Analiza specjacyjna czy metalomika?

Beata GodlewskaBeata Godlewska--ŻŻyyłłkiewiczkiewiczUniwersytet w BiaUniwersytet w Białłymstokuymstoku

Nowoczesne przyrządy pomiarowe jako narzędziaw pozyskiwaniu informacji naukowych

Ślesin 12-14 V 2008

SpecjacjaSpecjacjaWystWystęępowanie i rozmieszczenie rpowanie i rozmieszczenie róóżżnych chemicznych nych chemicznych i fizycznych form danego pierwiastka w rzeczywistych i fizycznych form danego pierwiastka w rzeczywistych prpróóbkach bkach

Analiza specjacyjnaAnaliza specjacyjnaAnaliza majAnaliza mająąca na celu identyfikacjca na celu identyfikacjęę i/lub pomiar i/lub pomiar zawartozawartośści jednej lub kilku form chemicznych ci jednej lub kilku form chemicznych pierwiastka w prpierwiastka w próóbcebce

wg IUPAC 2000

Pure Appl. Chem. 72 (2000) 1453

Oznaczanie i identyfikacja Oznaczanie i identyfikacja metale i metaloidymetale i metaloidy

ŚŚrodowiskorodowiskoPrzemysPrzemysłł chemicznychemiczny

MedycynaMedycyna

Biochemia roBiochemia rośślin i zwierzlin i zwierząąt, t, żżywienie, ekotoksykologiaywienie, ekotoksykologia

Metaloenzymy ‏Leki (Pt, Ru, Ti)‏Białka transportująceKwasy nukleinowe‏

Metaloporfiryny (Ni, V, Fe) ‏Katalizatory (Ru, Rh, Ni)Metylortęć, org.arsen(oleje, paliwa) ‏

Zw. metalorganiczne(Hg, Pb, Cd, Sn) ‏Różne stopnie utlenienia(As(III)/As(V), Cr(III)/Cr(V),Se(IV)/Se(VI), Fe(II)/Fe(III)‏

Zw. metaloorganiczneMetalotioneiny‏, fitochelatyny ‏Polisacharydy ‏Zw. makrocykliczne (kobalamina)

Obszary zainteresowania analizy specjacyjnej

Pierwiastki ważne w biologii i medycynie

RnAtPoBiPbTlHgAuPtIrOsReWTaHfLaBaCs

AcRa Fr

XeITeSbSnInCdAgPdRhRuTcMoNbZrYSrRb

KrBrSeAsGeGaZnCuNiCoFeMnCrVTiScCaK

ArClSPSiAl.MgNa

NeFONCBBeLi

HeHistotne fizjologicznie

toksyczne

istotne w farmakologiii diagnostyce

Kliniczny i biochemiczny aspekt specjacjiKontrola homeostazy, metabolizmu i detoksykacji pierwiastkKontrola homeostazy, metabolizmu i detoksykacji pierwiastkóów w niezbniezbęędnych do prawiddnych do prawidłłowego funkcjonowania organizmowego funkcjonowania organizmóóww

WyjaWyjaśśnienie mechanizmnienie mechanizmóów transformacji biochemicznej jonw transformacji biochemicznej jonóów metali i w metali i prostych zwiprostych zwiąązkzkóów nieorganicznych w organizmach w nieorganicznych w organizmach żżywychywych

Oznaczanie zwiOznaczanie zwiąązkzkóów o wysokich masach czw o wysokich masach cząąsteczkowychsteczkowychzwizwiąązki metalorganiczne (zki metalorganiczne (arsenobetaina, arsenocholina, arsenobetaina, arsenocholina, selenoaminokwasy)selenoaminokwasy)kompleksy z biakompleksy z białłkami: biakami: białłka transportujace (ka transportujace (Al, Cu, Zn, FeAl, Cu, Zn, Fe), ), fitochelatyny (fitochelatyny (Cd, Cu, Zn, CoCd, Cu, Zn, Co), metalotioneiny (), metalotioneiny (Cd, Cu, ZnCd, Cu, Zn)) ‏‏metaloenzymy (metaloenzymy (Zn, Co, MoZn, Co, Mo)) ‏‏mmetaloetalocukry cukry (Pb, Sr, Ca)(Pb, Sr, Ca), pochodne chlorofilu (, pochodne chlorofilu (Mg)Mg), kobalaminy , kobalaminy

(Co), glikoproteiny, kwasy nukleinowe (Co), glikoproteiny, kwasy nukleinowe (Cr, Pt, Ru, Ni)(Cr, Pt, Ru, Ni) ‏‏

Ewolucja analizy specjacyjnej

Model układu biologicznego

Haraguchi, JAAS 19 (2004) 5

Proteomikaproteom - protein complement of the genome

Kompleksowa analiza skKompleksowa analiza skłładu biaadu białłkowego danej kowego danej komkomóórki, tkanki lub organizmurki, tkanki lub organizmu

MetabolomikaKompleksowa analiza metabolitKompleksowa analiza metabolitóów komw komóórkowych,rkowych,substancji masubstancji małłoczocząąsteczkowych: aminokwassteczkowych: aminokwasóów,w,kwaskwasóów organicznych, jonw organicznych, jonóów metaliw metali

„„The variety of paths which individual elements The variety of paths which individual elements follow in any organ adds to the specific follow in any organ adds to the specific character of the organisms. Clearly the paths character of the organisms. Clearly the paths have evolved to create an have evolved to create an elemental distributionelemental distributionwhich we shall call the which we shall call the metallomemetallome, to parallel , to parallel the nomenclature of protein distribution, the the nomenclature of protein distribution, the proteomeproteome..””

R.J.P. Williams, Coord Chem Rev 216 (2001) 583 R.J.P. Williams, Coord Chem Rev 216 (2001) 583

elemental distribution in biological cells and organselemental distribution in biological cells and organs

Metalom

Metalomika Metalomika „„Identyfikacja Identyfikacja bioczbiocząąsteczek zwisteczek zwiąązanych z jonami zanych z jonami metali oraz metali oraz wyjaśnienie ich funkcjifunkcji w ukw ukłładach adach biologicznychbiologicznych””

Metalom (metallome)Metalom (metallome) -- „„czcząąsteczka steczka biologiczna zwibiologiczna zwiąązana z metalem oraz jony metali zana z metalem oraz jony metali alkalicznych i ziem alkalicznych, ktalkalicznych i ziem alkalicznych, któóre wystre wystęępujpująąggłłóównie jako wolne jonywnie jako wolne jony””

H. Haraguchi, J Anal At Spectrom 19 (2004) 5H. Haraguchi, J Anal At Spectrom 19 (2004) 5

metal assisted function biochemistrymetal assisted function biochemistry

Metalomika„„Wszechstronna analiza wszystkich form Wszechstronna analiza wszystkich form wystwystęępowania metali i metaloidpowania metali i metaloidóów wewnw wewnąątrz trz komkomóórki lub typu tkankirki lub typu tkanki””

MetalloproteomicsMetalloproteomics -- the study of the part of the the study of the part of the metallome involving the protein ligandsmetallome involving the protein ligands

HeteroatomHeteroatom--tagged proteomicstagged proteomics –– the use of a the use of a heteroelement, naturally present in a protein or heteroelement, naturally present in a protein or introduced in a tag added by means of derivatisation, for introduced in a tag added by means of derivatisation, for the spotting and quantification of proteinsthe spotting and quantification of proteins

J. Szpunar, Analyst 130 (2005) 442J. Szpunar, Analyst 130 (2005) 442

MetalomyWolne jony metaliWolne jony metaliZwiZwiąązki metaloorganicznezki metaloorganiczne

selenoaminokwasy, arsenobetaina, arsenocholina selenoaminokwasy, arsenobetaina, arsenocholina MetaloproteinyMetaloproteiny

metalotioneiny (Cu, Zn, Cd, Hg)metalotioneiny (Cu, Zn, Cd, Hg) ‏‏fitochelatyny (Cu, Hg, Cd)fitochelatyny (Cu, Hg, Cd) ‏‏ferrytyna, hemoglobina (Fe) ferrytyna, hemoglobina (Fe)

MetaloenzymyMetaloenzymykarboksypeptydaza (Zn)karboksypeptydaza (Zn) ‏‏nitrogenaza (Fe,Mo)nitrogenaza (Fe,Mo) ‏‏dysmutaza ponadtlenkowa dysmutaza ponadtlenkowa (Mn, Fe, Cu)(Mn, Fe, Cu) ‏‏

Techniki połączone stosowane w analizie specjacyjnej oraz metalomice

R. Łobiński, Biochimie 88 (2006) 1591

HPLC ICP-MS

CE ICP-MS

ICP

MS

próbka

Chromatografiacieczowa

Elektro-chromatografia

Rozdzielanie jednowymiarowe

A. Sanz-Medel et al. Anal Bioanal Chem 377 (2003) 236K. Połeć et al. J Anal At Spectrom 15 (2000) 1363

Chromatografia cieczowa

Jonowymienna, ICWykluczania, SECOdwróconych faz, RP

transferyna

ceruloplazminaalbuminaSurowica krwi

Cd-metalotioneiny - wątroba królika

IC-HPLC-ICP-MS

Badania Ni i Cu związanych z białkami w organach myszy SEC-ICP-MS (kolumna LMM)‏

Gomez-Ariza, Anal Bioanal Chem 380 (2008) 17

Ni

Cu

Metalotioneinyz wątroby królika

Wang i Prange; Anal Chem 74 (2002) 626

ElektrochromatografiaElektroforeza kapilarna, CEKapilarna elektroforezastrefowa, CZE

CE-ICP-MS

Badania oddziaływania różnych form rtęciz DNA (CE-ETAAS)

Metylortęćmetylortęć

etylortęć

fenylortęć

Hg(II)‏

12 h czas inkubacji Hg z DNA

CE: kapilara 40 cm, 12kV, bufor H3BO3-Tris, pH= 9,5

ETAAS: termosprayszczelina 2,6 nm

Li et.al., Anal. Chem 78 (2006) 611

Rozdzielaniejednowymiarowe

Elektroforeza żelowa

SeMet-CaM

1D SDS-PAGE LA-ICP-MS

LA

Ablacja laserowa

Chromatogram moczu (1:1)RP18- ICP - MS

Jakubowski et al.; JAAS 16 (2001) 457

Chromatogram moczu (1:1)‏

Jakubowski et al.; JAAS 16 (2001) 457

Analizatormas

roztwór białek

Identyfikacja selenizowanej kalmoduliny(SeCaM) techniką ES-MS

Łobiński et al.; JAAS 20 (2005) 493

Widmo po dekonwolucji

LA ICP-MS

ICP MS

Chromatografiawielowymiarowakolumnowa

Metalotioneiny wątrobykrólika związane z Cd

Elektroforeza dwuwymiarowa

Rozdzielenie białek wg ładunku i masy cząsteczkowej 2-DE (CGE)

Jonizacja laserowa wspomagana matrycąMALDI –TOF MS lub MALDI-QMS

Matryca: kwas synapinowykwas 2,5 dihydroksybenzoesowy

337nm

2D elektroferogrambiałek wydzielonychz mitochondriów drożdży

Becker et al. JAAS 19 (2004) 1235

Rozdzieleniebiałek 2D-PAGE

59

Poszukiwanie białek zawierającychmetale LA-ICP-MS

Sygnały 64Zn+ i 56Fe+ w rozdzielonych białkach otrzymane LA-ICP-SFMS

Identyfikacjabiałka (plamka 59)‏

Stosowane techniki:Stosowane techniki:SDS 2DSDS 2D--PAGE PAGE LALA--ICPICP--SFMSSFMSMALDIMALDI--FTICRFTICR--MSMS

Uzyskane informacje:Uzyskane informacje:Zawiera P, S, Zn, Fe, Cu Zawiera P, S, Zn, Fe, Cu Liczba atomLiczba atomóów S w S –– 1414Zu/S=0,006; Fe/S=0.03Zu/S=0,006; Fe/S=0.03StStężężenie Zn 3,4 mg/g enie Zn 3,4 mg/g

Fe 0,87 mg/gFe 0,87 mg/gMasa 35Masa 35--40 kDa40 kDa

Becker et al. JAAS 19 (2004) 1235

Aac2p Aac2p -- ggłłóówny translokator wny translokator ATP/ADP mitochondriATP/ADP mitochondrióóww

Zakres badań metalomikiTechnika pomiarowaBadania

Techniki sprzężone z ICP-MS

Diagnostyka medyczna

LC-ES-MS, LC-MALDI-MS, GE- MALDI-TOF-MS, LC-ICP-MS, LA-ICP-MS

Identyfikacja biocząsteczek zawierających metale, metaloprotein, metaloenzymów

GC-MS, ES-MS Metabolizm cząsteczek biologicznych i metali (metabolomów) ‏

Techniki sprzężone: LC-ICP-MS, GC-ICP-MS, MALDI-MS

Specjacja chemiczna pierwiastków w próbkach i układach biologicznych

Techniki analizy pierwiastkowej np. ICP-MS

Rozmieszczenie metali w płynach biologicznych, komórkach, narządach

Prange, ABC 383 (2005)‏372

ICPICP ESIESI MALDIMALDI

Analizowane masyAnalizowane masy 0,010,01--1kDa1kDa 0,050,05--100 kDa100 kDa 11--1000 kDa1000 kDa

Rodzaj prRodzaj próóbkibki ciekciekłłe, gazowe,e, gazowe, ciekciekłłee stastałłeestastałłe e (LA)(LA) ‏‏

SprzSprzężężenieenie z kolumnz kolumnąą z kolumnz kolumnąą planarneplanarneHPLC, CEHPLC, CE HPLCHPLC 2 DE2 DEplanarne (LA)planarne (LA) 2D2D--PAGEPAGE

Rodzaj informacjiRodzaj informacji identyfikacja identyfikacja identyfikacjaidentyfikacja identyfikacja czidentyfikacja cząąst.,st.,pierwiastka, pierwiastka, czcząąsteczkisteczki sekwencja sekwencja analizaanaliza aminokwasaminokwasóów,w,izotopowa,izotopowa, „„imagingimaging”” MSMSiloilośściowaciowa

Cykl geochemiczny związków metaloorganicznych w środowisku

Proteomika

Najnowsze trendy

Cu związana z białkami o różnych masach cząsteczkowych w organach myszySEC-ICP-MS (kolumna LMM) ‏

Gomez-Ariza, Anal Bioanal Chem 380 (2008) 17

Metody bezpoMetody bezpośśrednierednie::Oznaczanie specjacji arsenu, selenu, antymonu w materiaOznaczanie specjacji arsenu, selenu, antymonu w materiałłach ach

biologicznych technikbiologicznych technikąą generowania wodorkgenerowania wodorkóówwAs(III) i As(V), Se(IV) i Se(VI), Sb(III) i Sb(V)As(III) i As(V), Se(IV) i Se(VI), Sb(III) i Sb(V) ‏‏

Funkcje metali w układach biologicznych

Strukturalne (Ca, Mg)Strukturalne (Ca, Mg) ‏‏

Kontrola rKontrola róównowagi kwasowownowagi kwasowo--zasadowej oraz zasadowej oraz ciciśśnienia osmotycznego (Na, K)nienia osmotycznego (Na, K) ‏‏

Przenoszenie Przenoszenie łładunku (Na, K, Ca)adunku (Na, K, Ca) ‏‏

Stabilizacja struktury biaStabilizacja struktury białłek (Zn) oraz kwasek (Zn) oraz kwasóów w nukleinowych (Na, Mg)nukleinowych (Na, Mg) ‏‏

Przenoszenie elektronPrzenoszenie elektronóów (biaw (białłka ka żżelazowoelazowo--siarkowe, siarkowe, biabiałłka miedziowe)ka miedziowe) ‏‏

Aktywacja enzymAktywacja enzymóów, np. karboksypeptydazy, w, np. karboksypeptydazy, anhydraza wanhydraza węęglanowej, oksydoreduktazy glanowej, oksydoreduktazy

Oddychanie komOddychanie komóórkowe (Fe, Cu)rkowe (Fe, Cu) ‏‏

Techniki połączone stosowane w metalomice

CE

HPLC

Elektroforezażelowa

Elektro-chromatografia

SDS-PAGE

IEF

IC

RPSEC

CECMEKC

Rozdzielanie Detekcja MS

Atomowa ICP-MS

CząsteczkowaES-MS

MALDI TOF MS

Proteomikaproteom - protein complement of the genome

Kompleksowa analiza skKompleksowa analiza skłładu biaadu białłkowego danej kowego danej komkomóórki, tkanki lub organizmurki, tkanki lub organizmuWyodrWyodręębnianie krbnianie króótkich sekwencji aminokwastkich sekwencji aminokwasóów w (peptyd(peptydóów) czyli poszukuje siw) czyli poszukuje sięęmap peptydowych map peptydowych -- peptydy dzieli sipeptydy dzieli sięę, identyfikuje, , identyfikuje, --informacja o masie czinformacja o masie cząąsteczkowej i kolejnosteczkowej i kolejnośści ci aminokwasaminokwasóów wybranych peptydw wybranych peptydóów w -- poszukiwanie poszukiwanie rróóżżnic w profilach bianic w profilach białłkowych, ktkowych, któórymi rrymi róóżżniniąą sisięęosobnicy zdrowi i chorzyosobnicy zdrowi i chorzy