Caracterlzaclon por RAPD de tres variedades de tabaco(Nicotiana tabacum L.) obtenidas por cultivo de anteras in vitro

Molecular characterization of three anther tissue culturevarieties of tobaco (Nicotiana tabacum L.) using RAPD analysis.

Gloria Azucena Fernandez B.-, Lucia Aieneoot", Nicolas Jeremitto'", EdnaMarquez", Jose D. Tinoco', Sergio Orduz "".

RESUMEN

El analisis de arnplificacion al azar de fragmentos polim6rficos de AON (RAPD) fue usa do para caracterizar dosnuevas variedades de tabaco tipo Flue Cured y otra de tabaco negro derivadas por la tecnica del cultivo de anterasin vitro. Los RAPO son propuestos como un cornplemento apropiado de las caracterfsticas morfoagron6micas parallenar los requisitos de los estandares internacionales para el registro de sernillas, establecidos para la identificacionde variedades de tabaco. La identificaci6n de tres variedades de tabaco y sus progenitores fue realizada usando elanalisis RAPO con 64 iniciadores, Un numero de 214 productos polim6rficos fueron amplificados desde 14 inicia-dores. El analisis estadfstico realizado con el programa NTSYS, version 1.2, usando el coeficiente de similitud deJaccard. La inspeccion visual revel6 que cinco iniciadores permitieron la separaci6n de las variedades en dos gru-pos, de acuerdo con el tipo de tabaco: los Virginia (Flue Cured) y los Negros, mientras que un grupo de nueveiniciadores separ6 cada varied ad y establecio las relaciones geneticas con sus progenitores. Los resultados obteni-dos muestran que esta tecnica es apropiada para establecer diferencias geneticas entre las variedades de tabaco.

Palabras clave: tabaco, Nicotiana tabacum L, RAPO - PCR, ADN, mejoramiento, variedades

ABSTRACT

Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPO) analysis was used to characterize two new Flue Cured and oneblack tobacco type varieties derived from in vitro anther tissue culture technique. RAPOs are proposed as anappropriate complement of the morphoagronomic characteristics evaluations to fulfil international seed registrationstandards established for the identification of tobacco varieties. The identification of three tobacco varieties andtheir parents was carried out using the RAPO analysis with 64 random primers. Polymorphic products, 214 innumber, were amplified only from 14 primers. Statistical analysis realized with the NTSYS program version 1.2using the Jaccard similarity coefficient. The visual inspection revealed that five primers allowed the separation ofthe varieties in two groups, according to the type of tobacco: the Flue Cured and Black; while a group of nineprimers separates each variety and establish its genetic relationship with their parents. The results obtained showthat this technique is appropiated to establish genetic differences between tobacco varieties.

Key words: Tobacco, Nicotiana iabacum L, RAPO - PCR, ADN, breeding, varieties.

INTRODUCCION

EI tabaco es un cultivo agron6micamente impor-tante en Colombia. La superficie total dedicada asu cultivo es de aproximadamente 14.500 hecta-

reas y la producci6n total es de 30'000.000 de ki-logramos. Tanto el mercadeo del tabaco como lamanufactura de cigarrillos tiene altas exigencias

* Centro de Investigaci6n y Desarrollo Tecnol6gico, ClOT, Cornpanla Colombian a de Tabaco - Coltabaco. A.A. 828 Medellin.autor para correspondencia. e-mail: cidt.biotec@coltabaco.com.co** Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Medellin.*** Instituto de Biologia, Universidad de Antioquia, Medellin.**** Corporaci6n para Investigaciones BioI6gicas-CIB.

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de calidad y productividad; por esto la Cornparua Co-lombiana de Tabaco, Coltabaco, ha creado algunasvariedades con el fin de incrementar el rendimiento,la calidad tlsica, quimica y resistencia qenetica a losprincipales patoqenos de las zonas de produccion.Asi mismo, produce semilla certificada de optimacalidad bioloqica y qenetica de las diferentes varie-dades, que permiten a los agricultores obtener unamayor produccion a un bajo costa economico y am-biental y, por ende, satisfacer los requerimientos delmercado nacional e internacional.

Se han obtenido tres variedades todas con re-sistencia a rnuitiples enfermedades por la tecnica delcultivo de anteras in vitro, invirtiendo solo la mitad deltiempo requerido que en un programa de mejoramientotradicional. Dichas variedades son: COLTABACO 1-A® tabaco Negro tipo Garcia de curado al aire, TRC1-96@ Y TRC 2-99 (en proceso de registro ante elICA) son tabaco tipo Virginia - Flue Cured, curado enatmosfera artificial. De las tres se tiene la caracteriza-cion mortoaqronornica, analisis de la cornposicion qui-mica de su hoja curada, evaluaciones regionales derendimiento, calidad de rnaduracion, analisis econo-mico y evaluaciones de resistencia a enfermedadescomo al Virus Mosaico del Tabaco (TMV), al hongoPhytophthora parasitica var. nicotianae, al nematodeMeloidogyne incognita razas 1 y 3, Y a Alternaria posalternata (Tinoco y Fernandez, 1995; 1999).

La obtencion de las nuevas variedades vegeta-les requiere alta inversion en terrninos de conocimien-to, mana de obra, recursos materiales, dinero y tiem-po; por ello en la mayo ria de los palses del mundo,adernas de la caracterizacion rnortoaqronomica, sehan propuesto para su proteccion los marcadoresmoleculares 0 huellas qeneticas, mas cornunmenteconocidas como fingerprinting de las plantas.

Es asi como los marcadores basados en ADNpermiten la comparacion directa del material geneticode dos plantas individuales, evitando las influenciasambientales en la expresion de los genes. Los marca-dores propuestos por Smith y Smith (1991) para la ca-racterizacion molecular de las variedades vegetales fue-ron: polimorfismos en la longitud fragmentos derestriccion del ADN (RFLP) Y tecnicas basad as en lareaccion en cadena de la polimerasa (PCR), siendo lasmas reconocidas: arnplificacion al azar de fragmentospolirnorficos de ADN (RAPD), polimorfismos en la lon-gitud de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismos

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en el nurnero variable de secuencias repetidas (VNTR),anal isis de minisatehtes y analisis de rnicrosatelites(STR), siendo cualquiera de ellos valido si los resulta-dos son reproducibles.

Dentro de estas tecnicas, los RAPD han side am-plia y exitosamente utilizados en diferentes especiesvegetales (Yang y Quiros, 1993; Hu y Quiroz, 1991).Con ellos se han generado dendrogramas en la ca-racterizacion para accesiones de cultivares especifi-cos de Coftea (Orozco y Castillo et al., 1994),Theobroma (Wilde et al., 1992), Solanum (Demeckeet al., 1993), Allium (Wilkie et al., 1993), (Dweikat etal., 1993), Triticum (He et al., 1992; Chandrasekar etal., 1993; Joshi y Ngugen, 1993), Malus (Koller et al.,1993; Mulcahy et al., 1993), Ipomoea batatas (Sagredoet al., 1998), Cucumis (Garcia et al., 1998), Passifloras(Fajardo et al., 1998), Camellia sinensis (Wachira etal., 1995), Lycopersicon (Grandillo y Tanksley, 1996),Manihot esculenta (Colombo et al., 1998, 2000).

Los RAPD tarnbien han side ampliamente utili-zados para la ident'ficacion de hibridos sornaticosinterespecificos e intraespecificos en Nicotianatabacum y N. rustics L. y para la identiticacion y ca-racterizacion de variedades de N. tabacum, en la quese ha detectado polimorfismo intervarietal (Coussirat,1993,1994; Filippis etal., 1996; Yi, 1997; Yu, 1997;Rossi et al., 1999; Del Piano et al., 2000).

Los RAPD son marcadores dominantes y sumi-nistran informacion simuttanea sobre varios loci. Latecnica es altamente confiable en el rastreo de hue-lias qeneticas de variedades (Ragot y Hoisington,1993; Staub et al., 1996); ofrece ventajas en veloci-dad y simplicidad, precisa menos tiempo que otrastecnicas, el proceso de extraccion del ADN es massimple y requiere cantidades muy pequefias de ma-terial vegetal. Adernas, es apropiada para la caracte-rizacion qenetica cuando el tarnario de la muestra espequerio (Ragot y Hoisington, 1993; Staub y Serquen,1996), permitiendo determinar el grado de parentes-co entre las variedades.

Por 10 anterior, y dadas las necesidades deColtabaco, en esta investiqacion se utilize la tecnicaRAPD-PCR para caracterizar molecularmente lasvariedades y sus progenitores, y de esta manera es-tablecer las diferencias qeneticas entre elias. Talesdiferencias perrnitiran identificar las semillas certifi-cadas de tabaco, con fines de exportacion.

CARACTERIZACION POR RAPD DE TRES VARIEDADES DE TABACO OBTENIDAS POR CULTIVO DE ANTERAS IN VITRO

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal: Se utilizaron siete variedades detabaco, tres obtenidas por cultivo de anteras in vitroy los cuatro progenitores: la variedad COLTABACO1 - A® (tipo de tabaco negro) cuyos progenitores son:Coltabaco 23RM (C23RM) (tabaco negro tipo Garda),progenitor femenino donante de adaptabilidad, ren-dimiento y resistencia a TMV; Speight 28 (SPG - 28)(tabaco tipo Flue Cured) progenitor masculino del pri-mer cruce, donante de resistencia a Alternaria,Phytophthora parasftica, Ralstonia y Meloidogyneincognita e ICA Guane ( ICAG) (tabaco negro tipoGarda) que en la generaci6n F2actu6 como progeni-tor masculino donante de la caracterfstica morfol6gicaancho de la hoja y mejoramiento de la calidad. Lasdos variedades hermanas, TRC 1 - 96® Y TRC 2 -99, cuyos progenitores fueron NC 567 (tabaco tipoFlue Cured) progenitor masculino donante de resis-tencia a TMV y Meloidogyne incognita y SPG - 28(tabaco tipo Flue Cured) progenitor femenino donan-te de rendimiento y calidad, adem as de aportar re-sistencia a Alternaria pos alternata y a Meloidogyneincognita SPG - 28 se utiliz6 tanto para la obtenci6nde la varied ad Coltabaco 1 - A como para obtenerTRC 1 - 96 Y TRC 2 - 99; es un progenitor comunpara las tres variedades.

Extracci6n de ADN: Se utiliz6 el metodo de Dellaporta(1983) partiendo de 0,8 gramos de hojas j6venes ma-ceradas con nitr6geno Ifquido. EI ADN fue cuantificadopor espectrofotometrfa a 260 y 280 nm en unespectrofot6metro GENESIS 5.1®, encontrandose unrendimiento entre 70,30 hasta 94,69 IJg de ADN porgramos de hoja fresca procesada por muestra. La inte-gridad del ADN fue verificada por electroforesis en gelde agarosa al 0,8% (Seakelme).

peR: Se realiz6 con el protocolo utilizado por Coussirat(1994), modificando la concentraci6n de MgCI2 a 2,0mM, dNTP a 0,1 mM y la concentraci6n de ADN a 20ng, en un volumen final de 25 Ill. Se evaluaron 64 ini-ciadores RAPD de 10 mer cad a uno (OperonTechnology), correspondientes a los Kits: OPI (1 a 20),OPB: (1 a 20), OPM: (1 a 20) y los iniciadores indivi-duales OPC-07, OPD-14, OPE-17, OPH- 06.

Las amplificaciones se realizaron en untermociclador MJ RESEARCH modele PTC 20, pro-gramado a 45 ciclos: 94°C por 12 min, 94°C par 0,5min, 36°C por 1,0 min, zz-c por 1,0 min, zz-c por 10min, con incrementos de 1°C cada tres segundos,

dejando finalmente a 4°C. Los productos de amplifi-caci6n fueron separados en gel de agarosa al 1,5% a5 V/crn par dos horas y las bandas de ADN visualizadascon Bromuro de Etidio. Se utiliz6 un marcador de pesomolecular de 100 pb (Operon Technology).

Disefio experimental: De cada variedad se analiza-ron diez individuos. No se observ6 polimorfismointravarietal para ninguno de los primers evaluados.Esto permiti6 hacer mezclas del ADN de diez indivi-duos par variedad, los cuales se evaluaron con losiniciadores y condiciones de amplificaci6n anteriormen-te mencionados. Cada ensayo fue repetido dos vecescon iguales resultados.

Anallsls de datos: Se hizo una inspecci6n visual delos productos de amplificaci6n para determinar el per-fil qenetico de cada variedad. Para ello se registr6 elnurnero promedio de bandas electrotoreticas por ini-ciador por variedad, se cuantific6 el nurnero degenotipos multiloeus diferentes por variedad y se cal-cul6 la frecuencia de cada banda de electroforesis porvariedad. Esto permiti6 identificar los iniciadores quegeneraron polimorfismos propios a cada una de lassiete variedades. De tal manera, el perfil polim6rficounico de cada variedad permiti6 la identificaci6n sinambigOedades de las variedades y sus progenitores.

Con el objetivo de verificar las relaciones de pa-rentesco, se comput6 una matriz de presencia (1) yau-sencia de bandas (0), considerando s610los iniciadoresque generaron polimorfismos propios a cada variedad(Hadrys et al., 1992; Garda et al., 1998; Coussirat, 1994).Dentro de estos iniciadores se registraron las bandasgeneradas tanto por los fragmentos monom6rficos comopor los polim6rficos. Tal matriz binaria se utiliz6 paracalcular coeficientes de similitud de Jaccard (Crisci,1983), generando una nueva matriz de distanciasqeneticas entre cada par de variedades. A partir de lamatriz de distancias se construyeron arboles teneticosmediante el metoda de agrupaci6n por pares, utilizandolos promedios aritrneticos no ponderados (UPGMA) conel programa NTSYS pc versi6n 2.0.

RESULTADOS Y DISCUSION

Evaluaci6n de iniciadores: De los 64 iniciadoresevaluados, 14 de ellos amplificaron polimorfismos(21,88%), 17 no amplificaron (26,56°io) y 33 ampli-ficaron fragmentos monom6rficos (51,56%). Conlos 47 iniciadores que amplificaron se obtuvieron

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526 bandas, de las cuales 214 fueron poli-rnorficas y 312 rnonornorticas. Las band aspolimorficas por iniciador variaron desde2 a 24, con una media de 7,8 bandas, lascuales generaron un polimorfismo de20,34% entre las siete variedades. Talespolimorfismos permitieron identificar y di-ferenciar las siete variedades en estudio.

EI porcentaje de polimorfismos observa-do es cinco veces mayor que el obtenido porCoussirat (1994), quien obtuvo solo un 4,7%,el cual no Ie perrnitio c1asificara nivel de varie-dad. De igual manera, Del Piano et al., (2000)y Rossi et al., (1999) observaron muy pocavariabilidad qenetica al comparar por estametodologfa 36 y 19 variedades de tabaco,respectivamente. La diferencia puede deber-se a que el material utilizado en el presenteestudio posiblemente tenga una base qenencamas amplia, ya que las variedades C23RM eICAGUANE tienen al menos un progenitor co-rrespondiente a ecotipos nativos. Adi-cionalmente, los iniciadores aquf utilizados ylas variedades son diferentes a los emplea-dos por los auto res mencionados; solo dos ini-ciadores fueron comunes con los de Coussirat.

Polimorfismo para tipos de tabacoDe 64 iniciadores, con 14 que presentaronpolimorfismo, al evaluar las mezclas de ADNde diez individuos por variedad se detecto ungrupo de cinco (OPB 04, OPC 07, OP111, OPI17 YOPM 13), los cuales permitieron diferen-ciar las variedades por tipo de tabaco, sepa-rando las tres de tabaco Negro tipo Garda delas cuatro tipo Flue Cured (vease tabla 1).

Tabla 1. Secuencias de los cinco iniciadores que amplificaronfragmentos de ADN polim6rficos para tipo de tabaco y promedio

de bandas electrotoreticas generadas por iniciador.

Inieiadores polimorfieos para difereneiartipos de tabaeo Negro y Flue Cured

Inieiador Seeueneia Promedio bandasOPB 04 GGACTGGAGT 2OPC07 GTCCCGACGA 4OPI 11 ACATGCCGTG 6OPI 17 GGTGGTGATG 5OPM13 GGTGGTCAAG 9

INICIADOR OPI17

C23 ICAG CIA SP28 TRCI TRC2 NC567 M

ISOO

5(10

1000

TABACOS NEGROS TABACOS FLUE CURED

INICIADOR OPC 07

M C23RM ICAG CIA SP28 TRCI TRC2 NC567

1500

TABACOS FLUE CUREDTABACOS NEGROS

En la figura 1 se presentan los perfi-les RAPD generados por estos cinco ini-ciadores para las variedades de tabaco.EI iniciador OPI 17 genera una banda de500 pares de bases (pb) presente unica-mente en las tres variedades de tabaco detabaco negro tipo Garcfa: C23RM,ICAGUANE, COLTABACO 1- A Y ausenteen las Flue Cured (Virginia); el OPI 11 con unabanda de 550 pb, presente solo en los cuatro FlueCured: SPG 28, TRC 1-96, TRC 2-99 Y NC 567; elOPB 04 genera una unica banda de 500 pares debases para los negros tipo Garda y para los Virgi-nia, otra unica banda de 680 pb. EI iniciador OPC

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Figura 1. RAPD generados con los iniciadores OPI 17 Y OPC 07 corridoscon una mezcla de ADN de diez individuos por cad a variedad. Las flechasmuestran los fragmentos polim6rficos entre los tipos de tabaco. M = Marcador100 pb. En los carriles 1, 2 Y 3, las variedades C23RM, ICAGUANE,COLTABACO 1- A (tabacos negros) yen los carriles 4, 5, 6 Y7, las variedadesSPG 28, TRC 1-96, TRC 2-99 Y NC 567 Tabacos Flue Cured.

07 genera una banda de 650 pares de bases queesta presente solo en tabacos Virginia, el resto debandas con cada uno de estos iniciadores es igualpara todos los tipos de tabaco.

CARACTERIZACIONPORRAPDDETRESVARIEDADESDETABACOOBTENIDASPORCULTIVODEANTERASIN VITRO

II C23RM

rli ICAGUANE

r~~l~ COLTABACO I-A

~~l~

111111SI'EIGHT28

111:11TRC 1-96, TRC 2 -99

II ~I~E:~gt

li;ll~ NC 567

f"·-r-T- r'-ij--T'"'"'l '--11.' r----r0,80 0,85 0,90 0,95 1,00

Figura 2. Dendrograma que ilustra las distancias geneticas entre lasvariedades de tabaco tipo Negro Garcia y las variedades Flue cured; hayseparaci6n de los dos grupos, sin aportar diferencias intervarietales.Dendrograma construido por el metoda UPGMA a partir de una matriz desimilitud de Jaccard.

Tabla 2. Secuenciasde los nueveiniciadoresqueamplificaronfrag-mentosdeADN polim6rficosparadiferenciarvariedades de tabacoy

promediode bandaselectrotoreticasgeneradaspor iniciador.

Iniciadores polim6rficos para diferenciarvariedades de tabaco

Iniciador Secuencia Promedio bandasOPB02 TGATCCCTGG 2OPB05 TGCGCCCTIC 12OPB08 GTCCACACGG 11OPB12 CCTTGACGCA 8OPE17 CTACTGCCGT 11OPM04 GGCGGTIGTC 9OPM07 CCGTGACTCA 11OPM19 CCTICAGGCA 10OPM 20 AGGTCTIGGG 7

los Flue Cured (SPG 28, TRC 1-96, TRC2-99 Y NC 567), tarnbien sin establecersediferencias entre elias. Ambos grupos sediferencian en un 20% con un porcentajede similitud del 80%. Esta alta similitudobedece a que son variedades comercia-les del genero Nicotiana, las cuales pue-den estar muy relacionadas por los pro-cesos de mejoramiento. Los resultadosdel presente estudio permitieron encon-trar cinco iniciadores (OPB 04, OPC 07,OPI 11, OPI 17 Y OPM 13) que en sietevariedades generaron marcadores mole-culares especificos para tipos de tabaco,separando sin arnbiquedades los negrostipo Garcia de los Flue Cured.

Este es el primer informe del encuen-tro de estos marcadores RAPD para cadatipo de tabaco, 10cual reviste una gran im-portancia para el mantenimiento y manejode grandes colecciones en los bancos degermoplasma, pues perrnitira realizar la se-paraci6n inicial por tipos de tabaco y clasi-ficar las variedades, sobre todo en aque-1I0scasos don de haya duda de pertenenciaa alqun grupo 0 en algunos casos en loscuales el origen de los materiales es in-cierto. Este sistema perrnitira, adernas, unac1asificaci6n inicial de materiales muchomas practica y barata que si se utilizaranmarcadores moleculares como los AFLP,rnicrosatelites, etc.

Polimorfismo varietal en tabacoDe 14 iniciadores que generaron patronesRAPD polim6rficos, nueve (OPB 02, OPB05, OPB 08, OPB 012, OPE 17, OPM 04,OPM 07, OPM 19 Y OPM 20) generaronpolimorfismo para las siete variedades detabaco estableciendo c1aras diferencias en-tre elias (vease tabla 2).

Los marcadores RAPD generadospara las siete variedades por estos nue-

ve iniciadores produjeron 214 bandas polim6rficas,que permitieron calcular un polimorfismo total de20,34% entre las siete variedades y generaron hue-lias qeneticas propias de cad a una de las varieda-des (figura 3).

En el dendrograma (figura 2) generado a par-tir de una matriz de distancias de Jaccard se apre-cia una clara separaci6n de las variedades en dosgrupos: tabacos negros tipo Garda (C23RM,ICAGUANE, COLTABACO 1- A), sin establecer di-ferencia entre las tres y el grupo correspondiente a

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INICIADOR orM 19

C 23 ICAG CIA 51'28 T RCI TRC2 NC567 M

INICIADOR or-a 08

C 23 ICAG CIA SI'28 TRCI TRC2 NC567 M<411IlV' _.

- -'-~· .•_.ni! ••••i..... ~_. 5<'".. ~ - .,-. -~ ,-i .....~ ..:iII ..

Figura 3. RAPD generados con los iniciadores OPM 19 YOPB 08 corridoscon una mezcla de ADN de diez individuos por cada variedad. Se apreciael alto grado de polimorfismo entre las diferentes variedades. M =Marcador100 pb. En los carriles 1, 2 Y 3, las variedades C23RM, ICAGUANE,COLTABACO 1- A (tabacos negros), y en los carriles 4, 5, 6 Y 7, lasvariedades SPG 28, TRC 1·96, TRC 2-99 YNC 567 Tabacos Flue Cured.

1~li C2JRM

. lellI lEt

I~l ICAGUANE

i IIlll COLTABACO 1 - A

11111 SPEIGIIT 28

fRE1:jgml:~

fI~l:fi TRC 1-96

fllI:1ITRC 2- 99~ml~~mNC567

0,36 0,52 0,68 0,84 1,00

66

It:OO

La verificaci6n estadfstica de las bandas obte-nidas en los fenogramas se calcul6 por el fndice desimilitud de Jaccard para todas las variedades. Losresultados se expresan en el dendrograma de lafigura 4, donde se observa que las siete variedadesanalizadas generaron unos marcadores RAPD quelas siguen separando en dos grupos distintos, co-rrespondientes a los dos tipos de tabaco a los cua-les pertenecen, perc esta vez estableciendo dife-rencias entre las variedades de cada grupo.

1000

1500

En el dendrograma (figura 4) se puede apre-ciar que la variedad SPG 28 tipo Virginia muestrael mayor porcentaje de diferenciaci6n con el restode las variedades (54,64%), perc relacionandosemas estrechamente con las variedades de su gru-po (Flue Cured).

1000 Esta variedad SPG 28 es un progenitor co-rnun tanto para la variedad COLTABACO 1 - A,que es un tabaco negro tipo Garda, como paralas variedades hermanas TRC 1 - 96 Y TRC 2 -99 tipo Flue Cured, de las cuales esta mas cer-cana por ser el mismo tipo de tabaco. EI SPG 28fue progenitor femenino donante fundamental-mente de rendimiento, y aport6 en el proceso demejoramiento los altos niveles de resistencia alas enfermedades causadas por Alternaria posalternata y Meloidogyne incognita. Para el casode la variedad COLTABACO 1 - A, el SPG 28 fueel progenitor masculino del primer cruce, donan-te de resistencia a Alternaria pos alternata,Phytophthora parasftica variedad nicotianae,Ralstonia solanacearum y Meloidogyne incognita;en la misma figura se aprecia que hay relaci6ncon su descendiente COLTABACO 1 - A, percque a la vez tiene las mayores diferenciasqeneticas con el grupo de los tabacos negros tipoGarcia, 10 que se refleja principal mente en laparte ffsica y quimica de las plantas.

En la parte superior del mismo dendrograma,en el grupo de los tabacos negros tipo Garda sehallan muy relacionadas las variedades Coltabaco

Figura 4. Dendrograma que ilustra las distancias qeneticasentre las siete variedades de tabaco separando las de tipoNegro Garcfa y las variedades Flue Cured. Se observandiferencias entre las variedades por el polimorfismo generadopor los nueve iniciadores. Dendrograma construido por elrnetodo UPGMA a partir de una matriz de similitud de Jaccard.

CARACTERIZACION paR RAPD DETRESVARIEDADES DE TABAca aBTENIDAS paR CULTlva DE ANTERAS IN VITRO

23 RM, ICAGUANE Y COLTABACO 1 - A con un por-centaje de similitud del 52% (diferenciandose en48%); asf mismo, estas dos ultirnas guardan una se-mejanza del 61%. COLTABACO 1 - A se relacionamuy estrechamente con el progenitor ICAGUANE dequien se Ie incorpora la estructura de la planta y unalto porcentaje de la forma de la hoja. Tarnbien seobserva que estas dos variedades guardan relaci6ncon la variedad COLTABACO 23 RM tabaco negro,progenitor que actu6 como madre y que fue don antede adaptabilidad, rendimiento y resistencia a TMVde la COLTABACO 1 - A.

Como se aprecia tarnbien en la figura 4, las va-riedades hermanas TRC 1 - 96 Y TRC 2 - 99 son lasque presentan los mas altos porcentajes de similitudgenetica, del 87,2%, alcanzandose a diferenciar s610en un 12,8%. Estan tan estrechamente relacionadasporque tienen los mismos progenitores, proceden delmismo cultivo de anteras, pero fueron desde el inicioseleccionadas como Ifneas promisorias con algunascaracterfsticas diferentes; por tanto siguieron proce-sos de selecci6n encaminados a objetivos diversos.Ambas variedades son resistentes al Virus Mosaicodel Tabaco (TMV), moderadamente resistentes alhongo Phytophthora parasftica raza cera, tolerantesal hongo Alternaria pos alternata, y resistentes alnematode Meloidogyne incognita razas 1 y 3, percdifieren en sus caracterfsticas agron6micas, color dela hoja, producci6n, madurez tecnica, perfodovegetativo y azucares. Estas dos variedades tarnbienaparecen con alto porcentaje de similitud con la va-riedad progenitora NC 567, quien actu6 como proge-nitor donante de la resistencia a TMV, que fue la ca-racterfstica principal que se deseaba incorporar. Lavariedad NC 567 (Virginia) tiene un 72,8% de simi li-tud, se diferencia en 27,2%, siendo la mas cercana asus descendientes las variedades TRC 1 - 96 Y TRC2 - 99, Y estando todas junto con la SPG 28 en elgrupo de los tabacos Flue Cured.

Sequn los resultados y analisis anteriares, he-mos encontrado marcadores RAPD diagn6sticos paralas variedades de tabaco en estudio, que al analizar-se por el coeficiente de Jaccard y por el rnetodoUPGMA generan un dendrograma que muestra sieteconglomerados de individuos correspondientes a lassiete variedades: C23 RM, ICAGUANE, COLTABACO1 - A, SPG 28, TRC 1 - 96, TRC 2 - 99 Y la NC 567, Yestes a su vez, separados en dos grandes grupos: elde las variedades de tabaco negro tipo Garcia y el de

las variedades de tabaco Flue Cured. Se ha obtenidoun polimorfismo interespecifico importante con nueveiniciadores que generaron fragmentos polim6rficossuficientes para identificar y definir las siete varieda-des como diferentes entre sf.

Los hallazgos en este estudio guardan muchaconcordancia con los presentados por Coussirat(1993), quien con la tecnica de RAPD obtuvo exito enla identificaci6n de hfbridos sornaticos obtenidos parla fusi6n de pratoplastos de dos especies diferentesde N. Tabacum, y con s610cuatro iniciadores lograronidentificar huellas qeneticas unicas para cada una deellos, siendo adernas capaces de detectar variacio-nes de un solo par de bases del ADN gen6mico. Enotro trabajo igualmente pudo lIevarse a cabo la carac-terizaci6n qenetica por RAPD de cuatro hfbridossornaticos y de las especies progenitoras N. tabacumy N. plumbaginifolia, deterrninandose los porcentajesde contribuci6n de los progenitores (Pinto et al., 1995).Yu y Tsai (1997) tarnbien pudieron demostrar que losensayos RAPD son una tecnica sensitiva para identi-ficar relaciones tiloqeneticas a nivel interespecifico eintraespecifico en el genero Nicotiana.

En este estudio se encontr6 que las variedadesTRC 1 - 96 Y TRC 2 - 99 son mas altamente relacio-nadas entre sf por ser variedades hermanas descen-dientes de los mismos progenitores, del mismo culti-vo de anteras y por ser haploides diploidizados (DH).Estos datos de alta similitud y bajos porcentajes dediferenciaci6n qenetica son bastante coherentes conlos reportes de Yi (1977), quien logr6 detectar pe-queries polimorfismos presentes entre Ifneas DHrecombinantes de tabaco, con la utilizaci6n de dieziniciadores RAPD de 1.500 evaluados.

A pesar de que se han podido establecerpolimorfismos entre las siete variedades de tabaco,los porcentajes de similitud entre elias son bastantealtos; esto debido a que el tabaco es una especieque se reproduce por autopolinizaci6n, por 10que suvariabilidad parece ser mas baja que en las especiesde polinizaci6n cruzada. Por 10anterior a veces esdiffcil detectar la variabilidad qenetica presente en laspoblaciones de los tabacos de los tipos Flue Cured yBurley, ya que los pragramas de estandares mfni-mos internacionales exigen que los cultivares 0 va-riedades deban ser de una composici6n qufmica muysimilar, por 10que estan contribuyendo aceleradamen-te a reducciones en la variaci6n qenetica entre ellos.

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Adernas, los tabacos americanos de ambas c1ases,Flue Cured y Burley, probablemente evolucionaronde una poblaci6n cornun en los ultirnos 150 aries(Wernsman, 1999).

La explicaci6n anterior puede ser la raz6n paraque los estudios realizados por Rossi et al., (1999)generaran bandas RAPD poco polim6rficas, que noproveyeron suficiente resoluci6n para la identificaci6ny clasificaci6n de 19 variedades de tabaco, donde seinvolucraron 7 de Burley, 6 Flue Cured y 6 de tabacoOriental, evaluadas con 220 iniciadores. Asi mismo,dDel Piano y colaboradores (2000) en el anal isisintraespecifico en N. Tabacum, utilizando s610 dosiniciadores, obtuvieron un bajo polimorfismo, y la ma-yoria de los fragmentos amplificados fueronmonom6rficos. EI considera que esta tecnica puede serinadecuada para identificaci6n de variedades de taba-co, perc que sus resultados preliminares pueden cam-biar evaluando otro grupo mas amplio de iniciadores.

A diferencia de los anteriores estudios, en nues-tro caso los RAPD - PCR fueron un rnetodo efectivopara hacer un barrido del genoma vegetal y detectarpolimorfismo varietal en tabaco, por 10que se puedeafirmar, como 10 hace De Filippis (1996), que losmarcadores RAPD pueden ser aplicados para identi-ficar diferencias qeneticas entre individuos a pesarde que es un metoda cualitativo mas que cuantitativoy detecta solamente la presencia 0 ausencia de unasecuencia de ADN en el genoma estudiado. Sin em-bargo, nos permiti6 establecer las relacionesflloqeneticas entre los progenitores y las variedadesde Coltabaco registradas como COLTABACO 1 - A,TRC 1 - 96 Y TRC 2 - 99, estableciendo diferenciasqeneticas entre elias. Por tanto podemos afirmar contoda certeza que las siete variedades son total mentediferentes en su estructura qenetica.

Los anteriores resultados tarnbien permiten co-rroborar que la discriminaci6n establecida a nivelmolecular con los marcadores RAPD es evidenciadaigualmente a nivel morfol6gico por las tecnicas decaracterizaci6n morfoagron6mica que ha utilizadoColtabaco en la descripci6n de las nuevas varieda-des a traves del tiempo, 10cual perrnitira la integra-ci6n de las dos tecnicas, pues la fenotipica permiteel conocimiento morfol6gico de la variedad, y lamolecular, su patrimonio qenetico. Adernas, esto Iepermite a la empresa afianzar sus derechos deobtentor de variedades vegetales.

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CONCLUSIONES

Los marcadores RAPD permitieron encontrar la si-militud y la variaci6n qenetica entre los progenitoresy las variedades estudiadas, contirrnandose de estamanera que las producidas por Coltabaco mediantela tecnica del cultivo de anteras in vitro, registradascomo COLTABACO 1 - A. La TRC 1 - 96 Y TRC 2 -99 son completamente diferentes de sus progenito-res qeneticarnente, como se evidencia igualmente anivel morfol6gico por las tecnicas de caracterizaci6nmorfoagron6mica que ha utilizado Coltabaco en ladescripci6n de las nuevas variedades.

Para la empresa resulta de gran importanciala integraci6n de las dos tecnicas de caracteriza-ci6n de variedades, pues la fenotipica permite elconocimiento morfol6gico de la variedad, y lamolecular, su patrimonio qenetico. Adernas, Ie per-mite a afianzar sus derechos de obtentor de varie-dades vegetales.

Esta herramienta molecular, con la utilizaci6nen un futuro de los AFLP y los micrcsatelites, po-dria tener utilidad en la identificaci6n de marcado-res moleculares asociados a caracteristicas de re-sistencia a enfermedades presentes en lasaccesiones del banco de germoplasma de la com-parua, y con ello contribuir al desarrollo aqil de nue-vas variedades de tabaco. Posteriormente se po-dria implementar el secuenciamiento de fragmentosespecificos y la construcci6n de iniciadores espe-cificos que hagan mas tacil la identificaci6n de lasvariedades y el uso de genes asociados a caracte-risticas importantes.

AGRADECIMIENTOS

Los auto res de este trabajo desean agradecer muyespecialmente a las directivas de la Comparila Co-lombiana de Tabaco - Coltabaco, y en especial aldoctor Francisco Palacio, director del Centro de In-vestigaci6n y Desarrollo Tecnol6gico - C. I. D. T. dela Cornpafiia por su invaluable apoyo. AI posgradode Biotecnologia de la Universidad Nacional de Co-lombia, seccional Medellin y al doctor Sergio Orduz,director de la Unidad de Biotecnologia y Control Bio-16gico de la Corporaci6n para Investigaciones Bio-16gicas - CIB, quien dio via Iibre para el desarrollode la investigaci6n en su laboratorio.

CARAGERIZACION PORRAPDDETRESVARIEDADESDETABACOOBTENIDASPORCULTIVODEANTERASIN VITRO

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