Sylwia StudnickaIII rok OAMGr A/B

ANALITYCZNE ASPEKTY OZNACZENIA ENZYMÓW I ICH PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA. PROBLEMY ANALITYCZNE OZNACZANIA BILIRUBINY

ENZYMY•E

nzymy są to w większości białka, zdolne do katalizowania reakcji, w wyniku której następuje przekształcenie substratów w produkty poprzez obniżenie energii aktywacji tej reakcji.

Podział enzymówZe względu na sposób przedostawania się do przestrzeni pozakomórkowych:

Enzymy sekrecyjne: - powstają w narządach miąższowych i wydzielane są do krwi, gdzie pełnią prawidłowe funkcje;- obniżenie ich aktywności w surowicy = zaburzenia danego narządu.

Enzymy ekskrecyjne: - syntetyzowane są przez komórki narządów wydzielniczych i zostają wydzielone do śliny, do światła przewodu pokarmowego, itp. - występowanie ich w surowicy wynika z przeszkód w odpływie płynów wydzielniczych (żółci, soku trzustkowego).

Enzymy wskaźnikowe: - nie występują w prawidłowej surowicy lub aktywność ich jest niewielka w porównaniu z aktywnością wewnątrz komórek; - dostają się do krążenia wskutek uszkodzenia komórek. 

Podział enzymów

Wskaźnikowe Sekrecyjne Ekskrecyjneniespecyficzne narządowo

specyficzne narządowo

• lipaza lipoproteinowa,

• ceruloplazmina,• czynniki

krzepnięcia i fibrynolizy

● ślinianek: amylaza śl. ● trzustki: amylaza trzustkowa, lipaza trzustkowa, DN-aza, RN-aza● stercza: fosfataza kwaśna● gruczołów wydzielniczych żołądka: pepsynogen

● e. glikolizy: heksokinaza,fosfogliceromutaza, izomeraza, PK, LDH● e. cyklu pentozo-fosforanowego: dehydr. Glu-6-P, transketolaza● e. cyklu Krebsa:dehydr. Izocytrynianowa,Jabłczanowa, fumaraza● e. przemian białek: AspAT, AlAT, GGT, GLD● e. przemian puryn: dezaminaza adenozyny, oksydaza ksantyny

● w wątrobie: -dehydrogenaza alkoholowa -aldolaza Fru-1-P -dehydrogenaza sorbitolowa -arginaza●w mm poprzecz. prążkowanych: - aldolaza Fru-1,6-P2

- kinaza kreatynowa

Izoformy

Są to odmienne fizycznie postacie enzymu, powstające w wyniku jego modyfikacji potranslacyjnej:zmiana fosforylacjiasocjacja z innymi białkami, agregacjazmiana bocznego łańcucha węglowodanowegoczęściowe rozszczepienie łańcuchadeaminacjaacylacjautlenienie gr. SH

Izoenzymy (izozymy)F

izycznie różniące się postacie danego enzymu, kodowane w DNA.K

atalizuję tę samą reakcję, ale występują między nimi różnice w:

- wrażliwości na temperaturę

- powinowactwie do substratu- właściwościach immunologicznych- ruchliwości elektroforetycznej

przykłady izoenzymów:

- dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

-kinaza kreatynowa (CK)

Standaryzacja metod

Ochrona enzymu przed inaktywacją termiczną, degradacją proteolityczną, utlenianiem;

bufor testowy powinien chronić enzym przed hamowaniem nadmiarem produktu;

pomiar aktywności należy wykonywać w temperaturze 37°C;

zakres roboczy metody powinien odpowiadać zakresowi mierzonej aktywności;

możliwość porównywania wyników;

Standaryzacja metod

DiagnostykaPrzyczyny zmian aktywności lub stężenia enzymów w surowicy:proliferacja komórek;biosynteza enzymów wewnątrzkomórkowych;zmiana przepuszczalności błon komórkowych;nasilony rozpad komórek (w wyniku procesów patologicznych);upośledzona biosynteza enzymów sekrecyjnych w stanach

ciężkich uszkodzeń narządów miąższowych;utrudniony odpływ płynów zawierających enzymy ekskrecyjne.

Zmiany te wywołane są przez:urazy zewnętrzne → zmiażdżenie tkanki, oparzeniaurazy wewnętrzne → krwotokistany zapalneprocesy zwyrodnieniowe i martwicze

Lokalizacja enzymów w organellach komórkowych

Lokalizacja enzymu Przykład

cytoplazmaAldolazaLDHAlAT

mitochondriaenzymy cyklu Krebsa GLDHAspAT

retikulum endoplazamatyczne

esterazy reduktazy fosfataza Glu-6-P

rybosomyenzymy syntezy białek, ceruloplazmina esteraza cholinowa

lizosomy

proteazy fosfatazykolagenazy

siateczka endoplazmatyczna GGT

Diagnostyka a lokalizacja

Ze względu na umiejscowienie enzymów w komórce, stopień uszkodzenia tkanki ma wpływ na poziom i rodzaj enzymów komórkowych w osoczu.

● Lekkie uszkodzenia komórek powodują ucieczkę do osocza białek i enzymów cytoplazmatycznych.

● W ciężkich uszkodzeniach komórek w osoczu pojawiają się enzymy mitochondrialne.

KINAZA KREATYNOWA (CK) – enzym wskaźnikowy

Izoenzymy: CKMM, CKMB, CKBB

w osoczu ludzi zdrowych CKMM stanowi 95% aktywności całkowitej (CKcałk)

do obniżenia aktywności CKMM dochodzi w wyniku zmniejszenia masy mięśni

oznaczanie aktywności CKcałk i CKMBcat pozwala na potwierdzenie wystąpienia zawału w ciągu pierwszej doby tylko u ok. 70% chorych; skuteczniej wykrywa się stan zawałowy we wcześniejszych etapach oznaczając izoformy sercowe białek – troponiny I oraz T oraz mioglobinę; preferuje się także oznaczenia stężenia CKMBmass

  

znaczny wzrost – ponad 5-krotny

zawał sercazapalenie mięśnia sercowegourazy mięśnidystrofia mięśniowawstrząsniewydolność krążenia

 

umiarkowany wzrost 

zapalenia mięśni po injekcjachstany pooperacyjnerozległe uszkodzenie tkanki nerwowej

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) Izoenzymy LDH1 – LDH5 obecne są w mózgu, płucach,

leukocytach, mm szkieletowych, erytrocytach, mm sercowym, płytkach krwi, nerkach, wątrobie.

Swoistą izoformą dla mięśnia sercowego jest LDH1 , o długim okresie półtrwania (ok. 100 godzin); specyficzna dla wątroby – LDH5 ma krótki czas półtrwania (do 10 godzin).

W osoczu osób zdrowych dominuje izoenzym LDH2.

duży wzrost aktywności

z przewagą LDH1, LDH2

zawał serca (marker późny)niedokrwistość megaloblastycznaostre białaczkiciężkie uszkodzenie nerek

duży wzrost aktywności

z przewagą LDH5

choroby wątrobychoroby mięśni szkieletowych

 umiarkowany wzrost aktywności

całkowitej (objaw nieswoisty)

 zawał płuc i mózguprocesy nowotworowe

FOSFATAZA ZASADOWA (ALP) – enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny

Trzy izoenzymy, niespecyficzne tkankowo, kodowane są przez jeden gen – w wątrobie, tkance kostnej i nerkach.

Trzy izoenzymy – jelitowy, łożyskowy i komórek zarodkowych kodowane są przez 3 geny swoiste tkankowo. Izoenzym Przykład choroby

wątrobowa ALP ↑ choroby wątroby, cholestaza

kostna ALP ↑nowotworowe i nienowotworowe choroby kości

jelitowa ALP ↓ przewlekłe choroby wątroby

żółciowa i makromolekularna ALP ↑

cholestaza i przerzutowe guzy wątroby

łożyskowa ALP↑nowotwory płuc, jajników, macicy, jąder, układu żołądkowo-jelitowego

ALP komórek zarodkowych↑

nowotwory zarodkowe, przysadki, grasicy

FOSFATAZA KWAŚNA (ACP) – enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny

Izoenzymy: wątrobowy, nerek, stercza, kostny oraz izoformy izoenzymu kostnego wytwarzane w neutrofilach, erytrocytach, płytkach krwi, śledzionie.

U dzieci w okresie pokwitania aktywność ACP jest 2-5 razy wyższa, niż u dorosłych.

U dorosłych zdrowych mężczyzn ok. 30% aktywności całkowitej ACP stanowi aktywność izoenzymu stercza.

całkowita aktywność ACP ↑

choroba Pageta, przerzuty nowotworowe do kości, szpiczak, akromegalia, osteoporoza, hemoliza

ACP stercza (PAP) ↑ przerost, zapalenie, rak gruczołu krokowego

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA

AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA – AST, enzym wskaźnikowyzlokalizowana jest w cytoplazmie i mitochondriach komórek wątroby, mięśni szkieletowych i serca, w erytrocytach, komórkach kanalików nerkowychma znaczenie w diagnostyce schorzeń wątroby 

AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA – ALT, enzym wskaźnikowyALT występuje wyłącznie w cytoplazmie (w komórkach wątroby i nerek wyższy poziom; niższy – w mięśniach; w niewielkich ilościach obecna w komórkach wszystkich innych tkanek).ALT jest względnie swoista dla hepatocytówdogodny test skriningowy do wykrywania stanów zapalnych wątroby (zakażenie HBV, HCV, alkoholizm, leki hepatotoksyczne)Aktywność AST i ALT w prawidłowej surowicy jest nieco wyższa u mężczyzn, niż u kobiet; u noworodków jest większa 1,5- 2 razy, niż u dorosłych.

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA

AMINOTRANSFERAZA ALANINOWAAST ALT

Duży wzrost

wirusowe zapalenie wątrobytoksyczne uszkodzenie wątrobynowotwory, białaczki, chłoniakizapalenie dróg żółciowychzawał mm sercowegoostre reumatoidalne zapalenie mm sercowegociężka niewydolność krążeniahemoliza

wirusowe zapalenie wątrobytoksyczne uszkodzenie wątrobyzmiażdżenia wątroby, mięśniciężka niewydolność krążenia

Łagodnywzrost

 

przewlekłe choroby mięśniniewydolność krążenia bez zawałuprzewlekłe zapalenia wątrobycholestazazapalenie trzustkimononukleoza ostra niewydolność nerek

choroby mięśni szkieletowychmarskość wątrobyżółtaczka zastoinowa

DEHYDROGENAZA GLUTAMINIANOWA – GLDH, enzym wskaźnikowy

enzym zlokalizowany w mitochondriach wątroby

Duży wzrost aktywności

WZWśpiączka wątrobowaprzewlekłe agresywne zapalenie wątrobyżółtaczka zastoinowa

Umiarkowany wzrost aktywności

pierwotny rak wątrobywtórne nowotwory wątroby

GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT, enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny

enzym zlokalizowany w błonach komórek o aktywnym transporcie aminokwasów - nabłonku wątroby, trzustki, jelita dróg żółciowych, kanalików nerkowych

GGT obecna we krwi pochodzi głównie z wątroby

aktywność w prawidłowej surowicy u kobiet nieco niższa, niż u mężczyzn; duża aktywność u noworodków i niemowląt w pierwszych miesiącach życia

GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT, enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny

zmiany aktywności GGT wyraźnie korelują ze zmianami aktywności ALP

enzym podlega indukcji przez barbiturany, fenytoinę, estrogeny, spożywany alkohol

  

Duży wzrost aktywności

choroby zastoinowe wątrobychoroby dróg żółciowychnowotwory wątrobystany zapalne trzustkinowotwory trzustki przewlekły alkoholizm

ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny

W surowicy obecnych jest 8 izoenzymów pochodzących z trzustki, ślinianek, błony, śluzowej jelita cienkiego, gruczołów mlecznych, jajników, jąder

Diagnostycznie wykorzystuje się oznacznie aktywności całkowitej lub izoenzymu trzustkowego w surowicy i moczu w chorobach trzustki i przewodu pokarmowego

AMS jest białkiem małocząsteczkowym – podlega przesączaniu do moczu (białkomocz przednerkowy) i jest dobrym odzwierciedleniem poziomu we krwi; oznaczanie AMS w moczu może być dogodne w monitorowaniu schorzeń trzustki.

ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny

LIPAZA TRZUSTKOWA – LP, enzym ekskrecyjny

enzym wytwarzany głównie w trzustce zmiany aktywności LP mogą być wywołane przez leki:

- heparyna, kodeina, opioidowe leki przeciwbólowe zwiększają aktywność LP

- chinina hamuje aktywność LP wzrost aktywności LP w ostrym zapaleniu trzustki

utrzymuje się dłużej, niż aktywności AMS ze względu na swoistość narządową wzrost aktywności

LP charakteryzuje się prawie 100% czułością w rozpoznawaniu OZT.

Wzrost aktywności

ostre zapalenia trzustkirak trzustkicholestaza pozawątrobowa z zajęciem trzustki

ELASTAZA1– enzym sekrecyjny trzustki

Enzym nie ulega rozkładowi w jelicie cienkim i grubym, zawartość oznaczana w ekstrakcie próbki stolca odzwierciedla poziom elastazy wydzielanej do dwunastnicy.

Duży spadek zawartości elastazy 1 poniżej normy wskazuje na ciężką niewydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki.

CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny wątroby

enzym wydzielany z wątroby do krążenia

do tej grupy należy AChE (rozkład acetylocholiny) – acetylocholinesteraza w komórkach układu nerwowego, w erytrocytach, płucach

Znaczna zmienność międzyosobnicza aktywności ChE ogranicza jej przydatność jako pojedynczego testu w rozpoznawaniu uszkodzenia wątroby

CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny wątroby

ChE jest użyteczna w monitorowaniu przewlekłych chorób wątroby

↓ aktywności ChEświadczy o znacznym uszkodzeniu miąższu

wątroby i zahamowaniu syntezy

białek

miąższowe choroby wątrobyzatrucia związkami fosfoorganicznymi środki cytotoksycznewstrząs pourazowywrodzone niedobory enzymuniedożywienie

↑ aktywności ChEzespoły nerczycowe, nadczynność tarczycyokres rekonwalescencji po uszkodzeniu wątroby

Inne enzymy sekrecyjne Lipaza lipoproteinowa – różnicowanie zaburzeń

gospodarki lipoproteinowej.

Enzymy krzepnięcia i fibrynolizy – czynniki II, V, VII, IX, X: pomiar czasu protrombinowego jest miarą ich stężenia w surowicy.

Ceruloplazmina – gromadzenie jonów miedzi w wątrobie wywołuje spadek poziomu ceruloplazminy w osoczu.

Izoenzymy jako markery chorób nowotworowych

Wykrywane są częściej w stadiach zaawansowanych, niż we wczesnych etapach,

Monitorowanie ich aktywności w surowicy pozwala na ocenę skuteczności terapii oraz na wczesne wykrycie nawrotu choroby.

Przykłady: Enolaza– enzym glikolityczny ALP

ACP - Wzrasta aktywność u ok. 50% chorych z zaawansowanym rakiem stercza.

izoenzym wątrobowy ALP ↑

guzy przerzutowe do wątroby

frakcje rakowo-łożyskowe ALP ↑

guzy jajników, trzustki, okrężnicy, piersi, płuc

Izoenzymy jako markery chorób nowotworowych

GGT – wzrost aktywności w nowotworach wątroby, zwłaszcza z towarzyszącą cholestazą.

LDH

PSA (prostate specific antygen) – proteza serynowa wydzielana przez komórki nabłonkowe kanalików zdrowego stercza, ale również przez nabłonek gruczolakoraka i raka stercza.

wzrost poziomu LDH3

nowotwory o dużej dynamice wzrostu

wzrost poziomu LDH1, LDH2

chłoniaki, białaczki (zła prognoza)

Bilirubina

Pomarańczowoczerwony barwnik żółciowy, będący produktem rozpadu hemu hemoglobiny i innych hemoprotein

Bilirubina słabo rozpuszcza się w wodzie, dlatego w osoczu krwi transportowana jest w połączeniu z albuminą

Frakcja bilirubiny nietrwale związanej z albuminami nazywana jest bilirubiną wolną lub pośrednią. Bilirubina wolna nie przedostaje się do moczu, ale może przenikać przez barierę krew-mózg

BilirubinaB

ilirubina wolna transportowana jest do wątroby, gdzie następują jej dalsze przemiany do rozpuszczalnej w wodzie bilirubiny związanej (bezpośredniej), przez co traci zdolność przenikania przez barierę krew-mózg i traci właściwości neurotoksyczne

UDP-glukuronozylotransferaza sprzęga bilirubinę z kwasem glukuronowym (glukuronianem)

Bilirubina związana wydzielana jest aktywnie do żółci, skąd dalej trafia do jelita. Jest tam przekształcana w barwniki żółciowe – urobilinogeny (sterkobilinogeny) przy udziale enzymów bakteryjnych

Właściwości bilirubiny

Bilirubina jest związkiem wrażliwym na działanie światła naturalnego i sztucznego. W czasie ekspozycji na światło dochodzi do jej izomeryzacji i utleniania

W diagnostyce laboratoryjnej ekspozycja na światło może wpłynąć na wynik oznaczania bilirubiny, zaniżając jej stężenie, jeśli próbka nie była chroniona przed światłem

Hiperbilirubinemia

Może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm3 dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki.

Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie.

Hiperbilirubinemia

Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: WZW, marskości wątroby, zatruć, długotrwałego stosowania hepatotoksycznych leków, czemu towarzyszy upośledzenie wydzielania do żółci sprzężonej bilirubiny.

Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.

Bilirubina jako marker w diagnostyce laboratoryjnej

U zdrowych ludzi stężenie bilirubiny wynosi 1 - 1,3 mg/dl (17,1 - 22,2 μmol/l).

Stężenie to jest fizjologicznie wyższe u dzieci do 1 miesiąca życia, zwłaszcza u wcześniaków, u których prawidłowe stężenie może sięgać nawet do 16 mg/dl (273,6 μmol/l) w 3-5 dniu życia

Podwyższone stężenie bilirubiny określa się jako hiperbilirubinemię. U chorych bilirubina sprzężona może przenikać do moczu. Taki stan nazywa się cholurią

Metody oznaczania bilirubinyW

YSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC) pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje:

– alfa – frakcja bilirubiny wolnej

– beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid bilirubiny)

– gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid bilirubiny)

– delta – frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób zdrowych i pojawia się przy wysokich, utrzymujących się stężeniach bilirubiny sprzężonej; utrzymuje się we krwi ok. 2 tygodni

Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej diagnostyce.

Metody oznaczania bilirubiny

R

EAKCJA EHRLICHA – reakcja, w której dwuazowy kwas sulfanilowy reaguje z bilirubiną, w wyniku czego powstają dwa barwne izomery (w pH obojętnym obserwujemy kolor purpurowy, w pH kwaśnym lub zasadowym obserwujemy kolor niebieski)

Metody oznaczania bilirubiny

METODA JENDRASSIKA–GROFA (zmodyfikowana)

– wykorzystywana do bezpośredniego oznaczania bilirubiny wolnej i sprzężonej

– dokonuje się dwukrotnie pomiaru kolorometrycznego przy dwóch długościach fali – 400 i 460 nm.

– pierwszy pomiar pozwala określić stężenie bilirubiny całkowitej

– drugi pomiar wykorzystuje różnicę w molowej zdolności absorpcyjnej frakcji wolnej i sprzężonej

METODY OZNACZANIA BILIRUBINY W MOCZU

Przy użyciu testów paskowych

Bilirubina może krystalizować w moczu o kwaśnym pH, zwłaszcza po schłodzeniu, a jej kryształy są widoczne podczas analizy osadu moczu najczęściej w postaci żółto-brązowych igieł

Wyniki zaniżone: wysokie stężenie witaminy C, azotyny, ekspozycja na światło

Wyniki fałszywie dodatnie: NSLPZ

Bilirubinometr

Jest to urządzenie do nieinwazyjnego, przezskórnego pomiaru poziomu bilirubiny, również w czasie i po fototerapii noworodków.

Na pomiar nie ma wpływu płeć, rasa, wiek urodzeniowy, ani waga noworodka.

Pomiaru dokonuje się przez skierowanie białego światła w skórę noworodka i badanie intensywności powracających fal o określonej długości.

Znając spektralne właściwości składników skóry, można wydzielić składniki zakłócające i określające koncentrację bilirubiny.

Dziękuję za uwagę