnikami kalibarcyjnymikalibarcyjnymi ((correctioncorrection factorsfactors))--Metoda dodatku wzorca Metoda dodatku wzorca (standard (standard additionaddition) ) -- co najmniej dwa rozdzielaniaco najmniej dwa rozdzielania