Uniwersytet Warszawski - ichf.edu.plichf.edu.pl/Praca_W3_Zofia_Tomasiewicz.pdf · Dzięki temu, nie...

1

Uniwersytet Warszawski

Wydział Chemii

Zofia Tomasiewicz

Nr albumu: 292743

Synteza analogów kapu zawierających

linkery aminokarboksylowe w obrębie reszt rybozy

- substratów do znakowania fluorescencyjnego

i funkcjonalizacji nanomateriałów.

Projekt licencjacki

na kierunku Chemia

w ramach Kolegium Międzywydziałowych

Indywidualnych Studiów Matematyczno - Przyrodniczych

w zakresie Chemii Organicznej

Praca wykonana pod kierunkiem dr Jacka Jemielitego

Zakład Biofizyki IFD, Wydziału Fizyki UW

Warszawa, czerwiec 2012

3

Oświadczenie kierującego pracą

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego.

Data Podpis kierującego pracą

Oświadczenie autora pracy

Świadoma odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przez mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami.

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną.

Data Podpis autora pracy .

5

Streszczenie

Celem niniejszego projektu była synteza analogów końca 5’ mRNA zawierających linkery

w resztach rybozy 7-metyloguanozyny, pozwalające na przyłączenie znaczników

fluorescencyjnych, bądź funkcjonalizację nanocząstek. Otrzymano serię analogów kapu z trzema

różnymi linkerami aminokarboksylowymi w resztach 2’ oraz 3’ rybozy.

Słowa kluczowe

mRNA, 5’-kap, linkery, znakowanie fluorescencyjne, funkcjonalizacja nanocząstek, eIF4E, Dcp1/Dcp2

Dziedzina pracy (kody wg programu Socrates-Erasmus)

13.3 Chemia

7

Składam serdeczne podziękowania

dr Jackowi Jemielitemu

za przekazaną wiedzę, poświęcony czas

oraz okazaną serdeczność.

11

Spis treści

1. Ekspresja genu ............................................................................................................................ 13

1.1. Transkrypcja .......................................................................................................................... 13

1.2. Translacja ............................................................................................................................... 15

1.3. Degradacja mRNA .................................................................................................................. 16

2. Modyfikacje chemiczne struktury kapu .................................................................................... 17

2.1. Budowa i właściwości 7-metyloguanozyny ........................................................................... 17

2.2. Struktura kapu ....................................................................................................................... 17

2.3. Biologiczne funkcje kapu ....................................................................................................... 18

2.4. Modyfikacje w obrębie rybozy 7-metyloguanozyny ............................................................. 18

2.5. Cele syntezy analogów kapu zawierających linker w obrębie reszt rybozy .......................... 18

2.5.1. Analogi kapu w terapii przeciwnowotworowej ..................................................................... 18

2.5.2. Znakowanie fluorescencyjne ................................................................................................. 19

2.5.3. Koniungaty z nanocząstkami ................................................................................................. 20

3. Synteza chemiczna analogów kapu ........................................................................................... 21

3.1. Tworzenie wiązania pirofosforanowego ............................................................................... 21

3.1.1. Aktywacja nukleotydów ........................................................................................................ 21

3.1.1.1. Synteza p-imidazolidów Hashimoto .............................................................................. 21

3.1.1.2. Aktywacja fosforanu N,N-karbonylodiimidazolem........................................................ 22

3.2. Metylowanie w pozycji N7 guanozyny ................................................................................... 22

3.3. Otrzymywanie dinukleotydów .............................................................................................. 23

4. Badania własne ........................................................................................................................... 25

4.1. Cel pracy ................................................................................................................................ 25

4.2. Strategia syntezy analogów kapu zawierających linkery aminokarboksylowe ..................... 25

4.3. Badania NMR ......................................................................................................................... 28

4.4. Podsumowanie ...................................................................................................................... 30

5. Część eksperymentalna .............................................................................................................. 31

5.1. Informacje ogólne ................................................................................................................. 31

Rozpuszczalniki.................................................................................................................................. 31

Kolumnowa chromatografia jonowymienna .................................................................................... 31

Wysokociśnieniowa chromatografia kolumnowa (HPLC) ................................................................. 31

Spektrometria mas i NMR ................................................................................................................. 31

5.2. Syntezy chemiczne ................................................................................................................ 32

5’-O-(β-cyjanoetylo)difosforan guanozyny (4) .................................................................................. 32

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(2-karboksyetylo)-karbamoilo-guanozyny (5)............................................. 32

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(2-karboksyetylo)-karbamoilo-7-metyloguanozyny (8) (BAPA-CO-m7GDP) 33

BAPA-CO-m7GpppG (1) ..................................................................................................................... 33

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(3-karboksybutylo)-karbamoilo-guanozyny (6) .......................................... 34

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(3-karboksybutylo)-karbamoilo-7-metyloguanozyny (9) (GABA-CO-m7GDP)

34

GABA-CO-m7GpppG (2) ..................................................................................................................... 35

12

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(6-karboksyheksylo)-karbamoilo-guanozyny (7) ........................................ 36

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(2-karboksyheksylo)-karbamoilo-7-metyloguanozyny (10) (EACA-CO-

m7GDP) .............................................................................................................................................. 36

EACA-CO-m7GpppG (3)...................................................................................................................... 37

5.3. Uzupełnienie .......................................................................................................................... 38

5.3.1. BAPA-CO-m7GpppG ............................................................................................................... 38

5.3.2. GABA-CO-m7GpppG ............................................................................................................... 40

5.3.3. EACA-CO-m7GpppG ............................................................................................................... 42

Bibliografia ........................................................................................................................................... 45

13

1. Ekspresja genu

Ekspresja genu jest to proces odczytywania informacji genetycznej i wykorzystania jej

do syntezy odpowiednich makromolekuł [1]. W procesie tym powstają białka, jak również

funkcjonalne kwasy rybonukleinowe. Na mechanizm ekspresji genu składa się kilka podstawowych

etapów. Pierwszym z nich jest transkrypcja podczas której syntetyzowany jest matrycowy

(informacyjny) RNA (mRNA) o sekwencji komplementarnej do matrycowego odcinka DNA. Pierwotny

transkrypt jest modyfikowany na końcach 5’, 3’ a następnie poddawany jest tzw. procesowi składania

(ang. splicing), czyli wycinaniu fragmentów niekodujących – intronów. Dojrzały mRNA

transportowany jest z jądra do cytoplazmy, gdzie podlega translacji, w której bierze udział

wiele makrocząsteczek – czynniki białkowe, kwasy rybonukleinowe oraz rybosomy. Gotowy łańcuch

polipeptydowy poddawany jest modyfikacjom posttranslacyjnym oraz ulega zwijaniu (ang. folding).

Powstałe w ten sposób białko transportowane jest do odpowiedniego miejsca w organizmie.

Na poniższym schemacie została przedstawiona typowa droga przepływu informacji

genetycznej w komórce. Jej poszczególne etapy omówiono bardziej szczegółowo w kolejnych

podrozdziałach .

Rys. 1.1. Schemat ekspresji genów u eukariontów.

1.1. Transkrypcja

Transkrypcja u organizmów eukariotycznych zachodzi w jądrze komórkowym. Na matrycy

przechowywanego w nim DNA syntetyzowane są cząsteczki RNA o sekwencji zasad komplementarnej

do odcinka antysensownej nici DNA. Proces jest katalizowany przez zależną od DNA polimerazę RNA,

która najpierw wiąże się z promotorowym rejonem DNA i rozplątuje fragment nici DNA, a następnie

przyłącza kolejne trójfosforany rybonukleozydów obecne w nukleoplazmie, wydłużając łańcuch

mRNA. Obecność enzymu pirofosfatazy umożliwia hydrolizę powstających w wyniku kondensacji

14

pirofosforanów, dzięki czemu łańcuch nukleotydowy może się wydłużać. Synteza łańcucha

kwasu rybonukleinowego zachodzi w kierunku 5' 3'.

Po rozpoczęciu transkrypcji przez polimerazę RNA II na końcu 5’ dobudowana zostaje

specyficzna struktura zwana kapem (ang. cap) [2]. Proces ten zachodzi kotranskrypcyjnie,

rozpoczynając się gdy długość łańcucha RNA osiągnie długość 20-30 nukleotydów. Synteza kapu

jest dosyć złożona i zaangażowane jest w nią wiele enzymów, takich jak transferaza guanylowa,

dzięki której powstaje wiązanie 5’-5’ trifosforanowe, czy metylotransferaza, która metyluje guaninę

w pozycji 7. Dodatkowo, oprócz zwykłego, monometylowanego kapu, zwanego kapem 0,

istnieją w organizmie kapy di-, oraz trimetylowane, nazywane kapami 1 oraz 2, metylowane

w pozycji 2’-OH rybozy pierwszych dwóch transkrybowanych nukleotydów łańcucha mRNA.

Rys. 1.2. Schemat procesu transkrypcji zachodzącego w jądrze komórkowym.

Rys. 1.3. Naturalna struktura kapu

15

Po zakończeniu syntezy łańcucha, na końcu 3’, dobudowywany jest ciąg nukleotydów

adeninowych, zwany ogonem poli-A. Przeciętnie składa się on z 50 – 250 nukleotydów.

Modyfikacja ta między innymi zwiększa odporność łańcucha mRNA na hydrolizę enzymatyczną.

Jest również istotna z punktu widzenia translacji i innych procesów w których uczestniczy RNA

(np. represja translacji za pośrednictwem mikroRNA) [3].

Powstały w ten sposób pierwotny transkrypt mRNA (pre mRNA), ulega składaniu

(ang. splicing). Polega to na wycięciu niekodujących sekwencji nukleotydowych - intronów

i połączeniu fragmentów kodujących – egzonów. Utworzony w ten sposób dojrzały matrycowy RNA

transportowany jest do cytoplazmy.

1.2. Translacja

Proces ten u eukariontów ma miejsce w cytoplazmie bądź na powierzchni retikulum

endoplazmatycznego szorstkiego i składa się z trzech etapów: inicjacji, elongacji oraz terminacji.

W translację, oprócz mRNA, które tworzy matrycę do biosyntezy białka, zaangażowane są także

dwa inne typy kwasu rybonukleinowego: tRNA (transportowy RNA) i rRNA (rybosomalny RNA).

Inicjacja polega na przyłączeniu małej podjednostki rybosomu do końca 5’ mRNA przy pomocy

czynników inicjujących translację. Sygnałem do rozpoczęcia translacji jest związanie struktury kapu

przez białko eIF4E [2]. Etap ten limituje przebieg całego procesu translacji [4].

Pod koniec procesu inicjacji translacji, po przyłączeniu dużej podjednostki rybosomu,

odnalezieniu kodonu AUG oraz zakotwiczeniu pierwszego aminokwasu (metioniny) rozpoczyna się

proces elongacji łańcucha peptydowego. Gdy tylko rybosom napotka kodon stop następuje

terminacja transkrypcji i uwolnienie zsyntetyzowanego polipeptydu.

Rys. 1.4. Schemat procesu translacji zachodzącego w cytoplazmie.

16

Gotowy łańcuch polipeptydowy poddawany jest modyfikacjom posttranslacyjnym

oraz ulega zwijaniu. Powstałe w ten sposób białko transportowane jest do odpowiedniego miejsca

w organizmie.

1.3. Degradacja mRNA

Na stabilność struktury łańcucha mRNA wpływa struktura kapu na końcu 5’ oraz ogona poli-A

na końcu 3’ [5, 6]. W związku z tym degradacja łańcucha mRNA może przebiegać na dwa sposoby

rozróżniane w zależności od kierunku działania nukleaz [7, 8]. Zarówno degradacja 5’->3’ jak i 3’-> 5’

wymaga wcześniejszej deadenylacji [9].

Dostęp do matrycy mRNA od końca 5’ jest niemożliwy dla egzonukleaz gdy na 5’ końcu

znajduje się osłaniająca transkrypt struktura kapu, jednak gdy tylko kap zostanie zhydrolizowany

egzonukleazy natychmiast rozpoczynają degradację kwasu nukleinowego w kierunku jego 3’ końca.

Utrata kapu następuje pod wpływem kompleksu enzymatycznego Dcp1/Dcp2. Degradacja od strony

3’ przeprowadzana jest przez egzosom. Powstałe krótkie oligonukleotydowe fragmenty zawierające

kap są degradowane przez enzym DcpS (Decapping Scavenger).Enzym DcpS odcina kap hydrolizując

wiązanie pomiędzy β i γ fosforanem w przeciwieństwie do Dcp1/Dcp2, który hydrolizuje wiązanie

pomiędzy α i β fosforanem [10, 11].

Rys. 1.5. Degradacja mRNA.

17

2. Modyfikacje chemiczne struktury kapu

2.1. Budowa i właściwości 7-metyloguanozyny

7-metyloguanozyna jest nietypowym nukleozydem. Wprowadzenie grupy metylowej w pozycję

N7 zasady skutkuje pojawieniem się ładunku dodatniego. Ładunek ten ulega w pewnym stopniu

delokalizacji na atomy N7, C8 i N9 pierścienia aromatycznego. Wpływa to na wzrost kwasowości

protonu związanego z atomem N1 sąsiedniego pierścienia. W pH powyżej 7 następuje

oddysocjowanie tego protonu, co powoduje powstanie ładunku ujemnego zdelokalizowanego

na atomach N1, C6 oraz tlenu [12].

N

NH

N

N

NH2

O

R

CH3

+

- H+

+ H+

N

N

N

N

NH2

O

R

CH3

+

-

Rys. 2.1. Równowaga kwasowo-zasadowa 7-metyloguaniny i jej pochodnych.

Istotną cechą 7-metyloguanozyny jest zdolność do fluorescencji. Wzbudzenie przy długości fali

ok. 280 nm powoduje emisję z maksimum przy 370 – 420 nm (w zależności od pH) [12]. Własność ta

jest istotna z punktu analizy chemicznej, gdyż fluorescencja nie jest typową cechą nukleozydów.

Dzięki temu, przez zastosowanie detektora fluorescencyjnego sprzężonego z aparatem

do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) można łatwo identyfikować nukleotydy

zawierające 7-metyloguaninę. Związki zawierające niemetylowaną guanozynę wykazują jedynie

absorbcję w zakresie 240 – 280 nm.

2.2. Struktura kapu

Struktura kapu obecna na 5’ końcu mRNA jest pod wieloma względami wyjątkowa,

gdy patrzymy na nią pod kątem budowy występujących w organizmie polinukleotydów. Nieodłączną

częścią kapu są: 7-metyloguanina (zasada nukleinowa posiadająca ładunek dodatni), pierścień rybozy

oraz łańcuch trifosforanowy, który łączy 7-metyloguanozynę z pierwszym nukleozydem łańcucha

mRNA tworząc nietypowe dla polinukleotydów wiązanie 5’,5’–trifosforanowe. Nietypowa,

jak dla nukleotydów, budowa kapu, wpływa na jego niezwykłe właściwości.

Rys. 2.2. Struktura kapu z zaznaczonymi najpopularniejszymi miejscami modyfikacji chemicznych.

18

Ze względu na istotne funkcje pełnione w organizmie, struktura kapu jest interesującym obiektem do

badań. Wprowadzane do niej modyfikacje mogą znacząco wpływać na jej właściwości biologiczne,

takie jak powinowactwo do białek wiążących kap, czy odporność na hydrolizę z udziałem enzymów

degradujących kap [13].

Modyfikacje w mostku trifosforanowym polegają na podstawieniu atomu tlenu innym atomem

lub ugrupowaniem, mogą one być w pozycjach mostkowych – pomiędzy atomami fosforu, bądź

w pozycjach niemostkowych. Znacząco wpływają one na podatność kapu na degradację enzymami

hydrolitycznymi, oraz na powinowactwo kapu do białek wiążących kap.

Możliwe są również modyfikacje w obrębie rybozy 7-metyloguanozyny. Dzięki nim można badać

oddziaływania między kapem, a wiążącymi go białkami.

2.3. Biologiczne funkcje kapu

Struktura kapu obecna na końcu 5’ mRNA jest znakiem rozpoznawczym dla białek pełniących

istotne funkcje w procesie ekspresji genu. Już w jądrze komórkowym, kap obecny na końcu 5’

pre-mRNA oddziałuje z białkiem CBP (Cap Binding Protein), które to umożliwia splicing

oraz poliadenylację końca 3’ mRNA [14]. CBP bierze również udział w transporcie dojrzałego

transkryptu z jądra do cytoplazmy [15]. Bez obecności kapu na końcu 5’ mRNA żaden z tych procesów

nie mógłby być prawidłowo przeprowadzony.

Kap pełni również kluczową rolę w procesie inicjacji translacji. Oddziaływanie kapu

z eukariotycznym czynnikiem translacji eIF4E jest etapem limitującym szybkość syntezy białek [16].

Bez obecności kapu na końcu 5’ mRNA nie byłoby możliwe utworzenie kompleksu inicjującego

translację, a więc i wydajne powstawanie białek.

Niezwykle ważną funkcją kapu jest również ochrona mRNA przed degradacją.

Mostek 5’-5’-trifosforanowy stanowi skuteczną ochronę przed hydrolizą enzymatyczną, wydłużając

dzięki temu czas życia mRNA w komórce.

2.4. Modyfikacje w obrębie rybozy 7-metyloguanozyny

Jak wykazały badania krystalograficzne, modyfikacje w obrębie rybozy 7-metyloguanozyny

nie mają specjalnego wpływu na powinowactwo struktury kapu do czynnika inicjującego.

Grupy –OH w pozycjach 2’, 3’ rybozy 7-metyloguanozyny znajdują się poza centrum aktywnym białka,

a więc najprawdopodobniej słabo z nim oddziałują. Dzięki temu, nie tracąc na sile powinowactwa

można w te pozycje wprowadzać różne modyfikacje chemiczne (np. znaczniki fluorescencyjne),

nie zmieniając ich właściwości biologicznych [17].

Dodatkowo wprowadzenie modyfikacji w resztach 2’,3’ rybozy 7-metyloguanozyny zapewnia

prawidłowe wbudowywanie się kapu do łańcucha mRNA – z 7-metyloguanozyną na końcu 5’.

Kap z wolną grupą 3’-OH może zostać wbudowany odwrotnie, tzn. z 7-metyloguanozyną bliżej

3’ końca łańcuch mRNA. Transkrypt taki jest bezużyteczny.

2.5. Cele syntezy analogów kapu zawierających linker w obrębie reszt rybozy

2.5.1. Analogi kapu w terapii przeciwnowotworowej

W wielu komórkach nowotworowych stwierdzono podwyższony poziom ekspresji czynnika

inicjującego translację eIF4E [18,19]. Przy prawidłowym poziomie tego białka w komórkach translacji

ulegają tylko tzw. silne mRNA, wysycające obecne w komórce eIF4E, natomiast tzw. słabe mRNA,

19

kodujące zazwyczaj czynniki onkogenne, pozostają nieaktywne. Przy podwyższonym poziomie

białka eIF4E możliwe jest również wiązanie się słabych mRNA, a przez to translacja onkoprotein [20].

Redukcja poziomu eIF4E w komórce uniemożliwiłaby translację czynników związanych

z kancerogenezą, a więc rozwój nowotworu. Analogi kapu, dzięki wysoce specyficznemu wiązaniu

z eIF4E, mogłyby zmniejszyć pulę białka dostępnego w procesie translacji i zahamować

proces nowotworzenia [21, 22].

Innym potencjalnym zastosowaniem mRNA jest wykorzystanie go w terapii genowej [23].

Do tej pory w terapii genowej najczęściej stosowano DNA jednak, w porównaniu do zastosowania

mRNA, ma ono sporo wad. RNA jest znacznie bezpieczniejsze w użyciu, nie wymaga ingerencji

w genom pacjenta, więc zmniejsza ryzyko wprowadzania uszkodzeń w istotne fragmenty genomu,

co może prowadzić do nowotworzeni i innych groźnych chorób. Nie wprowadza nieodwracalnych

zmian. Jest również mniej immunogenne. Działa w cytoplazmie przez co nie jest konieczne

wprowadzanie do jądra komórkowego [24]. Jednak istnieje też pewne ograniczenie w stosowalności

RNA – naturalne mRNA jest dosyć nietrwałe w warunkach komórkowych. Przez wprowadzenie

odpowiedniej modyfikacji chemicznej w mostku trifosforanowym struktury kapu, możliwe jest jednak

znaczne wydłużenie jego czasu życia [25]. Wykazano, że mRNA wstrzyknięte do węzła chłonnego

zostaje spontanicznie wchłonięte przez niedojrzałe komórki dendrytyczne, gdzie ulega translacji,

a powstałe białko prezentowane jest na powierzchni komórek dendrytycznych i bierze udział

w specyficznej aktywacji układu immunologicznego [26, 27].

2.5.2. Znakowanie fluorescencyjne

Analogi kapu wprowadzone do komórki stwarzają wiele trudności badawczych.

Szczególnym problemem jest ocena ich lokalizacji oraz stężenia w komórce. Przyłączenie

do analogu kapu znacznika fluorescencyjnego umożliwiłoby wyznaczenie tych parametrów.

Stworzyłoby to nowe możliwości w badaniu procesów posttranskrypcyjnych, takich jak degradacja

mRNA przez enzym Dcp1/Dcp2. Pozwoliłoby też na lepsze poznanie mechanizmu działania analogów

kapu jako inhibitorów translacji poprzez badania na liniach komórkowych

oraz modelowych organizmach zwierzęcych. Znakowane fluorescencyjnie analogi kapu umożliwiłyby

również zbadanie mechanizmu pochłaniania mRNA przez komórki dendrytyczne oraz mechanizm

jego translacji podczas terapii genowej z wykorzystaniem RNA.

Dzięki zastosowaniu analogów kapu z odpowiednio dobranym znacznikiem fluorescencyjnym,

będzie można prowadzić badania wprowadzonych do komórki analogów kapu nawet przy niskich

stężeniach (rzędu dziesiątek nanomoli na litr). Dotychczas prowadzenie badań przy stężeniach

poniżej 1 M stanowiło nierozwiązany problem.

Ze względu na niską wydajność kwantową fluorescencji naturalnej struktury kapu pewne

techniki fluorescencyjne, jak np. FRET, czy badania oparte na zaniku anizotropii fluorescencji,

są niemożliwe do zastosowania. Zastosowanie znakowanych analogów umożliwiłoby wykorzystanie

tych metod.

Z drugiej strony, mimo niskiej wydajności kwantowej, fluorescencja 7-metyloguanozyny

stwarza trudności w badaniach oddziaływań analogów kapu z białkami. Przy dużych stężeniach kapu,

znacznie komplikuje się interpretacja danych eksperymentalnych, gdyż widmo emisji

7-metyloguanozyny pokrywa się z widmem emisji reszt tryptofanowych białek. Zastosowanie

20

analogów znakowanych fluorescencyjnie umożliwiłoby wygaszenie fluorescencji 7-metyloguanozyny

na zasadzie wewnątrzcząsteczkowego transferu energii (FRET).

2.5.3. Koniungaty z nanocząstkami

Analogi kapu, jak wszystkie nukleotydy, nie przenikają przez błony komórkowe. Przyłączenie

analogów kapu o znaczeniu terapeutycznym do nanocząstek stanowi jeden z pomysłów

na rozwiązanie tego problemu. Enkapsulacja analogów kapu wewnątrz nanocząstek przedłużyłoby

również ich żywotność, ponieważ krócej przebywałyby w środowisku fizjologicznym, gdzie

są narażone na działanie enzymów hydrolizujących kap. Połączenie z nanocząstkami magnetycznymi

umożliwiłyby natomiast ich kierowanie za pomocą pola magnetycznego i precyzyjne ulokowanie

w wybranych miejscach organizmu pacjenta.

Koniungaty kapu z nanocząstkami można również wykorzystać do tworzenia złóż

powinowactwa. Jest to bardzo prosty i wydajny sposób na oczyszczenie białek wiążących kap.

Znacznie ułatwiałoby to otrzymanie wysoko oczyszczonych preparatów białkowych niezbędnych

do badań biologicznych. Złoża powinowactwa na nośniku magnetycznym mogłyby również znaleźć

zastosowanie w poszukiwaniu nowych białek wiążących kap oraz do ich wstępnej charakterystyki.

Analogi kapu z przyłączonymi linkerami mogą posłużyć również do tworzenia biosensorów

do diagnostyki medycznej. Selektywność nadana sensorowi poprzez dołączenie analogu kapu

umożliwiłaby ilościowe oznaczenie białek wiążących kap nawet w próbkach o skomplikowanym

składzie bez konieczności ich oczyszczania. Przykładem mogą być elektrody grafenowe

z przyłączonymi analogami kapu – w zależności od tego, czy struktura kapu związana jest

przez czynnik eIF4E, zmienia się natężenie przepływającego prądu.

21

3. Synteza chemiczna analogów kapu

3.1. Tworzenie wiązania pirofosforanowego

Wytworzenie wiązania pirofosforanowego wymaga zwiększenia elektrofilowości jednego

z atomów fosforu. Aktywny P-imidazolid reagując z anionem fosforanowym daje odpowiedni

5’-difosforan nukleozydu.

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OH OH

P

O-

O

NN

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OH OH

P

O-

O

O-

O

O

O-

PZnCl2, DMF

PO4

3- sól TEAH

+

Rys. 3.1. Tworzenie wiązania pirofosforanowego.

W reakcji tej istotną rolę odgrywają sole metali

dwuwartościowych np. chlorek cynku lub magnezu [28]. Ich rola

w przebiegu reakcji jest dość złożona. Kationy metalu kompleksując

atomy tlenu w reszcie fosforanowej oraz P-imidazolidu, a także

oddziałując również z atomem azotu pierścienia imidazolu zwiększają

elektrofilowość atomu fosforu, stabilizując stan przejściowy reakcji.

Prawdopodobną strukturę stanu przejściowego przedstawiono

na rys. 3.2. Chlorki metali dwuwartościowych w istotny sposób

zwiększają też rozpuszczalność nukleotydów w wykorzystywanych

rozpuszczalnikach.

3.1.1. Aktywacja nukleotydów

Opracowano wiele metod chemicznych aktywacji grupy fosforanowej, jednak

w mojej pracy stosowane są pochodne, w której aktywną formą fosforanu są P-imidazolidy,

zaproponowane przez Hoarda i Otta [29]. W literaturze można znaleźć kilka sposobów otrzymywania

imidazolowych pochodnych nukleotydów, jednak przedstawię tylko dwie z nich, najważniejsze

z punktu widzenia niniejszej pracy.

3.1.1.1. Synteza p-imidazolidów Hashimoto

Reakcja Mukaiyamy-Hashimoto [30] przebiega w obecności trifenylofosfiny

i 2',2'-ditiodipirydyny, które stanowią układ aktywujący. W pierwszym etapie trifenylofosfina atakuje

atom siarki 2,2-ditiodipirydyny z utworzeniem soli fosfoniowej i anionu tiolanowego o żółtym

zabarwieniu. Taka sól fosfoniowa reaguje z grupą fosforanową aktywując ją, dzięki czemu ulega ona

substytucji nukleofilowej, tworząc p-imidazolid. Podstawienie atomu fosforu imidazolem możliwe

jest dzięki wytworzeniu bardzo trwałego wiązania P=O w odchodzącej trifenylofosfinie, co stanowi

siłę napędową reakcji.

Zn

ClCl

NN

ZnCl

Cl

P

OR

Nu

O-

O-

Rys. 3.2. Prawdopodobny mechanizm

działania ZnCl2. Nu oznacza centrum

nukleofilowe, natomiast R pozostałą

część nukleotydu.

22

N S NS

N S-

Ph3P+ NS

N S-

P

O

O

O-

O-

R

P

O

O

O-

O RPh3P+

NHN:

TEA

TEAH+Ph3PO

ROP

O

O-

NN

N

NH

N

N

NH2

O

O

OHOH

R =

Ph3P

Rys. 3.3. Mechanizm tworzenia p-imidazolidów metodą Hashimoto.

3.1.1.2. Aktywacja fosforanu N,N-karbonylodiimidazolem

Jedną z pierwszych procedur stanowi aktywacja fosforanu N,N-karbonylodiimidazolem (CDI)

[28]. Na początku podstawieniu ulega atom węgla N,N-karbonylodiimidazolu. W kolejnym etapie

następuje substytucja nukleofilowa imidazolu na atom fosforu z jednoczesnym odejściem

karbaminianu, który to ulega rozkładowi pod wpływem wody.

R O P

O

O-

NN

N

NH

N

N

NH2

O

O

OHOH

R =

P

O

O

O-

O-

R

NN

NN

O

+P

O

O

O-

OR NN

O

N:N

Rys. 3.4. Mechanizm tworzenia p-imidazolidów z użyciem CDI.

3.2. Metylowanie w pozycji N7 guanozyny

Atom azotu znajdujący się w pozycji N7 guaniny jest najbardziej nukleofilowym atomem

w całej cząsteczce 5’-monofosforanu guanozyny (GMP). Dzięki temu prowadzone reakcje alkilowania

nie wymagają stosowania zabezpieczeń. Najczęściej stosowanymi odczynnikami metylującymi

są jodek metylu czy siarczan dimetylu. Reakcja z nimi przebiega selektywnie, jednak

23

po zbyt długim czasie mogą powstawać produkty uboczne – metylowe estry fosforanowe. Reakcje

prowadzące do powstania produktów ubocznych, z powodu ich słabszych właściwości

nukleofilowych, biegną znacznie wolniej. Dzięki opisanym wcześniej właściwościom fluorescencyjnym

7-metyloguaniny łatwo jest monitorować przebieg reakcji, nie dopuszczając do powstania zbyt dużej

ilości produktów ubocznych.

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OHOH

O-

O

PO-

MeI

DMSO

N

NH

N

N+

NH2

O

OO

OHOH

O-

O

PO-

CH3

Rys. 3.5. Schemat syntezy pochodnej 7-metyloguanozyny.

Pamiętając o tym, że pierścień imidazolowy 7-metyloguaniny jest nietrwały w warunkach

zasadowych, syntezę analogów kapu należy zaplanować tak, aby dalsze etapy reakcji prowadzić

w łagodnych warunkach, unikając skrajnych wartości pH.

3.3. Otrzymywanie dinukleotydów

Reakcja sprzęgania mononukleotydów, podobnie jak tworzenie difosforanów nukleozydów,

wymaga uprzedniej aktywacji grupy fosforanowej jednego z nukleotydów oraz mediatora w postaci

chlorku cynku, bądź magnezu. Jako grupę aktywującą na jednym z fosforanów stosuje się imidazol.

W przebiegu reakcji p-imidazolid może ulegać hydrolizie i powstaje wtedy niewielka ilość

produktu ubocznego, będącego wynikiem reakcji p-imidazolidu z produktem jego hydrolizy.

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OH OH

P

O-

O

O-

O

O

O-

P

N

NH

N

N+

NH2

O-

OO

OHOH

P

O

O-

N

CH3

N

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OH OH

P

O-

O

O

O

O

O-

P

N

NH

N

N+

NH2

O-

OO

OHOH

P

O

O-

CH3

+

ZnCl2

DMF

Rys. 3.6. Schemat sprzęgania mononukleotydów.

25

4. Badania własne

4.1. Cel pracy

Celem niniejszej pracy było zaprojektowanie ścieżki syntezy i otrzymanie analogów

końca 5’ mRNA zawierających linkery aminokarboksylowe w resztach 2’ oraz 3’ rybozy

7-metyloguanozyny, umożliwiających znakowanie fluorescencyjne, bądź funkcjonalizację

nanocząstek. Kluczowym etapem było opracowanie przyłączania linkera aminokarboksylowego

do reszty cukrowej poprzez ugrupowanie karbaminianowe.

Zaplanowano syntezę trzech dinukleotydowych analogów kapu z następującymi

linkerami: β-alaninowym, γ-aminomasłowym oraz -kapronowym.

W przyszłości mogą one znaleźć zastosowanie między innymi w opracowywaniu terapii

genowej w oparciu o RNA (tzw. szczepionek RNA), czy też w diagnostyce medycznej.

4.2. Strategia syntezy analogów kapu zawierających linkery aminokarboksylowe

Związkiem wyjściowym do syntezy analogów kapu z linkerami aminokarboksylowymi

w obrębie 2’/3’ reszt rybozy 7-metyloguanozyny sól trietyloamoniowa GMP. Strategię syntezy

ilustrują poniższe schematy.

N

NH

N

N

NH2

O

O

O

OHOH

O-

O

PO-

P

O

N

OH

ON

N

ZnCl2, DMF

N

NH

N

N

NH2

O

O

O

OHOH

O-

O

POP

O

O-

O

N

N

NH

N

N

NH2

O

O

O

OHOH

O-

O

POP

O

O-

O-

OH(CH2)nNHO

O

1) CDI / DMF

2) linker, DBU

MeI

DMSO

N

N

N

N+

NH2

O-

O

O

OHOH

O-

O

POP

O

O-

O-

CH3

OH(CH2)nNHO

O

N

N

N

N+

NH2

O-

O

O

OHOH

O-

O

POP

O

O-

O

CH3

N

NH

N

N

NH2

O

O

O

OH OH

O

O-

P

OH(CH2)nNHO

O

GMP-Im, ZnCl 2

DMF

n = 2, 3, 5

1, 2 lub 3

5, 6 lub 7 8, 9 lub 10

4

Rys. 4.1. Strategia syntezy analogów kapu zawierających linker aminokarboksylowy w obrębie reszt rybozy.

Pierwszym etapem było zabezpieczenie grupy fosforanowej w pozycji 5’-OH pierścienia rybozy.

Aby wprowadzić linker na reszty rybozy, niezbędne jest wcześniejsze zabezpieczenie grupy

fosforanowej na końcu 5’-OH rybozy. Substratami do reakcji są p-imidazolid fosforanu

26

β-cyjanoetylowego oraz monofosforan nukleozydu. Mechanizm reakcji jest analogiczny,

jak w opisanym tworzeniu wiązania pirofosforanowego.

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OHOH

O-

O

PO-

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OHOH

O-

O

PO

O-

O

PO

N

P

O

N

OH

ON

N

ZnCl 2, DMF

Rys. 4.2. Schemat reakcji zabezpieczania grupy fosforanowej.

Zabezpieczenie fosforanu grupą cyjanoetylową jest niezbędne, gdyż karbonylodiimidazol,

jak było opisane wcześniej może aktywować fosforan, co w przypadku prowadzonej przeze mnie

syntezy było niepożądane (powstałyby dinukleotydy połączone mostkiem tetrafosforowym).

W przeprowadzonej przeze mnie syntezie CDI jest wykorzystany do utworzenia reaktywnego

węglanu na resztach 2’/3’-OH rybozy, w celu wprowadzenia tam linkera aminokarboksylowego.

N

NH

N

N

NH2

O

OO

OHOH

P

O

O-

O

O-

O

O

P

N GO

O

OO

P

O

O-

O

O-

O

O

P

N

O

NN

NN

O

DMF

H3N+(CH2)nCOO

-

DBU (1 eqv.)

OH (CH2)nNH2

O

GO

O

OO

P

O

O-

O

O-

O

O

P

N

O

GO

O

OO

P

O

O-

O

O-

O

O

P

N

O-

N+

OH (CH2)n

O H

H

OH (CH2)nNH

O

GO

O

OOH

P

O

O-

O

O-

O

O

P

N

O

n = 2, 3, 5

Rys. 4.3. Schemat wprowadzania linkera aminokarboksylowego w pozycje 2’/3’ rybozy.

N,N-karbonylodiimidazol przyłącza się do pierścienie rybozy z utworzeniem cyklicznego

węglanu. Następnie grupa aminowa linkera (zdeprotonowana przez DBU) atakuje karbonylowy atom

węgla i następuje addycja nukleofilowa z przejściem pary elektronowej na atom tlenu. Następnie

rozrywa się jedno z wiązań C-O i następnie przeskok protonu z grupy aminowej z jednoczesnym

utworzeniem wiązania O-H, odtwarza się również podwójne wiązanie C=O.

Otrzymany 5’-cyjanoetylodifosforan 2’/3’-karbamoiloguanozyny z przyłączonym linkerem

poddano in situ reakcji odbezpieczania. Zabezpieczenie cyjanoetylowe zdejmuje się w obecności

DBU, który odrywa proton od węgla w pozycji α, potem następuje β-eliminacja, a produktami

są difosforan nukleozydu oraz akrylonitryl. Etap ten jest odwracalny, w związku z czym reakcję

27

prowadzi się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40-50oC w celu usunięcia ze środowiska

reakcji powstającego akrylonitrylu (Twrz. akrylonitrylu wynosi 78oC).

GO

O

OHOH

P

O

O-

O

O-

O

O

P

N

n = 2, 3, 5

DBU

OH (CH2)nNH

O

O

GO

O

OHOH

P

O

O-

O-

O-

O

O

P

OH (CH2)nNH

O

O

Rys. 4.4. Schemat reakcji odbezpieczania fosforanu.

Dinukleotyd z linkerem w resztach 2’/3’ rybozy poddano metylowaniu za pomocą jodku metylu

otrzymując jego metylową pochodną. Wydzielony produkt poddano reakcji sprzęgania

z P-imidazolidem monofosforanu guanozyny.

N

NH

N

N

NH2

O

O

O

OHOH

O-

O

PNN

N

N

N

N+

NH2

O-

O

O

OHOH

O-

O

POP

O

O-

O-

CH3

OH(CH2)nNHO

O

N

N

N

N+

NH2

O-

O

O

OHOH

O-

O

POP

O

O-

O

CH3

N

NH

N

N

NH2

O

O

O

OH OH

O

O-

P

OH(CH2)nNHO

O

ZnCl 2

DMF

n = 2, 3, 5

+

Rys. 4.5. Schemat otrzymywania dinukleotydów.

Powyższe syntezy przeprowadzono kolejno dla każdego z linkerów. W ten sposób otrzymano

trzy pary izomerów, każdy z innym linkerem karboksylowym – odpowiednio były to β-alanina (BAPA),

kwas γ-aminomasłowy (GABA) oraz kwas -aminokapronowy (EACA).

28

4.3. Badania NMR

W celu zidentyfikowania struktury otrzymanych związków wykonano ich widma 1H NMR

oraz 31P NMR. Widma fosforowe pozwalają na potwierdzenie struktury otrzymanego mostka

5’,5’-trifosforanowego. We wszystkich widmach 31P NMR widać dublet dubletów przy δ= -22/-23 ppm

pochodzący od fosforu w pozycji β oraz nałożone dublety przy ok. -10/-11 ppm odpowiadający

jądrom fosforu w pozycji α oraz γ. Ze schematu rozszczepień wynika, że są one niemal równocenne,

a ich stałe sprzężenia z fosforem β są prawie identyczne (J=19,5 Hz dla związku 2 oraz J= 18,1 Hz

dla związku 3b).

Widma 1H NMR otrzymanych analogów kapu wykazują pewne podobieństwo. Wszystkie

składają się z trzech części zawierających sygnały od protonów guaniny w zakresie 9-8 ppm

oraz singlet przy ok. 4 ppm pochodzący od 3 protonów grupy metylowej, protonów rybozy

od 6 do 4 ppm oraz protonów linkera. Tylko część zawierająca sygnały od linkera jest znacząco inna

dla każdego z linkerów. Pozostałe dwie są bardzo podobne do siebie.

W widmach protonowych analogów z linkerem BAPA oraz GABA nie widać piku od protonu H8

m7-guaniny. Prawdopodobnie spowodowane jest to wymianą na deuter – proton ten jest lekko

kwaśny, w związku z czym, po pewnym czasie w wodzie ciężkiej, ulega on wymianie.

W widmie protonowym 2’-EACA-CO-m7GpppG (3a) w części obejmującej piki pochodzące

od protonów linkera multiplet o przesunięciu chemicznym 3,08 ppm pochodzi od protonów grupy

CH2. Według przewidywanego schematu rozszczepień powinien to być tryplet (sprzężenie z dwoma

równocennymi protonami grupy δCH2), jednak tak naprawdę protony przy kolejnych węglach linkera

są diastereotopowe (cząsteczka kapu jest chiralna). Jako, że protony od grupy CH2 znajdują się

najbliżej chiralnego centrum cząsteczki, to ma ono na nie największy wpływ, dlatego schematu

rozszczepienia nie da się tak łatwo przewidzieć. Zjawiska tego nie zaobserwowano w pozostałych

widmach.

Aby zidentyfikować miejsce przyłączenia linkera – reszta 2’/ 3’ rybozy, dla analogu kapu

zawierającego jako linker kwas 6-aminoheksanowy wykonano widma odprzęgania. Uprzednio

rozdzielono oba izomery na HPLC preparatywnym. Tzw. decoupling jest to metoda używana

w spektroskopii NMR, w której na próbkę działamy określoną częstością, aby wyeliminować efekt

sprzęgania pomiędzy określonymi jądrami.

Porównując widmo protonowe zarejestrowane normalnie oraz widmo z odprzęganiem

można określić, do której reszty rybozy przyłączony jest linker. Widma odprzęgania zostały

zarejestrowane dla analogów kapu z linkerem -aminokapronowym (EACA) a izomery zostały

rozdzielone za pomocą preparatywnej chromatografii HPLC. Co ciekawe, okazało się, że oczyszczone

produkty nie izomeryzują, a przynajmniej zjawisko to nie zostało zaobserwowane. Można to dosyć

łatwo wyjaśnić – aby zaszła izomeryzacja, musiałby powstać zatłoczony stan przejściowy

z czwartorzędowym atomem węgla, otoczonym przez cztery elektroujemne atomy (trzy tleny i azot).

Poniżej przedstawione jest widmo odprzęgania dla związku 3a, o krótszym czasie retencji

na HPLC. W ramkach ujęte są różnicujące fragmenty widma protonowego. Odprzęgnięty został

proton H2’ pochodzący od 7-metyloguanozyny, co oznacza, że zniknęły sprzężenia pomiędzy

protonami H1’m7G–H2’m7G oraz H2’m7G–H3’m7G. W ten sposób bardzo łatwo jest zidentyfikować

sygnały pochodzące od protonów H1’m7G, H2’m7G oraz H3’m7G. Pik przy δ=5,97 w widmie

29

protonowym był dubletem, teraz obserwowany jest singlet – oznacza to, że pochodzi on od protonu

H1’m7G. Tryplet pochodzący od H2’m7G zniknął, natomiast przy δ4,59 ppm zamiast trypletu widać

dublet – oznacza to, że sygnał ten pochodzi od protonu H3’m7G.

Rys. 4.6. Widmo decouplingu protonu H2’m7G od 2'-EACA-CO-m

7GpppG (3a).

Na przykładzie widma odprzęgania protonu H3’m7G dla związku 3b, łatwo jest zaobserwować

jakie przesunięcia chemiczne mają sygnały pochodzące od protonów H2’m7G oraz H3’m7G.

W widmie decouplingu pik pochodzący od protonu H3’m7G po prostu znika. Można również

zauważyć, że pik pochodzący od protonu H2’m7G jest częściowo zakryty przez sygnał wody i zmienia

swoją multipletowość (w widmie protonowym widać dwa piki, natomiast po odprzęganiu jeden).

Rys. 4.7. Widmo decouplingu protonu H3’m7G 3'-EACA-CO-m7GpppG (3b).

Wiadomo więc, że sygnał pochodzący od protonu przy atomie węgla, do którego przyłączony

jest linker, zostaje przeniesiony ku wyższym przesunięciom chemicznym. Dzięki temu można

rozpoznać, który izomer jest 2’, a który 3’. Można również rozróżnić protony grup 2’, 3’ guaniny

H2’m7G

H3’m7G

H1’m7G

H3’m7G

H2’m7G

30

od 7-metyloguaniny. Izomer 2’ ma krótszy czas retencji na HPLC, dzięki czemu wiadomo, że izomer 3’

jest bardziej preferowaną formą – w przypadku każdej syntezy, izomeru 3’ powstawało trochę więcej.

4.4. Podsumowanie

W ciągu pracy nad moim projektem licencjackim opracowano metodę wprowadzania linkera

w reszty 2’/ 3’-OH rybozy. Jako grupę aktywującą wybrano karbonyl, otrzymywany w wyniku reakcji

reszt 2’,3’-OH rybozy z karbonylodiimidazolem. Konieczne było więc zabezpieczenie fosforanu,

co osiągnięto przez wprowadzenie grupy cyjanoetylowej. Dobrano również odpowiednie warunki

zdejmowania zabezpieczenia z reszty fosforanowej, nie powodujące rozpadu wiązania między

węglem karbonylowym, a azotem z grupy aminowej linkera.

W rezultacie zsyntetyzowałam trzy analogi kapu zawierające linker w obrębie reszt rybozy

7-metyloguanozyny. Badania spektroskopowe potwierdziły strukturę otrzymanych przeze mnie

związków.

Rys. 4.8. Struktury otrzymanych analogów kapu.

W przyszłości mogą one posłużyć do badań nad procesami posttranslacyjnymi,

jak też do badania mechanizmów wchłaniania oraz translacji analogów kapu o znaczeniu

terapeutycznym. Mogą również być wykorzystane w diagnostyce nowotworów.

31

5. Część eksperymentalna

5.1. Informacje ogólne

Rozpuszczalniki

Do wszystkich eksperymentów używano wody miliporowej (MQ) dejonizowanej

za pomocą aparatury MiliQ Milipore. W syntezach wykorzystano handlowo dostępne rozpuszczalniki

o czystości cz.d.a. – DMF, DMSO, (CH3O)3PO i przechowywano je nad sitami molekularnymi 4Å.

Kolumnowa chromatografia jonowymienna

Chromatografię kolumnową przeprowadzono na złożu jonowymiennym DEAE-Sephadex A-25

w formie HCO3- (anionit). Do elucji stosowano liniowy gradient buforu wodorowęglanu

trietyloamoniowego w wodzie (TEAB, pH 7,8). Bufor otrzymywano przepuszczając gazowy CO2

przez roztwór wodny trietyloaminy, do uzyskania odpowiedniego pH. Zebrane frakcje badano

przez pomiar absorbancji przy 260 nm oraz RP HPLC. Frakcje zawierające oczyszczone związki

odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem z dodatkiem etanolu lub bezwodnego etanolu

w celu usunięcia buforu TEAB.

Wysokociśnieniowa chromatografia kolumnowa (HPLC)

Analityczna chromatografia HPLC, przeprowadzana była na kolumnie RP (z odwróconym

układem faz) Supelcosil LC-18-T RP column (wymiary kolumny: 4,6 x 250 mm, śr. 5μm;

przepływ 1,3 ml/min). Detekcja odbywała się przy pomocy detektora UV przy długości fali 260 nm

oraz detektora fluorescencyjnego (wzbudzenie falą o długości 280 nm, detekcja przy 370 nm).

Stosowano elucję gradientową przy użyciu dwóch układów: A – bufor 0,05 M CH3COONH4/CH3COOH

o pH 5,9; B – mieszaninę 1:1 (v/v) buforu A i metanolu. Rozdział prowadzono w liniowym gradiencie

buforu B w buforze A od 0 do 50% w czasie 15 minut.

Rozdział preparatywny prowadzono na kolumnie RP Discovery RP Amide C-16 (wymiary kolumny:

21.2 x 250 mm, śr. 5μm; przepływ 5,0 ml/min), wykorzystując bufor A (tak jak w przypadku

chromatografii analitycznej) oraz bufor C – 7:3 (v/v) buforu A oraz acetonitrylu. Zastosowano

gradient liniowy od 0 do 50% buforu C w 120 minut.

Spektrometria mas i NMR

Widma masowe otrzymanych związków zarejestrowane zostały na aparacie Micromass QToF

1 MS spectrometer, z jonizacją elektrosprej w trybie jonów ujemnych. Widma 1H NMR i 31P NMR

zarejestrowano przy pomocy aparatu Varian Inova 400 odpowiednio przy częstościach 399.94 MHz

i 161.90 MHz. Do rejestracji widm 1H NMR wykorzystano wzorzec wewnętrzny – TMSP

(2,2,3,3 – tetradeutero–3–(trimetylosililo)–propionian sodu), natomiast do widm 31P NMR

zastosowano wzorzec zewnętrzny – 85% roztwór kwasu ortofosforowego H3PO4 w D2O.

Z racji na niezbyt wysoką rozdzielczość zarejestrowanych widm, nie jesteśmy w stanie

zaobserwować multipletowości niektórych pików – zostały one oznaczone jako bs (ang. broad signal).

32

5.2. Syntezy chemiczne

5’-O-(β-cyjanoetylo)difosforan guanozyny (4)

Do zawiesiny 3,994 g (7,78 mmol) guanozyny w 60,0 ml DMF dodano 1,1 eqv. (8,55 mmol)

p-imidazolidu fosforanu β-cyjanoetylowego w formie soli trietyloamoniowej oraz 16 eqv.

(124,5 mmol) chlorku magnezu. Zawartość kolby mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego

przez około 5 godzin. Reakcję zakończono dodając 600 ml wody i rozdzielono za pomocą

chromatografii jonowymiennej (bufor: od 0 do 0,7 M TEAB).

Otrzymano 2,421 g (3,47 mmol) soli trietyloamoniowej 5’-O-(-cyjanoetylo)difosforanu guanozyny.

Wydajność całkowita 45%. RT 4,1 min, ESI M(-) m/z 495.

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(2-karboksyetylo)-karbamoilo-guanozyny (5)

W kolbie rozpuszczono 170,0 mg (0,244 mmol)cyjanoetylodifosforanu GDP (4) oraz 50 eqv. (12,2

mmol) karbonylodiimidazolu w 9,74 ml DMSO. Po 10 minutach, gdy całe GDP-ETCN przereagowało,

do mieszaniny reakcyjnej dodano 95 eqv. (23,1 mmol) wody w celu rozłożenia pozostałego CDI.

Następnie do kolby dodano równomolową mieszaninę (40 eqv.; 9,74 mmol) β-alaniny

oraz diazabicykloundecenu. Po 2 godzinach, gdy aminokwas przyłączył się do nukleotydu, kolbę

umieszczono na wyparce pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40oC aby zdjąć z fosforanu

zabezpieczenie cyjanoetylowe. Po 5 godzinach reakcję zakończono przez 10-krotne rozcieńczenie

wodą i wyekstrachowano octanem etylu, aby pozbyć się DBU. Pozostałości octanu etylu odpędzono

na wyparce. Mieszaninę poreakcyjną rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej

(bufor: od 0 do 1,1 M TEAB).

Otrzymano 150,9 mg (0,229 mmol) soli trietyloamoniowej 5’- difosforanu 2’-O/3’-O-

-(2-karboksyetylo)-karbamoilo-guanozyny (5). Wydajność całkowita 94%. RT1 5,9 min, RT

2 6,2 min,

ESI M(-) m/z 557.

33

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(2-karboksyetylo)-karbamoilo-7-metyloguanozyny (8)

(BAPA-CO-m7GDP)

Odparowane BAPA-CO-GDP (5) (150,9 mg; 0,229 mmol) zawieszono w 3,0 ml DMSO. Do roztworu

dodano 8 eqv. (1,83 mmol) jodku metylu i pozostawiono na 7 godzin mieszając na mieszadle

magnetycznym. W miarę zachodzenia reakcji roztwór zmieniał barwę z bezbarwnej na brązową

pod wpływem uwalniającego się jodu. W celu zakończenia reakcji mieszaninę rozcieńczono

10-krotnie wodą i wyekstrahowano eterem , w celu pozbycia się jodu z warstwy wodnej.

Resztek jodu pozbyto się przez dodanie odrobiny Na2S2O5. Pozostałości eteru odparowano



Otrzymano 69,6 mg (0,092 mmol) soli trietyloamoniowej 5’- difosforanu 2’-O/3’-O-(2-karboksyetylo)-

-karbamoilo-7-metyloguanozyny (8). Wydajność całkowita 40%. RT1 5,3 min, RT

2 5,5 min,

ESI M(-) m/z 571.

BAPA-CO-m7GpppG (1)

Do zawiesiny 69,6 mg (0,092 mmol) BAPA-CO-m7GDP (8) w 1,8 ml DMF dodano 1,25 eqv.

(0,115 mmol) p-imidazolidu (M=760,00 g/mol) oraz 16 eqv. (1,46 mmol) chlorku cynku. Zawartość

kolby mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego przez 2,5 godziny. Reakcję zakończono

roztworem EDTA/NaHCO3 w wodzie i rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej


Otrzymano 49,2 mg (0,048 mmol) soli trietyloamoniowej BAPA-CO-m7GpppG (1). Wydajność

całkowita 42%. RT1a 5,9 min, RT

1b 6,2 min, ESI M(-) m/z 916. 1H NMR (399,94 MHz, D2O, TMSP),

δ(ppm): 8,11 (nałożone s, 2H, 2H8G); 5,97 (d, 3J(H1’2’-BAPA-CO-m7G–H2’2’-BAPA-CO-m7G)=3,2 Hz, 1H, H1’2’-BAPA-

CO-m7G); 5,88 (d, 3J(H1’3’-BAPA-CO-m7G–H2’3’-BAPA-CO-m7G)=5,5 Hz, 1H, H1’3’-BAPA-CO-m7G); 5,79 (d, 3J(H1’G

–H2’G)=5,2 Hz, 2H, 2H1’G); 5,36 (dd, 3J(H1’2’-BAPA-CO-m7G–H2’2’-BAPA-CO-m7G)=3,2 Hz, 3J(H2’2’-BAPA-CO-m7G–H3’2’-

BAPA-CO-m7G)=5,0 Hz, 1H, H2’2’-BAPA-CO-m7G); 5,14 (dd, 3J(H2’3’-BAPA-CO-m7G–H3’3’-BAPA-CO-m7G)=4 Hz, 3J(H3’3’-BAPA-

34

CO-m7G–H4’3’-BAPA-CO-m7G)=4 Hz, 1H, H3’3’-BAPA-CO-m7G); 4,70 (dd, 3J(H1’3’-BAPA-CO-m7G–H2’3’-BAPA-CO-m7G)=5,5 Hz, 3J(H2’3’-BAPA-CO-m7G–H3’3’-BAPA-CO-m7G)=4 Hz, 1H, H2’3’-BAPA-CO-m7G); 4,60 (dd, 3J(H1’G–H2’G)=5,2 Hz, 3J(H2’G

–H3’G)=4,7 Hz, 2H, 2H2’G); 4,53 (dd, 3J(H2’2’-BAPA-CO-m7G–H3’2’-BAPA-CO-m7G)=5,0 Hz, 3J(H3’2’-BAPA-CO-m7G

–H4’2’-BAPA-CO-m7G)=6,2 Hz, 1H, H3’2’-BAPA-CO-m7G); 4,45-4,15 (m, 14H, 2H3’G, 2H4’BAPA-CO-m7G, 2H4’G,

4H5’BAPA-CO-m7G, 4H5’G); 4,04 (nałożone s, 6H, m7); 3,34 (nałożone t, 3J(αCH2– βCH2)=6,8 Hz, 3J(αCH2

– βCH2)=6,1 Hz, 4H, 2βCH2); 2,39 (nałożone t, 3J(αCH2– βCH2)=6,1 Hz, 3J(αCH2– βCH2)=6,8 Hz, 4H,

2αCH2); 31P NMR (161,90 MHz, D2O, H3PO4), δ(ppm): -11,12 (bs, 4P, 2Pα, 2Pγ); -22,76 (bs, 2P, 2Pβ).

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(3-karboksybutylo)-karbamoilo-guanozyny (6)

W kolbie rozpuszczono 59,5 mg (0,085 mmol) cyjanoetylodifosforanu GDP (4) oraz 50 eqv. (4,26

mmol) karbonylodiimidazolu w 3,41 ml DMSO. Po 20 minutach, gdy całe GDP-ETCN przereagowało,


Następnie do kolby dodano równomolową mieszaninę (40 eqv.; 3,41 mmol) kwasu

γ-aminomasłowego oraz diazabicykloundecenu. Po 4 godzinach, gdy aminokwas przyłączył się

do nukleotydu, kolbę umieszczono na wyparce pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40oC

aby zdjąć z fosforanu zabezpieczenie cyjanoetylowe. Dodano również kolejne 20 eqv. (1,70 mmol)

DBU. Po 7 godzinach reakcję zakończono przez 10-krotne rozcieńczenie wodą i wyekstrahowano

octanem etylu, aby pozbyć się DBU. Pozostałości octanu etylu odpędzono na wyparce. Mieszaninę

poreakcyjną rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej (bufor: od 0 do 1,1 M TEAB).


-(3-karboksybutylo)-karbamoilo-guanozyny (6). Wydajność całkowita 85%. RT1 6,1 min, RT

2 6,3 min,

ESI M(-) m/z 571.

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(3-karboksybutylo)-karbamoilo-7-metyloguanozyny (9)

(GABA-CO-m7GDP)

35

Odparowane GABA-CO-GDP (6) (52,5 mg; 0,073 mmol) zawieszono w 1,1 ml DMSO. Do roztworu

dodano 8 eqv. (0,582 mmol) jodku metylu i pozostawiono na 5 godzin mieszając na mieszadle

magnetycznym. W miarę zachodzenia reakcji roztwór zmieniał barwę z bezbarwnej na brązową

pod wpływem uwalniającego się jodu. W celu zakończenia reakcji mieszaninę rozcieńczono

10-krotnie wodą i wyekstrahowano eterem , w celu pozbycia się jodu z warstwy wodnej.

Resztek jodu pozbyto się przez dodanie odrobiny Na2S2O5. Pozostałości eteru odparowano





2 6,8 min,

ESI M(-) m/z 585.

GABA-CO-m7GpppG (2)

Do zawiesiny 17,9 mg (0,024 mmol) GABA-CO-m7GDP (9) w 1,8 ml DMF dodano 1,25 eqv.

(0,030 mmol) p-imidazolidu oraz 16 eqv. (0,390 mmol) chlorku cynku. Zawartość kolby mieszano

za pomocą mieszadła magnetycznego przez 3,5 godziny. Reakcję zakończono roztworem

EDTA/NaHCO3 w wodzie i rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej


Otrzymano 14,6 mg (0,014 mmol) soli trietyloamoniowej GABA-CO-m7GpppG (2). Wydajność

całkowita 47%. RT2a 7,2 min, RT

2b 7,4 min, ESI M(-) m/z 930. 1H NMR (399,94 MHz, D2O, TMSP),

δ(ppm): 9,07 (nałożone s, 2H, 2H8G); 5,98 (bs, 1H, H1’2’-GABA-CO-m7G); 5,90 (d, 3J(H1’3’-GABA-CO-m7G

–H2’3’-GABA-CO-m7G) =3,7 Hz, 1H, H1’3’-GABA-CO-m7G); 5,81 (d, 3J(H1’G–H2’G)=4,2 Hz, 2H, 2H1’G); 5,40 (bs, 1H,

H2’2’-GABA-CO-m7G); 5,17 (bs, 1H, H3’3’-GABA-CO-m7G); 4,74 (m, 1H, H2’3’-GABA-CO-m7G); 4,66 (nałożone t, 3J(H1’G

–H2’G)=4,7 Hz, 3J(H1’G–H2’G)=4,2 Hz, 2H, 2H2’G); 4,59 (dd, 3J(H2’2’-GABA-CO-m7G–H3’2’-GABA-CO-m7G)= 3J(H3’2’-

GABA-CO-m7G–H4’2’-GABA-CO-m7G)=4,2 Hz, 1H, H3’2’-GABA-CO-m7G); 4,55-4,17 (m, 14H, 2H3’G, 2H4’GABA-CO-m7G,

2H4’G, 4H5’GABA-CO-m7G, 4H5’G); 4,08 ( nałożone s, 6H, m7);3,14 (m, częściowo nakłada się z sygnałem

TEA-CH2, 4H, 2γCH2); 2,36 (nałożone t, 3J=7 Hz, 3J=7,5 Hz, 4H, 2αCH2); 1,78 (m, 4H, 2βCH2); 31P NMR

(161,90 MHz, D2O, H3PO4), δ(ppm): -10,68 (nałożone d, J(Pα–Pβ)= J(Pβ–Pγ)=19,5 Hz, 4P, 2Pα, 2Pγ);

-22,29 (dd, 2P, 2Pβ).

36

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(6-karboksyheksylo)-karbamoilo-guanozyny (7)

W kolbie rozpuszczono 68,0 mg (0,097 mmol) cyjanoetylodifosforanu GDP oraz 50 eqv. (4,87 mmol)

karbonylodiimidazolu w 3,89 ml DMSO. Po 10 minutach, gdy całe GDP-ETCN przereagowało,


Następnie do kolby dodano równomolową mieszaninę (40 eqv.; 3,90 mmol) kwasu

-aminokapronowego oraz DBU. Po 2 godzinach, gdy aminokwas nie przyłączał się do nukleotydu,

kolbę umieszczono na wyparce pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40oC. Po 7 godzinach

reakcję zakończono przez 10-krotne rozcieńczenie wodą i wyekstrahowano octanem etylu,

aby pozbyć się DBU. Pozostałości octanu etylu odpędzono na wyparce. Mieszaninę poreakcyjną

rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej (bufor: od 0 do 1,1 M TEAB).


-(6-karboksyheksylo)-karbamoilo-guanozyny (7). Wydajność całkowita 65%. RT1 10,1 min,

RT2 10,6 min, ESI M(-) m/z 599.

5’-difosforan 2’-O/3’-O-(2-karboksyheksylo)-karbamoilo-7-metyloguanozyny (10)

(EACA-CO-m7GDP)

Odparowane EACA-CO-GDP (7) (47,3 mg; 0,063 mmol) zawieszono w 0,94 ml DMSO. Do roztworu

dodano 8 eqv. (0,506 mmol) jodku metylu i pozostawiono na 3,5 godziny mieszając

na mieszadle magnetycznym. W celu zakończenia reakcji mieszaninę rozcieńczono 10-krotnie wodą

i wyekstrahowano eterem , w celu pozbycia się jodu z warstwy wodnej. Resztek jodu pozbyto się

przez dodanie odrobiny Na2S2O5. Pozostałości eteru odparowano na wyparce. Mieszaninę

poreakcyjną rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej (bufor: od 0 do 0,9 M TEAB).



2 11,7 min,

ESI M(-) m/z 613.

37

EACA-CO-m7GpppG (3)

Do zawiesiny 10,6 mg (0,014 mmol) EACA-CO-m7GDP (10) w 0,83 ml DMF dodano 1,25 eqv.

(0,017 mmol) p-imidazolidu oraz 16 eqv. (0,222 mmol) chlorku cynku. Zawartość kolby mieszano

za pomocą mieszadła magnetycznego przez 5 godzin. Reakcję zakończono roztworem EDTA/NaHCO3

w wodzie i rozdzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej (bufor: od 0 do 1,2 M TEAB).

Otrzymano 16,3 mg (0,014 mmol) zanieczyszczonej soli trietyloamoniowej EACA-CO-m7GpppG (3).

Wydajność całkowita 78%. RT3a 15,6 min, RT

3b 16,3 min, ESI M(-) m/z 958.

Produkt oczyszczono za pomocą preparatywnego HPLC. Frakcje zawierające te same izomery

połączono, odparowano bufor i zliofilizowano. Otrzymano 4,9 mg (0,0046 mmol) izomeru 2’ oraz

3,4 mg (0,0032 mmol) izomeru 3’. Wydajności całkowite syntezy wyniosły odpowiednio 33 % i 23 %.

2’-EACA-CO-m7GpppG (3a): RT(HPLC RP) 15,6 min, RT

(HPLC prep.) 53,7 min, 1H NMR (399,94 MHz, D2O,

TMSP), δ(ppm): 9,04 (s, 1H, H8EACA-CO-m7G); 8,01 (s, 1H, H8G); 5,98 (d, 3J(H1’EACA-CO-m7G–H2’EACA-CO-m7G)=3

Hz, 1H, H1’EACA-CO-m7G); 5,79 (d, 3J(H1’G–H2’G)=5,8 Hz, 1H, H1’G); 5,38 (dd, 3J(H1’EACA-CO-m7G–H2’EACA-CO-

m7G)=3 Hz, 3J(H2’EACA-CO-m7G–H3’EACA-CO-m7G)=5,4 Hz, 1H, H2’EACA-CO-m7G); 4,67 (dd, 3J(H1’G–H2’G)=5,8 Hz, 3J(H2’G–H3’G)=5,3 Hz, 1H, H2’G); 4,59 (dd, 3J(H2’EACA-CO-m7G–H3’EACA-CO-m7G)=5,4 Hz, 3J(H3’EACA-CO-m7G

–H4’EACA-CO-m7G)=5,2 Hz, 1H, H3’EACA-CO-m7G); 4,47 (dd, 3J(H2’G–H3’G)=5,3 Hz, 3J(H3’G–H4’G)=3,3 Hz, 1H,

H3’G); 4,44-4,20 (m, 6H, H4’EACA-CO-m7G, H4’G, 2H5’EACA-CO-m7G, 2H5’G); 4,07 (s, 3H, m7); 3,08 (m, 2H,

CH2); 2,26 (t, 3J(αCH2–βCH2)=7,5 Hz, 2H, αCH2); 1,57 (tt, 3J(δCH2–CH2)=7,5 Hz, 3J(γCH2–δCH2)=7,5 Hz,

2H, δCH2); 1,46 (tt, 3J(αCH2–βCH2)=7,5 Hz, 3J(βCH2–γCH2)=6,8 Hz, 2H, βCH2); 1,31 (tt, 3J(γCH2

–δCH2)=7,5 Hz, 3J(βCH2–γCH2)=6,8 Hz, 2H, γCH2); 31P NMR (161,90 MHz, D2O, H3PO4), δ(ppm):

-10,72 (nałożone d, 2P, Pα, Pγ); -22,29 (dd, 1P, Pβ).

3’-EACA-CO-m7GpppG (3b): RT(HPLC RP) 15,6 min, RT

(HPLC prep.) 56,0 min, 1H NMR (399,94 MHz, D2O,

TMSP), δ(ppm): 9,08 (s, 1H, H8EACA-CO-m7G); 7,98 (s, 1H, H8G); 5,90 (d, 3J(H1’EACA-CO-m7G–H2’EACA-CO-

m7G)=5,5 Hz, 1H, H1’EACA-CO-m7G); 5,78 (d, 3J(H1’G–H2’G)=5,7 Hz, 1H, H1’G); 5,17 (dd, 3J(H2’EACA-CO-m7G

–H3’EACA-CO-m7G)=5,2 Hz, 3J(H3’EACA-CO-m7G–H4’EACA-CO-m7G)=4,3 Hz, 1H, H3’EACA-CO-m7G); 4,73 (dd, 3J(H1’EACA-CO-

m7G–H2’EACA-CO-m7G)=5,5 Hz, 3J(H2’EACA-CO-m7G–H3’EACA-CO-m7G)=5,2 Hz, 1H, H2’EACA-CO-m7G); 4,66 (dd, 3J(H1’G

–H2’G)=5,7 Hz, 3J(H2’G–H3’G)=5,5 Hz, 1H, H2’G); 4,45 (dd, 3J(H2’G–H3’G)=5,5 Hz, 3J(H3’G–H4’G)=3,4 Hz,

1H, H3’G); 4,40- 4,18 (m, 6H, H4’EACA-CO-m7G, H4’G, 2H5’EACA-CO-m7G, 2H5’G); 4,08 (s, 3H, m7); 3,13

(t, 3J(δCH2–CH2)=6,6 Hz, 2H, CH2); 2,29 (t, 3J(αCH2–βCH2)=7,3 Hz, 2H, αCH2); 1,59 (tt, 3J(δCH2

–CH2)=6,6 Hz, 3J(γCH2–δCH2)=7,5 Hz, 2H, δCH2); 1,52 (tt, 3J(αCH2–βCH2)=7,3 Hz, 3J(βCH2

–γCH2)=7,0 Hz, 2H, βCH2); 1,35 (tt, 3J(γCH2–δCH2)=7,5 Hz, 3J(βCH2–γCH2)=7,0 Hz, 2H, γCH2); 31P NMR

(161,90 MHz, D2O, H3PO4), δ(ppm): -10,65 (nałożone d, J(Pα–Pβ)= J(Pβ–Pγ)=18,1 Hz, 2P, Pα, Pγ);

-22,27 (dd, 1P, Pβ)

38

5.3. Uzupełnienie

5.3.1. BAPA-CO-m7GpppG

40

5.3.2. GABA-CO-m7GpppG

42

5.3.3. EACA-CO-m7GpppG

45

Bibliografia

1. Lodish H. Berk, Zipursky S.L, Metsudaira P, Baltimore, Darnell J; Molecular Cell Biology,

4th edition. New York: W. H. Freeman (2000).

2. Shatkin AJ; mRNA cap binding proteins: essential factors for initiating trnslation; Cell, 40, 223-234,

(1985).

3. Mathonnet G, Fabian M.R, Svitkin Y.V, Parsyan A, Huck L, Jaramillo M, Murata T, Biffo S, Merrick

W.C, Darzynkiewicz E, Pillai R.S, Filipowicz W, Duchaine T.F, Sonenberg N; microRNA function

in vitro: inhibition of translational initiation by targeting eIF4F; Science, 317, 1764-1767 (2007).

4. Darnbrough C, Legon S, Hunt T, Jackson RJ; Initiation of protein synthesis: evidence

for messenger RNA-independent binding of methionyl-transfer RNA to the 40 S ribosomal

subunit.; J Mol Biol., 76, 379-403 (1973).

5. Coller J, Parker R, Annu. Rev. Biochem., 73, 861-890 (2004).

6. Parker R, Sheth U; P Bodies and the Control of mRNA Translation and Degradation; Mol.Cell., 25,

635–646 (2007).

7. Sachs AB; Messenger RNA degradation in eukaryotes; Cell, 74, 413-421 (1993).

8. Parker R, Song H; The enzymes and control of eukaryotic mRNA turnover; Nat Struct Mol Biol., 11,

121-127 (2004).

9. Couttet P, Fromont-Racine M, Steel D, Pictet R, Grange T; Messenger RNA deadenylylation

precedes decapping in mammalian cells; Proc Natl Acad Sci U S A., 94, 5628-5633 (1997).

10. Muhlrad D, Decker CJ, Parker R; Turnover mechanisms of the stable yeast PGK1 mRNA;

Mol Cell Biol., 15, 2145-2156 (1995).

11. Liu H, Rodgers ND, Jiao X, Kiledjian M; The scavenger mRNA decapping enzyme DcpS is a member

of the HIT family of pyrophosphatases; EMBO J., 21, 4699-4708 (2002).

12. Nishimura Y, Takahashi S.I, Yamamoto T, Tsuboi M, Hattori M, Miura K.I, Yamaguchi K, Ohtani S,

Hata T; On the base-stacking in the S'-terminal cap structure of mRNA: a fluorescence study;

Nucl. Acids Res., 8, 1107-1119 (1980).

13. Kałek M, Jemielity J, Darzynkiewicz Z.M, Bojarska E, Stępiński J, Stolarski R, Davis RE,

Darzynkiewicz E; Enzymatically stable 5' mRNA cap analogs: synthesis and binding studies with

human DcpS decapping enzyme; Bioorg Med Chem., 14, 3223-3230 (2006).

14. Hodel A.E, Gershon P.D, Shi X, Wang S.M, Quiocho F.A; Specific protein recognition of an mRNA

cap through its alkylated base; Nat. Struct. Biol., 4, 350-354 (1997).

15. Visa N, Izaurralde E, Ferreira J, Daneholt B, Mattaj I.W; A nuclear cap-binding complex binds

Balbiani ring pre-mRNA cotranscriptionally and accompanies the ribonucleoprotein particle during

nuclear export; J Cell Biol., 133, 5-14 (1996).

16. Kozak M; Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes; Gene, 234, 187-208 (1999).

46

17. Niedźwiecka A, Marcotrigiano J, Stępiński J., Jankowska-Anyszka M, Wysłouch-Cieszyńska A,

Dadlez M, Gingras A.C, Mak P, Darżynkiewicz P, Sonenberg N, Burley S.K, Stolarski R;

Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein: recognition of mRNA 5' cap structure

and synthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins; J. Mol. Biol., 319, 615-635 (2002).

18. Herbert T.P, Fshraeus, Prescott A, Lane D.P, Proud C.G; Rapid induction of apoptosis mediated

by peptides that bind initiation factor eIF4E; Curr. Biol., 10, 793 (2000).

19. Moerke N.J, Aktas H, Chen H, Cantel S, Reibarkh M.Y, Fahmy A, Gross J.A, Degterev A, Yuan J,

Chorev M; Small-molecule inhibition of the interaction between the translation initiation factors

eIF4E and eIF4G; Cell, 28, 257 (2007).

20. Mikkola S, Salomaki S, Zhang Z, Maki E, Lonnberg H; Preparation and properties of mRNA 5 '-cap

structure; Curr. Org. Chem., 9, 999-1022 (2005).

21. Żuberek J, Jemielity J, Jabłonowska A, Stępiński J, Dadlez M, Stolarski R, Darzynkiewicz E; Influence

of electric charge variation at residues 209 and 159 on the interaction of eIF4E with the mRNA

5' terminus; Biochemistry, 43, 5370-5379 (2004).

22. Jemielity J, Fowler T, Żuberek J, Stępiński J, Lewdorowicz M, Niedźwiecka A, Stolarski R,

Darzynkiewicz E, Rhoads R.E; Novel 'anti-reverse' cap analogues with superior translational

properties RNA; RNA, 9, 1108 (2003).

23. Mitchell D.A, Nair S.K; RNA transfected dendritic cells as cancer vaccines; Curr. Opin. Mol. Ther., 2,

176-181 (2000).

24. Yamamoto A, Kormann M, Rosenecker J, Rudolph C; Eur. J. Pharm. Biopharm., 71, 484-489 (2009)

25. Kowalska J, Lewdorowicz M, Żuberek J, Grudzień-Nogalska E, Bojarska E, Stępiński J, Rhoads R.E,

Darzynkiewicz E, Davis R.E, Jemielity J; RNA, 14, 1119-1132 (2008).

26. Mitchell D. A, Nair S. K; RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy; J. Clin Invest., 9,

1065-1069 (2000).

27. Kuhn A.N, Diken M, Kreiter S, Selmi A, Kowalska J, Jemielity J, Darzynkiewicz E, Huber C, Tureci O,

Sahin U; Phosphorothioate cap analogs increase stability and translational efficiency of RNA

vaccines in immature dendritic cells and induce superior immune responses in vivo; Gene

Therapy, 17, 961-971 (2010).

28. Kadokura M, Wada T, Urashima C, Sekine M; Efficient synthesis of gamma-methyl-capped

guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate

bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst

in DMF under anhydrous co; Tet. Lett., 38, 8359-8362 (1997).

29. Hoard D.E, Ott D.G; Conversion of Mono- and Oligodeoxyribonucleotides to 5'-Triphosphates;

J. Am. Chem. Soc., 87, 1785–1788 (1965).

30. Mukaiyama T, Hashimoto M; Synthesis of oligothymidylates and nucleoside cyclic phosphates

by oxidation-reduction condensation; J. Am. Soc., 94, 8528-8532 (1972).

Uniwersytet Warszawski - ichf.edu.plichf.edu.pl/Praca_W3_Zofia_Tomasiewicz.pdf · Dzięki temu, nie...

Documents

Transcript of Uniwersytet Warszawski - ichf.edu.plichf.edu.pl/Praca_W3_Zofia_Tomasiewicz.pdf · Dzięki temu, nie...