WIRUSOLOGIA MOLEKULARNA

Skrypt do ćwiczeń

2015

Zakład Wirusologii

dr Monika Adamczyk-Popławska

dr Agnieszka Kwiatek

dr Monika Radlińska

Instytut Mikrobiologii

Wydział Biologii UW

2

nr ćwiczenia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

infekcyjne

bakteriofagów

(liza i lizogenia)

liza i

lizogenia

faga - test

kroplowy

uzyskanie lizogenów

faga HP1

analiza

wyników lizy

i lizogenii

faga

izolacja lizogenów

faga wt (1)

izolacja

lizogenów

faga HP1 (1)

izolacja

lizogenów

faga wt (2)

izolacja lizogenów

faga HP1

(2)

izolacja i

uzyskanie

lizogenów

faga HP1 i

wt - odczytanie i

analiza

wyników

Techniki

namnażania

wirusów i

oznaczanie ich

miana

namnażanie

faga vir (1)

namnażanie

faga vir (2)

oznaczanie miana faga

vir

oznaczanie

miana faga

vir – odczytanie

wyników

Mechanizmy

obronne bakterii

przed infekcją

bakteriofagami

infekcja

abortywna

(1)

restrykcja-

modyfikacja (1)

infekcja

abortywna

(2)

restrykcja-

modyfikacja (2)

odczytanie i

analiza

wyników

Metody indukcji

profagów

indukcja

faga HP1

indukcja

faga CIts857S7 (1)

indukcja

faga CIts857S7 (2)

indukcja faga

CIts857S7 - analiza wyników

Otrzymanie

biblioteki

fragmentów

restrykcyjnych

faga HP1 w

wektorze

plazmidowym

pBluescript KS

II (+)

izolacja

DNA faga HP1

przygotowanie

substratów rekombinacji DNA:

- trawienie

restrykcyjne DNA faga HP1 i wektora

pBluescript;

- ligacja w/w DNA

wprowadzen

ie zrekombino

wanego

DNA do komórek E.

coli -

transformacja

izolacja i

analiza restrykcyjna

DNA

rekombinantów

analiza

wyników

Diagnostyka

wirusologiczna

izolacja

DNA chromosoma

lnego H.

influenzae

wykrywanie

materiału genetyczneg

o wirusów

(technika PCR)

analiza

wyników

Phage Display immobilizacja białka

dodanie

biblioteki bakteriofago

wej

elucja i namnożenie

specyficznie

związanych fagów

wytrącanie i mianowanie faga

namnożenie fagów

izolacja DNA faga

M13

analiza wyników

Transfekcja

H .influenzae

DNA faga HP1

izolacja DNA faga HP1

wykonanie analiza wyników

Elementy

bakteriofagowe

wykorzystywane

w biologii

molekularnej

wykonanie

3

3

ĆWICZENIE 1

Cykle infekcyjne bakteriofagów: liza i lizogenia (1)

Techniki namnażania bakteriofagów (1)

Część teoretyczna

Wirusy są bezwzględnymi wewnątrzkomórkowymi pasożytami, o budowie niekomórkowej,

pozbawionymi własnego metabolizmu. Materiałem genetycznym wirusów jest DNA lub RNA. Te

dwa rodzaje kwasu nukleinowego nigdy nie występują jednocześnie w tej samej cząstce wirusowej.

Genom wirusów zawiera informację genetyczną niezbędną do odtwarzania cząstek potomnych

wirusa i syntezy enzymów, czyli zawiera geny kodujące informacje o budowie (sekwencji

nukleotydowej) rdzenia oraz białkowego kapsydu. Natomiast genom wirusów nie koduje żadnej

informacji genetycznej dotyczącej własnych układów enzymatycznych, jakie są potrzebne do

przeprowadzania procesów metabolicznych (np. aparatu do wytwarzania i przekształcania energii,

ani do syntezy białek). Nukleinowy rdzeń otoczony jest białkowym kapsydem. Kapsyd zbudowany

jest z kapsomerów, które są uorganizowanymi oligomerami zbudowanymi najczęściej z 5 – 6

cząsteczek białka. Kapsyd może zawierać jeden rodzaj białka, ale zazwyczaj zawiera dwa lub więcej

rodzajów. Symetria kapsydu może być helikalna (pałeczkowata) lub ikosaedralna (bryłowa, kulista).

Kapsydy ikosaedralne są najczęściej ikosaedrami (dwudziestościami) lub dodekaedrami

(dwunastościanami). Ponadto występują wirusy posiadające symetrię złożoną. Kapsyd i rdzeń

nukleinowy tworzą nukleokapsyd. Nukleokapsyd może być „nagi” lub okryty dodatkową osłonką.

Osłonki zawierają białka, cukry i tłuszcze.

Wirion jest to pojedyncza zakaźna cząstka wirusa zdolna do replikacji w żywej komórce

gospodarza.

Wirusy ze względu na przyjęte kryterium możemy podzielić na różne grupy:

1. kryterium: komórki gospodarza:

- Wirusy bakteryjne (bakteriofagi), np. bakteriofag M13, , X174, HP1, Ngo6, CTX;

- Wirusy roślinne, np. wirus mozaiki tytoniu (TMV), wirus mozaiki kalafiora (CaMV);

- Wirusy zwierzęce, np. wirus grypy, ospy, ospy wietrznej, zapalenia wątroby (HCV, HBV,

HAV), brodawczaka ludzkiego (HPV), ludzki wirus niedoboru odporności (HIV), SV40;

- Wirusy infekujące grzyby, np. ScV L-A (wirus L-A infekujący Saccharomyces cerevisiae);

- Wirusy infekujące Protista;

2. kryterium: materiał genetyczny:

- Zawierające dwuniciowy DNA (ang. double-stranded DNA, dsDNA), dsDNA może być w

formie liniowej lub kolistej. Do tej grupy wirusów należą m.in. wirus ospy, herpeswirusy,

bakteriofag , bakteriofag HP1, HPV, bakulowirusy, bakteriofag T7;

- Zawierające jednoniciowy DNA (ang. single-stranded DNA, ssDNA), genom może być w

postaci jednej cząsteczki lub być podzielony na dwa lub więcej segmentów; DNA może być

zarówno o polarności dodatniej jak i ujemnej; np. M13, X174;

- Zawierające RNA o dodatniej polarności [(+) RNA], np. HCV, wirus różyczki;

- Zawierające RNA o ujemnej polarności [(-) RNA], genom może być w postaci jednego lub kilku

segmentów, np. wirus Ebola, wirus odry;

- Zawierające dwuniciowy RNA (dsRNA), w większości przypadków genom składa się z dwóch

lub większej liczby segmentów RNA, np. ScV L-A, rotawirusy;

4

3. kryterium: wielkość:

- Wirusy małe – do 50 nm;

- Wirusy średnie – do 150 nm;

- Wirusy duże – powyżej 150 nm;

Bakteriofagi

Bakteriofagi (fagi) to wirusy infekujące bakterie (bakteriofagi należące do 10 rodzin) i

archeony (10 rodzin). Materiałem genetycznym fagów jest: (+) ssRNA, dsRNA, ssDNA (fag M13,

X174) lub dsDNA (kolisty lub liniowy) (, T7, HP1). Cząstki wirusowe mogą mieć budowę

prostą lub złożoną. Cząstki o budowie prostej mogą mieć strukturę helikalną (M13) lub izomeryczną

(X174). W cząstkach bakteriofagowych o budowie złożonej wyróżniamy główkę i ogonek (, T7,

HP1). Główka jest ikosaedralna, przy czym ogonek może być krótki (T7), długi kurczliwy (Mu) lub

długi niekurczliwy () (Rys. 1). Wirion rzadko otoczony jest osłonką.

Etapy namnażania się bakteriofagów w komórkach gospodarza przebiegają podobnie jak

innych wirusów i obejmują następujące etapy:

- Adsorpcja cząstek fagowych do powierzchni wrażliwych komórek gospodarza (białka fagowe,

receptory, odpowiednie warunki fizyko-chemiczne, m.o.i.); proces ten polega na utworzeniu

wiązań jonowych między receptorem bakteriofagowym a receptorem bakteryjnym;

- Penetracja kwasu nukleinowego;

- Transkrypcja, translacja, replikacja bakteriofagowego materiału genetycznego;

- Składanie i dojrzewanie cząstek bakteriofagowych;

- Uwolnienie cząstek wirusowych z komórek gospodarza*;

* W określonych warunkach: (1) może nie dojść do adsorpcji cząstek fagowych do komórek

gospodarza; (2) zajdzie adsorpcja cząstek fagowych do powierzchni komórek gospodarza i

wniknięcie kwasu nukleinowego, ale: (i) DNA zostanie wbudowany w genom gospodarza – wystąpi

zjawisko lizogenii; (ii) DNA zostanie zdegradowany między innymi przez stanowiące część

systemów restrykcji–modyfikacji endonukleazy restrykcyjne komórek gospodarza (ćwiczenie 3 i 4);

(iii) wystąpi zjawisko infekcji abortywnej (ćwiczenie 3 i 4).

Komórka bakteryjna może zostać zakażona fagami, jeśli jest na nie wrażliwa (ang. sensitive).

Bakterie mogą być genetycznie oporne na zakażenie fagami. Komórki takie nie posiadają na

powierzchni, koniecznych do adsorpcji wirusa receptorów. Natomiast szczepy bakteryjne odporne

(and. resistant), to takie, które posiadają w swoim genomie wintegrowanego faga i są niewrażliwe

na infekcję takim samych lub pokrewnym fagiem. Szczep bakteryjny, który zapewnia optymalne

warunki do namnożenia się bakteriofaga to szczep permisywny, a taki, którego cechy nie pozwalają

na namnożenie się fagów to szczep restryktywny.

Rys. 1. Przykład budowy

morfologicznej bakteriofagów

złożonych.

5

Bakteria posiadająca w swoim genomie wbudowany genom infekującego ją faga to lizogen,

a bakteriofag wbudowany w genom gospodarza to profag. W genomach wielu gatunków bakterii

wykryto sekwencje profagowe. Często występuje więcej niż jedna sekwencja profagowa w jednym

genomie bakteryjnym. W skrajnych przypadkach np. w genomie Escherichia coli O157:H7 szczep

Sakai występuje 18 sekwencji profagowych, które stanowią 16% genomu gospodarza. Innym

przykładem jest Streptococcus pyogenes, który w zależności od szczepu zawiera od 4 do 6

profagów, które stanowią nawet 12% DNA gospodarza (Rys. 2).

Sekwencje profagowe mają znaczenie nie tylko ilościowe w genetyce i fizjologii bakterii, ale

również znaczenie jakościowe. Z występowaniem procesu lizogenii związana jest superinfekcja i

konwersja lizogenna. Superinfekcja jest to zjawisko polegające na tym, że bedące lizogenami

komórki gospodarza są odporne na ponowne zakażenie takim samym lub pokrewnym

bakteriofagiem. Fag adsorbuje się do odpornych komórek i wstrzykuje DNA, ale nie namnaża się w

takiej komórce.

Lizogen jest odporny na ponowne zakażenie takim samym fagiem, ale jest wrażliwy na

infekcję innym fagiem, nawet lizogenizującym ale włączającym swój genom w inne miejsce

chromosomu gospodarza.

Konwersja lizogenna jest to proces, na skutek którego komórki gospodarza nabywają nowe

cechy, w tym cechy związane z ich wirulencją. Corynobacterium diphtheriae wytwarza toksynę,

jeżeli występuje w postaci lizogena. Wirulencja Vibrio cholerae jest także związana z

występowaniem sekwencji profagowej w genomie tej bakterii. Toksyna cholery jest kodowana

przez nitkowatego profaga CTX zawierającego 10 genów, m.in. rstR, rstA, rstC, rstB, cep, orfU,

ace, zot. Gen zot koduje enterotoksynę. Innymi bakteriami, u których wykazano związek konwersji

lizogennej z chorobotwórczością są uropatogenne E. coli, Salmonella sp., Haemophilus influenzae

szczepy Sb., Pseudomonas aeruginosa (lizogenizacja profagiem D3 powoduje zmianę antygenu

powierzchniowego) (Tabela 1).

Rys. 2. Występowanie sekwencji profagowych

w genomach wybranych bakterii. Profagi

zaznaczono szarymi prostokątami. (A) S.

pyogenes szczep M1, M18 i M3 (od środka do

zewnątrz); (B) S. aureus szczep Mu50, N315,

MW2 i 8325; (C) E. coli o157:H7 Sakai,

O157:H7 EDL933, K12 i CFT073; (D) S.

enterica serovar Typhimurium LT2 i serovar

Typhi CT18 (Canchaya i wsp. 2003).

6

Tabela 1. Związek sekwencji profagowych z wirulencją niektórych bakterii patogennych.

Bakteria Fag Produkt genu

Vibrio cholerae CTX cholera toksyny

Streptococcus pyogenes T12 toksyna erytrogenna

Corynebacterium diphtheriae bakteriofag β toksyna błonicy

Clostridium botulinum CEβ toksyna botulinowa

Escherichia coli bakteriofagi lambdoidalne toksyna Shiga

Shigella dysenteriae bakteriofagi lambdoidalne Stx1 i Stx2

Ponadto znaczenie sekwencji profagowych nie ogranicza się tylko do bakterii patogennych,

ale także przystosowanie bakterii niepatogennych do ich niszy ekologicznej może być związane z

występowaniem profagów w ich genomie.

Bakteriofag lambda ()

Gospodarzem bakteriofaga lambda () są bakterie z gatunku E. coli. Bakteriofag ten należy

do rodziny Siphoviridae. jest bakteriofagiem łagodnym, tzn może wywoływać zarówno lizę jak i

lizogenię. Fag ten charakteryzuje się budową złożoną – ma główkę ikosaedralną i długi

niekurczliwy ogonek. Genom jest w postaci dwuniciowego liniowego DNA o wielkości 48 500 pz i

zakończony jest lepkimi końcami 5’ (12 nt sekwencje cos – niezbędne w procesie pakowania DNA

do główek fagowych). Do wydajnej adsorpcji wirusa na powierzchni komórek gospodarza

wymagana jest obecność Mg2+

. W czasie adsorpcji włókno ogonka (23 nm) (zbudowane z białek

gpJ) łączy się z receptorem bakteryjnym [białko LamB (część systemu transportu maltozy)]. W

genomie gospodarza znajduje się miejsce attB, a w genomie wirusa attP. Są to regiony

homologiczne, zachodzi wbudowanie DNA bakteriofaga do genomu gospodarza. W procesie tym

uczestniczą integrazy tyrozynowe. Jednym z białek odpowiedzialnych za utrzymanie stanu lizogenii

jest represor CI. Drogą alternatywą w cyklu „życiowym” bakteriofaga jest liza. Jest to proces, w

którym dochodzi do powstania i uwolnienia cząstek fagowych (Rys. 3). Liza komórek gospodarza

zachodzi w bogatym podłożu, optymalnej temperaturze i niskim m.o.i (ang. multiplicity of

infection). Widocznym objawem lizy na hodowli bakteryjnej prowadzonej na podłożu stałym jest

łysinka. Każda łysinka zawiera ok. 106

cząstek wirusowych. Natomiast uboga pożywka, niska

temperatura oraz wysokie m.o.i. sprzyjają lizogenii. Indukcja profaga (przejście od stanu lizogenii

do lizy) może nastąpić spontanicznie lub być indukowana czynnikami fizycznymi, np.

promieniowanie UV, lub chemicznymi, np. mitomycyna C.

7

Dziki szczep lambdy jest bakteriofagiem łagodnym, czyli takim, który może powodować

zarówno lizę jak i lizogenię. Natomiast w laboratoriach skonstruowano kilka zmutowanych

szczepów: (i) vir – wirulentna forma bakteriofaga lambda; ma zmutowany operator; zawsze

wchodzi w cykl lityczny; (ii) CIts857 – bakteriofag ze zmutowanym represorem CI; represor ten

jest temperaturowrażliwy, w temp. 30C ma prawidłową konformację, a w temp. 42C ma

nieprawidłową; (iii) CIts857Sam7 – bakteriofag, który posiada zarówno temperaturowrażliwy represor

CI jak i mutację typu amber w genie kodującym białko S. Mutanty typu amber tworzą łysinki

jedynie na szczepach zawierających supresor dla tych mutacji.

Bakteriofag HP1

Gospodarzem bakteriofaga HP1 jest Haemophilus influenzae. Fag ten należy do rodziny

Myoviridae. Jest to bakteriofag łagodny. HP1 charakteryzuje się budową złożoną. W jego budowie

wyróżnia się główkę ikosaedralną i kurczliwy ogonek zakończony kurczliwymi włókienkami.

Genom tego wirusa stanowi dwuniciowy liniowy DNA o wielkości 32 355 pz i zakończony jest 9 nt

lepkimi końcami (tzw. sekwencje cos). Na powierzchni komórek gospodarza receptorami dla

bakteriofaga HP1 jest LOS (lipooligosacharyd).

Bakteriofagi i HP1 są przykładami bakteriofagów łagodnych. Fagi te tworzą łysinki mętne,

ponieważ lizują tylko część komórek gospodarza.

Obok bakteriofagów łagodnych występują również bakteriofagi zjadliwe (wirulentne).

Wywołują one zawsze lizę. Przykładem takiego faga jest np. bakteriofag T7 infekujący E. coli.

Rys. 3. Schemat dwóch szlaków cyklu „życiowego” bakteriofaga .

8

Namnażanie bakteriofagów

Bakteriofagi można namnażać w hodowlach stałych lub płynnych. Bakterie i fagi miesza się

w proporcjach takich, aby liczba fagów była znacząco mniejsza niż liczba bakterii (m.o.i.) (Rys. 4.

pkt 1). Mieszanina jest inkubowana w warunkach pozwalających bakteriom dzielić się i ulegać

infekcji poprzez fagi. W pierwszej metodzie, do mieszaniny bakterii i bakteriofagów należy dodać

tzw. miękki agar (półpłynny) (Rys. 4 pkt 2). Wszystko wylewamy na powierzchnię płytki agarowej

(Rys. 4. pkt 3, 4). Bakterie dzielą się, fagi infekują tylko przyległe bakterie, ponieważ są

unieruchomione w agarze. Nie zainfekowane komórki kontynuują podziały, tworząc tzw. murawę

bakterii. Zainfekowane bakterie ulegają lizie: w ten sposób powstają przejrzyste obszary na tle

zmętniałej murawy bakterii: nazywamy je łysinkami (plaque) (Rys. 4. pkt 5). Po uwzględnieniu

współczynnika rozcieńczenia faga możemy policzyć łysinki i obliczyć liczbę infekcyjnych fagów w

oryginalnej próbce. Liczbę fagów podaje się jako liczbę jednostek tworzących łysinki (pfu - ang.

plaque forming units, jednostki tworzące łysinkę).

Rys. 4. Schemat przedstawiający wykonanie płytek dwuwarstwowych.

9

Test kroplowy (spot-test)

Test polega na nakropleniu na murawkę bakteryjną

zawiesiny fagowej (np. odpowiednio rozcieńczonej). Metoda

pozwala na szybkie określenie miana faga (na jednej szalce).

Murawkę bakteryjną przygotowujemy metodą płytek

dwuwarstwowych poprzez zmieszanie szczepu bakteryjnego z

podłożem półpłynnym.

Test krzyżowy (ang. cross-streaking)

Test polega na krzyżowaniu linii z zawiesinami

fagowymi oraz linii ze szczepami bakteryjnymi. Zawiesinę

fagową nakładamy na szalkę z podłożem stałym ezą.

Pozwalamy, aby zawiesina dobrze wsiąkła w podłoże, a

następnie nanosimy zawiesiny bakteryjne (również za

pomocą ezy).

10-4

10-6

10-2

100

.

fag

bakterie

10

Część praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne:

- E. coli Top10 (-)

s r

- m

-, F

- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)80 LacZ M15 lacX74 deoR

recA1 araD139 (ara-leu) 7697 galU galK lambda^-rpsL endA1 nupG

- E. coli ER3102 (cIts857)s

- E. coli ER1562 (wt)s MM294, mcrA1272::Tn10 (Tet

r), hsdR2 (rk

-, mk

+), mcrB1

- Haemophilus influenzae Rd30 (HP1-) HP1

s

Bakteriofagi (miana fagów zostaną podane przez prowadzącego zajęcia):

- zawiesiny fagów lambda: wt, CIts857, vir

- zawiesina faga HP1

Podłoża:

- LB płynne 1% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl

- LB półpłynne skład j.w. z dodatkiem 0,7% agaru

- LB stałe skład j.w. z dodatkiem 1,5% agaru

- pożywka BHI (ang. brain heart infusion - wyciąg mózgowo-sercowy) uzupełniona

heminą stężenie końcowe w pożywce: 10 µg/ml i

dinukleotydem nikotynoaminoadeninowym (NAD): 2 µg/ml

Roztwory:

- bufor S: 50 mM TrisCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4 , 2% żelatyna (w/v)

- NAD: stężenie początkowe 0,4 mg/ml

- hemina: stężenie początkowe 1 mg/ml rozpuszczona w 0,1 N NaOH z dodatkiem L-histydyny (1

mg/ml)

Wykonanie

1. Namnażanie bakteriofaga vir (patrz rys. 4. na str. 8)

- zawiesinę faga vir rozcieńczyć w buforze SM tak, aby otrzymać ok. 106

pfu/ml;

- zmieszać w probówce 0,2 ml nocnej hodowli szczepu E. coli Top10 z 0,1 ml odpowiednio

rozcieńczonego faga vir;

- inkubować 10 min w temp. pokojowej;

- dodać 3 ml LB półpłynnego schłodzonego do temp. 45C, wymieszać i wylać na szalkę z LB

stałym;

- inkubować 12-18 h w temp. 37C;

2. Liza i lizogenia (patrz rysunek str. 9)

- wylać sześć szalek ze stałym podłożem LB, każdą szalkę podzielić na trzy części i podpisać: wt,

vir, CIts857;

- na tak przygotowane szalki wysiać powierzchniowo jeden ze szczepów: Top10, ER1562 lub

ER3102 (3 ml półpłynnego LB o temp. 45C + 0,2 ml nocnej hodowli bakteryjnej) pamiętając o

odpowiednim podpisaniu szalek, każdy szczep wysiać w 2 powtórzeniach;

- po zakrzepnięciu górnej warstwy agarowej nanieść mikropipetą na powierzchnię po 5 µl każdej

zawiesiny fagów na odpowiadający im sektor szalek;

- odczekać aż płyn z fagami wsiąknie w agar;

- inkubować 12-18 h, odpowiednio w temp. 30C lub 42C i odczytać wynik;

11

3. Uzyskanie lizogenów faga HP1 - na szalkę ze stałym podłożem BHI uzupełnionym NAD i heminą wysiać powierzchniowo

szczep Haemophilus influenzae Rd30 (3 ml półpłynnego BHI o temp. 45C + 0,1 ml nocnej

hodowli bakteryjnej);

- po zakrzepnięciu górnej warstwy agarowej nanieść mikropipetą na powierzchnię po 2 µl

zawiesiny faga HP1, odczekać aż płyn z fagami wsiąknie w agar, inkubować 12 - 18 h w temp.

37C i odczytać wynik;

Wybrana literatura:

1. Canchaya C, Proux C, Fournous G, Bruttin A, Brüssow H (2003). Prophage genomics.

Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67 (2): 238–76

2. Waldor, M.K. and Mekalanos, J.J (1996) Lysogenic conversion by a filamentous phage

encoding cholera toxin. Science, 272 (5270): 1910-4.

3. Eklund, M. W., F. T. Poysky, S. M. Reed, and C. A. Smith. (1971). Bacteriophage and the

toxigenicity of Clostridium botulinum type C. Science 172:480-482

12

ĆWICZENIE 2

Cykle infekcyjne bakteriofagów: liza i lizogenia (2)

Techniki namnażania wirusów i oznaczanie ich miana (2)

Część teoretyczna

Namnażanie wirusów prowadzi się w hodowlach zawierających wrażliwe komórki

gospodarza.

Namnażanie i izolację wirusów zwierzęcych prowadzi się w liniach komórkowych i

tkankowych. Linie komórkowe wyprowadza się z różnych tkanek i narządów człowieka. Różnią się

one wrażliwością na wirusy zaliczane do różnych grup systematycznych. Do namnażania i izolacji

wirusów wybiera się komórki najbardziej wrażliwe na poszczególne wirusy i pozwalające na

uzyskanie najwyższego zbioru zakaźnych cząstek wirusa (Tabela 2).

Tabela 2. Przykłady linii komórkowych wykorzystywanych do namnażania wirusów zwierzęcych.

Nazwa

komórek

Pochodzenie Tkanka Morfologia Wrażliwość na

wirusy

JM człowiek limfocyty T limfocyty HIV

HeLa człowiek rak szyjki macicy nabłonkowe polio1,

adenowirusy,

herpeswirusy

Chang człowiek wątroba nabłonkowe polio 1-3,

adenowirusy,

VSV

KB człowiek rak jamy ustnej nabłonkowe polio 1,

adenowirusy

WI-38 człowiek płuca fibroblastyczne polio 1, VSV,

adenowirusy

MA104 małpa nerka nabłonkowe SV40, rotawirusy

BHK chomik nerka fibroblastyczne polio 1-3, VSV,

arbowirusy,

herpes simplex

Oprócz hodowli komórkowych do namnażania wirusów wykorzystywane są również

hodowle tkankowe i narządowe. Hodowle te służą także do badania zmian patologicznych

wywoływanych przez wirusy.

Aby namnożyć wirusa w hodowli komórkowej lub tkankowej, należy uwzględnić:

(i) wrażliwość danej komórki lub tkanki na infekcję namnażanego wirusa; (ii) dawkę zakaźną

wirusa. Zakaźna dawka wirusa może być wyrażona w różnych jednostkach:

- TCID50 (ang. tissue culture infectious dose) – 50% dawka zakaźna dla hodowli komórek, czyli

takie rozcieńczenie wirusa, które wywołuje efekt cytopatyczny w 50% zakażonych hodowli

komórkowych;

- pfu (ang. plaque forming units) – jednostka łysinkotwórcza, najwyższe rozcieńczenie wirusa

wywołujące zniszczenie hodowli komórek w postaci “łysinek” dających się policzyć;

- m.o.i. – liczba cząstek wirusa przypadająca na jedną komórkę;

Odpowiednia dawka zakaźna wirusa decyduje o końcowym mianie namnażanego wirusa i

jego zdolnościach infekcyjnych. W zależności od rodzaju hodowli i wirusa, namnożonego wirusa

13

zbiera się po 18–120 godzinnej inkubacji w temperaturze odpowiadającej danemu układowi (zwykle

od 26 do 37C).

Efekt cytopatyczny to wywołany przez wirusa nieodwracalny proces zniszczenia komórki.

Efekt cytopatyczny jest charakterystyczny dla określonej grupy wirusów i w zależności od rodzaju

wirusa powoduje różne zmiany w hodowlach komórek in vitro:

- Zmiana morfologii komórek;

- Powiększenie i deformacja jądra komórkowego;

- Powstanie wtrętów komórkowych;

- Degranulacja mitochondriów;

- Rozpad błony komórkowej;

- Tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich – syncytiów;

Miano to liczba cząstek wirusowych znajdujących się w jednostce objętości. Miano pfu

ponieważ nie każda cząstka wirusowa znajdująca się w roztworze spowoduje powstanie widocznego

efektu. Aby określić rzeczywistą liczbę infekcyjnych cząstek wirusowych, przeprowadza się proces

miareczkowania wirusów.

14

Część praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne: - E. coli Top (

-)

s r

- m

-, F

- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)80 LacZ M15 lacX74 deoR recA1

araD139 (ara-leu) 7697 galU galK lambda^-rpsL endA1 nupG

- szczepy bakteryjne uzyskane w czasie ćwiczenia 1

Bakteriofagi:

- bakteriofag vir namnożony w czasie ćwiczenia 1

Podłoża - LB półpłynne

- LB stałe

- BHI

Roztwory

- bufor S

- chloroform

Wykonanie

1. Namnażanie bakteriofaga vir

- każdą z szalek zalać 4 ml buforu SM i inkubować w temp. 4C przez 2 h;

- zlać zawiesinę razem z półpłynnym agarem z każdej szalki do 200 ml kolby (wszystkie pary do

jednej kolby);

- dodać 1 ml chloroformu i wytrząsać przez 10 min w temp. pokojowej;

- zawiesinę odwirować 10 min 8 000 rpm;

- supernatant przenieść do czystej kolby, dodać 0,2 ml chloroformu i oznaczyć miano (pkt 2);

2. Oznaczanie miana faga vir

Metoda płytkowa

- przygotować 3 probówki wirówkowe typu eppendorf (eppendorfówki) zawierające po 1 ml

buforu SM;

- wykonać serię stukrotnych rozcieńczeń faga vir, pobierając do rozcieńczeń po 10 l zawiesiny

(pamiętając o zmianie końcówek pipet);

- z rozcieńczeń 10-4

i 10-6

pobrać po 0,1 ml faga vir, zmieszać z 0,2 ml nocnej hodowli szczepu

E. coli Top10 (w probówce szklanej), inkubować 10 min w temperaturze pokojowej, dodać 3 ml

LB półpłynnego i wysiać na szalki wg schematu przedstawionego na rys. 4. str. 11;

- inkubować 12-18 h w temp. 37C;

Test kroplowy (spot - test) - denko szalki z agarem podzielić markerem na cztery części i podpisać: 0, -2, -4, -6;

- do probówki z półpłynnym LB schłodzonym do temp. 45C dodać 0,2 ml nocnej hodowli

szczepu E. coli Top10 i po wymieszaniu wylać na szalkę z LB stałym;

- po zakrzepnięciu agaru półpłynnego na jego powierzchnię nanieść po 5 l odpowiedniego

rozcieńczenia faga vir (tak, aby nie uszkodzić powierzchni agaru);

- inkubować 12-18 h w temp. 37C;

15

3. Lizogenia

Test 1. Izolacja lizogenów faga wt

- pobrać ezą odrobinę materiału z łysinki na sektorze szalki podpisanej Top10/wt (ćw.1; pkt 3;

test 1);

- wysiać na podłoże LB stałe posiewem redukcyjnym, w celu uzyskania pojedynczych,

zlizogenizowanych kolonii;

- inkubować 12-18 h w temp. 37C;

Test 2. Izolacja lizogenów faga HP1 - pobrać ezą odrobinę materiału z łysinki z szalki podpisanej Haemophilus influenzae Rd30/HP1

(ćw.1; pkt 4);

- wysiać na podłoże stałe BHI uzupełnione NAD i heminą, w celu uzyskania pojedynczych,

zlizogenizowanych kolonii;

- inkubować 12-18 h w temp. 37C;

0 brak łysinek

M łysinki mętne

P łysinki przejrzyste

LM liza murawki

fag

szczep wt vir CIts857

30C 42C 30C 42C 30C 42C

Top10 (-)

s

ER1562(wt)s

ER3102(cI)s

16

ĆWICZENIA 3 i 4

Mechanizmy obronne bakterii przed infekcją bakteriofagami: restrykcja modyfikacja oraz

abortywna infekcja

Część teoretyczna

Restrykcja modyfikacja DNA

Systemy restrykcji-modyfikacji (RM) zostały przypadkowo odkryte i opisane na początku lat

50-tych XX wieku podczas prac nad bakteriofagami T-parzystymi E. coli. Ówczesnych badaczy

zaintrygował fakt, że fag po udanej infekcji jednego ze szczepów nie jest w stanie się namnożyć lub

słabo namnaża się na innym szczepie bakterii. Na tej podstawie stworzono teorię, według której

bakteria musi posiadać mechanizm obrony przed fagiem, niezwiązany z brakiem receptorów dla

faga. Takim właśnie mechanizmem są systemy restrykcji-modyfikacji. W roku 1978 Werner Arber,

Daniel Nathans i Hamilton Smith otrzymali nagrodę Nobla w dziedzinie Medycyny za odkrycie

enzymów restrykcyjnych.

Systemy RM opierają się na dwóch aktywnościach: modyfikacji (metylacji) DNA w

specyficznej sekwencji DNA i endonukleolitycznemu cięciu dwuniciowego niezmodyfikowanego

DNA. Brak modyfikacji jest sygnałem do rozpoznania DNA jako obcego. Metylacja zasad w

obrębie tylko jednej z nici DNA wystarcza, aby zablokować działanie endonukleazy restrykcyjnej.

Systemy restrykcji-modyfikacji DNA występują powszechnie u prokariota, kodowane są zarówno

przez chromosomy i plazmidy. Aktualnie systemy RM podzielono na 4 grupy (Tabela 3).

Tabela 3. Właściwości poszczególnych typów systemów restrykcji-modyfikacji.

Charakterystyka Typy systemów restrykcji-modyfikacji

Typ I Typ II Typ III Typ IV

Cechy strukturalne

Wielofunkcyjny,

wieloskładnikowy,

3 podjednostki,

3 geny

Proste, oddzielne

enzymy,

2 podjednostki,

2 geny

Wielofunkcyjny,

wieloskładnikowy,

2 podjednostki,

2 geny

Szereg podjednostek i

genów, brak enzymu

modyfikacyjnego

Aktywności

enzymatyczne

ATPaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

ATPaza

Endonukleaza GTPaza

Kofaktory niezbędne

do aktywności

metylotransferaz

Ado-Met, Mg2+

Ado-Met Ado-Met, Mg2+

—

Kofaktory niezbędne

do aktywności

endonukleaz

restrykcyjnych

ATP, Ado-Met,

Mg2+

Mg

2+

ATP, Mg2+

,

(Ado-Met) Mg

2+, GTP

Rozpoznawana

sekwencja

Dwuczęściowa,

asymetryczna

Z reguły

symetryczna Asymetryczna

Dwuczęściowa,

zmetylowana

Miejsce cięcia

Cięcie

przypadkowe,

daleko od

rozpoznawanej

sekwencji

Cięcie w stałej

pozycji wewnątrz

lub kilka nt od

miejsca

rozpoznawania

Cięcie w stałym miejscu,

oddalonym od

rozpoznawanej sekwencji

25 - 27 nt

Cięcie w zmetylowanej

sekwencji

Translokacja DNA Translokacja Brak Translokacja Translokacja

Przedstawiciele EcoBI, EcoAI,

EcoDXXI

EcoRI, EcoRV,

BamHI EcoP1, EcoP15, StyLTI McrA, McrB, DpnI

17

Endonukleazy należące do systemów RM typu II są powszechnie używane w biologii

molekularnej, ze względu na przeprowadzanie reakcji w ściśle określonym miejscu.

Metylotransferazy modyfikują DNA, wprowadzając grupę metylową, do reszt cytozyny bądź

adeniny. Donorem grupy metylowej jest S-adenozylo-L-metionina. Produktami reakcji mogą być

N6-metyloadenina, C5-metylocytozyna lub N4-metylocytozyna. Metylazy typu I i III metylują

wyłącznie adeninę w pozycji N6.

Enzymy typu IV rozpoznają i wprowadzają cięcie w DNA, jeżeli rozpoznana sekwencja jest

zmetylowana (DpnI jest powszechnie używany w biologii molekularnej).

Budowa, mechanizm rozpoznawania oraz cięcia DNA poprzez enzymy należące do

systemów RM typu I i III są bardziej skomplikowane. Enzymy restrykcyjne typu I składają się z 3

podjednostek kodowanych przez 3 geny: hsdS, hsdM i hsdR. Produkty wszystkich trzech genów są

niezbędne dla uzyskania aktywności restrykcyjnej. Podjednostki HsdM i HsdS tworzą aktywną

metylazę DNA (Rys. 5). Podjednostka HsdS odpowiedzialna jest za rozpoznawanie specyficznej

sekwencji, ale nie posiada żadnej aktywności biochemicznej.

Enzymy typu III kodowane są

przez dwa geny mod i res.

Metylaza Mod odpowiedzialna jest

zarówno za rozpoznawanie

specyficznej sekwencji DNA i jej

metylację. W połączeniu z Res

staje się endonukleazą.

Endonukleazy typu III

(zbudowane z dwóch podjednostek

mod i res) wprowadzają cięcie w

stałym miejscu, oddalonym od rozpoznawanej sekwencji 25 - 27 nt. W przypadku systemów RM

typu I cięcie DNA jest powiązane z translokacją DNA (Rys. 6) i ma miejsce poza rozpoznawana

sekwencją (nawet do 1500 pz).

Rys. 6. Translokacja DNA przez enzym typu I EcoKI.

Genom bakteriofaga T7 posiada na końcu, który jako pierwszy wprowadzany jest do komórki bakteryjnej,

miejsce rozpoznawane przez enzym EcoKI. W naturze, genom tego faga penetruje do komórki bakteryjnej dzięki

polimerazie RNA (translokacja powiązana jest z transkrypcją).

Blokując transkrypcję poprzez dodanie ryfampicyny wykazano, że genom faga może zostać translokowany do

cytoplazmy w komórkach kodujących enzym EcoKI. Translokowany DNA staje się wrażliwy na DpnI, który

rozpoznaje i tnie DNA zmetylowany poprzez metylazę Dam. Translokacja DNA poprzez EcoKI odbywa się z

szybkością 100 pz/sec.

Rys. 5. Endonukleaza typu I (na biało: HsdM, na szaro HsdR i na

czarno HsdS).

18

Sekwencje rozpoznawane przez enzymy typu I są asymetryczne: składaja się z 3-4 nt rozdzielonych

niespecyficznym fragmentem (6-8 nt) od dalszych specyficznych (3-4) nt. Związane jest to z

budową podjednostki HsdS, którą podzielić można na 3 domeny konserwowane (CD conserved

domain) i dwie domeny TRD (target recognition domain) odpowiedzialne za rozpoznawanie

specyficznych sekwencj (Rys. 7).

Enzymy typu I rozpoznają sekwencje :

NgoAV: GCAN8TGC

NgoAVT: GCAN7GTCA

Enzymy typu III rozpoznają asymetryczną sekwencję i metylują tylko jedną nić DNA:

EcoP1: AGACC

EcoP15: CAGCAG

StyLTI: CAGAG

Rola systemów RM

Systemy RM są powszechnie obecne u prokariota. Przyjmuje się, że obecność systemów RM

zabezpiecza komórki bakterii przed inwazją przez obcy DNA, np. wirusowy lub plazmidowy (Rys.

8). Jednak hipoteza „obrony komórkowej” nie wyjaśnia różnorodności systemów RM, szczególnie

takich co rozpoznają sekwencje 8-nukleotydowe, które niezwykle rzadko lub w ogóle nie występują

w małych genomach plazmidów i wirusów. Ponadto niektóre komórki kodują jednocześnie

kilkanaście systemów RM.

1. Ochronna funkcja systemów RM przed „atakiem” przez obcy DNA

2. Systemy RM zapewne odgrywają rolę w ewolucji bakterii (fitness)

Możliwość pobierania obcego DNA ze środowiska MUSI być regulowana. Mycoplasma

pulmonis posiada dwa geny hsdS (RM typu I) o różnej specyficzności. Ich ekspresja jest zmienna

dzięki inwersji DNA. Hodowle zawierają liczne subpopulacje bakterii, które nie posiadają

wykrywalnej aktywności restrykcyjnej i są bardzo podatne na infekcje bakteriofagowe.

S.EcoR124

I

TRD TRD

GAA NNNNNNN RTCG

N C

CD CD CD

Rys. 7. Struktura podjednostki HsdS.

Ryc. 8. Ochronna funkcja systemów RM na

przykładzie typu I. Zlokalizowany w komórce

bakteryjnej system RM odpowiada za modyfikację

komórkowego DNA. Wnikający do komórki fagowy

DNA nie posiadający zmetylowanych odpowiednich

sekwencji (może posiadać inny wzór metylacji)

rozpoznawany jest jako obcy i podlega restrykcji.

Ciemne i jasne kropki oznaczają metylację.

Wg Tock i Dryden, 2005, rysunek zmodyfikowany.

19

Podobnie geny mod i res systemu RM typu III z Pasteurella haemolytica zawierają powieloną

pięcionukleotydową sekwencję: CACAG. Liczba powtórzeń tej sekwencji zmienia się w seryjnych

hodowlach i skutkuje zmianą specyficzności lub brakiem aktywności tego systemu RM.

Zmienność fazową w ekspresji genów należących do systemu RM typu III odkryto też u

Helibacter pylori. Wykazano, że gen res poprzedzony jest homopolimeryczną sekwencją bogatą w

cytozyny i że zmienność w długości tego odcinka reguluje ekspresję (lub jej brak) oraz siłę ekspresji

genu res (odpowiedzialnego za restrykcję).

3. Aktualnie sądzi się, że systemy RM mogą brać udział w regulacji ekspresji genów oraz w

zmienności fazowej.

Zmienność fazowa jest procesem adaptacyjnym, polegającym na częstych, odwracalnych

zmianach fenotypowych przez komórki bakteryjne. Zjawisku temu mogą podlegać pojedyncze geny

bądź też całe grupy genów. Zmienność fazowa prowadzi do zwiększenia różnorodności w obrębie

populacji bakterii. Tym, co odróżnia zjawisko zmienności fazowej od mutacji i klasycznej regulacji

ekspresji genów jest istnienie epigenetycznego bądź też genetycznego mechanizmu,

umożliwiającego dziedziczenie zmienności. Oznacza to, że komórka potomna odziedziczy fenotyp

komórki rodzicielskiej, ale odziedziczona zostanie też zdolność do przełączania ekspresji genów.

Częstość zmienności fazowej jest procesem losowym, chociaż proces ten może być modulowany

przez czynniki zewnętrzne. Wykazano, że zmienność fazowa ekspresji metylaz DNA może mieć

wpływ na ekspresję wielu genów. Np. system RM typu III z H. influenzae przez swoją zmienność

fazową zmniejsza ekspresję grupy genów kodujących białka będące transporterami oraz wiążącymi

niektóre składniki pokarmowe (hemoglobinę, cysteinę, hem), a podnosi poziom ekspresji

molekularnych chaperonów i katalizatorów fałdowania białek.

Wiele bakteriofagów (i plazmidów) wykształciło mechanizmy ochronne przed systemami RM.

Strategie są różne, np. :

1. Brak miejsc rozpoznawanych przez dany enzym restrykcyjny (dotyczy raczej enzymów typu

II), np. fagi T3 i T7 nie mają miejsc CCATGG rozpoznawanych przez EcoRII.

2. Ułożenie miejsc restrykcyjnych w orientacji uniemożliwiającej działanie enzymu

restrykcyjnego (miejsce EcoP15 w DNA faga T7)

3. Modyfikowanie zasad :

- Genomy bakteriofagów T2 i T4 zawierają hydroksymetylocytozynę zamiast cytozyny: takie

sekwencje nie są rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne;

- Fag Mu koduje białko Mom, które tworzy N6-(1-acetamido)adeninę, dzięki czemu jego genom

nie ulega restrykcji poprzez EcoKI i EcoBI;

4. Kodowanie specyficznych białek: - Fagi T2 i T4 kodują metylazę Dam (gen metylazy może także znajdować się na plazmidach oraz

genomach innych fagów (fagi infekujące B. subtilis);

- Stp (26 aa) białko kodowane przez faga T4 przeszkadza w formowaniu się kompleksu

enzymatycznego (zmiana konformacji białek);

- Produkt genu 0.3 faga T7, zwany także białkiem Ocr (overcoming restriction) wiąże kompleks

enzymatyczny EcoKI;

- Ard (alleviation of restriction of DNA): podobne do produktu genu 0,3 faga T7, białka

kodowane przez plazmidy IncW, które mają wielu gospodarzy. Białka te mają strukturę podobną

do podjednostki HsdS i prawdopodobnie uniemożliwiają poprawne tworzenie kompleksu

endonukleazy;

- Dar (defense against restriction), białko kodowane przez faga P1 prawdopodobnie przeszkadza

w translokacji DNA;

- Aktywacja metylazy gospodarza: Ral (restriction alleviation): białko kodowane przez faga

lambda faworyzuje metylację cząsteczek DNA, które nie uległy restrykcji (Ral aktywuje

wyrażanie genów hsdS i hsdM);

20

- Hydroliza S-adenozylometioniny przez hydrolazę faga T3 (ochrona przed enzymami systemów

RM typu IV);

- System naprawy DNA: białka Red i Gam kodowane przez bakteriofaga lambda pozwalają na

naprawę przeciętego DNA poprzez rekombinację z inną kopią fagowego DNA;

21

Bakteriofag T7:

Większość bakteriofagów zdolna jest po zainfekowaniu komórki bakteryjnej do wywołania

wyłącznioe cyklu litycznego tzn. kończącego się powstaniem potomnych cząstek fagowych. Fagi

takie zwane są fagami wirulentymi. Należy do nich coliphage T7 (Rys. 9), wyizolowany w 1945

jako fag namnażający się w E. coli. Aktualnie wiadomo, że fag ten infekuje również bakterie z

rodzajów Shigella, Yersinia, Salmonella i Klebsiella. Bakteriofag ten należy do rodziny

Podoviridae: fagów posiadających ogonek oraz genom zbudowany z dwuniciowego DNA.

Fag zbudowany jest z ikosahedralnej główki (ok. 60 nm średnicy),

niekurczliwego ogonka (ok. 20 nm długości i 10 nm szerokości) oraz 6

cienkich włókienek.

Receptorem faga jest lipopolisacharyd (LPS) obecny na powierzchni

bakterii: bakteriofag nie infekuje większości szczepów E. coli ze

środowiska.

Fag ten koduje, jako białko wczesne własną polimerazę RNA, która

specyficznie rozpoznaje promotory fagowe i przestawia maszynerię

syntezy białek na produkcję białek fagowych

Mapa genetyczna bakteriofaga przedstawiona jest na Rys. 10.

Genomem bakteriofaga T7 jest dwuniciowy liniowy DNA o długości

39937 bp. Sekwencja kodująca zajmuje aż 92 % genomu, reszta to

sekwencje sygnałowe. DNA zawiera podobny procent par GC do

genomu E. coli (48 %). Genom zawiera tylko 4 sekwencje GATC,

rozpoznawane przez metylazę Dam, regulującą wiele procesów w E. coli (statystycznie, w 40 kb

powinno być ok. 156 sekwencji GATC).

W genomie faga wytypowano ok 56

potencjalnych ramek odczytu ale

tylko ok. 20 genów, niezbędnych

jest do namnażania faga na

szczepach laboratoryjnych. Geny

zorganizowane są w trzy

bloki/klasy transkrypcyjne:

- Klasa I to geny wczesne:

ulegające wyrażeniu w pierwszych 8 minutach od wprowadzenia DNA do komórki. Produkty

tych genów przygotowują komórkę do „produkcji” wyłącznie nowych cząstek fagowych.

- Klasa II to geny kodujące enzymy biorące udział w metabolizmie DNA, geny te są

eksprymowane w 6 do 15 minut od penetracji DNA do komórki.

- Klasa III geny kodujące białka strukturalne, biorące udział w tworzeniu cząstek fagowych i lizie

(8-25 minut)

Ryc. 9 . Bakteriofag T7.

Ryc. 10. Mapa genetyczna

bakteriofaga T7.

22

Wejście faga T7 do komórki bakteryjnej przedstawiono na Rys. 11. Fag T7 adsorbuje się na

powierzchni komórek rozpoznając LPS. Białka składnikowe rdzenia faga (gp14-16: core proteins)

zostają wyrzucone z główki i tworzą kanał niezbędny do transportu DNA do komórki bakteryjnej.

Cykl lityczny trwa około 25-30 minut.

Transfer fagowego DNA do komórki bakteryjnej jest powolny (cały DNA potrzebuje 10

min, aby wejść do komórki bakteryjnej) i zależny od transkrypcji, jedynie 850 pz (umowny lewy

koniec genomu, w którym zlokalizowane są geny wczesne) może wejść do komórki bez udziału

aktywnej transkrypcji. Ten fragment genomu zawiera 3 promotory rozpoznawane przez polimerazę

RNA E.coli.

Bakteryjna polimeraza odczytuje geny klasy I (ok 19% genomu). Funkcje 5 białek

wczesnych są doskonale znane:

- Białko Gp0.3 (zwane także ocr: „overcomes classical restriction activity”) inaktywuje system

restrykcji modyfikacji typu I (ale bakteriofag pozostaje wrażliwy na systemy typu II i III). Gp0.3

wchodzi w interakcję z EcoKI oraz hydrolizuje AdoMet (donor grup metylowych w reakcji

metylacji DNA). Jest to możliwe dzięki „udawaniu” (mimikra) konformacji 24 nukleotydowej

dwunicioweej struktury B DNA.

- Białko Gp0.7 jest kinazą serynowo-treoninową odpowiedzialną za fosforylację wielu białek

bakteryjnych (np. rybosomalnych). Białko to uniemozliwia także transkrypcję genów zależną od

gospodarza poprzez inaktywację komórkowej polimerazy RNA.

- Gen gp1 koduje polimerazę RNA T7 specyficznie rozpoznającą promotory fagowe (polimeraza

ta ma zastosowanie w biologii molekularnej ponieważ ma bardzo dużą procesywność: 200-300

pz/sec)

- Gp1.3 jest ligazą DNA

- GP1.2 jest inhibitorem GTPaz bakteryjnych. Mutacja w genie gp1.2 pozwala fagom na wzrost

na komórkach E. coli zawierających plazmid F.

Ogólnie produkty genów wczesnych mają za zadanie wyłączenie transkrypcji komórkowego

DNA oraz zablokowanie aktywności białek bakteryjnych, które mogłyby zaburzyć proces infekcji

fagowej.

Ekspresja genów klasy II i III (81% genomu) ma miejsce dzięki polimerazie RNA faga T7.

Wyrażane są 24 geny biorące udział w metabolizmie DNA np. gp3 i gp6, kodujące endonukleazę

(Gp3) oraz egzonukleazę (Gp6), które degradują bakteryjny DNA (nie wiadomo, w jaki sposób

aktywności tych białek jest kontrolowana in vivo tak, aby genom faga nie był degradowany)

uwalniając w ten sposób nukleotydy, które są wykorzystywane podczas syntezy fagowego DNA

(80% nukleotydów w potomstwie faga pochodzi z degradacji genomu gospodarza).

Białko Gp2 jest inhibitorem bakteryjnej polimerazy RNA i jest niezbędne podczas pakowania

cząstek fagowych. Wśród białek eksprymowanych w tym procesie znajduje się także polimeraza

DNA faga T7.

Klasa III genów, to geny zaangażowane w morfogenezę faga, pakowanie DNA oraz lizę

komórki bakteryjnej. Geny te są transkrybowane z bardzo silnych promotorów rozpoznawanych

Rys. 11. Wejście faga T7 do komórki

bakteryjnej.

23

przez fagową polimerazę. Lizozym (Gp3.5) kodowany przez faga nie jest zaangażowany w lizę

komórek ale w uwalnianie cząstek fagowych z resztek bakteryjnych. Fag nie koduje typowej kasety

litycznej. Gen gp17.5 jest najprawdopodobniej holiną.

Rozpoczęcie transkrypcji genomu fagowego przez polimerazę T7 pozwala na wprowadzenie

całego fagowego DNA do komórki gospodarza.

Podczas ekspresji genów klasy II ma także miejsce replikacja fagowego DNA. Replikacja DNA

faga T7 jest procesem niezmiernie złożonym, fag koduje własne białka, biorące udział w tym

procesie: polimerazę DNA, primazę oraz helikazę (Rys. 12).

W wyniku replikacji powstaje tzw. „bubble” (widoczny pod

mikroskopem elektronowym, Rys. 13).

W hodowli płynnej przejaśnienie widać już po 20 minutach hodowli

(gwałtowny spadek OD600), a miano faga (liczba wirionów) zwiększa

już po 15 minutach (Rys. 14).

Infekcja abortywna

Istnieje wiele przykładów zahamowania infekcji fagowej, poprzez różne elementy obecne w

komórce bakteryjnej. Dotyczy to np. zajęcia/zmiany w strukturze/ braku ekspresji receptorów

zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych (obecnosć profaga) specyficznych dla danego faga, ekspresji

represorów (niemożności superinfekcji), cytoplazmatycznej degradacji genomowego DNA

Rys. 12. Replikacja genomu faga T7- kompleks enzymatyczny

a. Polimeraza DNA T7 jest kompleksem zbudowanym z dwóch

podjednostek: produktu genu gp5 oraz czynnika Trx

(tioredoksyna) kodowanego przez E. coli. Czynnik Trx ma wpływ

na procesywność polimerazy. Polimeraza łączy się z kompleksem

białkowym kodowanym przez gen gp4.

b. Białko Gp4 ma dwie aktywności: helikazy i prymazy.

Aktywność helikazy pozwala na rozwinięcie rodzicielskiego

DNA, prymaza pozwala na syntezę 10-60 nt startera RNA

potrzebnego do rozpoczęcia replikacji nici opóźnionej. Białko to

działa jako heksamer. Białko kodowane przez gen gp2.5 jest

białkiem wiążącym jednoniciowy DNA obecny w widełkach

replikacyjnych.

Rys. 14. Łysinki bakteriofaga T7. A: 12 godzinach, B: 24 godzinach,

C: 50 godzinach wielkie łysinki z przejrzystym środkiem. Fag szybko

ewoluuje, mapy restrykcyjne fagów pobranych w różnych miejscach

łysinki różnią się.

Rys. 13. Replikacyjny „bubble”.

24

bakteriofaga (restrykcja DNA). Bakteriofag w tym przypadku nie zaczyna cyklu litycznego. Podczas

infekcji abortywnej przerwany zostaje rozpoczęty cykl replikacyjny bakteriofaga.

Blokowanie replikacji fagowej przez elementy pozachromosomalne jest rozpowszechniona. Np.

fag T4 nie namnaża się na komórkach E. coli zlizogenowanych fagiem lambda: pierwsze 10 minut

infekcji przebiega klasycznie, a następnie gwałtownie zatrzymuje się synteza DNA oraz białek.

Wykazano, że w tym przypadku zlizogenizowane bakterie nie są w stanie utrzymać odpowiedniego

stężenia Mg2+

wewnątrz komórki. Prawdopodobnie, w podobny sposób dochodzi do infekcji

abortywnej wywołanej poprzez system rex, kodowany przez faga lambda (białka o nieznanej

funkcji, zlokalizowane w błonie komórkowej).

Wiele wirusów nie namnaża się w komórkach E. coli posiadających plazmid F lub F`. Są to np.

fagi: tau, T7, phiI, phiII, W13 (a np. fag T3 jest niewrażliwy na obecnosć F`).

Plazmid F (fertility factor): to element (ok. 100 kpz) pozwalający bakterii na syntezę pilusów

niezbędnych do koniugacji (F` to plazmid F, który zawiera jakąś część chromosomu E. coli).

Infekcja abortywna na przykładzie faga T7:

Najintensywniej badana była infekcja abortywna faga T7, ale fenomen nie został wyjaśniony do

końca i jest mnóstwo kontrowersji dotyczących mechanizmu tego zjawiska. Na szalkach można

zaobserwować mniejszą liczbę łysinek (ok. 100 do 100 milionów razy), łysinki mogą mieć (w

zależności od użytego szczepu laboratoryjnego) mniejszą średnicę.

Cykl lityczny zaczyna się klasyczną absorpcją, DNA faga nie jest degradowany jak w przypadku

ataku poprzez systemy RM.

Białka klasy I są prawidłowo syntetyzowane (powstaje np. T7 polimeraza RNA), lecz nagle

następuje represja replikacji DNA. Jakość syntetyzowanego mRNA jest poprawna, jednakże mRNA

klasy III mają często nieprawidłową długość. Długo sądzono, że ma to związek z niekompletnym

wejściem genomowego DNA faga do komórek bakteryjnych, jednakże infekcja abortywna ma

miejsce nawet po wprowadzeniou DNA do komórek bakteryjnych metoda transfekcji.

Nieprawidłowa jest natomiast translacja mRNA białek klasy II i III, syntetyzowane są tylko w 10 %.

Nie wyjaśniono mechanizmu, który zatrzymuje translację. Badania wykazały, że zarówno przy

zastosowaniu polimerazy RNA faga jak i gospodarza, synteza białek zatrzymuje się w 9-12 minut

po infekcji. Być może infekcja abortywna ma związek z kontrolą transkrypcji lub replikacją.

Wykazano, że w komórkach E. coli zawierających plazmid F, synteza DNA gospodarza zatrzymuje

się całkowicie podczas infekcji, a w komórkach pozbawionych plazmidu F spada tylko o 50%.

Plazmidy F zmutowane w genach pifA i pifB (phage inhibition factor) pozwalają na namnażanie

faga T7. PifA wykazuje podobieństwo sekwencji do transporterów typu ABC, lecz jego rola w

komórce bakteryjnej jest nieznana. Nie przypisano także temu białku żadnej funkcji biochemicznej.

Inna hipoteza dotyczy zaburzonej przepuszczalności błony: wykazano, że ONPG (chemiczny

chromogenny substrat -galaktozydazy) dyfunduje wyłącznie z komórek z plazmidem F. Z komórek

wypływa ATP oraz inne fosforylowane cząsteczki. Takie komórki nie są w stanie akumulować

glutaminy i proliny oraz mają problem z utrzymaniem odpowiedniego stężenia potasu.

Wyizolowano mutanty bakteriofaga T7 zdolne do przeżycia w komórkach E. coli zawierających

plazmid F. Mutacje dotyczą genów gp1.2 i gp10 (białko kapsydu). Zmutowane bakteriofagi T7 nie

są wrażliwe na uwalnianie nukleotydów z komórki.

Kiedy dochodzi do infekcji abortywnej, komórka umiera, ale nie lizuje: praktycznie nie

pojawiają się nowe cząstki fagowe.

Nowo powstałe fagi nie nabywają żadnych cech, które pozwoliłyby im na namnażanie się na

komórkach E. coli F`. W następnym cyklu infekcyjnym nadal będą ulegać infekcji abortywnej w

obecności plazmidu F`.

25

Wybrana literatura:

1. Beck PJ, Molineux IJ. Defective transcription of the right end of bacteriophage T7 DNA during

an abortive infection of F plasmid-containing Escherichia coli. J Bacteriol. 1991;173(3):947-54.

2. Bickle TA, Krüger DH.Biology of DNA restriction. Microbiol Rev. 1993; 57(2):434-50

3. Dryden DT, Davies GD, Martin I, Powell LM, Murray NE, Ellis DJ, Berge T, Edwardson JM,

Henderson RM.The assembly of the EcoKI type I DNA restriction/modification enzyme and its

interaction with DNA. Biochem Soc Trans. 1999; 27(4):691-6.

4. Duckworth DH, Glenn J, McCorquodale DJ. Inhibition of bacteriophage replication by

extrachromosomal genetic elements. Microbiol Rev. 1981; 45(1):52-71.

5. García LR, Molineux IJ. Incomplete entry of bacteriophage T7 DNA into F plasmid-containing

Escherichia coli. J Bacteriol. 1995l; 177(14):4077-83.

6. Krüger DH, Bickle TA. Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the

deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts. Microbiol Rev. 1983 Sep;47(3):345-60.

7. Loenen WA.Tracking EcoKI and DNA fifty years on: a golden story full of surprises. Nucleic

Acids Res. 2003; 31(24):7059-69.

8. Murray NE.Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani

and Weigle). Microbiol Mol Biol Rev. 2000; 64(2):412-34.

9. Studier FW. Bacteriophage T7. Science. 1972; 176(33):367-76

10. Tock MR, Dryden DT. The biology of restriction and anti-restriction. Curr Opin Microbiol.

2005; 8(4):466-72.

26

ĆWICZENIE 3 Część praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne

- E. coli Top10(-)

s, r

- m

-, F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)80 LacZ M15 lacX74 deoR

recA1 araD139 (ara-leu) 7697 galU galK lambda^-rpsL endA1 nupG

- E. coli TopF’ (F’ proAB lacIqZ)M15 Tn10 (Tetr)

- E. coli K12 (-)

s koduje system restrykcji-modyfikacji typu I EcoKI, który rozpoznaje

sekwencję AAC(N6)GTGC lub GCAC(N6)GTT

- E. coli Top10 (pNo12): koduje sklonowany na plazmidzie pUC19 system restrykcji-modyfikacji

typu I NgoAV (z Neisseria gonorrhoeae), który rozpoznaje sekwencję GCAN6TGC

- Haemophilus influenzae Rd30

Bakteriofagi (miana fagów zostaną podane podczas ćwiczeń)

- zawiesiny faga lambda: vir

- zawiesina faga T7

Podłoża

- LB płynne

- LB półpłynne

- LB stałe

- BHI stałe i półpłynne

Roztwory

- bufor SM

- chloroform

Wykonanie

1. Liza i lizogenia

- pobrać materiał z 5 kolonii z posiewu redukcyjnego ćw.2, pkt 4, test 1;

- wsiać do 0,25 ml płynnego LB (w eppendorfie) i inkubować 3 h w temp. 37oC;

- nakroplić 5 l hodowli na murawkę szczepu E. coli Top10 wysianego wcześniej w agarze

półpłynnym na podłoże stałe;

- inkubować 12-18 h w temp. 37oC;

2. Izolacja lizogenów faga HP1

- materiał pobrać z 5 kolonii z posiewu redukcyjnego ćw. 2. pkt 4, test 2;

- hodowlę lizogenów prowadzić w 0,25 ml płynnego BHI z NAD i heminą (w eppendorfie) i

inkubować 3 h w temp. 37oC ;

- nakroplić 5 l hodowli na murawkę szczepu H. influenzae Rd30, wysianego wcześniej na

podłoże stałe BHI uzupełnione NAD i heminą;

- inkubować 12-18 h w temp. 37oC;

3. Oznaczanie miana bakteriofaga vir

- obliczyć miano zawiesiny fagowej tj. liczba jednostek tworzących łysinki w 1 ml (pfu: plaque

forming units) według podanego niżej wzoru:

pfu (na ml) = N R 10

N = liczba łysinek

R = odwrotność rozcieńczenia

10 = przeliczenie na 1 ml

- w teście kroplowym (w przypadku uzyskania policzalnej liczby łysinek) liczbę faga w 1 ml

obliczyć ze wzoru: pfu = N R 200 (200 to przeliczenie na 1 ml)

27

4. Abortywna (poronna) infekcja faga T7

- wykonać rozcieńczenia faga T7 (10-1

, 10-2

, 10-3

, 10-4

, 10-5

, 10-6

) w buforze SM;

- metodą płytek dwuwarstwowych wysiać po 0,1 ml rozcieńczeń 10-5

i 10-6

z hodowlą nocną

szczepu E. coli Top10 (0,2 ml);

- metodą płytek dwuwarstwowych wysiać po 0,1 ml rozcieńczeń 10-2

i 10-3

z hodowlą nocną

szczepu E. coli Top10 F’ (0,2 ml;)

- inkubować 12-18 h w temp. 37oC;

-

UWAGA: rozcieńcznia zostaną podane podczas ćwiczeń (zależą od miana faga w zawiesinie

początkowej).

5. Zjawisko restrykcji-modyfikacji DNA

- wykonać rozcieńczenia faga vir (10-1

, 10-2

, 10-3

, 10-4

, 10-5

, 10-6

) w buforze SM;

- 0,1 ml z rozcieńczeń 10-5

i 10-6

wysiać metodą płytek dwuwarstwowych na szczep E. coli

Top10;

- 0,1 ml z rozcieńczeń 100 wysiać metodą płytek dwuwarstwowych na szczep E. coli K12;

- 0,1 ml z rozcieńczeń 10–2

i 10–3

wysiać metodą płytek dwuwarstwowych na szczep E. coli

Top10 (pNo12);

- inkubować 12-18 h w temp. 37oC;

-

UWAGA: rozcieńcznia zostaną podane podczas ćwiczeń (zależą od miana faga w zawiesinie

początkowej).

28

ĆWICZENIE 4

Część praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne:

- E. coli Top10(-)

s, r

- m

-, F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)80 LacZ M15 lacX74 deoR

recA1 araD139 (ara-leu) 7697 galU galK lambda^-rpsL endA1 nupG

- E. coli TopF’ (F’ proAB lacIqZ)M15 Tn10 (Tetr)

- E. coli K12 (-)

s koduje system restrykcji-modyfikacji typu I EcoKI, który rozpoznaje

sekwencję AAC(N6)GTGC lub GCAC(N6)GTT

- E. coli Top10 (pNo12): koduje sklonowany na plazmidzie pUC19 system restrykcji-modyfikacji

typu I NgoAV (z Neisseria gonorrhoeae), który rozpoznaje sekwencję GCAN6TGC

- E. coli Top10 (pSMRX): koduje sklonowany na plazmidzie pACYC184 system NgoAV z

punktową delecja w genie hsdS: NgoAVT (z Neisseria gonorrhoeae), który rozpoznaje

sekwencję GCAN7GTCA

Bakteriofagi:

- zawiesiny fagów lambda: Top10, No12 oraz SMRX

Podłoża

- LB płynne

- LB półpłynne

- LB stałe

Roztwory

- bufor SM

- chloroform

- roztwór białka docelowego (stężenie 100 g/ml) do Phage Display w 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6)

Wykonanie

1. Liza i lizogenia: odczytać wyniki testu 1 i 2 z ćw. 3

2. Abortywna (poronna) infekcja faga T7

- obliczyć miana fagów T7 uzyskane na obu szczepach;

- pobrać ezą 2-3 łysinki ze szczepu E. coli Top10F’ i zawiesić w 0,5 ml buforu SM;

- dodać kroplę chloroformu (40 l) i energicznie wytrząsać przez kilka minut (ewentualnie

osadzić chloroform poprzez wirowanie);

- następnie wykonać rozcieńczenia 10-1

, 10-2

, 10-3

w buforze SM;

- 0,1 ml odpowiedniego rozcieńczenia faga T7 (10-2

i 10-3

) zmieszać z 0,2 ml nocnej hodowli

szczepu E. coli Top10 i wysiać metodą płytek dwuwarstwowych, natomiast rozcieńczenia

10-1

, 10-2

wysiać na nocną hodowlę szczepu E. coli Top10 F’metodą płytek dwuwarstwowych;

- inkubować 12-18 h w temp. 37°C;

3. Zjawisko restrykcji-modyfikacji DNA

- obliczyć miana fagów vir namnożonych na obu szczepach: E. coli Top10 i E. coli K12 oraz

E. coli (pNo12);

- pobrać ezą kilka łysinek faga Top10 i zawiesić w 0,5 ml buforu SM;

29

- dodać 1 kroplę chloroformu i energicznie wytrząsać przez kilka minut;

- analogicznie postąpić z fagiem K12 i No12;

- zawiesiny fagowe rozcieńczyć 10-1

,10-2

, 10-3

;

- 0,1 ml z rozcieńczenia 10-2

, 10-3

wysiać metodą płytek dwuwarstwowych na szczepy E. coli

Top10, E. coli No12 i E. coli K12;

- inkubować 12-18 h w temp. 37oC;

4. Test krzyżowy (ang. cross - streaking)

- na szalce ze stałym LB nanieśc pipetą linię (200 l) z każdego faga : Top10, No12 oraz SMRX

(nie dotykając szalki);

- odczekać aż materiał wsiąknie w podłoże;

- nanieść ezą szczepy E. coli: Top10 i E. coli: Top10 (pNo12), E. coli: Top10 (pSMRX) oraz E.

coli: K12 przecinając powierzchnię z fagiem i pamiętając o każdorazowym opalaniu ezy przed

naniesieniem na następną rysę z materiałem fagowym;

- inkubować 12-18 h w temp. 37oC;

5. Phage Display

- rozprowadzić 1,5 ml roztworu białka docelowego na polipropylenowej szalce tak, aby pokryć

dokładnie całą jej powierzchnię;

- inkubować szalkę przez noc w temperaturze 4oC (w wilgotnym środowisku);

30

Schemat prezentujący kolejne etapy procedury, otrzymania biblioteki

fragmentów restrykcyjnych faga HP1 w wektorze plazmidowym

pBluescript KS II (+), realizowanej podczas kolejnych ćwiczeń od 5 do 11.

31

ĆWICZENIE 5

Metody indukcji profagów

Część teoretyczna

Bakteriofag lambda

Bakteriofag jest prototypem fagów łagodnych. Odkryty został w 1951 w szczepie E. coli

K12. Genom tego faga upakowany jest w główce w formie dwuniciowego liniowego DNA o

długości 48502 pz. Potencjalnie fag koduje

aż 71 białek i funkcja większości z nich jest

dobrze znana. Ekspresja genów jest

regulowana poprzez proteolizę czynników

transkrypcyjnych.

Geny kodujące białka potrzebne na

określonym etapie rozwoju zgrupowane są

w bloki transkrypcyjne: blok kodujący

elementy regulatorowe, zwany rejonem

odpornościowym (antyrepresor Cro,

represor CI, białko N, białka CII i CIII),

blok z genami biorącymi udział w

replikacji DNA (geny o i p), blok genów biorących udział w lizie (s, r, rz), rekombinacji (int i xis),

oraz blok z genami strukturalnymi (Rys. 15 i 16).

Podczas infekcji fag wstrzykuje (posiada kurczliwy ogonek) do cytoplazmy liniową cząsteczkę

DNA. Lepkie końce fagowego DNA składają się z komplementarnych 12 nukleotydowych

sekwencji cos, dzięki którym dwa enzymy bakteryjne, ligaza oraz gyraza, przekształcają liniowy

DNA w kolistą superhelikalną cząsteczkę DNA.

Rys. 16 Mapa genetyczna

bakteriofaga .

Rys. 15. Bloki transkrypcyjne w genomie faga .

32

Bakteriofag nie koduje własnej polimerazy, lecz wykorzystuje bakteryjną polimerazę RNA. Fag

ma 7 promotorów odczytywanych na różnych etapach cyklu:

Dwa silne promotory odpowiedzialne są za wyrażanie genów wczesnych:

- PR kieruje ekspresją genów niezbędnych do replikacji DNA, antyrepresora Cro, aktywatora

transkrypcji CII i antyterminatora Q

- PL kieruje ekspresją genów niezbędnych do rekombinacji DNA, antyterminatora N i białka

stabilizującego CIII

Dwa promotory odpowiedzialne są za kontrolę ekspresji represora CI:

- PRE pozwala na ekspresję represora CI, aby zainicjować cykl lizogeniczny

- PRM pozwala na ekspresję represora CI, aby utrzymać lizogenię.

Trzy promotory regulują ekspresję genów potrzebnych w cyklu litycznym lub lizogennym:

- PR' kieruje ekspresją genów niezbędnych do lizy komórki oraz genów strukturalnych (cykl

lityczny)

- PI pozwala na ekspresję genu int (integraza)

- PAQ pozwala na syntezę antysensownego DNA, który blokuje transkrypcję mRNA genu q

(antyterminator).

Rys. 17. Sekwencje operatorowe (17 nt) rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne nakładają się na promotory

fagowe PR oraz PL

Promotor prawy w genomowym DNA bakteriofaga , odpowiedzialny za produkcję białka Cro.

We wczesnym etapie infekcji, transkrypcja zapoczątkowana jest z promotora PL, który umożliwia

wyłącznie powstanie mRNA obejmującego gen kodujący białko N oraz z promotora PR, który

umożliwia powstanie mRNA obejmujący gen cro (Rys 17). Spowodowane jest to obecnością

terminatorów transkrypcji.

Białko N jest antyterminatorem transkrypcji: rozpoznaje sekwencje nutL lub nutR (N-

utilisation) na powstającym mRNA, ponieważ dzięki tym sekwencjom mRNA przybiera

rozpoznawaną przez N strukturę II rzędową.

Dzięki kompleksowi pomiędzy białkiem N, bakteryjną polimerazą RNA, sekwencjami nut, RNA

oraz bakteryjnym białkom „Nus”, polimeraza RNA nie zatrzymuje się na sekwencjach

terminatorowych i w ten sposób mRNA powstały z promotorów PL i PR jest wydłużony. Następuje

transkrypcja genów kodujących białka nazwane „opóźnionymi wczesnymi”: CIII, CII, Q, genów

związanych z rekombinacją (gam, red) oraz genów związanych z replikacja DNA (o i p).

CII jest czynnikiem transkrypcyjnym, który aktywuje dwa promotory: PI (transkrypcja int) i PRE

(promotor białka CI) bezpośrednio łącząc się z operatorami nakładającymi się na te promotory. CII

jest białkiem niestabilnym, podatnym na działanie proteaz bakteryjnych typu Hfl (Hfl- high

frequency of lysogeny). Białko CII jest stabilizowane poprzez białko CIII. Bez białka CIII czas

półtrwania białka CII wynosi ok 1 minuty, w obecności CIII 5 minut. Nadekspresja białka CII jest

toksyczna dla komórki gospodarza.

33

Białko CII aktywuje także trzeci promotor: PAQ odpowiedzialny za syntezę antysensownego RNA

do genu Q. Białko Q jest antyterminatorem pozwalający na transkrypcję białek litycznych (s i r) i

strukturalnych. Białko CII faworyzuje więc lizogenię, uniemożliwiając ekspresje białek potrzebnych

w cyklu litycznym.

Mutanty bakteriofaga w genach C (clear) tworzą przejrzyste łysinki na murawce E. coli.

Lizogenia

Aktywność represora CI oraz integrazy Int są wystarczające, aby bakteriofag wszedł w stan

lizogenii.

Białko CI jest represorem bakteriofaga . Jest to

niewielkie białko o wielkości 26 kDa, które można

podzielić na dwie domeny: część aminowa łączy

się z operatorem (5 -helis) oraz część

karboksylowa odpowiedzialna za łączenie się

białek w aktywne dimery a także oddziaływanie

dimerów pomiędzy sobą. Białko CI działa jako

dimer, ale łączy się także w tetramery i oktomery.

CI przyłącza się do operatorów OR1 i OR2

(tetramer) blokując ekspresję z PR i aktywując

własną ekspresję z promotora PRM. Podobnie CI

blokuje transkrypcję z promotora PL przyłączając

się do OL1 i OL2. CI przyłączone do operatorów

OR i OL oddziałują między sobą (oktomer) wyginając DNA. Powstanie pętli DNA faworyzuje

przyłączenie się CI także do OR3 i OL3 (Rys. 18). Następuje wtedy represja promotora PRM (ok. 50

% miejsc OR3 jest zajętych przez represor CI w stanie lizogenii).

W cyklu lizogennym, genom bakteriofaga integruje się z chromosomem bakteryjnym poprzez

rekombinację specyficznych sekwencji: attP (fag) i attB (bakteria). W rekombinacji genomu faga

lambda do chromosomu bakteryjnego biorą udział białka fagowe: produkty genów int i xis oraz

białko bakteryjne IHF (integration host factor). Tylko gen cI może być transkrybowany w stanie

lizogenii, dzięki promotorowi PRM (PRE wymaga aktywacji przez CII, a CII nie jest transkrybowany,

ponieważ zablokowany jest PR).

O tym że zjawisko lizogenii jest powszechne może świadczyć fakt, że w roku 2003 zostało

zsekwencjonowanych około 83 genomów bakteryjnych i w około 50 znaleziono profagi (lub jakieś

resztki 230 sekwencji fagowych). W genomie E. coli K-12 odkryto aż 4 niekompletne sekwencje

profagów lambdoidalnych. W genomie Neisseria gonorrhoeae znaleziono 7 fagów (dsDNA i

ssDNA) lub niekompletnych sekwencji fagowych.

Cykl lityczny:

Białko Cro jest anty-represorem (represor represora). Białko to zbudowane jest z 66 aa i rozpoznaje

sekwencje operatorowe obecne w PR i PL. Dzięki temu białku następuje blokada ekspresji genu cI

(poprzez blokadę promotora PRE) ale nie blokuje ekspresji genu antyterminatora Q (blokując

promotor PAQ). Akumulacja białka Cro redukuje progresywnie wczesną transkrypcję.

Białko Q jest antyterminatorem transkrypcji pozwalającym na wydłużenie mRNA i transkrypcję

genów kodujących białka lityczne: holiny (s) i endolizyny (r), a także genów kodujących białka

strukturalne. Białko Q łączy się z DNA powyżej promotora pR’ i oddziałuje z polimerazą RNA.

Cykl lityczny trwa około 35 minut w 37º C i z jednej zainfekowanej komórki powstaje ok. 100

potomnych cząstek fagowych.

Rys. 18. Oddziaływanie represorów CI z

operatorami.

34

Liza czy lizogenia?

Białka Cro i CI mają bardzo podobną budowę w domenie rozpoznającej DNA, co nie jest dziwne,

ponieważ rozpoznają te same sekwencje DNA. Białka te współzawodniczą w przyłączaniu się do

tych samych sekwencji operatorowych, ale z innym powinowactwem (Rys. 19):

Cro łączy się z preferencyjnie z OR3 > OR2/OR1 oraz OL3 > OL2/OL1

Represor także łączy się z każdą sekwencją z innym

powinowactwem: OR1 > OR2/OR3 oraz OL1 >

OL2/OL3

W zależnościod tego, które białko szybciej rozpozna

swój operator (co zależy od stężenia danego białka)

następuje synteza Cro, O P i innych i fag wchodzi w

cykl lityczny lub „wygrywa” CI i fag wchodzi w stan

lizogenii.

Co faworyzuje lizę ?

- Fakt, że Cro jest białkiem wczesnym a CI białkiem

„opóźnionym”;

- Niski poziom cAMP (dobre warunki pokarmowe

dla bakterii): kompleksy proteaz bakteryjnych Hfl

szybciej degradują CII. Lizogenia jest korzystna

dla faga, który może przeżyć w niekorzystnych

warunkach (potrzebuje maszynerii gospodarza do

namnażania);

- Mutacje w genach kodujących IHF (integration

host factor);

Co faworyzuje lizogenię ?

- Wysokie stężenie CII reguluje wejście w cykl

lizogeniczny;

- Infekcja „wygłodzonych bakterii” faworyzuje lizogenię.

Wysoki poziom cAMP (złe warunki pokarmowe dla

bakterii): Kompleks CAP/CAP site/polimeraza

faworyzuje ekspresję CI;

- Bakteria atakowana przez kilka fagów;

- Mutacje w genach kodujących proteazy Hfl

(odpowiedzialne za degradację CII);

- Lizogenia zachodzi w 1/1000 - 1/100 przypadków;

W przypadku bakteriofaga superinfekcja jest niemożliwa:

represor CI blokuje ekspresję wszystkich genów

posiadajacych sekwencje OR lub OL (działa in trans).

Miejsce attB, niezbędne do rekombinacji genomowego DNA

faga, nie istnieje.

Rys. 19. Liza czy lizogenia?

Rys. 20. Indukcja cyklu litycznego.

35

Indukcja/cykl lityczny

Spontaniczna indukcja profaga jest zjawiskiem bardzo rzadkim: <1/10 000 000 profagów

przechodzi w cykl lityczny. Indukcja ma miejsce dzięki inaktywacji białka represorowego CI, które

ulega proteolizie poprzez bakteryjne proteazy. Kluczowym białkiem w tym mechanizmie jest białko

RecA, które rozpoznając jednoniciowy DNA aktywuje wiele proteaz bakteryjnych. Celem białka

RecA jest inaktywacja poprzez proteolizę represora systemu naprawczego SOS, białka LexA (Rys.

20).

Spadek odpowiedniego stężenia represora CI w zlizogenizowanej komórce skutkuje

natychmiastową transkrypcją białek fagowych biorących udział

w cyklu litycznym. Promotory PL i PR nie są już reprymowane,

rusza ekspresja antyrepresora Cro. Indukcja faga jest

nieodwracalna. W praktyce zaindukować cykl lityczny mogą:

światło UV, czynniki mutagenne, wysoka temperatura.

Bakteriofaga CIts857Sam7 zaindukujemy temperaturą: mutacja

CIts857 powoduje inaktywację represora w 42°C (zmiana

konformacji).

Bakteriofaga HP1 zaindukujemy używając mitomycyny C (Rys.

21). Mitomycyny są produktami naturalnymi, izolowanymi z

promieniowców Streptomyces lavendulae i S. caespitosa. Mitomycyna C używana jest w

chemioterapii wielolekowej raka: żołądka, piersi, płuca, pęcherza moczowego, szyjki macicy,

okolic głowy i szyi oraz w innych lokalizacjach.

Mitomycyna C wiąże się kowalencyjnie z DNA. Jest to związek wysoce toksyczny, mutagenny

(alkilujący), który generuje powstawanie wolnych rodników.

Bakteriofag HP1/S2

Jest to bakteriofag łagodny, infekujący Haemophilus influenzae. Genom tego bakteriofaga

zbudowany jest z dwuniciowego liniowego DNA z „lepkimi” końcami. Genom składa się z 32355

pz i zawiera, podobnie jak genom gospodarza, 39% par GC. Bakteriofag koduje potencjalnie 41

białek. Nie wszystkie funkcje potencjalnych ORF są znane (Rys. 22).

Rys. 22. Mapa genetyczna genomu bakteriofaga HP1.

Wejście w cykl lityczny lub w stan lizogenii regulowane jest przez dwa białka: Cox (cro-like) i

represor typu CI. Białka te są pod kontrolą dwóch głównych promotorów bakteriofaga, od których

zaczyna sie proces transkrypcji w dwóch przeciwstawnych kierunkach: promotora lewego (CI) i

prawego (cox).

Rys. 21. Mitomycyna C.

36

Promotory te są podobnie rozpoznawane przez bakteryjną polimerazę RNA (mają podobną siłę).

Białko Cox blokuje PL, łącząc się z

sekwencjami operatorowymi

usytuowanymi tuż za promotorem PL,

blokuje ekspresję genu cI. Podobnie

białko CI, łącząc się z sekwencjami

operatorowymi, blokuje ekspresję

genu cox (Rys. 23). W przypadku

bakteriofaga HP1 liza zachodzi z tą

sama częstością jak lizogenia.

Wydaje się, że gen cI jest częścią

operonu, w którego skład wchodzi

także gen int: ekspresja int ma

miejsce także w zlizogenizowanych komórkach. ORF5 jest prawdopodobnie białkiem pełniącym

funkcje lambdowego białka CII. W genomie faga znajdują się 2 inne promotory rozpoznawane

przez bakteryjną polimerazę RNA, np. promotor orf14. Białko Cox bierze także udział w wycinaniu

genomu faga podczas indukcji. Białko to ma aktywność „wycinazy”.

Proteaza RecA nie aktywuje proteolizy represora faga HP1: mechanizm indukcji faga HP1 poprzez

mitomocynę C w H. influenzae jest nieznany.

Wybrana literatura:

1. Campbell A. The future of bacteriophage biology. Nature Reviews Genetics 4, 471-477;

2. Dodd IB, Shearwin KE, Egan JB. Revisited gene regulation in bacteriophage lambda. Curr Opin

Genet Dev. 2005; 15(2):145-52.

3. Gottesman ME, Weisberg RA. Little lambda, who made thee? Microbiol Mol Biol Rev. 2004;

68(4):796-813.

4. Esposito D, Fitzmaurice WP, Benjamin RC, Goodman SD, Waldman AS, Scocca JJ.The

complete nucleotide sequence of bacteriophage HP1 DNA. Nucleic Acids Res. 1996;

24(12):2360-8.

5. Esposito D, Scocca JJ. Purification and characterization of HP1 Cox and definition of its role in

controlling the direction of site-specific recombination. J Biol Chem. 1997; 272(13):8660-70.

Rys. 23. Organizacja promotorów wczesnych bakteriofaga HP1.

37

Część praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne

- E. coli NM 258 (cI857 S7)

- Haemophilus influenzae Rd30 (HP1)

- Haemophilus influenzae Rd30 (HP1-)

Odczynniki

A. Indukcja lizogenów HP1 i cI857 S7

- bufor SM: 50 mM TrisCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4, 2% żelatyna (w/v)

- RNaza: 10 mg/ml

- DNaza: 1 mg/ml

- chloroform

- mitomycyna C: 1mg/ml

- bufor do wytrącania: 2,5 M NaCl, 20% PEG 8000

B. Phage Display

- TBST: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20

- bufor blokujący: 0,1 M NaHCO3, 0,02% NaN3, 3% mleko odtłuszczone, pH 8,6

- bufor do wymywania: 0,2 M glicyna, 0,5% mleko odtłuszczone, pH 2,2

- 1M TrisHCl pH 9,1

Wykonanie

1. Abortywna (poronna) infekcja faga T7 c.d.

- porównać miana fagów i wygląd łysinek wyrosłych na obu szczepach po 12-18 h inkubacji w

temp. 37oC;

2. Zjawisko restrykcji - modyfikacji DNA c.d.

- obliczyć miana fagów i poziom restrykcji;

- zaobserwować liczbę i miejsce pojawienia się łysinek;

3. Indukcja faga cI857 S7

- przenieść trzygodzinną hodowlę E. coli NM 258 do wytrząsanej łaźni o temp. 45°C

- inkubować 20 min;

- przenieść hodowlę do wytrząsarki (temp. 37°C) i inkubować 2 h;

- zwirować hodowlę bakteryjną w temp. 4°C, przy 6 000 rpm, 10 min;

- zlać supernatant, usunąć pipetą resztki podłoża i zawiesić osad w 1 ml buforu SM

- przenieść zawieszony osad po 500 l do dwóch eppendorfówek;

- do każdej eppendorfówki dodać kroplę chloroformu (POD WYCIĄGIEM)

- wytrząsać zawartość 10 min;

- odwirować resztki bakterii w temp. 4°C, 8 000 rpm, 10 min, przenieść supernatant do 2

eppendorfówek;

- dodać RNazę do końcowego stężenia 10 g/ml i DNAzę do stężenia 1 g/ml;

- inkubować 10 min w temp. 37°C;

- przechowywać w temp. 4°C;

38

4. Indukcja lizogenów faga HP1

- do 20 ml 2-godzinnej hodowli Haemophilus influenzae Rd30 (HP1) dodać mitomycynę C do

końcowego stężenia 35 ng/ml;

- kontynuować hodowlę przy intensywnym wytrząsaniu i w ciemności 2 h (do wystąpienia lizy);

- dodać do kolbki 0,4 ml chloroformu (POD WYCIĄGIEM);

- wytrząsać 10 min w temp. 37°C;

- odwirować resztki bakterii w temp. 4°C, 8 000 rpm, 10 min;

- podzielić supernatant na 2 części i każdą przelać do 2 probówek wirowniczych;

- dodać RNazę do stężenia 10 g/ml i DNazę do stężenia 1 g/ml;

- inkubować w temp. 37°C, 15 min;

- dodać równą objętość (10 ml) roztworu do wytrącania i inkubować 12-18 h, w temp. 4°C;

5. Phage Display (część teoretyczna na stronie 74)

- wylać roztwór białka z inkubowanej szalki;

- napełnić szlakę buforem blokującym i inkubować przez 1 h w temp. 4°C z delikatnym

mieszaniem;

- zlać bufor blokujący i przemyć szalkę 6 razy buforem TBST;

- rozcieńczyć 10 l faga z biblioteki fagowej M13 w buforze TBST do miana 2 1011

, po czym

wylać go na szalkę i inkubować przez 1 h w temp. pokojowej;

- przemyć szalkę 10 razy buforem TBST;

- wylać na szalkę 1 ml buforu do wymywania fagów i inkubować 10 min w temp. pokojowej z

delikatnym mieszaniem;

- wymyte fagi zebrać do probówki eppendorfa i dodać 150 l 1 M TrisHCl pH 9,1;

- zebrane bakteriofagi przechowywac w temp. 4°C;

39

ĆWICZENIE 6

Metody izolacji DNA z bakteriofagów i ich gospodarzy

Część teoretyczna

Ogólne zasady izolacji DNA.

Czysty DNA to taki, który jest chemicznie stabilny, biologicznie aktywny oraz wolny od

RNA i białek. Ze względu na wielkość genomowego DNA (chromosom bakteryjny, genom faga) i

wrażliwość praktycznie niemożliwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Część DNA ulega

mechanicznemu uszkodzeniom, co nie powoduje zniszczenia drugorzędowej struktury DNA, ale

zmniejsza długość cząsteczki (fragmentacja).

Główne etapy izolacji DNA z komórek bakteryjnych:

1. Rozbicie ściany i błony komórkowej - użycie lizozymu. Lizozym, muramidaza (ang. lysozyme)

to białko kationowe o ciężarze 14,4 kDa, które ma właściwości enzymu hydrolitycznego

rozkładającego peptydoglikan ściany komórkowej bakterii. Działanie lizozymu polega na

rozrywaniu wiązań β-1,4-glikozydowych pomiędzy cząsteczkami kwasu N-acetylomuraminowego

(NAM) i N-acetyloglukozaminą (NAG). Efektem jest zniszczenie błony zewnętrznej i uwolnienie

zawartości komórki, w tym DNA.

Komórki pozostają zawieszone w roztworze I zawierającym Tris (zapewnia właściwe pH), glukozę

(warunkuje właściwe warunki osmotyczne), EDTA (chelatuje jony dwuwartościowe Mg2+

, Ca2+

,

dzięki czemu destabilizowane są osłony komórkowe).

2. Usunięcie białek - zastosowanie detergentu SDS (Laurylosiarczan sodu; dodecylosiarczan(VI)

sodu). Sól sodowa siarczanu dodecylu wiąże się z białkami i nadaje im silnie anionowy charakter.

Zdenaturowane białka oddysocjowują od DNA.

3. Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych komponentów komórkowych - odbiałczenie

DNA z użyciem mieszanin fenol : chloroform : alkohol izoamylowy oraz chloroform : alkohol

izoamylowy. W rezultacie powstają 3 fazy: górna wodna, dolna organiczna i trzecia pomiędzy nimi

gdzie gromadzi się zdenaturowane białko.

Fenol i chloroform powodują denaturację białek a alkohol izoamylowy redukuje pienienie i

stabilizuje granicę fazową (gdzie koncentruje się białko). Do pobranej górnej fazy wodnej

dodawany jest etanol, który zmniejsza polarność roztworu. To z kolei zmniejsza rozpuszczalność

DNA. Wytrącony DNA należy odwirować.

Izolacja bakteriofagowego DNA

Pierwszym etapem izolacji DNA bakteriofagów jest oddzielenie cząstek fagowych od składników

komórkowych i pożywki. Dzięki temu, że wiriony są uwalniane z komórek bakteryjnych do

podłoża, cząstki fagowe można oddzielić od komórek bakteryjnych poprzez wirowanie. Wiriony

pozostaną w supernatancie, a komórki i komórkowe debris zostaną zwirowane w odsadzie. Cząstki

fagowe wytrąca się z supernatantu z użyciem PEG (glikol polietylenowy) i NaCl. PEG absorbuje

wodę, co sprawia, że cząstki fagowe agregują i wytrącają się. Po zwirowaniu tworzą osad (pelet).

Aby uwolnić DNA z kapsydu, należy zastosować detergent (SDS) lub proteinazę K. Całkowite

odbiałczenie następuje po ekstrakcji mieszaninami: fenol:chloroform alkohol izoamylowy oraz

chloroform: alkohol izoamylowy.

40

Część praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne - Nocne hodowle szczepów Haemophilus influenzae Rd30 oznaczone jako A i B. Jeden z nich jest

zlizogenizowany fagiem HP1. Podczas zajęć izolowany jest chromosomalny DNA z obu szczepów.

Na jednym z kolejnych ćwiczeń (9) przeprowadzony będzie test z użyciem techniki PCR, aby

zidentyfikować szczep H. influenzae Rd30 zlizogenizowany HP1.

Do testu indukcji faga cI857 S7:

- E. coli LE392 (-)

s F

-, e14

-(McrA

-), hsdR514 (rk

-mk

+), supF58, lacY1 or (lacIZY)6, galK2,

galT22, metB1, trpR55

Phage Display do namnożenia fagów: - E. coli ER2738 F´proA

+B

+ lacI

q Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10(Tet

R)/ fhuA2 glnV Δ(lac-proAB) thi-1

Δ(hsdS-mcrB)5

Odczynniki

Izolacja DNA faga HP1

- 5 M NaCl

- 10 % SDS

- izopropanol

- mieszanina fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), wysycona buforem TE

- bufor TE: 10 mM TrisCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)

- etanol 96 % i 70 %

Izolacja chromosomalnego DNA (H. influenzae Rd30; szczepy A i B): - roztwór I: 50 mM glukoza, 25 mM TrisCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)

- lizozym - stężenie początkowe 10 mg/ml

- SDS 10 %

- mieszanina fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25:24:1)

- mieszanina chloroform : alkohol izoamylowy (24:1)

- etanol 96 %, 70 %

Test indukcji faga cI857 S7

- podłoże pólpłynne LB

- podłoże LB stałe (2 szalki na parę)

- bufor SM: 10 mM TrisCl (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl

Phage Display

- podłoże płynne LB

- roztwór do wytrącania fagów: 20% PEG 8000, 2,5 M NaCl

Wykonanie

1. Izolacja DNA faga HP1

- odwirować wytrącone cząstki fagowe w temp. 4C, 10 000 rpm, 10 min

- zlać supernatant i ponownie wirować osad w temp. 4C, 10 000 rpm, 2 min

- usunąć resztki płynu, otrzymany osad zawiesić w 750 l buforu TE i całość przenieść do

eppendorfówki

- po dokładnym zawieszeniu osadu (vortex), odwirować kłaczki heminy przez 2 min 13 000 rpm

- supernatant przenieść do nowej eppendorfówki

- dodać 7,5 l SDS 10%

- inkubować 3 min w temp. 68C

- dodać 15 l NaCl

- schłodzić do temp. pokojowej

41

- POD WYCIĄGIEM: Ekstrahować kolejno:

2 mieszaniną fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (równa objętość)

1 mieszaniną chloroform : alkohol izoamylowy (równa objętość)

Fazy rozdzielać za każdym razem wirując 1 min 13 000 rpm i zbierając fazę wodną, tj. górną, do

nowej eppendorfówki

- dodać równą objętość izopropanolu;

- wytrącać DNA przez minimum 15 min w temp. -20C;

- odwirować w temp. 4C, 13 000 rpm, 15 min

- osad przepłukać 1 ml 70 % etanolu, wysuszyć w temp. 42C przez 10 min i zawiesić w 65 l

buforu TE.

2. Izolacja chromosomalnego DNA (wg Sambrook i Russel, ed. 3)

- odwirować (w temp. 4C, 13 000 rpm, 1 min) 1,5 ml hodowli nocnej H. influenzae;

- osad zawiesić w 0,5 ml roztworu I;

- dodać lizozymu do stężenia końcowego 1 mg/ml (50 l);

- inkubować 30 - 60 min w temp. 37C;

- dodać SDS do końcowego stężenia 0,5% (27,5 l);

- inkubować 10 min w temp. 37C;

- POD WYCIĄGIEM: Ekstrahować kolejno:

2 mieszaniną fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (równa objętość)

1 mieszaniną chloroform : alkohol izoamylowy (równa objętość)

Po dodaniu mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy wytrząsać 5 min Fazy rozdzielać za

każdym razem wirując 5 min 13 000 rpm i zbierając fazę wodną, tj. górną, do nowej eppendorfówki,

czynność powtórzyć również w przypadku chloroformu

- dodać delikatnie 2 objętości 96% etanolu;

- wirować 10 min 13 000 rpm;

- delikatnie zlać etanol;

- ponownie wirować przez 3 min 13 000 rpm;

- wybrać resztki etanolu pipetą;

- suszyć w temp. 42C, 15 min w bloku grzejnym;

- rozpuścić w 100 l H2O.

3. Indukcja faga cI857 S7 cd.

- na 2 przygotowane szalki ze stałym podłożem LB wysiać powierzchniowo szczep E. coli LE392

(3ml półpłynnego LB o temp. 45C + 0,2 ml nocnej hodowli bakteryjnej);

- na powierzchnię zestalonego półpłynnego agaru nakroplić 5 l uzyskanego faga cI857 S7;

- inkubować 12–18 h w temp. 30oC (jedna szalka) i 42

oC (druga szalka).

4. Phage Display - etap: Namnożenie specyficznych fagów w komórkach bakteryjnych

E. coli - do dużych kolb (300 ml) dodać 20 ml podłoża LB, a następnie 0,2 ml nocnej hodowli E. coli

ER2738 oraz 20 l wyizolowanych fagów;

- kolby wytrząsać przez 2,5-3 h w 37C;

- hodowlę zwirować 10 min 10000 rpm; przenieść supernatant do nowej probówki i zwirować

ponownie;

- zebrać górne 80% supernatantu (16 ml), przenieść go do nowej probówki, dodać 1/6 objętości

buforu do wytrącania PEG/NaCl (2,7 ml) i wytrącać przez noc w temp. 4C.

42

ĆWICZENIE 7

Otrzymanie biblioteki fragmentów restrykcyjnych faga HP1 w wektorze plazmidowym

pBluescript KS II (+) (etap: Uzyskanie zrekombinowanego plazmidu zawierającego fragmenty

restrykcyjne faga HP1)

Część teoretyczna

Zjawisko restrykcji – modyfikacji (patrz też ćwiczenie 3)

W systemie restrykcji-modyfikacji (RM) wyróżnia się dwie aktywności enzymatyczne:

endonukleolityczną (endonukleaza restrykcyjna, ang. restriction endonuclease, REaza) oraz

modyfikującą (metylotransferaza DNA, metylaza DNA, ang. methyltransferase, MTaza), które

rozpoznają w DNA tę samą, specyficzną sekwencję. MTaza modyfikuje określoną zasadę w

sekwencji rozpoznawanej. Jeśli sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, REaza przeprowadza

cięcie endonukleolityczne DNA (Rys. 24).

Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadającej system RM, nie jest substratem

dla REazy z tego systemu. Natomiast obcy DNA (np. infekującego faga) zostaje rozpoznany przez

REazę i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np.

bakteriofagowym jest główną postulowaną funkcją systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według

innej hipotezy są one samolubnymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest

warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka” (Kobayashi, 2001). Sugeruje się też ich

udział w utrzymywaniu tożsamości gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz, to, że przez

indukowanie rearanżacji genomowych przyczyniają się do zróżnicowania genetycznego (Arber,

2000).

Rys. 24 Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA –

różne produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy.

Ze względu na różnorodność i mnogość przedstawicieli REaz oraz towarzyszących im

MTaz, systemy RM zostały podzielone na cztery typy (Loenen i wsp., 2014 Roberts i wsp., 2003;

patrz też ćwiczenie 3 Tabela 3). Do typu I zaliczono kompleksy białkowe złożone z trzech rodzajów

podjednostek: rozpoznających specyficzną sekwencję (S), endonukleolitycznych (R) i

modyfikacyjnych (M). Enzym do cięcia wymaga obecności ATP. Sekwencja rozpoznawana jest

asymetryczna i składa się z dwóch krótkich odcinków zasad o określonej specyficzności,

przedzielonych kilkoma niespecyficznymi parami nukleotydów (np. EcoKI AACN6GTGC).

Systemy typu II stanowi najliczniejszą grupę, składającą się najczęściej z dwóch oddzielnych białek:

monomerycznej MTazy i dimerycznej ENazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i

często palindromiczna. Systemy typu III RM składając się z dwóch rodzajów podjednostek:

5’ – G↓AATTC – 3’

3’ – CTTAA↑G – 5’

CH3

CH3

REaza MTaza

43

modyfikacyjnej (Mod) i endonukleolitycznej (Res). Miejsce rozpoznawane przez te enzymy, o

długości 5-6 par zasad, jest niepalindromiczne (do cięcia wymagane są jego dwie kopie), a także

ATP. Natomiast do typu IV zaliczono REazy, które trawią tylko zmetylowany DNA.

Endonukleazy typu I i III charakteryzuje brak ścisłej kontroli nad położeniem miejsca cięcia

względem rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy retrykcyjne typu II przecinają DNA w

sekwencji rozpoznawanej albo blisko niej. Wynikiem trawienia określonej sekwencji DNA jest,

w tym przypadku, powtarzalny zestaw fragmentów o przewidywanej długości. Właściwość ta

spowodowała szerokie wykorzystanie enzymów restrykcyjnych typu II jako narzędzi w

manipulacjach DNA.

Endonukleazy restrykcyjne typu II

Obecnie w bazie danych REBASE (http://rebase.neb.com), katalogującej enzymy

restrykcyjne, metylotransferazy DNA i pokrewne białka, znajduje się ponad 3949 ENaz typu II

rozpoznających 318 specyficznych sekwencji (dane z 01.2014). Komercyjnie dostępnych jest 236

różnych specyficzności REaz. Enzymy należące do tej grupy są najczęściej homodimerami lub

tetramerami, wymagającymi tylko jonów Mg2+

jako kofaktora. Nić DNA jest cięta wewnątrz

krótkiej sekwencji rozpoznawanej lub w pewnej stałej odległości od niej. Mimo wspólnych cech,

przedstawiciele tego typu są dość różnorodną grupą endonukleaz i dlatego wprowadzono podział na

podtypy, uwzględniając przy tym budowę białek, rodzaj sekwencji docelowej, sposób cięcia DNA i

inne cechy (Tabela 4). To samo białko może należeć do różnych podtypów, gdyż nie wykluczają się

one wzajemnie (Roberts i wsp., 2003).

Tabela 4. Podział enzymów resthrykcyjnych typu II na podtypy.

Podtyp Opis Przykładowe

enzymy

A niepalindromiczna sekwencja rozpoznawana; często jeden gen

koduje REazę a dwa geny kodują MTazy FokI, HphI

B dwuniciowe cięcia po obu stronach sekwencji docelowej AloI, HaeIV

C obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym

polipeptydzie GsuI, HaeIV

E do cięcia potrzebne dwie kopie sekwencji docelowej, jedna cięta,

druga działa jako efektor allosteryczny FokI, Sau3AI

F interakcja z dwiema kopiami sekwencji rozpoznawanej i obie cięte BspMI, Cfr10I

G obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym

polipeptydzie; AdoMet działa stymulująco na aktywność AloI, Eco57I

H podobna struktura genów do REaz typu I AhdI, BcgI

M sekwencja rozpoznawana cięta gdy zmetylowana DpnI

P sekwencja rozpoznawana palindromiczna EcoRI, HaeIII

S cięcie poza niepalindromiczną sekwencją rozpoznawaną FokI, Eco57MI

T heterodimery Bpu10I, MlyI

Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych: stosowane są literowe skróty (np. HindIII, EcoRI).

Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a

kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie

odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu.

HindIII - Haemophilus influenzae Rd; Mph1103I - Moraxella phenylpyruvica RFL1103

44

Izoschizomery – enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą

sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia.

Przykład: HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI - GG↓CC CC↑GG

Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w

DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia.

Przykład: SmaI Cfr9I Acc65I KpnI

CCC↓GGG C

↓CCGGG G

↓GTACC GGTAC

↓C

GGG↑CCC GGGCC↑C CCATG↑G C↑CATGG

Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną

hydrolizę wiązań w markerowego DNA o masie 1 g w czasie 1 godziny i w temperaturze i

warunkach właściwych dla danego enzymu.

REazy pozostawiają w rozciętej cząsteczce DNA dwa rodzaje końców (Rys. 25):

tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na końcach

są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici;

5’-GG↓CC-3’ 5’-GG–3’ 5’-CC-3’

3’-CC↑GG-5’ 3’-CC–5’ 3’-GG-5’

lepkie końce - 3` lub 5` - jednoniciowe odcinki występujące na obu końcach przeciętej

niesymetrycznie cząsteczki (Rys. 25).

HindIII Mph1103I

A↓AGCTT ATGCA

↓T

TTCGA↑A T↑ACGTA

5’-A–3’ 5’-AGCTT-3’ 5’-ATGCA T-3’

3’-TTCGA-5’ 3’-A-5’ 3’-T ACGTA–5’

Rys. 25 Enzym restrykcyjny HindIII generuje jednoniciowe wystające (lepkie) końce 5’ a enzym Mph1103I

jednoniciowe wystające (lepkie) końce 3’.

Rodzaj pozostawianych końców ma znaczenie przy manipulacjach przeprowadzanych przy

klonowaniu:

warunkuje połączenie końców zgodnych (kompatybilnych)

wymusza konieczność przekształcenia lepkich końców w tępe, np. przez zastosowaniu

polimerazy DNA

Sekwencja palindromiczna – sekwencja czytana w kierunku od 5’ do 3’ końca jest taka sama jak

na nici komplementarnej.

5’- AAGCTT -3’ 3’- TTCGAA -5’

45

Czynniki wpływające na aktywność enzymu restrykcyjnego

1. Bakterie, z których izolowane są enzymy restrykcyjne bytują w różnych, często ekstremalnych,

środowiskach. Stąd wynikają różne preferencje warunków reakcji związane np. z temperaturą

inkubacji. Inne elementy, które różnią bufory wykorzystywane do przeprowadzenia reakcji z

danym enzymem to: siła jonowa (stężenie soli), główny kation (sód lub potas) i pH. Każdy

enzym restrykcyjny wymaga obecności kofaktora Mg2+

!

2. Czasami w buforach do reakcji dostarczane są dodatkowe związki chemiczne, które wspomagają

działanie niektórych enzymów restrykcyjnych - np. detergent (Triton-X-100 do redukcji napięcia

powierzchniowego), BSA (ang. bovine serum albumin, albumina z grasicy cielęcej) zwiększa

ogólne stężenie białka.

3. Obecność zanieczyszczeń pozostałych po preparatyce izolacji DNA (EDTA, fenol, etanol,

proteinazy itd.) może inaktywować enzym restrykcyjny.

4. W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się niespecyficzna

aktywność enzymu - tzw. star activity. Czynniki sprzyjające:

zbyt długi czas reakcji (zmiana stężenia buforu w wyniku odparowywania wody z

mieszaniny reakcyjnej)

nieoptymalna temperatura reakcji,

zbyt wysokie stężenie enzymu,

nieoptymalne stężenie soli,

nieoptymalne pH,

obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn2+

, zamiast Mg2+

(jony Mg2+

są niezbędne dla

aktywności endonukleaz);

obecność rozpuszczalników organicznych,

zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20C w 50% glicerolu

jednak, aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno przekraczać

5%).

Endonukleazy restrykcyjne są wrażliwe na obecność zmetylowanej zasady w obrębie

sekwencji DNA przez nie rozpoznawanej, co wyraża się nie rozpoznaniem jako substratu

sekwencji docelowej. Zmetylowane zasady występujące w DNA to: N6-metyloadenina, N6mA,

m6A), N4-metylocytozyna (N4mC, m

4C) i 5-metylocytozyna (5mC, m

5C) (Rys. 26)

46

Rys. 26. Zmetylowane zasady w DNA oraz kofaktor grup metylowych S-adenozylometionina (AdoMet).

Niemal wszystkie szczepy Escherichia coli używane w laboratoriach zawierają, co najmniej dwie

metylotransferazy DNA:

- metylazę Dam (M.Dam), która dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC (produkt

Gm6ATC)

- metylazę Dcm (M.Dcm), która modyfikuje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCWGG (W=A

lub T) CC(A/T)GG do Cm5C(A/T)GG

Praktyczną konsekwencją tego zjawiska jest fakt, że wiele endonukleaz nie będzie trawić DNA

zmetylowanego przez w/w metylazy DNA. Poniżej kilka przykładów.

Metylaza Dam E. coli, modyfikując w DNA adeninę w sekwencjach GATC, czyni je niewrażliwymi

na trawienie enzymem MboI, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż substratem dla

enzymu Sau3AI.

AdoMet

adenina cytozyna

N6-metyloadenina N4-metylocytozyna 5mC -metylocytozyna

47

Metylaza Dcm E. coli, modyfikując w DNA drugą cytozynę w sekwencjach CCWGG, czyni je nie

wrażliwymi na trawienie enzymem EcoRII, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż

substratem dla enzymu MvaI.

Miejsca rozpoznawane przez niektóre enzymy mogą zawierać (np. BclI TGATCA) lub pokrywać się

częściowo z sekwencją GATC np TCGA (TaqI), ATCGA (ClaI). Gdy sekwencje te zostaną

zmetylowane przez M.Dam, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami. Podobna sytuacja

ma miejsce w przypadku nakładania się sekwencji docelowej danego enzymu z sekwencją CCWGG

modyfikowaną przez M.Dcm np AGGCCT (StuI); TGGCCA (MscI). Gdy sekwencje te zostaną

zmetylowane przez M.Dcm, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami.

nnTCGAtcnn

nnAGCTagnn

nnATCGATcnn

nnTAGCTAgnn

nnTGATCAnn

nnACTAGTnn

nnTCGAtcnn

nnAGCTagnn

nnTCGAtcnn

nnAGCTagnn

nnATCGATcnn

nnTAGCTAgnn

nnATCGATcnn

nnTAGCTAgnn

nnTGATCAnn

nnACTAGTnn

nnTGATCAnn

nnACTAGTnn

nnAGGCCTggnn

nnTCCGGAccnn

nnTGGCCAggnn

nnACCGGTccnn

nnAGGCCTggnn

nnTCCGGAccnn

nnAGGCCTggnn

nnTCCGGAccnn

nnTGGCCAggnn

nnACCGGTccnn

Jeśli (nieoczekiwanie) DNA nie został pocięty, przez użyty przez Ciebie enzym restrykcyjny,

lub trawienie jest tylko częściowe, sprawdź, czy ten enzym niejest wrażliwy na metylację!

Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej Nieodwracalna:

inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze 65C lub 80C);

denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform lub każdego z nich

oddzielnie (po odbiałczeniu preparatu należy poddać go precypitacji);

denaturacja białek poprzez dodanie HCl

Odwracalna:

dodanie EDTA do stężenia końcowego 12,5 mM (następuje wymiareczkowanie jonów

Mg2+

)

Połączenie fragmentów DNA w reakcja ligacji

Ligacja jest przeprowadzana przez enzymy ligazy, które łączą dwa fragmenty DNA poprzez

wytworzenie wiązania kowalencyjnego - fosfodiestrowego między końcem hydroksylowym 3'

jednego nukleotydu a końcem 5' z grupą fosforanową drugiego nukleotydu przy wykorzystaniu

energii z hydrolizy ATP (adenozynotrifosforanu). np ligaza faga T4 lub NAD+ np ligaza E. coli.

Dezaktywację ligazy przeprowadza się w temperaturze 65oC przez 20 minut.

48

Analiza zrekombinowaneo DNA - elektroforeza

Elektroforeza – jest techniką, w której wymusza się ruch cząsteczek za pomocą pola elektrycznego.

W przypadku DNA służy do identyfikacji, rozdziału i izolacji.

Cząsteczki kwasów nukleinowych posiadają ładunek negatywny wynikający z ich szkieletu

fosforanowego i migrują w kierunku anody (+).

Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy otrzymywany z glonów. Agaroza

zawieszona w wodzie w temperaturze pokojowej tworzy koloid - żel. Służy do rozdziału nawet

bardzo dużych cząsteczek, ale posiada relatywnie małą rozdzielczość. Typowe stężenia do rozdziału

DNA to 0,5-2%. W standardowych warunkach poprzez użycie różnych stężeń agarozy mogą być

rozdzielone fragmenty DNA między 50 a 20000 pz (Tabela 5).

Tabela 5. Zależność pomiędzy stężeniem żelu agarozowego a zakresem długości rozdzielanego liniowego DNA.

Stężenie agarozy (%) Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (kpz)

0,3 5 - 60

0,6 1 - 20

0,7 0,8 - 10

0,9 0,5 - 7

1,2 0,4 - 6

1,5 0,2 - 3

2,0 0,1 - 2

Elektroforeza w żelach agarozowych prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział

elektroforetyczny prowadzony jest w buforze:

TBE1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub

TAE1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8.

Akryloamid - polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akryloamidu. Ma

niską zdolność rozdziału (fragmenty DNA do ok. 500 pz), ale bardzo wysoką rozdzielczość.

Do uwidaczniania DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek

etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo

EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Obecność związku interkalującego w żelu

agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. EtBr to bardzo silny

mutagen prawdopodobnie także karcynogen i teratogen! Dzięki właściwościom

fluorescencyjnym EtBr możliwa jest wizualizacja DNA w świetle UV (300 nm). Innym

odczynnikiem stosowanym do wizualizacji DNA jest np. SYBR Green, którego czułość jest 25

większa niż EtBr.

Z reguły nakładając próbkę DNA na żel agarozowy mieszamy ją uprzednio z tzw.

barwnikiem do nakładania na żel, lub krótko barwnikiem (ang. loading dye). Przyczyn jego użycia

jest kilka:

próbka DNA, która ma kolor jest wygodna w nakładaniu (łatwość wizualizacji),

glicerol (lub sacharoza, ficoll 400) będący składnikiem tego barwnika zwiększa gęstość

próbki i zapewnia, że znajdzie się ona na dnie dołka,

negatywnie naładowany barwnik migruje przez żel w tym samym kierunku co DNA i stąd

ułatwia śledzenie postępu rozdziału elektroforetycznego.

49

Najpopularniejsze barwniki: błękit bromofenolowy (ang. bromophenol blue), cyjanian ksylenu (ang.

xylene cyanol), orange G. Różnią się kolorem, tempem migracji w danym żelu (stężenie agarozy,

rodzaj buforu).

Enzymy służące do modyfikacji DNA

Obecnie stosuje się wiele różnorodnych, komercyjnie dostępnych enzymów służących do

modyfikacji i rekombinacji DNA. Są to m.in.: enzymy restrykcyjne, alkaliczna fosfataza (AP, ang.

alkaline phosphatase), kinaza polinukleotydowa, ligaza DNA, polimeraza DNA I, fragment

Klenowa, nukleaza S1, odwrotna transkryptaza, terminalna transferaza, RNaza, DNaza,

egzonukleazy (I, III), endonukleazy (IV, V), polimeraza DNA (Taq, Pfu), topoizomeraza.

Alkaliczna fosfataza (EC 3.1.3.1) jest hydrolitycznym enzymem odpowiedzialnym za

usuwanie reszt 5’ fosforanowych z DNA, RNA oraz nukleotydów. Wszystkie alkaliczne fosfatazy

są metaloenzymami (Zn(II)). Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest defosforylacją i

przebiega z wytworzeniem produktu pośredniego zawierającego ufosforylowaną serynę. Enzym ten

wykazuje najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym – stąd jego nazwa. Możemy wyróżnić

kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z różnych źródeł, które odróżnia między innymi

możliwość inaktywacji:

bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP – bacterial alkaline phosphatase) – wykazuje

najwyższą aktywność i jest najbardziej trwała (najtrudniej ją inaktywować po zakończeniu

reakcji defosforylacji). BAP jest wydzielana w postaci monomeru

(Mr = 47 kDa) do przestrzeni peryplazmatycznej Escherichia coli, gdzie dimeryzuje i staje

się katalitycznie aktywna. W obojętnym lub alkalicznym pH, dimer BAP zawiera do 6

jonów Zn2+

, z których dwa są niezbędne dla aktywności enzymu. Tylko jedno z dwóch

miejsc katalitycznych dimeru jest aktywne przy niskim stężeniu sztucznego substratu,

podczas gdy oba stają się aktywne przy wysokim stężeniu.

alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - calf intestinal alkaline phosphatase) –

najczęściej używana w laboratoriach biologii molekularnej. Wykazuje niewiele niższą

aktywność w stosunku do BAP, a można ją efektywnie inaktywować termicznie lub

poprzez trawienie proteolityczne. CIAP jest glikoproteiną zbudowaną z dwóch 514-

aminokwasowych monomerów. Aktywność enzymu zależy od stężenia jonów Mg2+

i Zn2+

.

Zn2+

wiąże się w centrum katalitycznym i jest wymagany do aktywności katalitycznej.

Mg2+

wiąże się do różnych miejsc enzymu i jest allosterycznym aktywatorem.

alkaliczna fosfataza z krewetek (SAP - shrimp alkaline phosphatase) – izolowana z

krewetek Pandalus borealis, jest stosunkowo łatwa do inaktywacji termicznej.

Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza używana jest głównie do:

usuwania grupy 5´fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które

uprzednio zostały strawione enzymami restrykcyjnymi (Rys. 28). Zapobiega to ponownej

cyrkularyzacji wektora, a tym samym wydajność klonowania jest większa (Rys. 28).

usuwania grupy 5´fosforanowej z fragmentów DNA poprzedzającego radioaktywne

znakowanie 32

P (przygotowanie DNA do radioaktywnego znakowania w reakcji z

wykorzystaniem polinukleotydowej kinazy faga T4);

usuwania grupy 5´fosforanowej z RNA, rNTPs i dNTPs (Rys. 27);

jako enzym reporterowy w nieradioaktywnych systemach do wykrywania i lokalizacji

kwasów nukleinowych i białek. AP jest skoniugowana z ligandem, który specyficznie

oddziałuje z cząsteczką docelową.

50

Rys. 27 Usuwanie grupy 5´fosforanowej DNA/RNA. (A) struktura nukleotydu, zaznaczono usuwaną grupę

fosforanową; (B) i (C) reakcja defosforylacji.

Rys. 28 Schemat klonowania insertu (powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym) do defosforylowanego

wektora.

wektor nie poddany działaniu

alkalicznej fosfatazy może ulegać

ponownej cyrkularyzacji, co

prowadzi do otrzymania dużej

ilości „pustych” wektorów

defosforylowany wektor nie może

ulec cyrkularyzacji, bez insertu

3’ OH 5’ P

3’ OH 3’ OH

3’ OH

5’ P

5’ pDNA lub 5’pRNA 5’ OHDNA lub 5’OHRNA alkaliczna fosfataza

(A) (B)

(C)

51

Kinaza polinukleotydowa bakteriofaga T4 (T4 PNK) katalizuje przeniesienie -fosforanu z ATP

(Rys. 29) na (patrz struktura nukleotydu po defosforylacji) koniec 5’ OH jedno- lub dwu-niciowego

DNA, RNA lub oligonukleotydów.

Rys. 29 Struktura ATP (ang. adenosine triphosphate) i ADP (ang. adenosine diphosphate).

Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji: reakcji

podstawienia (ang. forward reaction) i reakcji wymiany (ang. exchange reaction) (Rys. 30).

W reakcji podstawienia -fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy nukleotyd nie

posiada reszty fosforanowej na końcu 5’ (została ona usunięta w reakcji defosforylacji lub w takiej

postaci została zsyntetyzowana chemicznie). Reakcja ta jest odwracalna. W reakcji wymiany,

nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5’-fosforan z ufosforylowanego DNA, a

następnie DNA jest ponownie fosforylowany przez przeniesienie -fosforanu z ATP (np. [-32

P]ATP). W reakcji katalizowanej przez T4 PNK stężenie ATP powinno wynosić 1M (reakcja

podstawienia) lub 2M (reakcja wymiany). Ponadto enzym posiada aktywność 3’ fosfatazy.

Rys. 30 Aktywność enzymatyczna T4 PNK.

Oczyszczenie kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4 z zainfekowanych komórek

gospodarza jest niewydajne i trudne, dlatego też źródłem T4 PNK są komórki Escherichia coli

z wklonowanym genem pseT bakteriofaga T4. T4 PNK jest homotetramerem zbudowanym

z podjednostek o masie 28,9 kDa każda.

T4 PNK jest głównie wykorzystywana do:

radioaktywnego znakowania na końcu 5’ kwasów nukleinowych (reakcja podstawienia lub

wymiany), które następnie wykorzystywane są: (i) jako sonda hybrydyzacji; (ii) do

mapowania transkryptu; (iii) jako markery do elektroforezy żelowej; (iv) jako startery w

reakcji sekwencjonowania DNA; (v) jako startery do reakcji PCR lub w innych metodach

wymagających terminalnie wyznakowanego DNA.

5'-fosforylacji oligonukleotydowych łączników i DNA/RNA przed ligacją.

52

Polimeraza DNA I (holoenzym) (PolI, polimeraza Kornberga) syntetyzowana przez E. coli

zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 109 kDa,

kodowanego przez gen polA. Enzym ten posiada następujące aktywności: (i) polimerazy DNA

5’→3’; (ii) egzonukleazy 3’→5’; (iii) egzonukleazy 5’→3’ oraz (iv) RNazy H. Aktywność RNazy

H nie jest powszechnie wykorzystywana w biologii molekularnej. Poszczególne aktywności

katalizowane są przez odrębne domeny enzymu (Tabela 6).

Tabela 6. Domeny polimerazy DNA I kodowanej przez Escherichia coli.

Domena Aktywność

Karboksylowa, aminokwasy 543 – 928,

~46 kDa

polimeryzacyjna 5’→3’

Centralna, aminokwasy 326 – 542,

~22 kDa*

egzonukleolityczna 3’→5’

Aminowa, aminokwasy 1-325* egzonukleolityczna 5’→3’

*karboksylowa i centralna domena stanowią fragment Klenowa

Fragment Klenowa jest dużym fragmentem polimerazy DNA I kodowanej przez E. coli.

Posiada aktywność polimeryzacyjną 5’→3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’→5’ (aktywność

naprawcza). W porównaniu z PolI nie posiada aktywności egzonukleolitycznej 5’→3’. Do

przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5’→3’ wymagana jest obecność jednoniciowej matrycy

oraz startera. Niezbędnym kofaktorem reakcji katalizowanych przez enzym są jony Mg2+

. Fragment

Klenowa jest monomerem o wielkości 76 kDa. Enzym ten można otrzymać poprzez proteolizę

polimerazy Kornberga subtylizyną lub też poprzez sklonowanie odpowiedniego fragmentu genu

polA w komórkach E. coli.

Fragment Klenowa jest wykorzystywany w biologii molekularnej m.in. do:

- wypełniania lepkich końców 5’ (Rys. 31), powstałych po trawieniu enzymami

restrykcyjnymi pozostawiającymi tego typu końce. Enzym ten katalizuje w sposób zależny

od matrycy dodawanie trifosforanów nukleotydów do cofniętej reszty hydroksylowej 3’.

Synteza zachodzi w kierunku 5’→3’do momentu, aż wystający lepki koniec zostanie

całkowicie wypełniony.

Rys. 31 Wypełnianie wystających lepkich końców 5’ przez fragment Klenowa.

- wytępiania lepkich końców 3’, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi

zostawiającymi wystające końce 3’. Jednak wytępianie lepkich końców 3’ jest wydajniej

katalizowane przez polimerazę DNA faga T4, która ma większą aktywność

egzonukleolityczną. W niektórych przypadkach aktywność egzonukleolityczna 3’→5’

fragmentu Klenowa jest niepotrzebna lub szkodliwa. Należy wtedy zastosować fragment

Klenowa exo-. Enzym ten zachowuje aktywność polimeryzacyjną, nie posiada natomiast

5’ ...GTCCA 3’OH 5’ ...GTCCAAGCT 3’OH 3’ ...CAGGTTCGAp 5’ 3’ ...CAGGTTCGAp 5’

fragment Klenowa

dATP, dTTP,

dGTP, dCTP

Mg2+

53

aktywności egzonukleolitycznej 3’→5’. Fragment Klenowa exo- uzyskuje się poprzez

wprowadzenie odpowiedniej mutacji w genie kodującym fragment Klenowa.

Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest białkiem o wielkości 114 kDa kodowanym przez gen 43

colifaga T4. Otrzymywany jest z komórek E. coli niosących plazmid zawierających gen 43. Enzym

ten posiada aktywności zbliżone do aktywności fragmentu Klenowa, tj. aktywność polimeryzacyjną

5’→3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’→5’. Nie posiada aktywności egzonukleolitycznej

5’→3’.

Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest wykorzystywana w biologii molekularnej m.in do:

- wytępiania lepkich końców 3’, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi

zostawiającymi wystające końce 3’ (Rys. 32). Aktywność egzonukleolityczna w stosunku do

dwuniciowego DNA blokowana jest przez aktywność polimeryzacyjną 5’→3’.

Rys. 32 Wytępianie lepkich końców 3’ przez polimerazę DNA bakteriofaga T4.

- wypełniania lepkich końców 5’. Aktywność polimeryzacyjna 5’→3’ wymaga obecności

matrycy, startera, jonów Mg2+

oraz dNTP.

Aktywność egzonukleolityczną 3’→5’ polimerazy DNA bakteriofaga T4 jest ok. 200 razy

silniejsza niż fragmentu Klenowa. Powoduje to, że enzym ten jest wydajniejszy w wytępianiu

lepkich końców 3’.

5’ ...pCpGpCpApTpCpT 3’ ...pCpGpCOH 3’

3’ ... GpCpGp 5’ ... GpCpGp 5’

+

pA + 5’pC +

5’pT

polimeraza DNA

bakteriofaga T4

Mg2+

54

Część praktyczna

Materiały

Rekombinacja DNA

Podstawowymi materiałami są wyizolowane przez studentów DNA faga HP1 i plazmidu

pBluescript KSII(+) oraz

- enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) BamHI i BglII

- bufor do trawienia enzymami restrykcyjnymi (10 stężony): 100 mM TrisCl (pH 8,5),

100 mM MgCl2, 1000 mM KCl, 0.1mg/ml BSA

- bufor TBE (10 stężony): 1M Tris, 0,9 M kwas borowy, 0,01 M EDTA

- barwnik (obciążnik) do nakładania na żel (6 stężony): 15 % glicerol, 0,25 % błękit

bromofenolowy, 0,25% xylen cyanol FF

- bromek etydyny 10 mg/ml

- ATP 10 mM.

Phage Display

- PEG/NaCl: 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl

- TBS: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl

- 3 szalki LB z IPTG, X-gal i tetracykliną

- nocna hodowla E. coli ER2738

Wykonanie

1. Nastawienie trawień DNA

wektora pBluescript KSII(+) enzymem restrykcyjnymi BamHI: GGATCC

CCTAGG

- 3 l DNA (ok. 0,5 g)

- 2 l buforu do trawienia

- 14, 7 l H2O

- 0, 3 l enzymu restrykcyjnego BamHI

-

DNA faga HP1 enzymem restrykcyjnym: BglII: AGATCT

TCTAGA

- 6 l DNA (ok. 1,5 g)

- 2 l buforu do trawienia

- 11, 7 l H2O

- 0, 3 l enzymu restrykcyjnego BglII

inkubacja w temp. 37oC, 1,5 h

Uwaga! Dokładne ilości składników mieszaniny (trawienie 1 i 2) podane zostaną przez osobę

prowadzącą ćwiczenia.

2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

- przygotowanie żelu agarozowego (0,7 % w buforze 1 TBE)

- przygotowanie próbek trawionego DNA do naniesienia na żel (pobrać 10 l mieszaniny

reakcyjnej i po zmieszaniu z 2 l barwnika, nanieść na żel)

- rozwijać elektroforezę przez 1 h, a następnie barwić żel w bromku etydyny

- wizualizacja żelu w świetle UV (dł. fali 300 nm)

55

3. Przygotowanie reakcji ligacji

- pobrać 6 l pociętego DNA plazmidu

- 6 l pociętego DNA faga HP1

- dodać 8 l mieszaniny ligacyjnej: bufor do trawienia 0,8 l, 10 mM ATP 2 l, H2O 4,2 l

ligaza - 1 l,

Reakcję inkubować w temp. pokojowej 12 – 18 h

Fot. Elektroforeza produktów trawienia DNA faga HP1 enzymem BglII.

NC BglII M

nie cięty DNA 10504bp

9591bp

6941bp

5208bp

Tor NC: nie cięty DNA faga HP1

Tor BglII: DNA faga HP1 strawiony

enzymem BglII

M: marker wielkości

1000bp

8000bp

6000bp

5000bp

4000bp

3500bp

3000bp

2500bp

2000bp

1500bp

1200bp

1000bp

900bp

800bp

700bp

600bp

500bp

56

5. Odczytanie wyników (oglądanie szalek) z ćwiczenia 6 pkt 4. (Indukcja faga cI857 S7)

6. Phage Display

- na początku ćwiczeń odświeżyć nocną hodowlę szczepu E. coli ER2738

- wytrącone cząstki fagowe zwirować 15 minut, 10000 rpm w 4C, zlać supernatant

- ponownie zwirować 5 minut, 10000 rpm w 4C i dokładnie usunąć supernatant

- osad faga zawiesić w 1 ml TBS, przenieść do probówki eppendorfa i wirować 1 min 5000 rpm

- przenieść supernatant do nowej probówki eppendorfa, dodać 1/6 objetości PEG/NaCl i wytrącać

fagi w lodzie przez 30 minut

- wirować 10 minut 10000 rpm w temp 4C i usunąć supernatant

- osad faga zawiesić w 200 l TBS

- wirować 1 min 5000 rpm i przenieść supernatant do nowej probówki

- wykonać szalki dwuwarstwowe z hodowlą E. coli ER2738, na podłożu LB z IPTG, X-gal i

tetracykliną z użyciem rozcieńceń faga 10-4

, 10-6

i 10-8

Wybrana literatura:

1. Arber W, Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled

modification of bacteriophage lambda. J Mol Biol. 1962. 5:18-36

2. Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS

Microbiol Rev. 2000. 24:1-7

3. Bertani G, Weigle JJ. Host controlled variation in bacterial viruses. J Bacteriol. 1953. 65:113-21

4. Ishikawa, K., Fukuda, E., Kobayashi, I. Conflicts targeting epigenetic systems and their

resolution by cell death: novel concepts for methyl-specific and other restriction systems. 2010.

DNA Res. 17: 325-342

5. Jeltsch A. Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function

for restriction/modification systems? Gene. 2003. 317:3-6

6. Kobayashi I.Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their

impact on genome evolution. Nucleic Acids Res. 2001. 29:3742-56

7. Loenen WA, Dryden DT, Raleigh EA, Wilson GG, Murray NE. Highlights of the DNA cutters:

a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 2014. 42:3-19.

8. Luria SE, Human ML. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J Bacteriol.

1952. 64:557-69

9. Orlowski, J., Bujnicki, J.M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction

enzymes based on theoretical and experimental analyses. 2008. Nucleic Acids Res. 36: 3552-

3569

10. Roberts RJ et. al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing

endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 2003. 31:1805-12

11. Sambrook,J. and Russell,D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

57

ĆWICZENIE 8

Otrzymanie biblioteki fragmentów restrykcyjnych faga HP1 w wektorze plazmidowym

pBluescript KS II (+) (etap: Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do komórek Escherichia

coli, transformacja).

Transfekcja Haemophilus influenzae DNA faga HP1

Część teoretyczna

Transformacja: rys historyczny

W 1928 r. F. Griffith jako pierwszy zbadał i opisał zjawisko transformacji komórek

bakteryjnych. Opracowując szczepionkę przeciw zapaleniu płuc, Griffith badał dwa szczepy

Streptococcus pneumoniae: zjadliwy szczep S, które wytwarzał polisacharydową otoczkę oraz

niewirulentny bezotoczkowy szczep R. Wirulentne bakterie szczepu S, po zabiciu przez podgrzanie i

wstrzyknięciu myszom, nie powodowały objawów chorobowych. Jednak jeśli martwe bakterie

szczepu S wstrzyknięto razem z żywymi niezjadliwymi bakteriami szczepu R, myszy umierały.

Istniał więc czynnik transformujący szczep niepatogenny w patogenny. Dalsze badania wykazały, że

czynnikiem transformującym jest DNA (Avery, MacLeod, McCarthy, 1944).

Transformacją nazywamy proces pobierania obcego, zewnątrzkomórkowego, wolnego

DNA przez komórkę biorcy. Jedynie komórki kompetentne są w stanie pobrać DNA ze środowiska.

Wiele bakterii jest naturalnie kompetentnych. Większość osiąga ten stan spontanicznie w

określonych warunkach (np. Bacillus, Streptococcus, Azotobacter czy Haemophilus), inne są

konstytutywnie kompetentne (np. Neisseria gonorrhoeae).

Zazwyczaj pobierany jest każdy DNA, jednak niektóre bakterie, jak np. N. gonorrhoeae lub

H. influenzae, pobierają tylko DNA homologiczny, tzn. taki, który posiada specyficzne sekwencje

(tzw. uptake sequence). Istnieją także komórki, które w warunkach naturalnych nigdy nie osiągają

stanu kompetencji, np. komórki E. coli.

Transformacja chemiczna

Cząsteczki DNA są zbyt duże, aby przenikać przez błony komórkowe. W warunkach

laboratoryjnych, transformację E. coli przeprowadza się metodą chemiczną. Mieszanina DNA

dodawana jest do zawiesiny komórek uprzednio traktowanych dwuwartościowymi kationami: Ca2+

,

Mg2+

, Mn2+

lub Ba2+

w niskiej temperaturze. Całość poddaje się szokowi termicznemu. Mechanizm

transformacji chemicznej jest nieznany. Podejrzewa się, że w komórkach będących w

logarytmicznej fazie wzrostu, błony komórkowe (zewnętrzna i wewnętrzna) tworzą tzw. obszary

adhezji (ang. adhesion zone), dzięki czemu powstają

kanały. W niskiej temperaturze, cząsteczki LPS,

obecne na powierzchni błony zewnętrznej,

dezorganizują się, odsłaniając te kanały.

Dwuwartościowe jony neutralizują ujemny ładunek

DNA, który może się „przykleić” do kanałów. Krótki

szok cieplny pozwala na wejście DNA do

cytoplazmy komórki (Rys. 33).

W przypadku E. coli wydajność transformacji zależy

od formy DNA: najwyższa jest dla formy CCC

(covalently closed circular), niższa dla OC (open

circular) a najniższa dla formy liniowej.

Rys 33. Przypuszcalny mechanizm

transformacji E.coli metodą chemiczną.

58

Transformując komórki mieszaniną DNA w warunkach saturacyjnych (nadmiarze DNA) do

komórek mogą wniknąć dwa plazmidy, jednakże jeżeli należą one do tej samej grupy niezgodności

to nie mogą razem koegzystować w jednej komórce, juz przy pierwszym podziale jeden z

plazmidów będzie usunięty.

Naturalną transformację można podzielić na 4 etapy:

- przyłączanie DNA do komórki bakteryjnej

- fragmentacja DNA

- degradacja i transport DNA

- rekombinacja z chromosomem gospodarza

U bakterii gram dodatnich, dwuniciowy DNA łączy się z powierzchnią komórki w specyficznych

miejscach. W kompetentnej komórce B. subtilis jest około 50 takich miejsc (tzw. DNA binding site),

do których przyłącza się DNA, u S. pneumoniae-ok. 33-75.

U B. subtilis i S. pneumoniae receptorem DNA jest białko ComEA (Rys. 34). Wydaje się, że jest

ono także zaangażowane w transport DNA do komórki. Istnieje wiele innych receptorów wiążących

DNA u B. subtilis: np. białka kodowane przez operony comG i comC. Nie wydaje się, aby

sekwencja pobieranego DNA miała tu wpływ na adsorpcję na powierzchni komórkowej.

Natychmiast po połączeniu się z receptorem zaczyna się fragmentacja DNA (wykazano u B. subtilis

i S. pneumoniae). U tej ostatniej DNA jest najpierw nikowany a później następuje cięcie obu nici.

Przez błonę cytoplazmatyczną przechodzi tylko jednoniciowy DNA (druga nić jest degradowana). U

S. pneumoniae za nikowanie, cięcie i degradację DNA odpowiedzialna jest błonowa endonukleaza

EndA (obecna także w E.coli).

U Bacillus subtilis transport DNA do wewnątrz komórki trwa ok 1,5 min w 37° C. Prędkość

transferu to ok. 180 nukleotydów/sek. (S. pneumonie ok. 90-100 nt/sek) W tym samym czasie w

podłożu pojawiają się nukleotydy oraz nukleozydy, potwierdzając fakt, że degradacja DNA ma

miejsce na zewnątrz komórki.

Za transport jednoniciowego DNA do komórek, odpowiedzialne są białka ComEA i ComEC,

kodowane przez operon comE. U B. subtilis w transporcie uczestniczy także błonowe białko

ComFA, które translokuje DNA.

Rys. 34. Transformacja bakterii gram-

dodatnich. Dwuniciowy DNA łączy się z

receptorem ComEA. Następuje cięcie DNA i

degradacja poprzez nukleazę N jednej nici (EndA

u S. pneumoniae). Białka ComG tworzą

transporter umożliwiający przejście DNA przez

ścianę komórkową. Białka ComEC tworzą pory w

błonie komórkowej. Białko ComFA translokuje

DNA do cytoplazmy.

59

U bakterii gramujemnych DNA musi przejść przez błonę

zewnętrzną, ścianę komórkową oraz błonę cytoplazmatyczną

(Rys. 35).

Transformacja bakterii H. influenzae oraz N. gonorrhoeae

wymaga obecności w pobieranym DNA specyficznych

sekwencji, tzw. uptake sequence. Te dwie bakterie pobierają

więc tylko homologiczny DNA. Natomiast Acinetobacter

calcoaceticus zdolny jest do pobrania każdego DNA. U H.

influenzae wykazano obecność tylko 4-8 miejsc wiązania

zewnątrzkomórkowego DNA/komórkę kompetentną.

Receptorami DNA są białka zaangażowane w wykształcanie

pili (Pil Q), u N. gonorrhoeae: dodatkowo potrzebny jest

produkt genu pilC.

Zarówno u H. influenzae jak i u N. gonorrhoeae DNA jest

transportowany z szybkością 500-1000 nt/sek do wnętrza

komórki.

U bakterii gramujemnych także ma miejsce degradacja DNA,

jednakże tylko kolistych lub bardzo dużych cząsteczek

liniowych (Rys. 36). Podejrzewa się, że dwuniciowy DNA jest transportowany do peryplazmy i

wtedy dopiero ma miejsce degradacja jednej nici DNA. W translokacji DNA do cytoplazmy,

podobnie jak u B. subtilis, uczestniczy białko ComFA (H. influenzae i prawdopodobnie

Neisseriaceae).

Transformasomy H. influenzae

H. influenzae wchodzi w stan kompetencji fakultatywnie, np. w niekorzystnych warunkach wzrostu.

Stan kompetencji można u H. influenzae wywołać, np. zwiększając stężenie cAMP w podłożu

(obniżone stężenie węglowodanów), obniżając stężenie puryn w komórce (hodowla na podłożu

minimalnym MIV) lub poprzez metodę tlenowo-beztlenową.

Podwyższone stężenie cAMP powoduje aktywację białka CRP (cAMP responsive protein), a

obniżone stężenie puryn aktywuje białko TfoX (homolog białka Sxy u E. coli). Oba te białka

Ryc. 35. Transformacja komórek

Gram ujemnych

Ryc. 36. Transformacja bakterii gram-

ujemnych. Dwuniciowy DNA wchodzi do

peryplazmy przez błonę zewnętrzną (OM)

dzięki porom zbudowanym z białek PilQ. U N.

gonorrhoeae w tym etapie uczestniczy także

białko PilC. Prawdopodobnie białka PilE

tworzą strukturę umożliwiającą przejście przez

ścianę komórkową (z pomocą białek ComL i

Tpc). Białka receptorowe oraz nukleaza (N)

degradująca jedną nić DNA nie są znane. Kanał

pozwalający na przejście jednoniciowego DNA

przez błonę wewnętrzną (IM) zbudowany jest z

białek ComA (homologów ComEC). Za

translokację odpowiedzialne jest

prawdopodobnie białko ComFA (T).

60

rozpoznając elementy CRE (cAMP responsive element) kontrolują ekspresję genów kompetencji.

Znanych jest wiele białek kodowanych przez geny kompetencji, są to:

receptory wiążące DNA na powierzchni komórki

egzonukleazy, odpowiedzialne za usuwanie jednej z nici DNA

białka transportujące DNA do wnętrza komórki (np. permeaza oligonukleotydowa)

białka stabilizujące jednoniciowy DNA

składniki transformasomu

Transformasomy są to wyspecjalizowane wypustki/uwypuklenia błony, licznie obecne na

kompetentnych komórkach H. influenzae (Rys. 37). Transformasomy zbudowane są z dwóch

warstw lipidowych, w które wbudowane są białka błony zewnętrznej oraz LPS. W miejscu, gdzie

transformasomy stykają się z błoną zewnętrzną, odkryto obecność małych porów/kanałów. DNA

wchodzi do transformasomu i tam jest chroniony

(np. przed enzymami restrykcyjnymi).

DNA z transformasomu (II) jednym końcem

wnika do cytoplazmy (III). Nić o polarności 5’-3’

jest degradowana i ostatecznie do cytoplazmy

dociera jedynie nić 3’-5’

Pobrany DNA nie utrzymuje się w komórce

bakteryjnej, lecz musi zostać zrekombinowany z

chromosomem gospodarza (IV).

Tylko dwuniciowy liniowy DNA może opuścić

transformasom: kolisty DNA zostaje uwięziony w

transformasomie, ponieważ nie ma wolnych

końców (IIA).

H. influenzae pobiera wyłącznie homologiczny

DNA (sekwencja “uptake sequence”– 5’-

AAGTGCGGTCA-3’, ok. 600 kopii w

chromosomie H. influenzae). Na ćwiczeniach

przeprowadzimy transfekcję wolnym

genomowym DNA z bakteriofaga HP1 (8 miejsc AAGTGCGGTCA).

Czemu służy zdolność do pobierania DNA ze środowiska:

- Możliwość naprawy uszkodzeń we własnym DNA: u B. subtilis system naprawczy DNA jest

częścią regulonu obejmującego kompetencję. Czynniki uszkadzające DNA nie zawsze indukują

kompetencję, jednakże wywołanie kompetencji u B. subtilis potraktowanego UV zwiększa

liczbę bakterii, które przeżyją naświetlanie.

- Nabywanie nowych cech fenotypowych: aby pobrany DNA doprowadził do zmian w genomie

biorcy, DNA musi zostać ustabilizowany (rekombinacja z homologiczną sekwencją w genomie

biorcy/ ustabilizowanie plazmidu) . W ten sposób pobranie obcego DNA może zwiększyć

przewagę selekcyjną transformanta.

- Niektórzy badacze sugerują, ze pobieranie wolnego DNA służy jako swoiste sondowanie

„terenu” w poszukiwaniu nowych cech. Np. u N. meningitidis znaleziono gen socD, który

posiada dwie „uptake sequences” z H. influenzae i prawdopodobnie został nabyty w drodze

transformacji.

- Pozakomórkowy DNA może służyć jako składnik pokarmowy;

Rys. 37. Transformasomy u Haemophilus

influenzae.

61

Wybrana literatura:

1. Chen I, Christie PJ, Dubnau D.The ins and outs of DNA transfer in bacteria. Science. 2005;

2;310(5753):1456-60.

2. Claverys JP, Martin B, Polard P. The genetic transformation machinery: composition,

localization, and mechanism. FEMS Microbiol Rev. 2009; 33(3):643-56..

3. Goodgal SH. DNA uptake in Haemophilus transformation. Annu Rev Genet. 1982;16:169-92.

4. Goodgal SH, Mitchell M. Uptake of heterologous DNA by Haemophilus influenzae. J Bacteriol.

1984;157(3):785-8.

62

Cześć praktyczna

Materiały

Szczepy bakteryjne

E. coli TopF´ (-)

s, r

- m

-, mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)80 LacZ M15 lacX74 deoR

recA1 araD139 (ara-leu) 7697 galU galK lambda^-rpsL endA1 nupG (F’ proAB lacIqZ)M15

Tn10 (Tetr)

E. coli ER2738 F´proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/ fhuA2 glnV Δ(lac-proAB) thi-1

Δ(hsdS-mcrB)5

H. influenzae Rd30 (HP1-)

DNA

DNA bakteriofaga HP1 (ćw. 6)

DNA fagmidu pBluescript (ćw. 6)

DNA fagmidu pBluescript - uliniowione enzymami restrykcyjnymi (ćw. 7)

mieszanina ligacyjna (ćw. 7)

Odczynniki

Podłoża

LB stałe z dodatkiem:

tetracykliny (10 g/ml)

ampicyliny (100 g/ml)

IPTG (izopropylo--D-tiogalaktopiranozyd; 0,5 mM)

X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galaktozyd; 40 g/ml)

LB płynne

BHI stałe (ang. Brain Heart Infusion – wyciąg mózgowo-sercowy) uzupełnione heminą

(stężenie końcowe w pożywce 10 g/ml) i NAD (10g/ml)

BHI płynne bez uzupełnień

BHI półpłynne uzupełnione heminą i NAD (j.w.)

Wykonanie

1. Transformacja E. coli

- podzielić komórki kompetentne na 2 porcje po 100 l

- dodać do 100 l komórek kompetentnych:

a) 5 l mieszaniny ligacyjnej lub b) 0,5 l DNA plazmidowego lub c) 0,5 l uliniowionego

DNA plazmidowego

- inkubować 15-20 min w łaźni lodowej

- przenieść na 1,5 min do temp. 42° C

- umieścić na 3 minuty w łaźni lodowej

- dodać 0,9 ml LB płynnego (nie uzupełnionego antybiotykami !!!)

- inkubować transformowane komórki przez 60 min w temp. 37° C

- nanieść 100 l na szalkę z LB + tetracyklina + ampicylina + X-gal + IPTG i rozprowadzić

głaszczką równomiernie po całej powierzchni.

- odwirować resztę bakterii (przez 2 min, 6000 rpm), zawiesić w 100 l LB płynnego i wysiać na

szalkę (j.w.)

- inkubować 12-18 h w temp. 37° C

63

2. Przygotowanie bakterii kompetentnych Haemophilus influenzae

- zaszczepić 20 ml podłoża BHI uzupełnionego NAD i heminą całonocną hodowlą szczepu

H. influenzae Rd30

- inkubować z wytrząsaniem, aż hodowla osiągnie OD 600 = 0,5 (2 h)

- przenieść całość hodowli do szklanej probówki, tak aby wypełnić jak największą objętość

- inkubować w temp. 37°C przez 1 h (bez wytrząsania: warunki beztlenowe)

- przelać hodowlę do kolbki i inkubować z wytrząsaniem 1 h w temp. 37° (warunki tlenowe)

- po tych dwóch inkubacjach komórki H. influenzae nabywają stan kompetencji

3. Transfekcja komórek H. influenzae Rd30 DNA faga HP1

- zrobić mieszaninę transfekcyjną: do 1,3 ml podłoża BHI bez heminy i NAD dodać:

0,1 ml kompetentnych bakterii H. influenzae

10 l DNA faga HP1

- inkubować w temp. 37° C przez 30 min

- do 3 ml półpłynnego BHI uzupełnionego NAD i heminą dodać 0,2 ml nocnej hodowli szczepu

wskaźnikowego H. influenzae Rd30 i 0,3 ml mieszaniny transfekcyjnej

- wymieszać i wylać na płytkę ze stałym podłożem BHI uzupełnionym NAD i heminą

- inkubować 12-18 h w temp. 37° C

4. Phage Display

- nocną hodowlę E.coli ER2738 rozcieńczyć podłożem LB w stosunku 1:100, odświeżyć i

rozdzielić do 5 probówek Eppendorfa po 1 ml

- do każdej z probówek przenieść jałowo materiał z pojedynczej łysinki i hodować 2,5-3 h w temp

37C z wytrząsaniem

- hodowle zwirować 1 minutę przy 5000 rpm

- supernatanty przenieść do nowych probówek, ponownie zwirować

- przenieść górne 80% supernatantów do nowych probówek i przechowywać w 4 C

64

ĆWICZENIE 9

Otrzymanie biblioteki fragmentów restrykcyjnych faga HP1 w wektorze plazmidowym

pBluescript KS II (+) (izolacja i analiza restrykcyjna DNA rekombinantów)

Część teoretyczna

Izolacja plamidowego DNA metodą lizy alkalicznej (Brinboim i Doly, 1979) jest najbardziej

popularną metodą stosowaną do komórek Escherichia coli. Ekspozycja zawiesiny bakterii na silny

jonowy detergent w wysokim pH otwiera ścianę komórkową, denaturuje chromosomalny DNA i

białka oraz uwalnia plazmidowy DNA do supernatantu. Chociaż alkaliczne środowisko kompletnie

rozrywa wiązania wodorowe, nici koliście zamkniętego plazmidowego DNA nie są zdolne do

rozdzielenia się ze względu na topologiczne super zwinięcie (forma CCC ang. covalently closed

circular). Gdy pH zostaje zneutralizowane (dodanie octanu potasu) następuje renaturacja

plazmidowego DNA. Natomiast chromosomalny DNA i białka tworzą nierozpuszczalny kompleks

wraz z dodecylosiarczanem potasu – KDS. Dodany octanu potasu wypiera jony sodu z SDS,

zastępując je jonami potasu. Wykorzystane jest tu zjawisko niskiej rozpuszczalności KDS oraz

wysokiego powinowactwa SDS do białek.

Kluczowym etapem w izolacji plazmidowego DNA jest efektywna liza komórek bakteryjnych (ilość

DNA i jego jakość zależy od jakości lizatu komórkowego).

Główne etapy lizy alkalicznej:

1. Zawieszenie komórek bakteryjnych. Ważne jest

aby zawiesina komórek była homogenna, bowiem

wówczas odczynniki mogą dotrzeć do wszystkich

komórek.

Roztwór I: glukoza (zapewnia odpowiednie

warunki osmotyczne, zapobiega zbyt wczesnemu

pęknięciu komórek), EDTA (chelatuje jony

dwuwartościowe Mg2+

, Ca2+

, dzięki czemu

destabilizowane są osłony komórkowe), Tris-Cl

(zapewnia właściwe pH)

2. Liza. SDS rozpuszcza fosfolipidowe i białkowe

komponenty błony komórkowej, prowadząc do lizy

i uwolnienia zawartości komórek. NaOH denturuje

DNA i białka.

Zabronione jest gwałtowne wstrząsanie lizatu, gdyż

może to doprowadzić do fragmentacji

chromosomu. Pozostawione w supernatancie wolne

fragmenty chromosomu będą oczyszczać się

wspólnie z plazmidowym DNA.

3. Neutralizacja. pH lizatu zostaje zobojętnione

poprzez dodanie kwaśnego octanu sodu. Wysokie

stężenie soli powoduje wytrącenie

dodecylosiarczanu potasu (KDS) wraz ze

zdenaturowanymi białkami, chromosomalnym

DNA i resztami osłon komórkowych w postaci

nierozpuszczalnego kompleksu. Wytrącaniu sprzyja użycie zimnego buforu neutralizującego i

inkubacja w lodzie.

4. Oczyszczenie lizatu – wirowanie lub filtracja.

65

Część praktyczna

Materiały:

Nocne hodowle zaszczepione z białych kolonii uzyskanych w ćwiczeniu 8, tj. szczep Escherichia

coli XL-1 Blue (niosący zrekombinowany plazmid pBluescript KS)

Odczynniki do izolacja plazmidowego DNA (metodą lizy alkalicznej):

- roztwór I: 50 mM glukoza, 25 mM TrisCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)

- roztwór II: 0,2 M NaOH, 1 % SDS

- roztwór III: 3 M octan sodowy, 2 M kwas octowy

- mieszanina fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1)

- etanol 96 %, 70 %

- bufor TE: 10 mM TrisCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)

Wykonanie:

1. Izolacja izolacja plazmidowego DNA

- przenieść 1,5 ml hodowli do eppendorfówki i odwirować (7 000 rpm), w temp. 4C, 1,5 min

- zlać supernatant, powtórzyć czynność z pkt. 1

- zawiesić bakterie w 100 l roztworu I

- dodać 200 l roztworu II, wymieszać zawartość przez kilkakrotne DELIKATNE odwracanie

eppendorfówki

- dodać 150 l roztworu III, wymieszać zawartość przez kilkakrotne odwracanie eppendorfówki

- inkubować w lodzie przez 5 min

- odwirować w temp. 4C, maksymalne obroty (13 000 rpm), 8 min

- przenieść supernatant do nowej eppendorfówki

- ekstrahować równą objętością mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy

- odwirować 2 min 13 000 rpm

- przenieść fazę wodną (górną) do nowej eppendorfówki

- dodać 1 ml (2 objętości) etanolu (96 %) i wytrącać DNA przez 5 min w temp. pokojowej

- odwirować w temp. 4C, 13 000 rpm, 5 min

- zlać ostrożnie supernatant

- przepłukać osad 0,5 ml etanolu (70%)

- odwirować przez 1 min

- zlać supernatant; usunąć dokładnie resztki etanolu przy użyciu pipety automatycznej

- suszyć 15 min w temp. 42C

- osad zawiesić w 50 l wody lub TE z RNazą 20 g/ml

2. Nastawienie trawień enzymami restrykcyjnymi

Trawienie 1 enzymem BsuRI

- zmieszać:

10 l wyizolowanego DNA plazmidowego

2 l buforu R+

7, 7 l H2O

0,3 l enzymu BsuRI: GGCC

CCGG

66

Trawienie 2 enzymem BglI

- zmieszać:

10 l wyizolowanego DNA plazmidowego

2 l buforu O+

7, 7 l H2O

0,3 l enzymu BglI: GCCNNNNNGGC

CGGNNNNNCCG

Uwaga! Dokładne ilości składników mieszaniny (trawienie 1 i 2) podane zostaną przez osobę

prowadzącą ćwiczenia.

67

Diagnostyka wirusologiczna: wykrywanie materiału genetycznego wirusów z zastosowaniem

łańcuchowej reakcji polimerazy - PCR

Co to jest PCR?

PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), czyli łańcuchowa reakcja polimerazy jest jedną z

podstawowych technik biologii molekularnej. Wykorzystywana jest do powielania konkretnych

fragmentów DNA. Jej podstawowym atutem jest szybkość oraz prostota.

Pomysłodawca PCR Kary Mullis (Nagroda Nobla w dziedzinie Chemii w 1993) wykorzystał

podstawowe zasady replikacji DNA przeprowadzanej przez enzym - polimerazę DNA. Enzym ten

jest w stanie dołączyć nukleotyd tylko do wolnej grupy -OH na’końcu 3’ nici, dlatego kierunek

polimeryzacji jest określony: 5’ -> 3’. Ponadto, polimeraza do rozpoczęcia polimeryzacji potrzebuje

tzw. startera, nie jest bowiem w stanie przyłączyć się do pojedynczej nici DNA.

Startery wyznaczają fragment DNA, który chcemy powielić. Do przeprowadzenia reakcji

PRC używa się aktualnie termostabilnych polimeraz DNA, a reakcję PCR przeprowadza się w

specjalnych aparatach, zwanych termocyklerami, które umożliwiają szybkie i precyzyjne zmiany

temperatury.

Reakcja PCR rozpoczyna się od denaturacji DNA. W wysokiej temperaturze (ok. 95°C)

dochodzi do zerwania wiązań wodorowych łączących obie nici. Następnie temperatura zostaje

obniżona do około 50-60°C – w tej temperaturze startery odnajdują swoje sekwencje

komplementarne na niciach matrycowych i łączą się z nimi. Po około 30-60 sekundach temperatura

zostaje podwyższona do 72°C - temperatury optymalnej dla polimerazy DNA. Polimeraza odnajduje

hydroksylowe końce 3’ starterów i na podstawie nici matrycowej syntetyzuje nową nić DNA. Czas

polimeryzacji (zwany elongacją) jest skorelowany z długością amplifikowanego fragmentu. Tak

kończy się pierwszy cykl reakcji PCR. Aby namnożyć wybrany fragment w ilości nadającej się do

dalszych analiz zwykle powtarza się taki cykl około 25-35 razy. Pozwala to uzyskać ogromną liczbę

kopii danego fragmentu DNA. Z każdym kolejnym cyklem liczba cząsteczek DNA ulega

podwojeniu. Po 30 cyklach liczba cząsteczek dwuniciowego DNA wyniesie 1.073.741.764 (ok.

1109). Reakcję łańcuchowej polimeryzacji można więc postrzegać jako „molekularną kopiarkę”.

Dzięki reakcji PCR następuje selektywna amplifikacja (powielenie) określonego odcinka

DNA. Ten odcinek może reprezentować niewielką część dużej i złożonej mieszaniny różnych DNA

np. DNA chromosomalny, DNA totalny (chromosom plus plamidy).

Dzięki PCR można w ok. 2 h zamplifikować śladowe ilości DNA (np. pojedynczą kopię

genu) do ilości użytecznych (tj. widocznych w żelu), Matryca do PCR nie musi być oczyszczona –

wystarczy „zagotowana” kolonia bakteryjna.

Produkt PCR może zostać następnie strawiony enzymami restrykcyjnymi,

zsekwencjonowany lub sklonowany.

Klasyczny cykl syntezy DNA w reakcji PCR (3 etapy, Rys. 38):

- denaturacja (94-95C) 15-30 sek

- przyłączenie (hybrydyzacja) starterów (55-65C) 15-30 sek

- wydłużanie (72C), czas zależny od wielkości produktu

Cykl ten jest powtarzany 20-40 razy. Zwiększenie liczby cykli >35 ma niewielki efekt pozytywny,

gdyż plateau jest osiągane gdy: wyczerpują się odczynniki, produkty łączą się same ze sobą oraz

polimeraza ulega inaktywacji. Efektem może być: akumulacja „niechcianych” produktów

(niespecyficznych)!

68

Rys. 38. Profil termiczny reakcji PCR.

Co znajduje się w reakcji PCR?

Matryca DNA lub RNA, startery (ang. primers), bufor, substraty – dNTP, jony Mg2+

, termostabilna

polimeraza DNA

Optymalny rezultat reakcji PCR to obecność tylko właściwego produktu, przy braku

produktów niespecyficznych!

Jak duży może być produkt PCR? Typowy produkt ma długość 500 - 3000 pz

Większe produkty (nawet > 25 kb), są możliwe do uzyskania. Reakcja wymaga jednak

zmodyfikowanego buforu, koktailu polimeraz i długiego czasu syntezy.

Ograniczeniem jest integralność matrycy. Duże DNA jest mechanicznie fragmentowane do

odcinków < 50kb.

Projektowanie starterów - przypuszczalnie najbardziej krytyczny parametr efektywnej

reakcji PCR

Krytyczne zmienne w wyborze startera:

- długość

- temperatura topnienia (Tm)

- specyficzność

- sekwencja komplementarna

- zawartość par GC

- sekwencja na końcu 3'

Długość startera - specyficzność i temperatura hybrydyzacji startera w dużej mierze zależą od

jego długości. Przyjmuje się, że startery o długości 20-30 pz są wysoce specyficzne.

Długość startera jest związana z wydajnością hybrydyzacji: ogólnie - im dłuższy jest starter

tym hybrydyzacja jest mniej wydajna. Ale starter nie powinien być zbyt krótki, gdyż wówczas spada

specyficzność!

Specyficzność (unikalność) startera – Startery muszą być unikalne! Specyficzność startera

zależy częściowo od jego długości. Sekwencja 24 nukleotydowa jest bardziej unikalna niż ta o

długości 15 pz

Naturalnie startery muszą flankować odcinek, który ma być powielony!

Temperatura topnienia startera zależy od jego długości i sekwencji. Im więcej par GC tym wyższa

wartość Tm. Zbyt niska temperatura topnienia faworyzuje niewłaściwe łączenie nukleotydów w

pary.

69

Zasady projektowania starterów: - Długość przynajmniej 15 pz

- Zawartość par GC ok. 50%; równomierna dystrybucja wszystkich 4 nukleotydów, brak

odcinków wielokrotnych powtórzeń pojedynczego nukleotydu, szczególnie poli-G i poli-C.

5’ GGTTGACTTGGGGGGGGATG 3’

- Temperatura hybrydyzacji z matrycą 50-65C. Z reguły im wyższa temperatura hybrydyzacji

tym lepiej (wzrasta specyficzność startera). Starter kierunkowy i odwrotny powinny mieć mniej

więcej tę samą temperaturę hybrydyzacji.

- Brak odcinków wewnętrznej homologii powyżej 3 par zasad (odcinków typu „szpilka do

włosów” lub „pętla – łodyga”).

- Brak wzajemnej homologii międzycząsteczkowej - pomiędzy starterami tworzącymi parę. Gdy

homologia dotyczy odcinka środkowego utrudnia to hybrydyzację startera. Homologia końców

3' skutkuje wytworzeniem produktu „primer-dimer”.

- Sekwencja na końcu 3’ – kluczowa w zabezpieczaniu przed błędnym parowaniem startera.

Najlepiej aby ostatnim nukleotydem była G lub C: 5’ GGTTGACTTGGCGAATG 3’

- Temperatura topnienia (Tm). Temperatura hybrydyzacji przynajmniej 50C

Zasada ustawienia temperatury etapu hybrydyzacji startera: 5 niżej niż temperatura topnienia

Wyliczenie Tm zależy od użytego algorytmu.

Prosta formuła kalkulacji (formuła Wallacea) może być zastosowana tylko do krótkich starterów o

długości do 25 nukleotydów: Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T)°C

Gdy starter jest dłuższy (>25 nukleotydy) – Tm oblicza się używając specjalistycznego programu

komputerowego.

70

Część praktyczna

Materiały:

- PCR bufor (10×): 100 mM Tris (pH 8,8), 15 mM MgCl2, 500 mM KCl

- startery oligonukleotydowe: (10 M)

Nazwa Sekwencja 5’ 3’ % GC długość Tm LgtF_F GGCGGATCCGTGGGCGTAAAAAGTCGTAAAAGTA 40%, 50% 25bp, 34bp 54,66C

LgtF_R CGGGCGAATTCCCGAGCCAAGTTAGAAGCCATTGTTA 46%, 51% 26bp, 37bp 58,68C

ORF14ATG GCCGAATTCATGTTATACCCAATTTGTATCG 32%, 39% 22bp, 31bp 49,59C

ORF14TAA GGCAAGCTTTTATGCAGAAAGTAATCTATTTGTTG 27%, 34% 26bp, 35bp 50,60C

- polimeraza DNA Taq (5 U/l)

- matrycowy DNA – chromosomalny DNA Haemophilus influenzae (z lub bez profaga) 100 ng –

1 g

- nukleotydy - mix (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) (10 mM)

Wykonanie:

1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej - zmieszać:

5 l buforu do reakcji PCR (końcowo 1×)

5 MgCl2 (końcowo 1,5 mM)

5 l dNTPs (końcowo 200 nM)

5 l 4 starterów (po 100 pmoli każdego)

5 l matrycowego DNA

0,5 l polimerazy DNA Taq (5U/l)

2. Warunki reakcji PCR prowadzonej w termocyklerze

a - wstępna denaturacja 94C przez 2 min

b - denaturacja 94C przez 30 sek.

c - przyłączanie starterów (annealing) 45C przez 30 sek

d - elongacja 72C przez 1,5 min

- etapy b, c, d powtórzyć w 2 cyklach

e - denaturacja 94C przez 30 sek.

f - przyłączanie starterów (annealing) 55C przez 30 sek

g - elongacja 72C przez 1,5 min

- etapy e, f, g powtórzyć w 28 cyklach

- w cyklu 30 elongację wydłużyć do 7 min w temp. 72 C

- próbki schłodzić do temp. 4C

-

M 1 2 3

Fot. Elektroforeza produktów rekacji PCR.

M-marker wielkości

Tor 1 – produkt PCR 1400 bp z matrycy DNA chromosomalne H.influenzae

Tor 2 - produkty PCR 1400 bp i 450bp z matrycy DNA chromosomalnego H.

influenzae zlizogenizowanego fagiem HP1

Tor 3 – produkt PCR 450 bp z DNA faga HP1

71

ĆWICZENIE 10

Wykorzystanie elementów bakteriofagowych w biologii molekularnej. Phage Display

Część teoretyczna

W biologii molekularnej i biotechnologii znalazły zastosowanie całe wirusy lub

poszczególne elementy lub enzymy wirusowe.

Wykorzystywane enzymy bakteriofagowe to m.in:

Ligaza DNA faga T4 - enzym ten katalizuje tworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy grupą

fosforanową 5’ a grupą hydroksylową 3’ w DNA lub RNA; łączy lepkie lub tępe końce; naprawia

jednoniciowe pęknięcia w dwuniciowym DNA; wymaga ATP jako kofaktora reakcji; jest

kodowany przez gen 30 bakteriofaga T4 E. coli; jej aktywność jest hamowana przez wysokie

stężenie NaCl lub KCl (> 200 mM);

Ligaza RNA faga T4 - kodowana jest przez gen 63 bakteriofaga T4 E. coli, katalizuje ATP-

zależne tworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy grupą fosforanową 5’ a grupą

hydroksylową 3’ jednoniciowego RNA i DNA;

Kinaza polinukleotydowa faga T4 (patrz ćwiczenie 7);

Polimeraza DNA faga phi29 - białko to jest kodowane przez gen 2 bakteriofaga phi29 Bacillus

subtilis; enzym ten jest wysoceprocesywną polimerazą DNA, pozwalającą na amplifikację DNA

w stałej temperaturze;

Polimeraza DNA faga T4 (patrz ćwiczenie 7);

Egzonukleaza faga - enzym ten kodowany jest przez gen exo bakteriofaga λ E. coli; posiada

aktywność egzonukleolityczną w kierunku 5’→3’;

Ponadto zastosowanie znalazły promotory i represory bakteriofagowe. Promotory

bakteriofaga T5 i T7 wykorzystuje się m.in. w wektorach służących do uzyskiwania nadprodukcji

białek, których geny sklonowane są na tych wektorach. Promotor faga T5 znajduje się m.in. w

wektorze pQE-30, pQE-40, promotor faga T7 znalazł zastosowanie w wektorach z serii pET, np.

pET28a, pET30a.

Promotor bakteriofaga T5 „czytany” jest zarówno przez polimerazę RNA faga T5 jak i

polimerazę RNA komórek gospodarza.

Promotor bakteriofaga T7 „czytany” jest jedynie przez polimerazę RNA faga T7. Gen tej

polimerazy znajduje się pomiędzy 3170 – 5819 nt genomu faga i koduje 883 aminokwasowe białko.

Polimeraza RNA faga T7 jest, wysoce specyficznym zależnym od promotora T7, enzymem

katalizującym syntezę RNA w kierunku 5'→ 3. Białko to wymaga DNA jako matrycy i jonów Mg2+

jako kofaktora reakcji, a jego aktywność stymulowana jest przez BSA (ang. bovine serum albumine)

i spermidynę. Dodatkowa charakterystyka polimerazy RNA faga T7 zawarta jest na Rys. 39.

Rys. 39. Charakterystyka polimerazy RNA bakteriofaga T7.

72

Represory pochodzenia bakteriofagowego są elementami bakteryjnych systemów

dwuhybrydowych służących do wykrywania i badania oddziaływań pomiędzy białkami.

Wykorzystywany jest również DNA bakteriofagów, których genomy zostały poznane i

zsekwencjonowane. Służą one m.in. do przygotowania odpowiednich markerów wielkości DNA np.

markery wielkości DNA uzyskane z DNA bakteriofaga lambda lub o bakteriofaga PhiX174 (np.

PhiX174 DNA/BsuRI, PhiX174 DNA/Hinf1I) (Rys. 40).

Elementy pochodzenia bakteriofagowego wykorzystane zostały również do konstrukcji

wektorów fagmidowych, np. wektory z serii pBluescript. Dodatkowo DNA lub RNA pochodzenia

bakteriofagowego może być stosowany do badania aktywności nowoodkrytych nukleaz.

Phage Display

Phage Display jest metodą wykorzystującą całe cząstki fagowe. Polega ona na prezentacji

peptydów lub białek na powierzchni kapsydu bakteriofaga. Najpopularniejszymi bakteriofagami

wykorzystywanymi w tej metodzie są fagi nitkowate takie jak: M13, f1 i fd. Stosuje się również

inne bakteriofagi, np. T7, T4, i wirusy eukariotyczne (Tabela 7).

Tabela 7. Główne systemy prezentacji peptydów i białek na powierzchni bakteriofagów.

Bakteriofag Używane białko Typ fuzji

N-końcowa C-końcowa

nitkowate

pIII + +

pVIII + -

pVI - +

pVII/pIX + -

V - +

D + +

Vac - +

T4 Soc + +

Hoc + -

T7 gp10 - +

Rys. 40 Przykłady komercyjnie dostępnych markerów wielkości DNA przygotowanych z DNA

bakteriofaga (www.fermentas.com).

73

Bakteriofag M13

Bakteriofag ten należy do rodziny Inoviridae. Jego gospodarzem są komórki E. coli, które

zawierają plazmid F i wytwarzają pilusy F (pilusy płciowe), natomiast receptorem fagowym jest

białko gp3. Fag ten posiada helikalną (nitkowatą) strukturę, jego genom to jednoniciowy DNA o

wielkości 6407 nt, który okresowo wewnątrz komórki gospodarza występuje w formie dwuniciowej

(forma replikatywna). Genom faga M13 zawiera 10 genów (Rys. 41). Geny III, VI, VII, VIII i IX

kodują białka strukturalne kapsydu faga, geny I, IV, V, X i XI - białka niezbędne podczas składania

faga, natomiast gen II - białko niezbędne w procesie replikacji DNA faga.

Głównym białkiem kapsydu jest białko pVIII o wielkości 50 aminokwasów. Natomiast

białko pIII, o wielkości 406 aa, jest receptorem fagowym wiążącym się z komórkami gospodarza

(Rys. 42). Jest ono niezbędne do infekcji fagowej.

W metodzie Phage Display wykorzystującej bakteriofaga M13 wybrane peptydy lub białka

syntetyzowane są najczęściej w fuzji z N-końcową domeną strukturalnego białka kapsydu pIII lub

pVIII. Ze względu na wielkość białka pVIII do kodującego je genu wklonowuje się odcinki DNA

kodujące krótkie peptydy. Natomiast w przypadku białka pIII można tworzyć fuzję z dużymi

białkami, a nie tylko krótkimi peptydami.

Rys. 41. Schemat genomu bakteriofaga nitkowatego.

Rys. 42. Schemat budowy faga nitkowatego.

Kółkami zaznaczono białka kapsydu najczęściej

wykorzystywane w technice Phage Display.

Rys. 43. Typy systemów Phage Display

wykorzystujące bakteriofagi nitkowate.

czarne prostokąty – gen VIII

białe prostokąty – gen III

zakreskowane prostokąty – wklonowany

fragment.

74

Istnieją również systemy Phage Display, w których wykorzystywana jest fuzja badanego

białka z końcem aminowym białka pVII lub pIX lub końcem karboksylowym białka pVI.

W obrębie polipeptydowej biblioteki bakteriofaga M13 wyróżnić można trzy typy systemów:

fagowy, hybrydowy i fagmidowy (Rys. 43). System fagowy skonstruowane jest w taki sposób, że

dołączony polipeptyd wyrażany jest na każdej kopii danego białka strukturalnego. Wadą tego typu

systemów jest to, że jeżeli każda kopia białka pIII będzie zrekombinowana, to drastycznie spadnie

wydajność infekcji fagowej takim zmodyfikowanym wirusem. Analogicznie, jeżeli każde białko

pVIII będzie zrekombinowane, to może to zaburzyć prawidłową budowę kapsydu faga nitkowatego.

W systemach typu hybrydowego genom bakteriofaga zawiera dwie kopie białka pIII (wektory typu

33) lub pVIII (wektory typu 88), z których jedna jest typu dzikiego, druga natomiast

rekombinowana. Promotory obu kopii genów zorganizowane są w taki sposób, aby ekspresja genów

białka typu dzikiego zachodziła na wyższym poziomie niż białka fuzyjnego. W rezultacie wirion w

tym systemie jest mozaiką, której płaszcz składa się zarówno z rekombinowanych cząsteczek białka

pIII lub pVIII, jak i białek typu dzikiego, przy czym liczba tych ostatnich jest znacznie wyższa. W

systemach typu fagmidowego wirion, zamiast genomu bakteriofaga zawiera fagmid, który po

infekcji fagiem pomocniczym (ang. helper phage) wyraża wszystkie białka bakteriofagowe, w tym,

także rekombinowane białka pIII (wektory typu 3+3) lub pVIII (wektory typu 8+8).

Metoda Phage Display pozwala na identyfikację peptydów i białek, które wiążą się

specyficznie do różnorodnych cząsteczek receptorowych stanowiących cele przeciwciał, receptorów

hormonów lub nawet całych organów. Technika ta umożliwia również badanie oddziaływań białko-

białko oraz DNA-białko. Peptydy wyselekcjonowane względem konkretnego receptora pozwalają

na identyfikację sekwencji wiążącego motywu poprzez sekwencjonowanie kodującego je DNA.

Randomizowane biblioteki fagowe prezentujące fragmenty przeciwciał służą do mapowania

epitopów przeciwciał mono- i poliklonalnych, identyfikujące nawet te epitopy, dla których nie

znamy lub nie posiadamy antygenu. Metoda ta wykorzystywana jest także do identyfikacji ligandów

białkowych, nowych receptorów, selekcji białek o zwiększonej stabilności i poszukiwaniu

substratów dla różnych enzymów. Metoda Phage Display wykorzystywana jest również do selekcji

białek wiążących DNA i RNA.

75

Na Rys. 44 przedstawiono główne etapy metody Phage Display. Fazą stałą do immobilizacji

receptora może być polisterynowa szalka Petriego lub 12- lub 96-studzienkowa płytka Linbro. W

zależności od używanego zestawu dodaje się bibliotekę fagową wykorzystującą białko pIII. W gen

tego białka wklonowany jest fragment DNA kodujący 7- lub 12- aminokwasowy peptyd (Rys. 45).

Wyjściowa biblioteka fagowa jest heterogenną mieszaniną poszczególnych klonów

bakteriofaga, z których każdy zawiera inną obcą sekwencję DNA, w związku z czym prezentuje na

swojej powierzchni różne peptydy lub białka. Następnie 3 razy powtarza się punkty 3, 4 i 5 w celu

zwiększenia specyficzności. Etap selekcji ma na celu wyizolowanie z wyjściowej puli

1. Immobilizacja receptora na stałej fazie*

2. Dodanie do opłaszczonego na fazie

stałej receptora fagów z biblioteki

fagowej

3. Odmycie fagów niezwiązanych oraz

związanych niespecyficznie

4. Wymycie fagów związanych z

receptorem

5. Namnożenie specyficznych fagów w

komórkach bakteryjnych E. coli

6. Izolacja i sekwencjonowanie DNA z

wyselekcjonowanych fagów

7. Ustalenie sekwencji konsensusowej

8. Przeszukanie baz danych ustaloną

sekwencją konsensusową

9. Identyfikacja białek „partnerskich”

* punkty 1 – 5 powtarza się 3-krotnie;

Rys. 44. Schemat przebiegu głównych etapów metody Phage Display. wy

Rys. 45. N-terminalna sekwencja fuzji heptapeptyd-gIII. Ekspresja fuzji zachodzi łącznie z

sekwencją liderową odcinaną w czasie sekrecji w miejscu zaznaczonym strzałką. Powoduje to,

że heptapeptyd znajduje się bezpośrednio na końcu aminowym dojrzałego białka pIII.

76

bakteriofagów, wchodzącej w skład biblioteki, niewielkiej populacji wyrażającej rekombinowane

peptydy lub białka o określonych motywach. Stanowią one jedynie niewielką frakcję wyjściowej

puli bakteriofagów, która po namnożeniu w komórkach gospodarza, poddawana jest kolejnym

rundom selekcji w celu podwyższenia specyficzności wiązania do wybranego celu. Po

przeprowadzonej selekcji otrzymuje się bakteriofagi prezentujące na swojej powierzchni peptydy

lub białka o określonej sekwencji. Każda łysinka zawiera cząstki wirusowe pochodzące z

pojedynczej infekcji, dlatego też cząstki wirusowe w pojedynczej łysince posiadają identyczny

materiał genetyczny. Po przeprowadzonej selekcji, z fagów tworzących łysinki izoluje się DNA i

sekwencjonuje. Następnie wykorzystując metody bioinformatyczne, tłumaczy się otrzymaną

sekwencję nukleotydową na sekwencję aminokwasową. Uzyskane wyniki porównuje się i ustala

sekwencję konsensusową, którą wykorzystuje się do przeszukania baz danych.

W biologii molekularnej i biotechnologii wykorzystuje się nie tylko wirusy i elementy

wirusów bakteryjnych, ale także wirusów eukariotycznych.

Wirus mozaiki tytoniu i wirus mozaiki kalafiora są często używane w biologii molekularnej

roślin. Szczególnie interesujący jest silny promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora często używany w

transformacji roślin.

77

Część praktyczna

Materiały:

Szczepy bakteryjne:

Zaindukowane hodowle szczepów:

- E. coli Top10 niosących plazmid pET28a::xylE

- E. coli BL21(DE3) niosących plazmid pET28a::xylE

- E. coli Top10 niosących plazmid pQE30::xylE

- E. coli M15 niosących plazmid pQE30::xylE

- E. coli Top10 niosących plazmid pXPL

- E. coli Top10 niosących plazmid pMPMT4::xylE

- E. coli Top10 niosących plazmid pUC19::xylE

E. coli BL21(DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB

- mB

-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7

nin5])

E. coli Top10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR nupG recA1 araD139

Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ

-

E. coli M15 K12 KmR (pREP4) Nal

S Str

S Rif

S Thi

- Lac

- Ara

+ Gal

+ Mtl

- F

- RecA

+ Uvr

+ Lon

+

Odczynniki:

- bufory:

do przemywania – 50 mM K2HPO4 (pH 7,5)

lizujący – 100 mM K2HPO4 + 10% aceton (pH 7,2)

reakcyjny – 100 mM K2HPO4 (pH 7,2)

- 1 M roztwór IPTG

- 20% roztwór arabinozy

- 10% roztwór Tritonu X-100

- 1 mM roztwór katecholu w buforze reakcyjnym

- bufor jodowy: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 4 M NaI, pH 8,0

- 96% etanol

- 70% etanol

- PEG/NaCl: 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl

Wykonanie:

1. Wykorzystanie promotorów bakteriofagowych w biologii molekularnej. Porównanie siły i

regulacji promotorów bakteriofagowych

- przenieść po 1,5 ml każdej z zaindukowanych hodowli bakteryjnych do nowych probówek typu

eppendorf;

- odwirować hodowle (2 min, 6000 rpm, 4°C);

- usunąć pipetą supernatant, a osad bakterii przepłukać (nie zawieszając) 200 µl buforu do

przemywania;

- ponownie osadzić bakterie (2 min, 6000 rpm, 4°C);

- usunąć supernatant, a osad dokładnie zawiesić (poprzez kilkukrotne przepipetowanie) w 50 µl

buforu lizującego;

- inkubować próby przez 10 minut w 37°C;

- po zakończeniu inkubacji dodać do prób po 2 µl 10% roztworu Tritonu X-100. Próbki krótko

worteksować i umieścić w łaźni lodowej;

- inkubować próby przez 10 minut w lodzie;

78

- po zakończeniu inkubacji próby odwirować (10 minut przy 10000 rpm, 4°C;)

- przenieść SUPERNATANT do nowych probówek 1,5 ml i umieścić je w łaźni lodowej;

Oznaczanie aktywności 2,3-dioksygenazy katecholu

Dla wszystkich prób jednocześnie wykonać kolejno poniższe czynności:

- umieścić w łaźni lodowej nową, odpowiednio opisaną probówkę 1,5 ml;

- odpipetować 760 µl buforu reakcyjnego bez acetonu!;

- odpipetować po 40 µl próby do każdej z probówek zawierających bufor Probówki cały czas

muszą pozostawać w łaźni lodowej!; - do każdej probówki dodać 200 µl roztworu katecholu (stężenie końcowe 0,2 mM) i

przepipetować kilkakrotnie;

- wyjąć próbki z łaźni lodowej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej;

2. Phage Display

- 500 l faga przenieść do nowej probówki typu eppendorf, dodać 200 l PEG/NaCl;

- inkubować 10 min w temp. pokojowej;

- zwirować 10 min przy 10 000 rpm, usunąć supernatant;

- rozpuścić osad w 100 l buforu jodowego, dodać 250 l 96% etanolu i inkubowac 10 min w

temp. pokojowej;

- zwirować 10 min przy 10000 rpm, usunąć supernatant;

- przemyć osad 70% etanolem i wysuszyć w 42C;

- osad DNA zawiesić w 30 l wody dejonizowanej;

- próbki poddać automatycznemu sekwencjonowaniu;

79

ĆWICZENIE 11

Otrzymanie biblioteki fragmentów restrykcyjnych faga HP1 w wektorze plazmidowym

pBluescript KS II (+) (analiza otrzymanych wyników). Metody identyfikacji rekombinantów

Diagnostyka wirusologiczna (analiza wyników)

Część teoretyczna

Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA, na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane

przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w

nukleotydach.

Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi

enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo, w kombinacjach oraz w ilościach

wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu, można ustalić wzajemne

położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy.

Analiza restrykcyjna identyfikuje pozycje wybranych miejsc restrykcyjnych. Takie ustalenia są

konieczne na przykład w celu subklonowania fragmentów DNA lub poznania orientacji insertu w

obrębie wektora.

Mapa genetyczna pokazuje względne położenie genów na chromosomie. Klasyczną mapę

genetyczną tworzyło się na podstawie częstości rekombinacji. Jej opracowanie zależało, więc od

występowania takich mutacji, które przejawiają się jako rozpoznawalne zmiany w łatwo dostępnych

dla obserwacji strukturach i funkcjach organizmu.

Natomiast mapę fizyczną tworzy się za pomocą sklonowanych odcinków DNA, nawet, jeśli ich

związek z cechami organizmu nie jest znany. Pierwszym krokiem do sporządzenia kompletnej mapy

fizycznej jest przedstawienie genomu lub pojedynczego chromosomu) jako uporządkowanego

zestawu fragmentów restrykcyjnych. Klony, które zawierają zachodzące na siebie odcinki DNA,

wykorzystuje się następnie do ustalenia, w jakim porządku są one ułożone na chromosomie.

W ustaleniu położenia genu na chromosomie pomaga często porównanie mapy genetycznej z

fizyczną.

Celem ćwiczenia jest identyfikacja rekombinantów uzyskanych na poprzednich zajęciach. Istotne

dane:

a) DNA faga HP1 jest cząsteczką liniową i zawiera 4 miejsca restrykcyjne dla enzymu BglII.

Strawienie tym enzymem generuje 5 fragmentów restrykcyjnych.

b) Fragmenty restrykcyjne BglII faga HP1 były substratem klonowania w wektorze pBluescript KS

w miejscu restrykcyjnym BamHI (ćwiczenie 7 i 8)

c) Fragmenty BglII mogą być wstawione w miejsce BamHI wektora w dwóch orientacjach

d) Na końcach liniowej cząsteczki faga HP1 znajdują się sekwencje cos (ang. cohesive end site).

Klonowanie fragmentu BglII_1 oraz BglII_5 możliwe jest tylko wówczas, gdy sekwencja cos jednej

cząsteczki połączy się z sekwencją cos drugiej cząsteczki np. fragment BglII_1 (111bp) połączy się

via sekwencje cos z innym fragmentem BglII_1 lub z fragmentem BglII_5. W ten sposób powstanie

fragment fuzyjny.

e) Jeśli numeracja kolejnych zasad we fragmencie wklonowanym jest taka sama jak numeracja

sekwencji nukleotydowej wektora mówimy o orientacji zgodnej (ang. forward). W przeciwnym

wypadku mamy do czynienia z orientacją niezgodną (ang. reverse) (Rys. 46).

f) Numeracja nukleotydów w cząsteczce kolistej rośnie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a w

cząsteczce liniowej od lewego ramienia do prawego.

80

Omówienie wyników ćwiczenia 9

1. Analiza obrazu rozdziału elektroforetycznego trawień rekombinantów z ćwiczenia 9

2. Komputerowe obliczanie wielkości uzyskanych fragmentów restrykcyjnych

3. Identyfikacja rekombinantów, mapy restrykcyjne

Omówienie wyników ćwiczenia 9 Analiza rozdziału elektroforetycznego produktów PCR z ćwiczenia 9.

Rys. 46 Przykład dwóch możliwych orientacji wklonowania fragmentu restrykcyjnego 2 HP1_BglII do wektora.

81

ĆWICZENIE 12

Phage Display (Analiza uzyskanych wyników - identyfikacja białka partnerskiego endonukleaz

Vsr V.NgoAI i V.NgoAII)

1. Analiza wyników sekwencjonowania

2. Wytypowanie sekwencji konsensusowej

3. Przeszukanie baz danych sekwencją konsensusową

4. Wytypowanie białek partnerskich endonukleaz Vsr – V.NgoAI i V.NgoAII