XVIII Zjazd Naukowy

Polskiego Towarzystwa Diagnostyki

Laboratoryjnej

Warszawa, 15 – 18 września 2013 r.

WYKŁADY PLENARNE

Rola badań molekularnych w personalizacji terapii chorób nowotworowych. Marek Mirowski Przez wiele lat poszukiwania leków były związane z przypadkowym odkrywaniem substancji biologicznie aktywnych. Dopiero poznanie genomu człowieka w ramach projektu Human Genome Project pozwoliło na rozwój koncepcji medycyny i terapii personalizowanej, która opiera się na dopasowaniu leku do pacjenta, a nie do danej choroby. „Terapia na miarę” stała się możliwa dzięki wykorzystaniu szeregu wysoko zaawansowanych metod diagnostycznych, ponieważ to właśnie one umożliwiają precyzyjne zdefiniowanie różnic genetycznych pomiędzy chorującymi na tę samą chorobę oraz identyfikację możliwych tarcz działania leków. Dzięki zdobyczom biologii molekularnej nowoczesna medycyna personalizowana posługuje się nowymi narzędziami diagnostycznymi pozwalającymi na precyzyjne oznaczenia zmian związanych z procesem nowotworzenia na poziomie DNA (genomika) i RNA (transkryptomika). Należą do nich technika polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) i szereg jej modyfikacji RT-PCR, PCR-RFLP, qRT-PCR, mikromacierze cDNA i oligonukleotydowe oraz metody sekwencjonowania. Należy jednak pamiętać, że w personalizacji terapii istotne są również badania metabolomiczne czy proteomiczne. Badania prowadzone w oparciu o ww. techniki stwarzają możliwości wyboru nowych biomarkerów charakterystycznych dla poszczególnych nowotworów i w konsekwencji na planowanie struktury nowych leków i indywidualizację terapii. Klasycznym przykładem biomarkera może być receptor naskórkowego czynnika wzrostu typu 2 (HER2). Białko HER2 stało się czynnikiem predykcyjnym odpowiedzi na terapię celowaną trastuzumabem u chorych z rakiem piersi. Istotną rolę w onkogenezie wielu nowotworów m.in. płuca, jelita grubego, trzustki odgrywa gen K-RAS. Kodowane przez ten gen białko K-RAS stanowi istotny element szlaku sygnałowego inicjowanego przez receptor EGFR. Jak wykazano pacjenci z prawidłowym genem kodującym białko K-RAS dużo lepiej odpowiadają na leczenie anty-EGFR niż pacjenci z genem zmutowanym. Z kolei mutacje w obrębie genu kodującego receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu korelują z odpowiedzią na leczenie pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą inhibitorów kinazy tyrozynowej. Mutacje w obrębie genu BRAF występują u około 50% chorych na czerniaka skóry. Inhibitor białka będącego produktem tego zmutowanego genu może wkrótce stać się przełomem w leczeniu tego źle rokującego nowotworu. Badania molekularne są również wykorzystywane do oceny szybkości metabolizmu leków. Na tej podstawie dobiera się optymalną dawkę dla chorego, przewiduje ich skuteczność, toksyczność oraz lekooporność. Zmienność ta wiąże się z występowaniem różnych wariantów genetycznych w ludzkim genomie. Zjawisko to określane jest polimorfizmem genetycznym. Znanych jest kilka rodzajów polimorfizmu, wśród nich najważniejsze to: SNP (polimorfizm pojedynczych nukleotydów), D/I (polimorfizm delacja/insercja) oraz VNTR (polimorfizm zmiennej liczby tandemowych powtórzeń). Dla niektórych, stosowanych w onkologii leków np. azatiopuryny i merkaptopuryny głównie metabolizowanych przez metylotransferazę tiopuryny (TPMT), irynotekanu przekształcanego w czynny metabolit SN-38, który jest następnie inaktywowany poprzez sprzęganie z kwasem glukuronowym z udziałem glukuronylotranferazy-UDP (UGT1A1) farmakogentyczna informacja jest zawarta w ulotkach o leku. Znaczenie diagnostyki molekularnej w medycynie personalizowanej podkreśla wprowadzenie nowego terminu jakim jest „teranostyka” lub „teradiagnostyka”, który łączy terminy terapia i diagnostyka a medycyna personalizowana staje się wyzwaniem medycyny w XXI wieku. Rola badań diagnostycznych w przeszczepieniach szpiku Wiesław Wiktor Jędrzejczak Badania diagnostyczne wykonywane podczas zabiegu przeszczepiania komórek krwiotwórczych można podzielić na badania dotyczące choroby, która jest wskazaniem do wykonania danego zabiegu oraz na badania związane z samym zabiegiem. Te ostatnie można z kolei podzielić na badania standardowe wykonywane podczas wszystkich poważniejszych zabiegów i dotyczące monitorowania istotnych funkcji życiowych oraz powikłań oraz na badania swoiste dla przeszczepiania komórek krwiotwórczych. Badania dotyczące choroby, która była wskazaniem do wykonania zabiegu zależą od rodzaju tej choroby i zwykle polegają na ocenie jej natężenia i znalezienia wykładników, które będą

mogły następnie być wykorzystywane do oceny wyników leczenia. Badania dotyczące monitorowania istotnych funkcji życiowych obejmują testy hematologiczne, biochemiczne, mikrobiologiczne oraz badania obrazowe. Badania swoiste dla zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych obejmują w pierwszej kolejności dobór dawcy, następnie ocenę zdolności krwiotwórczej przeszczepu, a ostatecznie ocenę chimeryzmu poprzeszczepowego, czyli ocenę wytwarzania przez przeszczep komórek pochodzących od dawcy w organizmie biorcy. Dobór dawcy to przede wszystkim badania HLA wysokiej rozdzielczości, badanie grup krwi (nie ma znaczenia dla wyniku zabiegu, ale określa sposób jego wykonania) oraz w przypadku przeszczepiania krwi pępowinowej crossmatch. Ocena zdolności krwiotwórczej przeszczepu to ocena liczby komórek jednojądrowych w przeszczepie oraz liczba komórek CD34 dodatnich (i/lub CD133 dodatnich) wśród których znajdują się krwiotwórcze komórki macierzyste. Wreszcie ocenę chimeryzmu poprzeszczepowego wykonuje się różnymi metodami. Jeśli dawca i biorca różnili się antygenami grupowymi krwi to do tego celu może być wykorzystana zmiana tych antygenów po przeszczepieniu. Jeśli dawca i biorca różnili się płcią to do tego celu może być wykorzystane pojawianie się lub zanikanie chromosomu Y. Oprócz tego, obecnie powszechnie wykorzystywane są markery mikrosatelitarne określane metodami biologii molekularnej. Badania te mogą być wykonywane w odniesieniu do pełnego szpiku lub krwi obwodowej lub mogą oddzielnie dotyczyć izolowanych populacji komórkowych, a więc np. limfocytów T. Podsumowując, zabiegi przeszczepiania szpiku wymagają na każdym etapie dużej liczby badań monitorujących funkcję przeszczepu, chorobę podstawową i powikłania, a jeśli są wykonywane zgodnie z protokołem zapewniają wysoką skuteczność leczniczą tych zabiegów.

Glikacja – znaczenie kliniczne i diagnostyczne

Krystyna Sztefko

Nieenzymatyczne potranslacyjne modyfikacje zmieniające strukturalne i biologiczne własności białek w organizmach żywych są jedną z przyczyn procesu starzenia organizmu i różnych, często długotrwałych, schorzeń. Nieodwracalne modyfikacje białek wynikają z reakcji przyłączania się różnych niskocząsteczkowych metabolitów do wolnych, reaktywnych grup aminowych białek z następową rearanżacją chemiczną cząsteczek białka. W takiej sytuacji naruszona zostaje równowaga pomiędzy syntezą de nowo białek a procesem degradacji zmodyfikowanych białek, co powoduje nagromadzanie się tych ostatnich zarówno wewnątrz- jak i poza komórką. Procesy te pojawiają się progresywnie z wiekiem, ale schorzenia takie jak cukrzyca, choroby nerek, retinopatia, osteoporoza, choroby neurodegeneracyjne, nadciśnienie i miażdżyca proces ten przyspieszają. Najbardziej znaną nieenzymatyczną modyfikacją białek, lipidów i kwasów nukleinowych jest glikacja. Reakcja glikacji, pierwszy etap reakcji Maillarda in vivo, to kondensacja grupy karbonylowej z wolną grupą aminową białek w wyniku czego powstaje zasada Schiffa, która ulega spontanicznej rearanżacji do produktu Amadoriego. Ten ostatni produkt jest z kolei degradowany do różnych produktów pośrednich. W ostatecznej fazie powstają końcowe produkty glikacji (AGEs). Procesowi glikacji ulegają wszystkie białka, przy czym najbardziej znaną reakcją jest glikacja hemoglobiny. Proces ten jest niezależny od wieku w zdrowej populacji. Molekularne starzenie się białek powoduje: 1) nagromadzenie się białek opornych na proteolizę, 2) agregację białek, co zmienia fizykochemiczne i mechaniczne własności tkanek, 3) utratę funkcji biologicznej „starego” białka co powoduje nieprawidlowe oddziaływanie białko-białko czy komórka-białko oraz 4) tworzenie się nowych immunogennych epitopów, 5) nieprawidłowy efekt biologiczny na skutek uruchamiania nieprawidłowego przekazu informacji po połączeniu uszkodzonych białek z receptorami komórkowymi. Badania nad produktami glikacji to bardzo obiecująca dziedzina nauki. Jednakże z analitycznego punktu widzenia jest to niesłychanie trudny problem bowiem ogromna liczba struktur chemicznych o różnym czasie biologicznego półtrwania i różnej stabilności jest główną przyczyną braku selektywnych i wysoko czułych metod. Do tej pory do oznaczania białek glikowanych, produktów pośrednich, reaktywnych metabolitów lub swoistych zmodyfikowanych białek a także końcowych produktów glikacji wykorzystywane były metody kolorymetryczne, fluorescencyjne, immunochemiczne, chromatografii gazowej czy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrem masowym. Najbardziej istotny z klinicznego punktu widzenie byłby pomiar końcowych produktów glikacji a nie ich pośrednich produktów. Istotnym utrudnieniem dla analityka jest egzogenne pochodzenie wielu produktów glikacji a ich stężenie stanowi wypadkową wielu równoległych i konkurencyjnych reakcji chemicznych. Należy mieć nadzieję, że zastosowanie proteomiki to oznaczania AGEs z pewnością będzie milowym krokiem w zrozumieniu procesu nieenzymatycznej glikacji i pozwoli na wprowadzanie nowych terapii znanych chorób.

WYKŁADY NA SESJACH N AUKOWYCH

I. NOWE TECHNOLOGIE I PRZYKŁADY ICH ZASTOSOWANIA - Mikromacierze, nanotechnologia, lab on a chip. Urszula Demkow Mikromacierze (microarray) to miniaturowe układy hybrydyzacyjne składające się z różnego typu sond rozpoznających fragmenty genów, transkryptów lub białek. Poziom ekspresji badanych genów, transkryptów lub obecność protein ocenia się mierząc natężenie emitowanej punktowo fluorescencji. Pomiaru dokonuje się za pomocą odpowiedniego analizatora. Mikromacierze mogą one służyć zarówno do analizy strukturalnej jak i czynnościowej genomu, transkryptomu lub proteomu. Mikromacierze znajdują coraz szersze zastosowanie w wielu dziedzinach biologii i medycyny, w tym w rutynowej diagnostyce. Zaletą techniki mikromacierzy w diagnostyce jest znaczne przyspieszenie procesu analitycznego, synchronizacja wielu oznaczeń w jednym czasie oraz niewielka ilość niezbędnego do analizy materiału. Mikromacierze są przydatnym narzędziem do badań genomu. Stwarzają możliwości poznania sekwencji materiału genetycznego, mapowania genomu oraz określenie zależności wewnątrz genomu. Mikromacierze mają potencjalnie bardzo szerokie znaczenie w onkologii. Wzorce ekspresji genów umożliwiają bardziej precyzyjną stratyfikację chorych. Analiza proteomu komórki może mieć również duże znaczenia diagnostyczne i poznawcze. Mikromacierze mogą służyć jako metoda badawcza ułatwiająca identyfikację istotnego punktu uchwytu dla leku hamującego wzrost guza. Badania można prowadzić in vitro na wyizolowanych od chorego komórkach nowotworowych. Farmakogenomika nowotworów pozwala na odkrycie nowych leków przeciwnowotworowych oraz molekularnych celów dla nich na podstawie poznania mechanizmu onkogenezy. Technika mikromacierzy stała się jednym z ważniejszych narzędzi farmakogenomiki. Nanotechnologia zajmuje się obiektami o rozmiarach w granicach od 1 do 100 nanometrów. Rozwój nanotechnologii możliwy był dzięki rozwojowi skaningowej mikroskopii tunelowej, pozwalającej oglądać obiekty wielkości atomów. Obiekt zbudowany z tych samych atomów w skali makroskopowej ma zupełnie inne, obserwowane w naszym codziennym życiu właściwości. Przy rozdrobnieniu do wielkości cząstek rzędu nanometrów pojawiają się nowe cechy fizyczne. Wynikają one z dużego stosunku powierzchni cząstek w stosunku do zajmowanej przez nie objętości. Nanodiagnostyka polega na zastosowaniu urządzeń pracujących w nanoskali. Pozwalają one na znaczne zwiększenie czułości metody i przyspieszenie procesu analitycznego. Przykładem miniaturyzacji urządzeń pomiarowych może być laboratorium na szkiełku (lab –on a chip). Wykorzystując taką technologię kilkadziesiąt tysięcy reakcji biochemicznych dziennie można przeprowadzić za pomocą układu mikroprzepływowego wielkości karty kredytowej. Reakcje zachodzą we wnętrzach drobnych kropel, przesuwających się wzdłuż odpowiednio zaprojektowanych kanalików. Objętości kropel są kontrolowane za pomocą komputera. Przy małych objętościach przepływ jest laminarny co ułatwia kontrolowanie przebiegu reakcji. Układy wytwarzające kropelki są proste i tanie, substancje w mikrokanalikach doskonale się mieszają, a ich przepływ zazwyczaj jest wymuszany różnicą ciśnień. Pomimo ogromnych sukcesów nowych technologii znaczący postęp techniczny nie idzie jeszcze w parze z zastosowaniami klinicznymi. Stopień skomplikowania analiz, złożoność i koszt aparatury oraz trudności związane ze złożoną analizą biostatystyczną stanowią wciąż ogromne wyzwanie. Możliwości aplikacyjne LC-MRM/MS do rutynowego oznaczenia stężenia białek i peptydów w osoczu, moczu oraz tkance Dominik Domański W ciągu ostatnich dwudziestu lat biochemia białek została zrewolucjonizowana dzięki rozwojowi nowych technologii spektrometrii mas tworząc dziedzinę zwaną proteomiką. Badania proteomów różnych organizmów za pomocą spektrometrii mas pozwoliły na identyfikację i pomiar stężenia tysięcy białek, badanie ich posttranslacyjnych modyfikacji oraz analizę ich struktury. Globalne analizy proteomiczne doprowadziły do identyfikacji potencjalnych biomarkerów wielu chorób, w tym markerów chorób nowotworowych, chociaż większość z nich czeka na walidacje za pomocą bardziej specyficznych metod. Przed kilku laty w proteomice powstał nowy sposób analizowania prób, zwany

analizą ukierunkowaną- Multiple Reaction Monitoring (MRM). Zastosowanie tej analizy spowodowało znaczny wzrost liczby prowadzonych badań proteomicznych m.in. dotyczących walidacji biomarkerów, dzięki możliwości dokładnego pomiaru ilościowego konkretnych białek w bardzo zróżnicowanym materiale biologicznym organizmów (począwszy od roślin po płyny ustrojowe człowieka). Do zalet metody MRM należy krótki czas analizy (poniżej jednej godziny) oraz jej wysoka wydajność. Co więcej, dzięki możliwości użycia syntetycznych peptydów wyznakowanych ciężkimi aminokwasami i nowoczesnych spektrometrów mas, analiza MRM pozwala na pomiar białek ze specyficznością, precyzją, powtarzalnością oraz czułością nieosiągalną dla innych metod analitycznych w biochemii. Aplikacje tej innowacyjnej, ilościowej techniki proteomicznej zostaną przedstawione w oparciu o przykłady oznaczeń stężenia białek i peptydów w osoczu, moczu oraz tkance w badaniach naukowych z potencjalnymi możliwościami zastosowań w rutynowych laboratoriach diagnostycznych w przyszłości. Ilościowe oznaczenia za pomocą LC-MS/MS w materiale klinicznym panelu leków immunosupresyjnych Leszek Pączek Streszczenia nie dostarczono Możliwości zastosowania HPLC i LC-MS/MS w rutynowym oznaczaniu metabolitów witaminy D oraz paneli hormonów sterydowych. Zbigniew Bartoszewicz W rutynowej diagnostyce medycznej stężenia metabolitów witaminy D oraz hormonów sterydowych są najczęściej oznaczane za pomocą testów immunochemicznych. Używane w testach przeciwciała wykazują różne powinowactwo w stosunku do poszczególnych izoform mierzonego analitu oraz mogą reagować krzyżowo z innymi związkami znajdującymi się w badanym materiale biologicznym, co wpływa na wiarygodność otrzymywanych wyników. Z pośród wielu metabolitów witaminy D najczęściej oznaczane jest stężenie jej 25-hydroksylowanej formy (25OHD, kalcidiol), która najlepiej odzwierciedla status witaminy D w organizmie. W surowicy dominującą jest izoforma 25OHD3 (cholekalcidiol), jakkolwiek w zależności od rodzaju stosowanej diety, trybu życia i rodzaju suplementacji izoforma 25OHD3 (ergokalcidiol) może stanowić znaczny udział. Dodatkowo u niemowląt występuje forma epimeryczna C-3 -hydroxy epimer -25OHD. Przeciwciała w testach immunochemicznych w różnym stopniu rozpoznają 25OHD3, 25OHD2 i C-3 epimer, reagują krzyżowo z formami laktonowymi oraz innymi metabolitami np. z 24,25-dihydroksy witaminą D. Z tego powodu wyniki pomiaru stężenia 25OHD wykonane testami immunochemicznymi różnych producentów mogą znacznie od siebie odbiegać co obserwuje się w międzynarodowym programie kontroli jakości (Vitamin D External Quality Assessment Scheme -DEQAS). W konsekwencji znaczące dysproporcje w wynikach stężeń 25(OH)D mogą mieć wpływ na podejmowanie odmiennych decyzji dotyczących leczenia danego pacjenta. Powyższych problemów można uniknąć stosując do pomiarów stężeń wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężona z tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS). Obecnie stosowane kolumny chromatograficzne pozwalają na rozdział 25OHD3, 25OHD2 i C-3 epimeru, a po ich zjonizowaniu w trybie monitorowania wybranych reakcji MRM - Multi Reaction Monitoring w spektrometrii mas poddaniu analizie powstałych z jonów macierzystych charakterystycznych dla danego analitu jonów fragmentacyjnych (potomnych). Wyniki pomiaru stężenia 25OHD metodą LC-MS/MS w programie DEQAS wykazują wyższą wiarygodność w porównaniu z metodami immunochemicznymi. Dodatkowo w badanej próbce można określić udział poszczególnych izoform 25OHD3, 25OHD2 oraz C-3 epimeru. Diagnostyka wielu ważnych chorób układu endokrynnego bazuje na oznaczeniach stężeń wybranych hormonów steroidowych testami immunochemicznymi i jest obarczona błędami wynikającymi z interakcji przeciwciał używanych w testach z lekami (np. spirolaktonem) oraz metabolitami hormonów steroidowych o zbliżonej strukturze chemicznej. Niektóre testy immunochemiczne np. do oceny stężenia dihydrotestosteronu oraz 21-deoksykortyzolu - najbardziej specyficznego metabolitu dla rozpoznania wrodzonego przerostu nadnerczy (WPN) są trudno dostępne. Zastąpienie testów immunochemicznych metodą LC-MS/MS pozwala na usprawnienie diagnostyki poprzez oznaczanie w jednej analizie stężeń niezbędnych paneli hormonów sterydowych oraz porównanie ich stosunków ilościowych. Wprowadzenie metody LC-MS/MS do rutynowej diagnostyki medycznej na świecie stało się faktem ponieważ dysponuje ona możliwościami niedostępnymi dla obecnie stosowanych metod, pozwalając

przy okazji uniknąć błędów z nimi związanych. Polska w tym zakresie znacznie pozostaje w tyle za USA i zachodnią częścią Unii Europejskiej.

II. BADANIA W MIEJSCU OPIEKI NAD PACJENTEM Badania w miejscu opieki nad pacjentem – koncepcja, zalecenia, regulacje Bogdan Solnica Rozwój metod intensywnej opieki medycznej (oddech wspomagany i zastępczy, wspomaganie krążenia, rewaskularyzacja niedokrwionego myocardium i in.) oraz rosnąca liczba innych procedur klinicznych stwarzają potrzebę radykalnego skrócenia czasu oczekiwania na wyniki badań laboratoryjnych (TAT, turn-around time), a często wyników w czasie rzeczywistym. Wykonywanie badań w laboratorium, z fazą przedanalityczną, analityczną i poanalityczną, często nie może zapewnić wymaganego TAT. Najbardziej efektywnym sposobem skrócenia TAT i otrzymywania wyników badań w czasie rzeczywistym jest wykonywanie ich w miejscu opieki nad pacjentem (POCT, point-of-care testing). Koncepcja POCT rozwijana jest od końca lat 1980. i obecnie ten sposób wykonywania badań jest nieodwracalnym trendem w diagnostyce laboratoryjnej. Konsekwencją przeniesienia wykonywania badań do miejsc opieki nad pacjentem było stworzenie nowej kategorii aparatury laboratoryjnej – obecnie ten segment rynku IVD rozwija się najszybciej. Istotnymi aspektami POCT są kwalifikacje personelu wykonującego te badania oraz system jakości. Wskazania do wykonywania badań w trybie POCT oraz zalecana ich organizacja zostały opisane w zaleceniach praktyki medycyny laboratoryjnej, jak np. w wydawnictwie amerykańskiej NACB z 2006. „Evidence-based Practice for Point-of-Care Testing”. Są one również przedmiotem zapisów normy PN-EN ISO 22870 z 2007. “Badania w miejscu opieki nad pacjentem. Wymagania dotyczące jakości i kompetencji. Warto podkreślić, że zarówno zalecenia NACB jak I polaska norma przewidują aktywny udział i odpowiedzialność centralnego laboratorium placówki służby zdrowia w zakresie organizacji i wyposażenia stanowisk POCT oraz szkolenia i kontroli jakości. Czynniki determinujące jakość badań POCT Jan Kanty Kulpa Badania laboratoryjne stały się, niezbędnym elementem medycyny klinicznej, obserwuje się dynamiczny wzrost zapotrzebowania na wyniki badań laboratoryjnych, na poszerzenie zakresu badanych parametrów. Diagnostyka laboratoryjna jest jedną z dziedzin medycyny o wyjątkowo rozbudowanym systemie kontroli jakości wykonywanych badań. Międzynarodowe normy (ISO 17025 jak i ISO 15189) wyraźnie precyzują wzorce, których spełnienie zwiększa prawdopodobieństwo wiarygodnych wyników, a akty legislacyjne nakładają na medyczne laboratoria diagnostyczne obowiązek ich wdrażania. Konsekwencją rozwoju metod intensywnej opieki medycznej, którego od szeregu lat jesteśmy świadkami jest znaczący – tak pod względem liczby jak i asortymentu wykonywanych badań – rozwój działu badań diagnostycznych wykonywanych przy łóżku chorego (point of care testing – POCT), których podstawową zaletą jest minimalizacja czasu oczekiwania na wynik. Stwarza to określone wymagania odnośnie technik i aparatury pomiarowej stosowanych przy wykonywania tego typu badań. Przy pełnym zrozumieniu dla znaczenia wyników POCT w intensywnej opiece medycznej, należy być świadomym zagrożeń, jakie ten tryb wykonywania badań stwarza dla ich wiarygodności. Minimalizacja – prawie do zera - czasu trwania fazy przedanalitycznej bynajmniej nie zapewnia eliminacji, przynajmniej niektórych czynników, które mogą być przyczyna błędnego wyniku badania. W fazie pomiarowej, pomimo jej znacznej automatyzacji i ograniczenia czynności, istotny problem stanowią ograniczenia profesjonalnych umiejętności wykonawców badań, brak systemów kontrolnych jak i autoryzacji wyników badań, problemy z elektroniczną dokumentacja wyników badań. W fazie poanalitycznej brak istotnych informacji dotyczących pacjenta może stwarzać trudności dla prawidłowej interpretacji wyników badań. Świadomość tych wszystkich ograniczeń leży u podstaw określenia roli i wymagań, jakie stawiane są przed medycznym laboratorium diagnostycznemu w zakresie pomocy i opieki nad badaniami wykonywanymi w trybie POCT, obejmującymi zarówno udział w wyborze aparatury pomiarowej, szkoleniu kadr, jak i przygotowaniu instrukcji wykonawczych, systematycznej kontroli wykonawstwa

badań oraz procedur konserwacyjnych. Należy mieć pełną świadomość, ze tylko wówczas wynik badania w trybie POCT jest bezpieczny i wnoszący istotne informacje dla podejmowania decyzji w trakcie intensywnej opieki medycznej, jeżeli jest wiarygodny. Laboratoryjne parametry krytyczne w stanach zagrożenia życia, ich przydatność w szpitalnym oddziale ratunkowym i oddziale intensywnej terapii. Wojciech Gaszyński W stanach zagrożenia życia pacjentów leczonych w Szpitalnym Oddziale Ratunkowym (SOR) i w Oddziale Intensywnej Terapii (OIT) poza badaniem przedmiotowym poszkodowanego , kluczową rolę w szybkiej diagnostyce a tym samym w stabilizacji stanu chorego odgrywają badania laboratoryjne wykonywane przyłóżkowo w SOR i OIT. Badania te określane jako „laboratoryjne parametry krytyczne” powinne być wykonane w pierwszej kolejności po badaniu podmiotowym (jeżeli wywiad jest możliwy) i badaniu przedmiotowym (ocena fizykalna) w stanach krytycznych u chorego przed dalszą szczegółową diagnostyką, bowiem w oparciu o wyniki tych badań wdrażane są określone procedury ratunkowe diagnostyczno-lecznicze. Do „laboratoryjnych parametrów krytycznych” wykonywanych przyłóżkowo w SOR w zależności od stanu pacjenta zaliczamy:

1. U wszystkich pacjentów nieprzytomnych, konieczne jest natychmiastowe oznaczenie stężenia glukozy we krwi;

2. U wszystkich chorych bladych, z przyśpieszonym tętnem, niskim lub nieoznaczalnym ciśnieniem tętniczym krwi konieczne jest natychmiastowe oznaczenie stężenia hemoglobiny i wartości hematokrytu;

3. U wszystkich chorych z zaburzeniami rytmu serca , konieczne jest natychmiastowe oznaczenie stężenia jonów potasu we krwi;

4. U wszystkich chorych z bólami w klatce piersiowej, konieczne jest wykonanie natychmiastowe oznaczenia enzymów sercowych;

5. U wszystkich chorych z zaburzeniami oddechowymi, konieczne jest wykonanie natychmiastowe gazometrii krwi z uwzględnieniem met-hemoglobiny i stężenia CO;

Do „laboratoryjnych parametrów krytycznych” wykonywanych przyłóżkowo w OIT poza wymienionymi wyżej wykonywanymi w SOR w zależności od stanu pacjenta zaliczamy:

1. U wszystkich chorych z zaburzeniami oddechowymi wentylowanymi mechaniczni, konieczne jest wykonywanie przyłóżkowe gazometrii krwi z uwzględnieniem równowagi kwasowo zasadowej i wodno-elektrolitowej;

2. U wszystkich chorych z ciągłą terapią nerkozastępczą z użyciem cytrynianów, konieczne jest oznaczanie przyłóżkowe wapnia zjonizowanego;

3. U wszystkich chorych z punktacją APACHE II > 15 pkt., konieczne jest wykonywanie przyłóżkowe stężenia glukozy we krwi.

4. U wszystkich chorych z objawami krwawienia, powinno się wykonywać przyłóżkowo badania tromboelastograficzne;

Uzasadnieniem dla wykonywania badań laboratoryjnych przyłóżkowych są stany zagrożenia życia i konieczność podjęcia natychmiastowej terapii. Decyduje czas otrzymania wyniku badania a tym samym podjęcia decyzji terapeutycznej. Rola diagnosty w organizacji badań POCT Alicja Utracka Centralne Laboratorium Kliniczne Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku, w odpowiedzi na potrzeby klinicystów w zakresie otrzymywania niektórych wyników badań laboratoryjnych w czasie rzeczywistym, stworzyło sieć punktów do oznaczeń parametrów krytycznych. W całym szpitalu stworzono jednolity system. System ten jako koncepcja POCT (Badania w miejscu opieki nad pacjentem) jest nadal rozwijany. Do takiego rozwiązania w dużej mierze przyczyniło się rozproszenie klinik na terenie całego szpitala i oddalenie ich od laboratorium centralnego co uniemożliwiało wcześniej szybkie wykonywanie analiz. W 2005 roku we współpracy klinicystów z diagnostami laboratoryjnymi, po rozpoznaniu rynku z zakresu aparatury diagnostycznej rozpoczęto wdrażanie projektu. Zainstalowano wówczas w klinikach 5 analizatorów (na dzień dzisiejszy 12 analizatorów POCT). Od początku główną rolę we wdrożeniu systemu (przygotowanie specyfikacji przetargowej, określenie zakresu wykonywanych badań na

analizatorach, ich instalacje na oddziałach, kalibracje, system kontroli, konserwacje, serwis techniczny, zabezpieczenie w odczynniki, szkolenia personelu, nadzór nad systemem informatycznym) pełnili diagności laboratoryjni. Wdrożono system zarządzania jakością i Standardowe Procedury Badawcze (SOP) spójne dla klinik i laboratorium. Za nadzór nad badaniami odpowiadają diagności Centralnego Laboratorium Klinicznego. Stworzono stanowisko Asystenta Opiekuna Analiz Krytycznych odpowiedzialnego za ten obszar. Jego głównym zadaniem jest zabezpieczenie prawidłowego działania wszystkich analizatorów, wydawanie wiarygodnych wyników. Odpowiada on za ciągłe, nieustanne szkolenia i podnoszenia kwalifikacji personelu wykonującego badania na oddziałach ( lekarze, pielęgniarki, ratownicy medyczni). Wszystkie analizatory zostały połączone w jeden system informatyczny nadzorujący ich pracę. Diagnosta laboratoryjny za jego pomocą może monitorować prawidłowość pracy poszczególnych aparatów. W systemie tym widoczne są aktualne statusy analizatorów. Możliwa jest zdalna interwencja diagnosty w poszczególne analizatory. System umożliwia kontakt z osobą obsługującą aparat POCT za pomocą komunikatora na ekranie analizatora. Program nadzoru nad analizatorami komunikuje się dwukierunkowo z systemem laboratoryjnym. Przesyła dane pacjentów i ich wyniki do Laboratoryjnego Systemu Informatycznego, który jest połączony w sieci ze szpitalnym systemem informatycznym. Rozwój POCT jest nieunikniony i jest nowym obszarem do działania dla diagnostów laboratoryjnych. Wdrażanie w szpitalu systemu POCT jest przykładem na to jak nowoczesne laboratorium medyczne powinno szybko identyfikować i reagować na potrzeby odbiorców wyników badań laboratoryjnych. Takie działania są jednocześnie wspomagane regulacjami prawnymi tj. Rozporządzeniem Ministra z dnia 15 marca 2007 r. w sprawie szpitalnego oddziału ratunkowego jak też normą ISO 22870 „Badania w miejscu opieki nad pacjentem. Wymagania dotyczące jakości i kompetencji”

III. ASPEKTY ANALITYCZNE I KLINICZNE ZABURZEŃ FUNKCJI NEREK

Markery nerkowe jako wskaźniki ryzyka pozanerkowego Zbigniew Gaciong Przewlekła choroba nerek stanowi niezależny od poznanych, „tradycyjnych” czynników ryzyka wskaźnik zwiększonego ryzyka choroby wieńcowej, jak również powikłań u osób z już istniejącą chorobą układu krążenia. Zarówno zmniejszenie wielkości przesączania kłębuszkowego, jak i obecność białkomoczu wskazują na wzrost zagrożenia zdarzeniami sercowo-naczyniowymi, a zależność pomiędzy ryzykiem a wymienionymi parametrami ma charakter ilościowy i ciągły. Wzrost zagrożenia powikłaniami ze strony układu krążenia tłumaczy się częstym występowanie „tradycyjnych” czynników ryzyka, takich jak nadciśnienie tętnicze, palenie tytoniu, cukrzyca, hiperlipidemia i podeszły wiek, u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Ponadto, w zaawansowanych stadiach niewydolności nerek, dodatkowo mogą niekorzystnie oddziaływać zaburzenia typowe dla mocznicy – obecność toksyn mocznicowych, niedokrwistość, zaburzenia gospodarki wapniowo-fosforanowej, kwasica i in. Nie można również wykluczyć, że objawy uszkodzenia nerek wynikają ze zmian naczyniowych, które występują także w innych narządach, stąd białkomocz czy spadek GFR mogą być wskaźnikiem a nie czynnikiem ryzyka. Dane z dużych badań epidemiologicznych dowodzą, że wzrost ryzyka ma miejsce już w początkowych okresie przewlekłej choroby nerek, nawet gdy wartości stężenia kreatyniny pozostają w zakresie wartości referencyjnych dla zdrowej populacji. Podobnie, wzrost wydalania albumin, nawet niewielki - nie spełniający kryteriów mikroalbuminurii, zwiastuje zwiększone zagrożenie. Dlatego od kilku lat powszechnie zaleca się ocenę czynności nerek w oparciu o wyliczany wskaźnik przesączania kłębuszkowego (eGFR). Spośród popularnych wzorów (MDRD, Cocrofta-Gaulta, Schwartza) najbardziej dokładny wydaje się zaproponowany niedawno kalkulator CKD-EPI. Należy pamiętać, że powyższe kalkulatory eGFR zostały opracowane w oparciu o dane pochodzące od określonych grup pacjentów, co ogranicza ich przydatność w szeregu populacjach, jak osoby starsze, dzieci, ciężarne. Bardziej dokładną ocenę czynności nerek – i tym samym lepsze określenie ryzyka sercowo-naczyniowego zapewnia pomiar stężenia cystatyny C. Stężenie tego białka, które jest naturalnym inhibitorem proteaz, nie zależy od masy mięśniowej i wcześniej niż kreatynina, „reaguje” na zmiany wielkości przesączania kłębuszkowego. Poszukuje się lepszych nerkowych „markerów” ryzyka i pewne obserwacje wskazują, że niektóre krążące w surowicy białka (np. beta2-mikroglobulina) mogą okazać się przydatne do tego celu.

Objawy łagodnej choroby nerek w większym stopniu wskazują na zagrożenie powikłaniami sercowo-naczyniowymi aniżeli ryzyko rozwoju schyłkowej niewydolności nerek. Epidemia chorób układu krążenia nakazuje ocenę czynności nerek (eGFR) i pomiar białkomoczu u każdego pacjenta, natomiast ciągle poszukuje się lepszych bardziej czułych i swoistych markerów. Czy są troponiny nerkowe? Jolanta Małyszko Dotychczasowe definicje ostrego uszkodzenia nerek (acute kidney injury-AKI) opierają się o wzrost stężenia kreatyniny w surowicy, a nie o spadek GFR. Z badań wiadomo, że wzrost kreatyniny pojawia się późno i ulec musi uszkodzeniu co najmniej połowa nefronów, aby znalazło to odbicie we wzroście stężenia kreatyniny. Dlatego też poszukuje się wczesnych markerów uszkodzenia nerek w celu identyfikacji tych pacjentów. Dotyczy to nie tylko uszkodzenia wywołanego kontrastem, ale też uszkodzenia nerek po leczeniu cytostatykami, po transplantacji nerek oraz dużych zabiegach, w tym kardiochirurgicznych. Problem dotyczy więc dużej grupy pacjentów, u których istnieje prawdopodobieństwo wystąpienia ostrego uszkodzenia nerek. O potrzebie czułego i specyficznego biomakera (ów) AKI świadczy przykład ostrych zespołów wieńcowych. W przeciwieństwie do ONN/AKI , gdzie nadal od końca lat 50-tych XX wieku praktycznie nic się nie zmieniło i nadal podstawą rozpoznania jest oznaczanie stężeń kreatyniny, a śmiertelność nadal jest wysoka W przypadku zaś ostrych zespołów wieńcowych rzecz ma się zupełnie. Co kilka lat pojawiały się nowe markery (LDH, CK, CK-MB, Mioglobina, Troponina T, Troponina I) co pozwoliło na poprawę diagnostyki OZW. Przejawiło się to zarazem znacznym zmniejszeniem śmiertelności u tych chorych. Ocena stężenia troponiny uwalnianej z uszkodzonych miocytów umożliwia szybkie rozpoznanie OZW, pozwala na interwencję terapeutyczną w odpowiednim czasie i w konsekwencji dramatyczny spadek śmiertelności. Wczesne rozpoznanie AKI jest pomocne w prowadzeniu dotychczasowego leczenia (unikanie leków nefrotoksycznych, adekwatne prowadzenie bilansu płynów) oraz w rozwoju nowych form leczenia. Istnieje również bezpośrednia korelacja pomiędzy czasem trwania niewydolności nerek a śmiertelnością. Wczesne rozpoznanie umożliwi czasowe wprowadzenie metod leczenia uszkodzenia nerek i zapobiegania progresji- jednakże jak wynika z badań doświadczalnych i u ludzi „okno możliwości terapeutycznych” jest wąskie. Należy także rozważyć ocenę stężenia biomarkerów jako wtórnych punktów końcowych, kryteriów włączenia do badań oraz bezpieczeństwo stosowania leków tj ocenę potencjalnej neurotoksyczności. Obecnie trwają intensywne prace nad znalezieniem biomarkera lub kilku biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek. Biomarkery AKI obecnie oceniane: NGAL (osocze/surowica i mocz), KIM-1 (mocz), L-FABP (mocz), IL-18 (mocz), cystatyna C (osocze/surowica, mocz), albumina (mocz), NAG (mocz), GST α i π (mocz), GGT (mocz), beta-2-mikroglobulina (mocz), midkine (osocze/surowica), hepcydyna (osocze/surowica, mocz), renalaza (surowica, osocze). Z tych wielu badanych biomarkerów obecnie największym obiektem zainteresowania jest NGAL. Wyniki uzyskane w wielu badaniach klinicznych wykazują iż NGAL jest dobrym, obiecującym markerem wczesnego uszkodzenia nerek. Niestety nie pozbawiony jest też wad. Ograniczeniem jest jego występowanie poza nerką. Jego bardzo niskie stężenie wykryto w kilku innych narządach, tchawicy, płucach, żołądku i jelicie grubym . Wzrost stężenia NGAL w surowicy odnotowano np. w ostrej infekcji bakteryjnej. Na temat pełnej przydatności NGAL powiedzą nam przeprowadzane obecnie duże badania kliniczne, wtedy uzyskamy odpowiedź czy może on być troponiną w nefrologii. Rola badań laboratoryjnych w dializoterapii Jerzy Przedlacki Wyniki badań laboratoryjnych są istotne przy podejmowaniu decyzji o rozpoczęciu leczenia dializami i przy ocenie skuteczności i bezpieczeństwa dializoterapii. Służą ocenie wielu ważnych życiowo parametrów, w tym gospodarki żelazowej (problem niedokrwistości), wapniowo-fosforanowej, ocenie stanu zapalnego i niedożywienia. Nie jest możliwe bezpieczne prowadzenie Ośrodka Dializ bez ścisłej współpracy z lokalnym laboratorium. Kwalifikacja do leczenia dializami: Jest ona oparta jest na ocenie stanu klinicznego pacjenta i wynikach niektórych badań laboratoryjnych. Wartość eGFR (z wykorzystaniem stężenia kreatyniny w surowicy) poniżej 10-15 ml/min/1,73m

2 jest najczęściej uznawana za wskazanie do rozpoczęcia

leczenia dializami chorych z przewlekłą chorobą nerek. Innymi uwzględnianymi badaniami są: stężenie potasu (>6,5 mmol/l) i mocznika (>250 mg/dl) w surowicy oraz kwasica metaboliczna (HCO3 <13 mmol/l). Istotna jest również ocena stanu odżywienia oparta na wyniku stężeniu albumin we krwi,

cholesterolu, transferryny, rzadziej somatomedyny C i prealbumin. W ostrym uszkodzeniu nerek graniczne wartości eGFR kwalifikujące do rozpoczęcia dializoterapii są najczęściej wyższe (<20-25 ml/min/1,73 m

2), a mocznika niższe (>140-200 mg/dl).

Kontrolne badania laboratoryjne w trakcie dializoterapii: Badania laboratoryjne są, obok stanu klinicznego, podstawowym sposobem oceny skuteczności i bezpieczeństwa leczenia dializami. Zakres badań u pacjentów leczonych dializą otrzewnową i hemodializą jest praktycznie taki sam. Krew u pacjentów hemodializowanych jest najczęściej pobierana przed hemodializą, a u pacjentów dializowanych otrzewnowo w godzinach rannych. Pacjenci leczeni dializami wymagają znacznie częstszych kontrolnych badań laboratoryjnych niż w ogólnej populacji. Poszczególne Ośrodki Dializ wprowadziły różne modyfikacje w zakresie wykonywanych badań, szczególnie dotyczące odstępów pomiędzy nimi. W badaniach comiesięcznych przed hemodializą dializą wykonywane jest oznaczenie morfologii krwi, stężenia w surowicy: mocznika kreatyniny, sodu, potasu, wapnia, fosforanów, CRP. Po dializie oznaczane jest stężenie mocznika, kreatyniny, sodu i potasu. W badaniach wykonywanych co 3 miesiące, poza wymienionymi wcześniej, oznaczane jest w surowicy stężenie: kwasu moczowego, glukozy, cholesterolu i jego frakcji HDL i LDL, triglicerydów, parathormonu (intact-PTH), żelaza, TIBC, ferrytyny, białka całkowitego, albumin, HbA1c. Oznaczana jest też aktywność w surowicy transaminaz alaninowej i asparaginowej, gammaglutamylotranspeptydazy, fosfatazy zasadowej. Pacjenci dializowani otrzewnowo mają częściej niż hemodializowani oznaczane stężenie albumin. Dodatkowe badania zależą od indywidualnych wskazań. Interpretacja wyników badań laboratoryjnych w dializoterapii: Większość wyników badań laboratoryjnych jest interpretowana tak jak w ogólnej populacji. Istnieją jednak odstępstwa od tych zasad, które nakazują przyjąć inne wartości optymalne. Zgodnie z zaleceniami towarzystw nefrologicznych optymalne stężenie intact-PTH w surowicy mieści się w zakresie 2-9 krotnej górnej granicy normy dla danego testu, przy stabilnych wartościach kontrolnych badań. Wartości stężenia intact-PTH powyżej lub poniżej optymalnego stężenia są wykładnikiem m.in. zwiększonego ryzyka klinicznie jawnej osteodystrofii nerkowej. Optymalne stężenie hemoglobiny jest niższe niż w ogólnej populacji i wynosi 10-11,5 g/dl. Wyższe wartości hemoglobiny wiążą się ze zwiększonym ryzykiem złej kontroli ciśnienia tętniczego oraz powikłaniami zakrzepowymi. Przydatność badań laboratoryjnych w dializoterapii: Wyniki badań laboratoryjnych pozwalają modyfikować leczenie dializami i leczenie farmakologiczne. Są istotne przy podejmowaniu decyzji o rozpoczęciu leczenia dializami i przy ocenie skuteczności i bezpieczeństwa dializoterapii. Służą ocenie wielu ważnych życiowo parametrów, w tym gospodarki żelazowej (problem niedokrwistości), wapniowo-fosforanowej, ocenie stanu zapalnego i niedożywienia. Nie jest możliwe bezpieczne prowadzenie Ośrodka Dializ bez ścisłej współpracy z lokalnym laboratorium. Problemy analityczne oznaczeń kreatyniny Dagna Bobilewicz Kreatynina jest jednym z najczęściej wykonywanych badań laboratoryjnych, a pierwsze próby oznaczeń klasyczną metodą Jaffe pojawiły się na początku XX wieku. Obecnie metodą referencyjną oznaczania stężenia kreatyniny jest metoda spektrometrii masowej z rozcieńczeniami izotopowymi (Isotope Dilution Mass Spectrometry – IDMS). Metoda ta nie nadaje się do stosowania rutynowego natomiast zgodnie z ustaleniami miedzynarodowymi obowiązkiem producentów zestawów jest standaryzacja wszystkich innych wersji odczynnikowych właśnie wobec IDMS. Przez wiele lat do oznaczeń rutynowych wykorzystywano reakcję w której powstaje pomarańczowo czerwony barwnik pomiędzy kreatyniną a kwasem pikrynowym w środowisku alkalicznym /reakcja Jaffe/. Ilość wytworzonego barwnika jest proporcjonalna do stężenia kreatyniny w badanej próbce. Pomiaru wytworzonej barwy dokonuje się przy długości fal około 500 – 520 nm. Reakcja Jaffe nie jest swoista wyłącznie dla kreatyniny. Aceton, ketokwasy i białka tworzą dodatkowy kompleks z kwasem pikrynowym zawyżając wynik oznaczenia. Fałszywie zawyżone wyniki uzyskuje się także w próbkach z wysokim stężeniem glukozy, kwasu askorbinowego, kwasu moczowego oraz cefalosporyny. Z kolei w próbkach ze znaczną bilirubinemią /próbki żółtaczkowe/ uzyskuje się wyniki fałszywie zaniżone. Znajomość zachodzących nieprawidłowości doprowadziła do powstania szeregu modyfikacji metody. Dużym powodzeniem cieszy się obecnie wersja kinetyczna w której dokonuje się kilkakrotnych pomiarów przyrostu absorbancji w krótkich odcinkach czasu. Prowadzi to do eliminacji wielu czynników interferujących, których kinetyka reakcji jest odmienna od kinetyki reakcji z kreatyniną. Odmienną grupę stanowią tzw. metody z kompensacją w których także częściowo udało się

wyeliminować wpływ substancji interferujących, określanych jako Jaffe dodatnie. Nową grupę metod stanowią metody enzymatyczne. Wykorzystywane w nich enzymy: kreatyninaza, kreatynaza i oksydaza sarkozynowa przekształcają kreatyninę w glicynę, formaldehyd i nadtlenek wodoru. Powstały H2O2 jest rozkładany przez peroksydazę chrzanową z wytworzeniem aktywnej postaci tlenu. Pod jego wpływem dochodzi do utlenienia tzw. chromogenów i przekształcenia postaci bezbarwnych w barwne co daje możliwość pomiaru spektrofotometrycznego. Powszechnie znany hamujący wpływ piramidonu i uzyskiwane w jego obecności wyniki fałszywie zaniżone. Wymienione wyżej enzymy zostały wykorzystane także w metodzie określanej jako amperometryczna w której pomiar dokonywany jest przy pomocy specjalnej elektrody. W metodach z użyciem enzymów udało się wyeliminować wpływ większości substancji interferujących w oznaczenia z użyciem metody Jaffe. Oznaczenie stężenia kreatyniny dostępne jest w menu wszystkich analizatorów biochemicznych, a w niektórych, dostępne są obydwie metody. Rutynowo stężenie kreatyniny oznaczane jest w surowicy krwi i w moczu. Jako materiał do badania dopuszcza się także osocze. Wprowadzenie metody amperometrycznej dało możliwość wykonywania oznaczeń także we krwi pełnej, heparynizowanej. Jest ona dostępna w analizatorach parametrów krytycznych najnowszej generacji. Zastosowanie pomiaru amperometrycznego i specjalnej, półprzepuszczalnej membrany dla kreatyniny, pozwoliło dodatkowo na eliminację wpływu kwasu askorbinowego, bilirubiny, cyklosporyny, glukozy i hemoglobiny. W metodzie tej czas konieczny na uzyskanie wyniku skrócony jest do 1 – 2 minuty, bez konieczności wstępnego przygotowywania próbki. We wszystkich ulotkach dołączanych do zestawów odczynnikowych są wyszczególnione czynniki interferujące tym nie mniej w codziennej praktyce spotyka się niewytłumaczalne w jednoznaczny sposób różnice między metodami, co dotyczy najczęściej chorych w stanie ciężkim, otrzymujących jednoczasowo wiele preparatów drogą dożylną. Cystatyna C jako użyteczny marker? Marzena Iwanowska Cystatyna C jest uznawana jako marker przewlekłej choroby nerek, pozwalający na ocenę zmian jeszcze w okresie niezaawansowanych stadiów ich niewydolności, w przypadkach, kiedy stężenia kreatyniny lub eGFR MDRD nie są istotne diagnostycznie. Mając na uwadze fakt, że możliwości wprowadzenia oznaczeń cystatyny do badań rutynowych były ograniczone tak ze względu na metodykę jak i cenę ciągle nie ma wystarczających danych, umożliwiających wprowadzenie cystatyny do ogólnie zaakceptowanych procedur diagnostycznych. W piśmiennictwie dyskutowane są propozycje wykorzystania stężeń cystatyny i kreatyniny do wyliczeń eGFR. Z doświadczeń własnych nie wynika jednoznacznie przewaga oznaczeń cystatyny nad innymi parametrami u chorych z nadciśnieniem tętniczym, jak również w grupie osób z granicznymi wartościami eGFR MDRD (50 – 59ml/min)

IV. HIPOWITAMINOZA D – NOWE WYZWANIA DLA MEDYCYNY LABORATORYJNEJ

Vitamin D Status and Osteoporosis: Critical Decision Limits Howard A. Morris Current data demonstrate that vitamin D deficiency contributes to the aetiology of two metabolic bone diseases, osteomalacia and osteoporosis. Osteomalacia, or rickets in children, is the index disease of vitamin D deficiency and arises from a delay in mineralization. It can be resolved by normalising plasma calcium and phosphate homeostasis even if the vitamin D status remains depleted. The well characterised endocrine pathway of vitamin D metabolism and its activities are solely responsible for vitamin D regulating plasma calcium and phosphate homeostasis and therefore for protecting against osteomalacia. Clinical data indicate that plasma calcium homeostasis is markedly disrupted only when serum 25-hydroxyvitamin D levels fall below 20 nmol/L with decreased serum 1,25-dihydroxyvitamin D and intestinal calcium absorption with marked hypocalcaemia and secondary hyperparathyroidism.

In contrast a large body of clinical data support the concept that an adequate vitamin D status protects bone health by improving bone mineral density and reducing the risk of fracture. Adequate serum 1,25-dihydroxyvitamin D levels do not reduce the risk of osteoporotic fractures. The risk of hip fracture is markedly increased at levels of serum 25-hydroxyvitamin D below 50 nmol/L. Meta-analyses of randomised control trials strongly indicate that vitamin D in combination with calcium supplements reduce the risk of fractures in the institutionalised elderly. Meta-regression analyses of such data suggest that serum 25-hydroxyvitamin D levels above 75 nmol/L are required to achieve significant fracture reduction. Clinical bone histology studies support this value of serum 25-hydroxyvitamin D as necessary to optimise bone cell activities. A plausible mechanism for various activities of vitamin D arising from the various serum 25-hydroxyvitamin D levels is provide from studies on human bone cells in culture and animal models. 25-hydroxyvitamin D can be metabolised to 1,25-dihydroxyvitamin D by each of the major bone cells to activate VDR and modulate gene expression to reduce osteoblast proliferation and stimulate osteoblast and osteoclast maturation. These effects are associated with increased mineralization and decreased mineral resorption. Dietary calcium interacts with vitamin D metabolism at both the renal and bone tissue levels to direct either a catabolic action on bone through the endocrine system or an anabolic action through a bone tissue autocrine or paracrine system.

Wyzwania i trudności wynikające z suplementacji populacji polskiej w witaminę D. Roman Lorenc

α,25-dihydroksywitamina D [1,25(OH)2D] - aktywna forma witaminy D - należy do superrodziny hormonów regulujących ekspresję genów. Jej synteza ograniczana jest przez dostępność substratu - 25(OH)D. Dlatego właściwe stężenie 25(OH)D jest kluczowym elementem odpowiedniego zaopatrzenia organizmu w witaminę D dla manifestacji jej szerokiego spektrum działania. Stężenie 25(OH)D w surowicy w zakresie 30-50 ng/ml jest rekomendowane jako właściwe oraz bezpieczne, co dokumentują dane z badań dotyczących a) wysokiej ekspozycji na słońce, b) kinetyki 1-alfa-hydrolazy (CYP27B1), gdzie Km = 40 ng. Stężenia 25(OH)D poniżej 30 ng/ml wiążą się ze wzrostem częstości występowania różnych schorzeń, dlatego wartość ta uznana została za graniczną dla określenia niedoboru witaminy D. Górna granica właściwego zaopatrzenia organizmu w witaminę D została ustalona na poziomie 50 ng/ml 25(OH)D, chociaż przypadki toksyczności obserwowano niezwykle rzadko poniżej 200 ng/ml. Standardem oznaczania 25(OH)D w surowicy zgodnie z zasadami GLP (ang. Good Laboratory Practice) są metody automatyczne oceniające równocześnie stężenie 25(OH)D2 i 25(OH)D3 charakteryzujące się CV < 8% kontrolowane w systemie DEQAS (ang. The International External Quality Assessment Scheme for Vitamin D Metabolites). Wielkość odpowiedzi na zastosowaną suplementację witaminą D zależy od wyjściowego stężenia 25(OH)D oraz składu ciała (masa ciała, BMI). U pacjentów zagrożonych niedoborem witaminy D proponuje się stosowanie terapii spersonalizowanej. Suplementacja poprzez syntezę skórną musi być zawsze brana pod uwagę, jako bezpieczne i naturalne źródło witaminy D. Niedostateczna synteza skórna wymaga uzupełnienia suplementami w dawkach 1000-2000 IU/dzień (górna bezpieczna dawka 4000 IU/dzień). Stężenie 25(OH)D w surowicy w zakresie 30-50 ng/ml wskazuje na adekwatne zaopatrzenie organizmu w witaminę D, zapewniające dostępność substratu do odpowiedniej produkcji 1,25(OH)2D dla jej endokrynnego i parakrynnego działania.

Standaryzacja oznaczeń witaminy D Elżbieta Karczmarewicz

W ramach programu Vitamin D Standardization Program (VDSP) wprowadzono standaryzację oznaczeń 25(OH)D w surowicy, która spełnia kryteria dla oznaczeń endokrynologicznych. Ocena zaopatrzenia organizmu w witaminę D winna opierać się na metodach oznaczających równocześnie 25(OH)D3 oraz 25(OH)D2 . Jako procedurę referencyjną zatwierdzono metodę LC-MS/MS mającą zdolność dyskryminacji metabolitu 3-epi-25(OH)D (www.bipm.org/jctm/ ) a jako materiały referencyjne SRM 972 Vitamin D in Human Serum oraz SRM 2972 25-Hydroxyvitamin D2 and D3 Calibration Solutions wytwarzane przez The National Institute of Standards and Technology (NIST) oraz The

National Institutes of Health (NIH) Office of Dietary Supplements (ODS). Zalecenia dotyczące maksymalnego dopuszczalnego współczynnika zmienności (CV) dla oznaczeń rutynowych, referencyjnych i wzorcowych wynoszą odpowiednio 10%, 5% i 0,6%. Kontrola zewnętrzna w systemie DEQAS (Vitamin D External Quality Assessment Scheme) jest warunkiem koniecznym do ustalenia kryteriów porównywalności różnych metod. W systemie tym od 10.2012 ocena wiarygodności oznaczeń 25(OH)D w próbkach rutynowych ma być oceniana względem procedury referencyjnej VDSP oraz jak dotychczas względem wskaźnika odchylenia standardowego (SD) wszystkich oznaczeń ( ALTM -All-Laboratory Trimmed Mean ). Przyjęcie wspólnych kryteriów interpretacji wyników jest głównym celem prac mających na celu harmonizację oznaczeń. Zalecenia polskie , opracowane przez ekspertów w oparciu o zasady medycyny opartej na dowodach , wskazują stężenie 25(OH)D w surowicy 30-50 ng/ml jako optymalne dla zdrowia człowieka.. Porównanie automatycznych metod oznaczania 25(OH)D w naszych doświadczeniach laboratorium szpitala pediatrycznego, uczestniczącego w międzynarodowym systemie kontroli jakości DEQAS ,wykazało że badane metody automatyczne zastosowane w analizatorach LIAISON i ELECSYS spełniają kryteria dokładności oznaczeń przyjętych w systemie DEQAS, wykazują niski błąd oznaczeń (< 8%) i są rekomendowane do badań pediatrycznych. Oznaczenia 25(OH)D Total na analizatorach LIAISON oraz ELECSYS wykazywały również dużą zgodność wyników z metodami uznawanymi za złoty standard, HPLC i LC/MS.

V. UWARUNKOWANIA JAKOSCI BADAŃ LABORATORYJNYCH Wymogi fazy przedanalitycznej, analitycznej i poanalitycznej w medycznych laboratoriach diagnostycznych w świetle standardów jakości i wymagań normy PN-EN ISO 15189: 2008 Mirosława Pietruczuk, W prezentowanej pracy przedstawiono laboratoryjną opiekę nad pacjentem, w odniesieniu do wymagań resortowych i wymagań normy PN-EN ISO 15189: 2008. Pokazano szczególną rolę współpracy lekarz – laboratorium, pielęgniarka – laboratorium, personel pomocniczy – laboratorium, uwzględniając możliwości i ograniczenia tej współpracy. W polskiej diagnostyce laboratoryjnej obowiązują uregulowania prawne, które w większości powstawały równolegle do utworzonej w 2001 roku korporacji diagnostów laboratoryjnych. Ich konsekwencją jest między innymi określenie standardów jakości, które musi spełniać medyczne laboratorium diagnostyczne oraz personel w nim pracujący. Akty prawne wprowadziły także odpowiednią nomenklaturę dotyczącą laboratoriów wykonujących badania diagnostyczne, jako medyczne laboratoria diagnostyczne, nazwę wykonywanego w nich zawodu, diagnosta laboratoryjny (wymóg wyższego kierunkowego wykształcenia) oraz nazwę wykonywanych w nich czynności, jako czynności diagnostyki laboratoryjnej. Ustawa o diagnostyce laboratoryjnej określa również kompetencje diagnosty laboratoryjnego, w tym kierownika laboratorium, specjalisty w dziedzinie adekwatnej do profilu laboratorium medycznego. Ustawa o diagnostyce laboratoryjnej, wskazuje również fizyczne miejsce wykonywania czynności diagnostyki laboratoryjnej jako medyczne laboratorium diagnostyczne, co również jednoznacznie precyzuje że, diagnosta laboratoryjne sprawuje laboratoryjną opiekę medyczną nad pacjentem w medycznym laboratorium diagnostycznym. Obowiązujące akty prawne, określają wymagania fazy przedanalitycznej, analitycznej i poanalitycznej w medycznych laboratoriach diagnostycznych. Standardy jakości w medycznych laboratoriach diagnostycznych wymuszają istnienie systemów zarządzania jakością, w związku z tym coraz częściej laboratoria decydują się na wdrożenie normy PN-EN ISO 15189:2008 (Polska Norma PN-EN ISO 15189:2008, Laboratoria medyczne, Szczególne wymagania dotyczące jakości i kompetencji), normy dedykowanej do medycznych laboratoriów diagnostycznych. Wpływ fazy przedanalitycznej na wiarygodność wyników badań Hanna Zborowska Podstawą uzyskania rzetelnego wyniku oznaczenia oprócz zastosowania właściwej, dobrze wystandaryzowanej metody badawczej jest także odpowiednia jakość próbki. Płyny ustrojowe jako materiał do badań, są szczególnie narażone na wpływ wielu czynników, których zaistnienie może w sposób istotny zmienić wartość uzyskanego wyniku i wpływać na jego interpretację. Mino dobrze

określonych wymagań w zakresie przygotowania pacjenta do badania mających na celu wyeliminowanie wpływu pory dnia, posiłku, wysiłku fizycznego, itp. należy pamiętać, że ich wykonanie zależy wyłącznie od pacjenta, szczególnie jeśli jest to pacjent ambulatoryjny. Od pacjenta zależy także jakość próbek moczu czy kału, które w większości pobierane są przez niego samego. Oczywiście standardowe wymagania mogą być zrealizowane wyłącznie w odniesieniu do badań planowych. W każdym innym przypadku wpływ powyższych czynników należy uwzględnić przy interpretacji wyniku. Często nie uświadamianą przyczyną niespójności wyników z sytuacją kliniczną jest stosowanie, często w sposób niekontrolowany /zdarzają się wielokrotne przekroczenia zapotrzebowania/, suplementów diety. Mogą one zmieniać stężenie w zakresie składników zawartych w suplemencie - żelazo, magnez, kwas foliowy ale także wpływają np. na stężenie hormonów i czynniki układu krzepnięcia. Farmakoterapia, oprócz pożądanego efektu leczniczego jest przyczyną niezamierzonego działania uszkadzającego na narządy /wątroba, nerki, szpik kostny/ ale też modyfikuje przebieg wielu reakcji chemicznych w czasie oznaczenia. Powszechnie znany jest hamujący wpływ witaminy C na przebieg reakcji oksydazowej oznaczenia glukozy. Niewątpliwie trudnym problemem są zmiany natury próbki spowodowane sytuacją kliniczną pacjenta: hiperbilirubinemia, hiperlipemia, hipo- i hiperproteinemia czy obecność przeciwciał heterofilnych i autoprzeciwciał. Te ostatnie często są źródłem „nieprawdziwych” wyników oznaczeń immunologicznych. Nie mniejsze źródło odstępstw w jakości próbki stanowią błędy popełniane na etapie pobierania krwi do badania. Najczęściej są to działania mechaniczne /zbyt długi ucisk stazy, oklepywanie miejsca pobrania, zbyt intensywna aspiracja, użycie za cienkiej igły/ prowadzące do rozpadu krwinek. Czerwone zabarwienie surowicy lub osocza jest potwierdzeniem tego zjawiska i takie próbki powinny być dyskwalifikowane. W próbkach shemolizowanych uzyskuje się fałszywie zawyżone wyniki oznaczeń potasu, AST, LDH, żelaza wynikające z uwolnienia się tych składników z wnętrza krwinek ale także błędne wyniki oznaczeń związane z interferencją ze strony hemoglobiny. Należy pamiętać, że hemoliza nie jest widoczna w próbkach krwi pełnej i w przypadku jakichkolwiek wątpliwości należy upewnić się czy fakt ten nie ma miejsca odwirowując próbkę krwi pełnej Lu pozostawiając ją do opadnięcia krwinek. Inne błędy zdarzające się na etapie pobierania próbek krwi to: niezachowanie proporcji pomiędzy objętością krwi i antykoagulantu /możliwa dyskwalifikacja próbki/ i użycie niewłaściwego antykoagulantu. W tym drugim przypadku wykrycie błędu jest prawie nie możliwe. Szczególną sytuacją jest wykrzepienie próbek z antykoagulantami wskutek ich niewłaściwego wymieszania. Powstający skrzep może być widoczny gołym okiem i próbka powinna być zdyskwalifikowana, ale wytworzenie mikro skrzepów może być trudne w ocenie makroskopowej i w efekcie być źródłem błędnych wyników oznaczeń parametrów układu krzepnięcia. Z kolei nie wykrzepienie próbek surowicy powoduje zmiany w naturze analizowanego materiału i w efekcie uzyskanie odmiennych wyników oznaczenia niektórych parametrów /np. białka/. W warunkach szpitalnych częstym błędem jest pobieranie próbek przez wenflom, bez uprzedniego usunięcia pierwsze porcji krwi. Takie postępowanie jest częstym źródłem rozcieńczenia próbki i uzyskiwania fałszywie zaniżonych wyników wszystkich oznaczanych parametrów lub też domieszki składnika jeśli oznaczany składnik zawarty jest w płynie infuzyjnym /glukoza, elektrolity. Pobranie próbki na badanie układu krzepnięcia po uprzednim przepłukaniu wenflomu heparyną będzie źródłem błędnych oznaczeń parametrów układu krzepnięcia. Wielość problemów fazy przedlaboratoryjnej stanowi istotny problem i zawsze powinny one być uważnie rozważone przy interpretacji wyników. Quality Control in View of ISO 15189 and Beyond Oswald Sonntag Quality control programs in the medical laboratory have a long history. Today the focus is mainly driven by either patient safety initiatives or/and the ISO 15189 document. In the presentation we will learn more about some details of the quality control challenges in the routine laboratory work. From the beginning of the calibration process, internal and external quality control process, use of independent control material, reference method values and how to use and set goals for achieving reliable patient results. Further aspects of extended quality control procedures need to be considered in order to improve the quality of the medical laboratory. We will discuss the use of uncertainty values, concept of traceability, commutability of calibrators and control materials, quality indicators for pre-, post-, and analytical phase, and how to set goals for the quality. Calculation of the sigma level and the state of the art of laboratory performance will be covered. Finally we will understand the way of troubleshooting in daily laboratory performance issues by use of

inter-laboratory comparisons. It is estimated that 60 – 80 % of clinical decisions are based upon information derived from laboratory test results. A good quality control program is essential to provide reliable laboratory results for patients to protect them for misdiagnosis and mistreatment. Such programs will help to safe money to avoid unnecessary additional testing and examinations of the patient. It has an influence in the long run of the hospitalisation and also the reputation of the hospital. Zmiany stężenia białka w surowicy krwi jako czynnik interferujący. Ewelina Kmin Hiperproteinemia jako czynnik interferujący wydaje się szczególnie trudna do wykrycia ponieważ nie można jej ocenić wizualnie, a nowoczesne analizatory biochemiczne mimo dużego postępu technologicznego wciąż nie posiadają opcji jej detekcji. Celem przeprowadzonych badań było porównanie wyników stężenia elektrolitów dwoma metodami (ISE Indirect, ISE Direct ) w próbkach surowicy krwi o wysokim stężeniu białka całkowitego (> 9,2 g/dl) oraz ocena wpływu zmian stężenia białka na wyniki elektrolitów oznaczanych obydwoma metodami. Materiał do badań stanowiły świeże próbki surowicy krwi (n = 30) z normoglikemią, wolne od hemolizy, lipemii i hiperbilirubinemii, które dostarczono do laboratorium celem wykonania rutynowych badań biochemicznych. Pomiaru elektrolitów dokonywano powszechnie stosowaną w analizatorach biochemicznych metodą potencjometrii pośredniej przy użyciu elektrod jonoselektywnych - ISE Indirect (analizator Cobas c501, Integra 800, Dimension EXL) oraz potencjometrii bezpośredniej - ISE Direct (analizator Vitros FS5600, ABL 800 Radiometer) Uzyskane wyniki wskazują, że pomiary potencjometryczne przy użyciu ISE Indirect są w znaczący sposób zakłócane i modyfikowane w próbkach krwi o wysokich stężeniach białka a tym samym nie odzwierciedlają stanu rzeczywistego i są powodem rozbieżności wyników pomiędzy obydwoma metodami. Różnice wahają się w granicach 6-10 mmol/l dla sodu oraz 0.18 – 0,33 mmol/l dla potasu. W niektórych przypadkach różnice między poszczególnymi wartościami stężeń dla jonów sodowych dla obu metod sięgały nawet 12 mmol/l, a dla jonu potasowego 0,37 mmol/l. Wysoką zgodność wyników obserwowano natomiast w próbkach surowicy z normoproteinemia jak również w przypadku obniżonego stężenia białka całkowitego.W codziennej praktyce laboratoryjnej problem dotyczy głównie uzyskiwania fałszywie niskich wartości stężeń jonów sodowych, także znacznie rzadziej zlecanych jonów chlorkowych. W badanych próbkach stwierdzono zależność pomiędzy nasileniem hiperproteinemii a uzyskiwaniem zaniżonych wyników pomiarów. Wniosek: Wraz z patologicznym wzrostem stężenia białka rośnie ryzyko występowania pseudohiponatremii i pseudohipochloremii. Ze względu na fakt, że hiperproteinemia dotyczy ciężko chorych (najczęściej jest wynikiem rozrostu szpiczakowego) fałszywe wyniki mogą mieć istotne konsekwencje kliniczne.

VI. OD PEDIATRII DO GERIATRII Krew do badań – potrzeby laboratorium a rzeczywistość Przemysław Tomasik Utrata krwi związana z pobieraniem próbek do oznaczeń laboratoryjnych stanowi czasami poważny problem medyczny. Dotyczy to zwłaszcza noworodków i niemowląt, a także dorosłych pacjentów intensywnie monitorowanych w oparciu o wyniki badań laboratoryjnych. Pobieranie krwi do celów diagnostycznych może prowadzić do anemii jatrogennej, a w konsekwencji do pogorszenia stanu klinicznego chorego i przedłużającej się rekonwalescencji. Szczególnie narażoną grupą pacjentów są wcześniaki, ponieważ jednorazowe pobranie kilku mililitrów krwi u jednokilogramowego noworodka, jest porównywalne z pobraniem 450 ml krwi od dorosłego krwiodawcy. W praktyce brak jest uniwersalnych zaleceń dotyczących dopuszczalnych objętości krwi, które można pobrać jednorazowo. U dzieci, według różnych zaleceń, można pobrać od jednego do pięciu procent objętości krwi krążącej, co u przeciętnego, donoszonego, trzykilogramowego noworodka wynosi od 3 do 15 ml krwi. Ograniczenia

dotyczą także pobierania krwi w dłuższych przedziałach czasowych, np. w ciągu dwóch miesięcy nie powinno się pobierać więcej niż 8% całkowitej objętości krwi krążącej. U małych dzieci z powodów medycznych często te zalecenia nie są przestrzegane. U dorosłych pacjentów bardzo rzadko zdarza się zagrożenie anemizacją związane bezpośrednio z jednorazowym pobieraniem krwi do badań. Brak takiego zagrożenia nie stanowi jednak usprawiedliwienia dla pobierania nadmiernych objętości krwi, jeżeli procedury analityczne tego nie wymagają. Z własnych badań wynika, że powszechną praktyką, niezależnie od wieku pacjenta, jest pobieranie większych objętości krwi niż wymagają tego laboratoryjne metody diagnostyczne. Można wnioskować, że w kształceniu pielęgniarek i lekarzy pomija się informacje o automatyzacji i miniaturyzacji metod analitycznych. Często brakuje świadomości, że jeden ml krwi jest wystarczający do oznaczenia nawet kilkunastu parametrów biochemicznych. Laboratorium powinno odgrywać wiodącą rolę w opracowywaniu standardów dotyczących objętości krwi potrzebnej do wykonania zleconych oznaczeń. Takie wytyczne powinny być przedmiotem rutynowych szkoleń dla personelu odpowiedzialnego za pobieranie materiału do badań. Niechęć do stosowania mikroprobówek zarówno od ze strony personelu medycznego jak i laboratoryjnego jest zrozumiały, ale wypracowanie odpowiednich procedur związanych z właściwym pobieraniem krwi do badan laboratoryjnych powinno być priorytetem wszystkich odpowiedzialnych za pacjenta. Geriatra, laboratorium i starzejący się pacjent Tomasz Grodzicki Pacjenci w wieku starszym stanowią większość chorych w gabinetach lekarzy POZ oraz około 30% pacjentów hospitalizowanych. Zarówno proces diagnostyczny jak i leczenia są znacznie trudniejsze niż u osób młodszych ze względu obecność zmian związanych ze starzeniem przebiegającym z różnym nasileniem, współistnienie szeregu chorób, stosowanie wielu leków, i często brak współpracy pacjenta z lekarzem. Chociaż badania laboratoryjne stanowią nieodłączną część całego procesu diagnostycznego, w geriatrii interpretacja wyników oznaczeń jest trudna. Podobnie jak w ocenie klinicznej, zmiany w wynikach badań laboratoryjnych wynikają z procesu starzenia, choroby podstawowej, zaburzeń towarzyszących lub mogą być pochodną stosowanych leków. Dla oceny wyników laboratoryjnych istotne są również zmiany polegające na odwodnieniu lub przewodnieniu, wyniszczenie, zanik masy mięśniowej i kostnej, menopauza i andropauza. Przebyte uprzednio choroby i stosowane leczenie mogą dodatkowo wpływać na wyniki aktualnych badań laboratoryjnych. Trudności we właściwej interpretacji wyników mogą być także rezultatem niewłaściwego przygotowania chorego do badania wynikającego z demencji, depresji bądź niesprawności. Od pediatrii do geriatrii – zależne od wieku przedziały referencyjne Krystyna Sztefko Wyniki badań laboratoryjnych zależą od wielu modyfikowalnych i niemodyfikowalnych czynników. Jednym z nich jest wiek. Zależna od wieku dojrzałość różnych narządów, układu immunologicznego czy osi hormonalnych, zmiany z powodu andropauzy i menopauzy, zmiany spowodowane brakiem aktywności fizycznej, czynnikami środowiskowymi i zmiany będące konsekwencją chorób mają istotny wpływ na stężenie wielu analitów Największe różnice w stężeniach parametrów biochemicznych obserwuje się porównując między sobą następujące grupy wiekowe: noworodki (wcześniaki i urodzone o czasie), niemowlęta, dzieci przed okresem dojrzewania, dzieci po okresie dojrzewania, dorośli i osoby starsze (populacja geriatryczna). Bardzo szerokie przedziały wartości referencyjne wielu analitów uzyskiwane dla zdrowych noworodków są z jednej strony następstwem okresu życia płodowego, a z drugiej wynikają z niedojrzałości narządów. Interpretując wyniki u noworodka należy brać pod uwagę jego dojrzałość i szybkie zmiany fizjologiczne a także sposób porodu czy stan matki w czasie porodu oraz choroby matki w czasie ciąży. Zmiany adaptacyjne i dojrzewanie narządowe mogą zachodzić w różnym czasie, zatem postnatalny wiek chronologiczny nie zawsze koreluje z rozwojem dziecka. Z tego powodu nie zawsze wartości referencyjne stosowne do wieku będą odpowiednie dla każdego noworodka. Po okresie niemowlęcym, do okresu szybkiego wzrostu i dojrzewania płciowego, obserwuje się niewielkie wahania stężenia wiekszości parametrów. W okresie dojrzewania zmieniają się wartości stężenia hormonów płciowych i parametrów związanych z procesem wzrastania. Po osiągnięciu dojrzałości płciowej parametry laboratoryjne oznaczane u dziecka osiągają wartości, które mogą stanowić osobnicze wartości referencyjne. W następnych latach życia bowiem stężenie parametrów

ściśle regulowanych, związanych z utrzymaniem homeostay, takich jak jony sodowe, potasowe czy wapniowe, nie ulega zmianie natomiast poziomy tych parametrów, na które w istotny wpływ ma styl życia czy sposób odżywiania, np. glukozy, triglicerydów czy cholesterolu, ulegają podwyższeniu. Do okresu menopauzy, kiedy to następują istotne zmiany hormonalne, stężenia większości analitów nie ulegają zmianie z wiekiem. W okresie wczesnej a tym bardziej późnej starości obserwuje się zmiany stężeń analitów na skutek niewydolności narządów np. nerek (podwyższenie stężenia kreatyniny i mocznika), zmniejszenie syntetycznej funkcji wątroby (np. spadek stężenia albuminy), zmniejszenie wydolności gruczołów dokrewnych co powoduje spadek stężenia hormonów docelowych (np. FT4) i podwyższenie stężenia hormonów tropowych, np. (TSH). Obniżeniu ulega także stężenie hemoglobiny. Dodatkowo, ze względu na współistnienie wielu schorzeń, wielolekowość, stres i brak aktywności fizycznej trudno jest jednoznacznie określić przedziały referencyjne w populacji geriatrycznej. Odróżnienie zmian w stężeniach parametrów biochemicznych/hematologicznych związanych z wiekiem od zmian patologicznych czy spowodowanych czynnikami środowiskowymi wymaga łączenia wiedzy praktycznej z wiedzą teoretyczną. Często jednak wiedza praktyczna ogranicza się do stwierdzenia „tak to przeciętnie wychodzi w danej grupie wiekowej”. Wiedza teoretyczna, coraz bardziej szeroka wśród diagnostów laboratoryjnych, nie zawsze jest wykorzystywana. Dla właściwej interpretacji wyników badań laboratoryjnych istotne jest jednak aby oba te źródła wiedzy umiejętnie łączyć.

VII. NOWE KIERUNKI W TERAPII MONITOROWANEJ STĘŻENIEM LEKU Terapeutyczne monitorowanie stężeniem leku w leczeniu immunosupresyjnym – korzyści i zagrożenia Tomasz Pawiński Terapeutyczne monitorowanie stężeniem leku (TML) jest dyscypliną naukową, która w ostatnim ćwierćwieczu zdobyła uznanie zarówno diagnostów jak i klinicystów w optymalizacji terapii i poprawie jej bezpieczeństwa. Prowadzona jest zazwyczaj w przypadku leków o wąskim przedziale terapeutycznych stężeń, farmakokinetyce nieliniowej, braku bezpośredniej zależności pomiędzy podaną dawką a działaniem leczniczym oraz znaczącym zróżnicowaniu przebiegu farmakokinetyki wewnątrz- i międzyosobniczej. Ponadto z punktu widzenia diagnosty oznaczającego lek w materiale biologicznym konieczne jest aby opracowana, zwalidowana metoda analityczna umożliwiała pomiar stężenia leku w sposób stosunkowo prosty i szybki w rutynowym badaniu. Równocześnie lekarz powinien obserwować zależność pomiędzy ogólnoustrojową zawartością leku w organizmie a efektem terapeutycznym. Ten efekt leczniczy leków o tzw. krytycznym znaczeniu dawki jest również trudny do osiągnięcia podczas stosowania standardowej terapii stąd często stosowane jest zindywidualizowane dobieranie dawki do potrzeb chorego, konwersja leków i terapia skojarzona z zastosowaniem kilku środków leczniczych. Leki immunosupresyjne to grupa terapeutyczna, która od momentu wprowadzenia cyklosporyny w terapii przeciwodrzuceniowej w połowie lat 80-tych XX wieku została objęta terapeutycznym monitorowaniem stężenia w pełnej krwi, osoczu i innych płynach ustrojowych. Aktualnie coraz częściej podkreśla się również znaczenie diagnostyczne monitorowania stężenia w tkance docelowej i jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. Metody analityczne stosowane w TML immunosupresyjnych to najczęściej metody immunochemiczne oparte na szybkich testach z użyciem analizatorów i metody chromatograficzne z różną detekcją. W zależności od zakresu stężeń analizowanych leków stosowane są mniej lub bardziej czułe metody analityczne. Technika chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją masową pozwala na oznaczanie stężeń inhibitorów kalcyneuryny (cyklosporyny i takrolimusa) oraz inhibitorów sygnału proliferacji (sirolimusa i ewerolimusa) w stężeniach nanogramowych. Również wolna frakcja kwasu mykofenolowego o wartościach poniżej 10 ng/ml jest możliwa do oznaczenia z użyciem ww. techniki. Obecnie prowadzone są badania umożliwiające oznaczanie leków immunosupresyjnych w elementach morfotycznych krwi i w samej tkance w stężeniach pikogramowych. Niewątpliwie wyznaczenie bezpiecznych przedziałów terapeutycznych stężeń dla tych leków ograniczających do minimum wystąpienie epizodów ostrego odrzucania przeszczepionych narządów oraz występowania działań niepożądanych w organizmie ludzkim jest celem nadrzędnym TML (Rekomendacja Polskiego Towarzystwa Transplantacyjnego dotycząca schematów leczenia). Korzyści odnoszone poprzez spersonalizowane leczenie mają wymierny efekt w postaci obniżenia kosztów terapii, poprawy jakości życia biorców i znajomości

dodatkowych parametrów obrazujących losy leku w ustroju. Należy zwrócić jednocześnie uwagę na zagrożenia pojawiające się podczas interpretacji wyników oznaczonych stężeń. Są nimi z pewnością niskie wartości stężeń i ekspozycji tych leków w organizmie zwłaszcza we wczesnym okresie po transplantacji mogące mieć zmienną przyczynowość. Podawanie i odstawianie bądź konwersja równolegle stosowanych innych leków immunosupresyjnych ( inhibitory kalcyneuryny, glikokortykosteroidy) w przypadku terapii mykofenolanem mofetylu, osiągnięcie przez lek stężenia stacjonarnego w badanym materiale biologicznym, polimorfizm genetyczny, indukcja i inhibicja enzymatyczna oraz regularność przyjmowania leków to tylko niektóre z zagrożeń, które mogą utrudniać poprawną interpretacje wyniku i mało doświadczony personel medyczny wprowadzić w błąd o trudnych do oszacowania konsekwencjach. Również inne parametry biochemiczne obserwowane u pacjenta będą miały znaczący wpływ na wartość stężenia. Szacuje się, że np. w przypadku kwasu mykofenolowego ponad 50 % pacjentów w pierwszym tygodniu po przeszczepieniu posiada wartości

pola powierzchni pod krzywą poniżej 30 mgh/L, przy czym ta liczba biorców ulega dwukrotnemu obniżeniu już w 3 miesiącu. Przyczyny, które mogą leżeć u podstaw obserwowanych odmiennych wartości stężeń to klirens kreatyniny, poziom albumin we krwi, wartości hemoglobiny i bilirubiny. Dlatego w prawidłowej ocenie oznaczonej wartości stężenia leku immunosupresyjnego w płynach ustrojowych niezmiernie ważny jest pełny obraz wskaźników biochemicznych pacjenta i wiedza na temat profilu genetycznego i schematu leczenia. Oznaczanie leków immunosupresyjnych we krwi nowoczesnymi metodami chromatograficznymi Paweł K. Kunicki Terapeutyczne monitorowanie stężenia leku we krwi odgrywa kluczową rolę dla ustalenia optymalnej dawki wszystkich podstawowych leków immunosupresyjnych u pacjentów po przeszczepieniach narządowych. Leczenie immunosupresyjne polega na równoczesnym stosowaniu kilku leków w określonych schematach, w zależności od przeszczepionego narządu i charakterystyki klinicznej pacjenta. Spośród podstawowych leków immunosupresyjnych, inhibitory kalcyneuryny – cyklosporyna (CSA) i takrolimus (TAC) oraz inhibitory mTOR – ewerolimus (EWE) i syrolimus (SYR) wymagają oznaczania stężenia we krwi pełnej, natomiast kwas mykofenolowy (MPA) powinien być oznaczany w osoczu krwi. Obecnie pomiar stężenia leków immunosupresyjnych opiera się głównie na metodykach immunochemicznych, które są dostosowane do rutynowych oznaczeń w laboratoriach diagnostycznych, zapewniając dużą automatyzację analiz oraz często satysfakcjonujące parametry walidacji. Nieustannie jednak największym problemem jest brak wystarczającej specyficzności metod immunochemicznych powodujący uzyskiwanie zawyżonych wyników, jak również relatywnie wysoka cena samych odczynników. Alternatywą jest stosowanie metod chromatograficznych zapewniających wiarygodne wyniki oznaczeń. Referencyjną techniką analityczną jest chromatografia cieczowa połączona z podwójną detekcją masową (LC-MS/MS). Dotychczas medyczne laboratoria diagnostyczne nie korzystały z techniki LC-MS/MS z uwagi na kosztowną aparaturę oraz wyspecjalizowany personel analityczny. Dodatkowo, pokutuje przekonanie, że metodyka taka jest przeznaczona dla placówek naukowo-badawczych lub przemysłowych, a jest zbyt wyrafinowana do rutynowego stosowania w diagnostyce laboratoryjnej. Obniżająca się cena aparatury w połączeniu z dostępnością komercyjnych zestawów aplikacyjnych przeznaczonych do analizy kilku leków jednocześnie oraz niewielkie zużycie odczynników i krótki czas analizy sprawiają, że technika LC-MS/MS jest coraz szerzej wykorzystywana w nowoczesnej terapii monitorowanej. Historycznie, w Pracowni Farmakologii Klinicznej i Terapii (PFKiT) w oznaczaniu leków immunosupresyjnych stosowane były liczne metody immunochemiczne: FPIA®, MEIA®, EMIT®, ACMIA®, PETINIA®, QMS®. W roku 2011 we współpracy z Instytutem Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie rozpoczęliśmy jako pierwsze medyczne laboratorium diagnostyczne w Polsce monitorowanie EWE techniką LC-MS/MS. Ostatnio, w PFKiT do monitorowania leków immunosupresyjnych wdrożona została technika ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) połączonej z tandemową detekcją masową (MS/MS). Do badań wykorzystano system UPLC-MS/MS – Acquity Ultra Performance LC (Waters, USA) oraz certyfikowany zestaw analityczny MassTox® dedykowany dla leków immunosupresyjnych (Chromsystems, Niemcy). Opracowana oryginalna metoda umożliwiająca jednoczesną analizę CSA, TAC, EWE i SYR w próbkach krwi pełnej została zwalidowana w zakresie dostępnym dla komercyjnych zestawów zawierających wstępnie przygotowane kalibratory, kontrole i standardy wewnętrzne, a uzyskane parametry walidacji (specyficzność, liniowość, powtarzalność kalibracji, precyzja i dokładność wewnątrz- i międzyseryjna decydujące o zakresie metody) spełniły wymagania stawiane metodom bioanalitycznym przez Europejską Agencję Leków (EMA).

Dla oznaczania stężenia MPA w PFKiT opracowano autorską metodykę chromatograficzną HPLC-UV, która po kompleksowej walidacji w zakresie stężeń: 0,1-40 μg/ml została zastosowana w rutynowej terapii monitorowanej. Opracowana procedura analityczna jest prosta, czas wykonania badania - krótki, a metoda jest specyficzna zapewniając uzyskiwanie wiarygodnych wyników, które w przeciwieństwie do metod immunochemicznych (EMIT®, PETINIA®) - nie są zawyżone w wyniku reakcji krzyżowej odczynników z produktami metabolizmu MPA cechującej te metody immunochemiczne. Przedstawione nowoczesne metodyki chromatograficzne są wygodnym i wiarygodnym narzędziem zarówno dla potrzeb rutynowej terapii monitorowanej leków immunosupresyjnych, jak i dla prowadzenia badań farmakokinetycznych. Perspektywy dla terapii monitorowanej w leczeniu depresji Halina Matsumoto Według WHO głównymi powodami inwalidztwa w skali globalnej są : depresja i zaburzenia lękowe. Wg prognoz, w 2020 roku liczba zachorowań na depresję ma przewyższyć zachorowalność na choroby ze strony układu sercowo-naczyniowego. Problemy związane z leczeniem depresji, to: wzrost kosztów społecznych na skutek zaburzeń w funkcjonowaniu pacjentów dramatyczny wzrost liczby przypisywanych leków przeciwdepresyjnych dobry efekt terapeutyczny osiąga się jedynie u 40-70% leczonych ocena skuteczności klinicznej możliwa jest dopiero po 6-8 tygodniach leczenia. W tej sytuacji poszukuje się predykatorów odpowiedzi terapeutycznej na stosowane leki , do których zalicza się zarówno objawy kliniczne lub reakcje neurobiologiczne, które pojawiają się na początku leczenia i mają dużą moc predykcyjną w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie indywidualnego pacjenta. Są to tzw. endofenotypy odpowiedzi na leczenie przeciwdepresyjne (ang. response endophenotypes-RE). Za markery skuteczności leczenia przeciwdepresyjnego uważa się obecnie szereg wskaźników laboratoryjnych, takich jak: stężenie leku i jego aktywnych metabolitów we krwi (Terapia monitorowana stężeniem leku we krwi (TDM) uzupełnianej badaniami farmakogenetycznymi i/lub farmakogenomicznymi badania farmakoencefalograficzne (farmako-EEG), zwłaszcza ilościowe (QEEG) oznaczanie markerów biochemicznych, takich, jak: BDNF, kortyzol, cytokiny, stężenie biopierwiastków we krwi. Badania polimorficznych wariantów genów kodujących receptory neuroprzekaźników (np. układu serotoninergicznego), takich, jak: 5HTRA1, 5HTRA2, transportera serotoniny: 5HTTLPR,enzym syntezy serotoniny: TPH2. Wiele uwagi poświęca się genetycznym markerom osi Podwzgórze-Przysadka- Nadnercza (HPA), zwanej osią stresową. Najczęściej genotypuje się CRH1 i CRH2, ACE, FKPB5. Przyszłością terapii monitorowanej w leczeniu depresji jest tzw. medycyna spersonalizowana (ang.Personalized Medicine), która obiecuje rozwój sztuki dobierania skutecznego i bezpiecznego leczenia dla każdego pacjenta na podstawie informacji istotnych klinicznie oraz danych laboratoryjnych z zakresu TDM, farmakogenetyki, badań neuroobrazowania mózgu oraz wyżej wymienionych biomarkerów. Znaczenie terapeutycznego monitorowania stężeniem leku w leczeniu antyretrowirusowym Beata Gralak Dąbrowska Oznaczanie wartości stężeń leków antyretrowirusowych w materiale biologicznym (osoczu, wewnątrz komórek krwi obwodowej) ma duże znaczenie w praktyce klinicznej podczas prowadzenia terapii antyretrowirusowej. Pozwala bowiem dokonać modyfikacji dawki, w zależności od obserwowanego zróżnicowania we wchłanianiu substancji czynnej, przebiegu metabolizmu uwarunkowanego polimorfizmem genetycznym i występowania interakcji pomiędzy lekami podawanymi w terapii skojarzonej. Monitorowanie stężenia leku jest również pomocne w kontroli zjawiska nieregularnego przyjmowania dawki środka leczniczego (nonadherence) co jest szczególnie ważne podczas leczenia antyretrowirusowego. Określenie właściwego przedziału terapeutycznego stężeń stało się w ostatnim okresie nadrzędnym celem prowadzonej terapii monitorowanej. Obserwowany jest bowiem w określonym zakresie stężeń korzystny efekt leczniczy w postaci obniżonego poziomu wiremii i ograniczenia do minimum działań niepożądanych ze strony metabolizowanego leku. Aby wyniki oznaczanych stężeń leków mogły być wiarygodne niezbędne jest stosowanie w analityce czułych, selektywnych i powtarzalnych, zwalidowanych metod analitycznych. Są nimi najczęściej metody

chromatograficzne (HPLC, UPLC, LC/MS/MS) umożliwiające oznaczanie równocześnie kilku leków antyretrowirusowych z kilku grup chemiczno-terapeutycznych podawanych w terapii skojarzonej. Wśród leków tej grupy terapeutycznej najczęściej monitorowane są nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NIOT) oraz inhibitory proteazy (IP). NIOT będące pro-lekami wymagają do uzyskania aktywności farmakologicznej wewnątrzkomórkowej fosforylacji do aktywnych trójfosforanów. Stężenie w osoczu pro-leków jest łatwe do oznaczenia, ale słabo koreluje z efektem leczniczym. Z kolei stężenie wewnątrzkomórkowych trójfosforanów posiada wysoki współczynnik korelacji z efektem zahamowania replikacji wirusa HIV, ale z punktu widzenia analitycznego oznaczenie jego stężenia jest trudne i wymaga specjalistycznej aparatury (LC/MS) dostępnej jedynie w wybranych laboratoriach. W przypadku terapeutycznego monitorowania IP poszukuje się w dalszym ciągu parametru farmakokinetycznego, który posiadałby wysoki współczynnik korelacji z długotrwałą odpowiedzią w postaci zahamowania replikacji wirusa HIV. Optymalnym wskaźnikiem może stać się wartość stężenia w określonym punkcie czasowym od podania leku w odniesieniu do efektu leczniczego. Czy jest nim C0, Cmax, czy w końcu AUC ? Liczne badania wskazują, że wartość Cmin jest najlepszym wskaźnikiem prognostycznym odpowiedzi wirusologicznej. Z drugiej jednak strony nie zawsze wartości C0 i AUC dobrze korelują z liczbą komórek CD4

+. Dlatego koniecznym stało się w dalszym ciągu poszukiwanie optymalnego

parametru farmakokinetycznego w odniesieniu do zahamowania replikacji wirusa HIV. Konieczne jest zatem opracowanie nowych metod analitycznych służących wiarygodnemu oznaczaniu stężeń leków stosowanych w terapii antyretrowirusowej.

VIII. EPIDEMIA CUKRZYCY CZY MEDYCYNA LABORATORYJNA MOŻE POMÓC Wykrywanie cukrzycy ciążowej – już rozwiązany problem? Maciej Małecki Streszczenia nie nadesłano Od mikroalbuminurii do leczenia nerkozastępczego – diagnostyka nefropatii cukrzycowej. Czy może być lepiej? Dariusz Moczulski Nefropatia cukrzycowa to jedną z najpoważniejszych późnych powikłań cukrzycy, która prowadzi do schyłkowej choroby nerek. Staje się ona na świecie najczęstszą przyczyną przewlekłej choroby nerek wymagającej leczenia nerkozastępczego. Pierwszymi objawami nefropatii cukrzycowej jest zwiększone wydalanie albumin w moczu. W kolejnych etapach dochodzi do upośledzenia czynności wydalniczej nerek. Rozpoznanie nefropatii cukrzycowej stawia się na podstawie pośrednich dowodów, że u chorego na cukrzycę doszło do upośledzenia czynności nerek w przebiegu cukrzycy. Rzadko wykonuje się biopsję nerki w celu postawienia rozpoznania. Zwiększone wydalanie albumin w moczu oraz upośledzenie czynności wydalniczej nerek nie są specyficznymi wskaźnikami dla nefropatii cukrzycowej. Nadal poszukuje się bardziej specyficznych wskaźników nefropatii cukrzycowej. Obecnie nie zaleca się przeprowadzenia dobowej zbiórki moczu w celu zbadania dobowego wydalania albumin w moczu. Zaleca się jedynie badanie wydalania albumin w porannej porcji moczu oraz oznaczenia wskaźnika ACR (albumin to creatinine ratio). U każdego chorego na cukrzycę zaleca się przynajmniej raz w roku oznaczenie stężenia kreatyniny i oszacowanie na tej podstawie wskaźnika przesączania kłębuszkowego (GFR glomerular filtration rate) używając wzoru MDRD. Nadal poszukuje się dokładniejszych wskaźników funkcji wydalniczej nerek, takich ja na przykład cystatyna C. U każdego chorego na cukrzycę przed rozpoznaniem nefropatii cukrzycowej należy przeprowadzić również diagnostykę różnicową w kierunku niecukrzycowej choroby nerek. W ostatnich latach towarzystwa naukowe zalecają zaniechania używania określeń, takich jak mikroalbuminuria czy makroalbuminuria. Zalecają, żeby zamiast tego używać określenia umiarkowanie i znacznie zwiększone wydalanie albumin w moczu. Poza tym nefrologiczne towarzystwa naukowe zalecają, aby termin nefropatia cukrzycowa zastąpić określeniem cukrzycowa choroba nerek.

Cukrzyca typu 2 – jak wykrywać i monitorować Leszek Czupryniak Streszczenia nie nadesłano Samokontrola glikemii, technologia i jakość – czy czas na zmianę wymagań? Bogdan Solnica Samokontrola glikemii jest uznawana za integralną część leczenia cukrzycy, stąd jakość analityczna oznaczeń przy użyciu glukometrów ma duże znaczenie kliniczne. Używane obecnie narzędzia jej oceny oraz regulacje, jak norma DIN EN ISO15197 i wymogi Food and Drug Administration w USA “dopuszczają” błąd glukometru sięgający 20%. Wymogi te krytykowane są jako zbyt liberalne, szczególnie w odniesieniu do dawkowania insuliny na podstawie wyników pomiarów. Producenci glukometrów /pasków testowych ciągle ulepszają ich własności użytkowe i jakość analityczną. Trwają prace nad enzymami – oksydoreduktazami utleniającymi glukozę – stosowanymi w paskach testowych. Poprzez modyfikację struktury enzymów i koenzymów zwiększa się swoistość substratową całego układu, doskonali się także techniki pomiarowe glukometrów. Pracuje się nad wykorzystaniem w glukometrach fluoroforów, zjawiska transferu energii Förstera (FRET) i pomiarów fluorescencji. W efekcie, dla wielu dostępnych na rynku glukometrów / pasków testowych wykazuje się całkowity błąd oznaczenia <5% i coraz mniejszą podatność na czynniki interferujące. Panuje opinia, że poprawa dokładności oznaczeń jest wystarczającą podstawą do zwiększenia wymogów jej dotyczących. Postuluje się np. zmiany w wymogach FDA, gdzie minimalnym standardem dla stężeń glukozy >75

mg/dl byłby błąd do 15% wartości referencyjnej, a dla stężeń 75 mg/dl –błąd do 10 mg/dl, ponadto obowiązywałaby gradacja dokładności w zależności od zastosowania glukometru.

IX. POSTĘPY W BADANIACH HEMOSTAZY

Płytki krwi – aspekt naukowy i praktyczny. Milena Dąbrowska, Coraz lepiej poznana biologia płytek krwi wzbudza zainteresowanie zarówno praktyków jak i teoretyków różnych dziedzin nauk medycznych. Obecnie, intensywnie badane są procesy molekularne, kontrolujące tworzenie propłytek z dojrzałych megakariocytów. Również aktywacja płytek, wiązana głównie z hamowaniem krwawienia, ma wpływ na szereg innych zjawisk. Ostatnio, wiele uwagi poświęca się mikrocząstkom płytkowym, które mogą pełnić rolę nośników efektorów błonowych i cytoplazmatycznych. Uwzględniając znaną rolę płytek w progresji miażdżycy i zakrzepicy tętniczej nasila się debata, czy stwierdzenie przetrwałej reaktywności płytek u osób leczonych przeciwpłytkowo może mieć znaczenie kliniczne. Dzięki coraz lepiej poznawanej roli transporterów płytkowych, płytki postrzega się jako mikrokompartment farmakologiczny, w którym hamowanie swoistego transportera może być atrakcyjną opcją terapeutyczną. Intensywnie rozwija się także koncepcja, że płytki krwi są komórkami efektorowymi nie tylko w reakcjach zapalnych, ale także w odporności wrodzonej i nabytej. Odkąd wykazano, że wspierają progresję i przerzutowanie nowotworów oraz odgrywają istotną rolę w neoangiogenezie, płytki krwi stały się potencjalnym celem terapeutycznym w chorobie nowotworowej. Wdrożone szerokie programy badawcze umożliwiają odkrycie nowych genów zaangażowanych w fizjologię płytek w warunkach zdrowia i choroby, a dalszy rozwój wiedzy o funkcjonalnej charakterystyce produktów genowych może zrewolucjonizować nasze spojrzenie na funkcję tych niepozornych „elementów morfotycznych”. Hemostaza "trzeciego wieku" - parametry hemostazy u osób w wieku więcej niż dojrzałym Jacek Golański U osób powyżej 60 roku życia, w badaniach hemostazy, rejestrowane jest zwiększone stężenie czynników krzepnięcia, wyższa reaktywność płytek krwi, dysfunkcja śródbłonka, osłabienie

mechanizmów antykoagulacyjnych w tym upośledzenie aktywności fibrynolitycznej. Obserwowana jest rosnąca wraz z wiekiem tendencja do przesunięcia równowagi hemostazy w kierunku zwiększającym ryzyko wystąpienia zakrzepicy. Zjawisko to manifestuje się między innymi, wzrostem liczby zachorowań na żylną chorobę zakrzepowo-zatorową u starszych osób. Około 70% przypadków tej choroby dotyczy osób w wieku >60 lat, a zapadalność na ŻChZZ jest ponad 3-krotnie większa wśród osób w wieku ≥65 lat niż w wieku 45-55 lat.W badaniach prowadzonych w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku zaobserwowano zwiększające się wraz z wiekiem stężenie fibrynogenu w osoczu. U młodych osób stężenie fibrynogenu (fg) wynosi średnio 2,5 g/L, u osób w wieku 47–54 lat kształtuje się na poziomie 2,8 g/L podczas gdy w grupie wiekowej 65–79 lat stężenie to wynosi ponad 3,0 g/L. Zaobserwowano, że każda kolejna dekada życia związana jest ze zwiększeniem stężenia fibrynogenu osoczu u osób w analizowanych grupach wiekowych średniego o 0,1 g/L. W podobny sposób zwiększa się. wraz z wiekiem badanych osób. stężenie czynnika von Wllebrand’a i czynnika VIII.Prokoagulacyjne tendencje hemostazy odzwierciedlane są w badaniach stężenia markerów aktywacji krzepnięcia.Średnie stężenia w osoczu fragmentów F1+2, kompleksów TAT oraz dimeru D jest od dwóch do pięciu razy wyższe u osób w wieku powyżej 60 lat niż u osób młodszych .Brak równowagi hemostazy pogłębiany jest także na skutek zahamowania fibrynolizy. Postępujący wraz z wiekiem wzrost stężenia głównego inhibitora fibrynolizy – PAI-1 powoduje , że aktywność fibrynolityczna istotnie słabnie. W związku z powyższym, u osób w podeszłym wieku obserwowane jest, między innymi, wydłużenie czasy fibrynolizy w euglobulinach. Podobne, prokoagulacyjne tendencje zaobserwowano u osób starszych w obrębie hemostazy pierwotnej, w pierwszej kolejności opisano w tej grupie wiekowej krótsze czasy krwawienie niż u osób młodych. Stwierdzono także zwiększającą się wraz z wiekiem reaktywność płytek krwi.W badania prowadzone przez Mari i wsp. w trzech grupach wiekowych (od 18 do 50, od 51 do 69 oraz 100 lat) potwierdziły, że stężenie czynnika VIII i dimeru D jest wyższe o osób w wieku powyżej 50 lat niż u osób młodych.Z kolei, w badaniach Emmerechts i wsp. porównujących dwie skrajne grupy wiekowe (od 26 – 32 i 84 do 88) wykazano istotne różnice w zakresie: stężenia fibrynogenu, czynnika vW , czynnika VIII i APTT.Zestawienie danych dostępnych w piśmiennictwie pozwala na wyciągniecie wniosku, że parametry hemostazy zaczynają się zmieniać w wieku średnim (powyżej 50 lat), a wyraźne różnice pojawiają się u osób w wieku podeszłym (powyżej 80 lat). Nie ma w tej chwili jednoznacznych opinii na temat konieczności wprowadzenia zakresów referencyjnych dla badań hemostazy wykonywanych u starszych osóbPojawiają się jednak propozycję zmiany progów odcięcia stosowanych w wykluczaniu zakrzepicy żylnej. Proponuje się zastosowanie tradycyjnego progu wynoszącego 500 μg/L dla osób w wieku poniżej 60 lat oraz 750 μg/L dla osób starszych. Jest prawdopodobne, że w najbliższym czasie pojawią się podobne propozycje dla stężenia fibrynogenu, czynnika vW i czynnika VIII. Trombofilia – problemy diagnostyczne (przykłady kliniczne) Magdalena Jeleńska Żylna choroba zakrzepowo-zatorowa (ŻCHZZ) występuje w ogólnej populacji europejskiej z częstością jeden przypadek na 600 osób na rok. U młodych osób (poniżej 45 roku życia) w większości przypadków wynika ona z obecności wrodzonych czynników ryzyka ŻCHZZ, natomiast w późniejszym wieku jest zazwyczaj konsekwencją chorób towarzyszących, unieruchomienia, przebytej operacji. Zostaną omówione przyczyny wrodzonej tromboflilii (zaburzenia hemostazy predysponujące do ŻCHZZ) i zalecenia odnośnie jej diagnostyki. Na przykładach klinicznych będą przedstawione niektóre problemy związane z wykonywaniem badań, w trakcie czynnej zakrzepicy lub leczenia przeciwzakrzepowego. Również na przykładzie klinicznym zostanie omówiona możliwość wystąpienia zakrzepicy z towarzyszącą jej małopłytkowością, w przebiegu leczenia heparyną tzw HIT (heparin- induced trombocytopenia). Monitorowanie leczenia przeciwzakrzepowego – dziś i jutro Anna Raszeja-Specht Monitorowanie leczenia przeciwzakrzepowego w laboratorium analitycznym jest niezaprzeczalnym standardem od czasu rozpoczęcia terapii heparynowej. Lekarze wprowadzający obecnie leczenie doustnymi antykoagulantami nowej generacji entuzjastycznie przyjmują fakt, że nie wymagają one bezwzględnie monitorowania w warunkach laboratoryjnych, dzięki temu są zdecydowanie bardziej przyjazne pacjentom niż antagoniści witaminy K. Leczenie heparyną wielkocząsteczkową (UFH) wymaga oznaczania czasu częściowej tromboplastyny

po aktywacji (APTT). Heparyny drobnocząsteczkowe (LMWH) należą do leków przeciwkrzepliwych i przeciwzakrzepowych, stosowanych najczęściej w profilaktyce i leczeniu żylnych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych oraz ostrych zespołów wieńcowych, a większość pacjentów, u których wprowadzono terapię LMWH, nie wymaga monitorowania. Metodą z wyboru w monitorowaniu leczenia LMWH u ciężarnych oraz w określonych sytuacjach klinicznych, jest oznaczanie aktywności anty-Xa. Leczenie tzw. „doustnymi antykoagulantami”, pochodnymi warfaryny, antagonistami witaminy K, monitorowane jest poprzez oznaczanie czasu protrombinowego w wersji wystandaryzowanej, wyrażanego jako INR. Obecnie prowadzone są badania leków, które w sposób bezpośredni blokują działanie czynnika Xa lub trombiny i są podawane doustnie. Leczenie nie wymaga monitorowania ani modyfikacji dawki, jednakże klasyczne testy stosowane w diagnostyce zaburzeń hemostazy – czasy APTT i PT, ulegają przedłużeniu lub nie zmieniają się w okresie terapii. W monitorowaniu leczenia rywaroksabanem (Xarelto) u pacjentów z grup ryzyka, znajdują zastosowanie takie testy, jak oznaczanie aktywności anty-Xa, APTT i PT, dRVVT oraz HepTest, przy czym część z nich wymaga modyfikacji. Zarówno rekombinowane hirudyny jak i analogi hirudyny monitorowane są poprzez pomiar APTT. Skuteczność doustnych bezpośrednich inhibitorów trombiny np. dabigatranu, można monitorować poprzez oznaczanie zmodyfikowanego czasu trombinowego oraz czasu ekarynowego. Zastosowanie doustnych inhibitorów czynników Xa i IIa rozpoczęło nową erę w profilaktyce i terapii żylnych oraz niektórych tętniczych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych. Dotychczasowe wyniki badań klinicznych zachęcają do dalszego wprowadzania tych leków w różnych grupach chorych. Oczekiwania klinicystów dotyczą uproszczenia wielomiesięcznego leczenia przeciwzakrzepowego i zwiększenia bezpieczeństwa, co jednak jest związane, jak zawsze w pierwszym okresie po wprowadzeniu nowej terapii, ze zwiększonymi kosztami leczenia. Ten problem może być kompensowany ograniczeniem konieczności laboratoryjnego monitorowania skuteczności działania

X. BIOMARKERY W ONKOLOGII – OCZEKIWANIA A RZECZYWISTOŚĆ

Biomarkery - uniwersalne narzędzie we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej Jan Kanty Kulpa Rozwój w okresie ostatnich 30 – 40 lat szeroko pojmowanej biologii molekularnej stworzył nowe perspektywy dla diagnostyki laboratoryjnej chorób nowotworowych. Coraz szerszy staje się panel biomarkerów, których ekspresja w materiale komórkowym, ale również stężenia w płynach ustrojowych pozwalają na bardziej precyzyjną charakterystykę zaburzeń szeregu procesów metabolicznych, do jakich dochodzić może w następstwie transformacji nowotworowej, a także w odpowiedzi organizmu gospodarza na obecność nowotworu. Obok „klasycznych” markerów nowotworowych, do biomarkerów zalicza się wiele czynników wzrostu i ich receptorów, chemokin, enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów, przeciwciał, dodatnich i ujemnych reaktantów ostrej fazy. Jakkolwiek użyteczność badań większości z tych biomarkerów dla wykrywania choroby nowotworowej we wczesnych stadiach zaawansowania pozostaje nadal ograniczona, ze względu na niezadowalającą czułość, a zwłaszcza swoistość diagnostyczną, to coraz więcej faktów dokumentuje znaczenie wyników ich badań w diagnostyce różnicowej zmian niezłośliwych i złośliwych, kontroli chorych po leczeniu podstawowym, przewidywaniu podatności lub oporności na radio-, chemio- i immunoterapię, ocenie rokowania chorych. Możliwości precyzyjnego określenia, zespołu cech molekularnych czy genetycznych, charakterystycznych dla danego typu nowotworu ma istotną wartość predykcyjną dla wybór metody leczenia, rodzaj leku, immuno- lub chemioterapeutyka o potencjalnie najwyższej efektywności działania w odniesieniu do tego przypadku klinicznego. Właśnie ta precyzyjna diagnostyka stwarza warunki sprzyjające rozwojowi terapii spersonalizowanej. Systematyczne badania panelu właściwie dobranych biomarkerów w monitorowaniu tego rodzaju leczenia pozwalają na wczesną ocenę reakcji chorych na terapię. Równocześnie badania szeregu innych biomarkerów mogą być pomocne we wczesnym wykrywaniu ewentualnych powikłań, do rozwoju jakich może dochodzić w trakcie terapii. Umiejętność łączenia badań laboratoryjnych z badaniami z użyciem innych technik diagnostycznych stanowi jeden z elementów postępu we współczesnej onkologii.

Diagnostyka molekularna chorych na choroby nowotworowe ze szczególnym uwzględnieniem raka płuca. Janusz A. Siedlecki Przyczyną chorób nowotworowych są liczne zmiany w genomie. Zmiany te to zarówno różnego typu mutacje, delecje i insercje, translokacje chromosomalne jak i zmiany epigenetyczne. Konsekwencją zmian zachodzących w wielu różnych genach, których produkty są istotne dla prawidłowego przebiegu procesów wzrostu, proliferacji, różnicowania i śmierci komórki jest stopniowa zmiana fenotypu z prawidłowego na nowotworowy. Celem większości dotychczas stosowanych terapii przeciwnowotworowych jest usunięcie lub co najmniej uśmiercenie komórek nowotworowych. Działanie leków nowej generacji czyli leków nakierowanych na cele molekularne oparte jest o zupełnie inną zasadę. Celem dla tych leków jest zablokowanie (lub przynajmniej czasowe zahamowanie) jednego z czterech podstawowych procesów związanych z żywotnością komórki nowotworowej takich jak: proliferacja, różnicowanie, zdolność do przemieszczania się i śmierć programowana. Procesy te sterowane są za pomocą różnorodnych ścieżek sygnalizacyjnych. Dlatego najogólniej biorąc większość nowoczesnych leków celowanych to związki hamujące zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowe przekaźnictwo sygnału. Z dotychczasowych doświadczeń wynika, że leki celowane są skuteczne jedynie wówczas, gdy podawane są pacjentom, u których biologia nowotworu ukierunkowana jest zgodnie z mechanizmem działania leku. Oznacza to, że należy wstępnie wyselekcjonować grupę pacjentów, która odniesie korzyść ze stosowanej terapii. Taka selekcja jest dodatkowo konieczna ze względu na wysokie koszty tego typu terapii. Omówione zostaną podstawowe metody, którymi posługuje się diagnostyka molekularna oraz klasyczne przykłady wykorzystania tego rodzaju badań do selekcji pacjentów. Dzięki metodom molekularnym możemy ustalić status kluczowych dla przekazywania sygnału genów, ocenić stopień uszkodzenia systemów naprawy DNA a także poznać rolę polimorficznych form genu w odpowiedzi na terapię. Szczególna uwaga poświęcona zostanie metodom selekcjonującym chorych na raka płuca. Jak się wydaje diagnostyka molekularna staje się obecnie jednym z podstawowych narzędzi, które pozwolą na coraz skuteczniejszą walkę z chorobami nowotworowymi. Główny problem na dziś polega na braku odpowiedniej bazy. Dotychczas badania genetyczne były domeną ośrodków uniwersyteckich i instytutów badawczych. Obecnie diagnostyka molekularna musi stać się częścią rutynowego postępowania diagnostycznego. Oznacza to, że muszą powstać podobnie jak to jest w przypadku diagnostyki mikrobiologicznej czy biochemicznej odpowiednio wyspecjalizowane jednostki. Powinny one posiadać odpowiednio wyszkolona doświadczona kadrę i odpowiednio opisane procedury postępowania. Laboratoria takie powinny posiadać akredytacje pod względem jakościowym. Powinny też poddać się procesowi walidacyjnemu. Na dziś brak jest zarówno odpowiednich przepisów prawnych jak i jednostki zdolnej do akredytacji takich laboratoriów. Wpływ palenia tytoniu na zaburzenia podstawowych procesów metabolicznych Ewa Wójcik Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) ocenia, że prawie miliard mężczyzn i 250 mln kobiet na świecie to nałogowi palacze tytoniu, w Polsce stanowią oni 24,6% społeczeństwa. Palenie tytoniu uważa się za jeden z głównych czynników etiologicznych szeregu chorób, w tym szczególnie nowotworów złośliwych. Dym tytoniowy zawiera substancje o działaniu drażniącym, toksycznym, mutagennym, i karcinogennym. Pod wpływem obecnych w nim karcinogenów tj. policyklicznych węglowodorów aromatycznych, amin aromatycznych, czy N-nitrozoamin, w organizmie palacza dochodzić może do uszkodzeń DNA m.in. utleniania zasad, lub powstawania adduktów DNA. Karcinogeny powinny być usuwane w procesie detoksykacji, jednak wzmożona aktywność enzymów aktywacyjnych oraz obniżona sprawność enzymów detoksykacyjnych i naprawczych prowadzi do zmian w strukturze DNA i mutacji. Powtarzające się mutacje w komórkach somatycznych onkogenów i genów supresorowych, oraz te związane z metabolizmem karcinogenów skutkują utratą dozoru nad różnicowaniem i wzrostem komórek, zmianami w ich genomie. Uważa się, że nikotyna m.in. moduluje fenotyp prawidłowych komórek nabłonka przewodu oddechowego, czego następstwem jest osłabienie apoptozy i nasilenie angiogenezy. Ostateczny efekt mutagennego działania składników dymu tytoniowego zależy od predyspozycji genetycznych gospodarza. Szczególnie istotną rolę przypisuje się składnikom dymu tytoniowego w rozwoju raka płuca, jamy ustnej, przełyku, krtani, żołądka, trzustki, czy pęcherza moczowego. W wyniku stresu oksydacyjnego dochodzi m.in. do utleniania białek, nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, zostają upośledzone funkcje komórek, może dochodzić do ich

śmierci. Składniki dymu tytoniowego aktywują kaskady wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów w komórkach nabłonkowych, aktywują m.in prozapalne czynniki transkrypcyjne. Sekrecja

mediatorów zapalenia takich jak IL-8, IL-6 i TNF promuje ciągłą rekrutację komórek układu immunologicznego. Modulacja sygnałów wewnątrzkomórkowych i supresja wrodzonej oraz nabytej aktywacji układu immunologicznego u osób palących osłabia odporność na infekcje oraz zakażenia wirusami. Indukowane dymem tytoniowym zmiany wykładników stanu zapalnego w organizmie są wyrazem zaburzeń równowagi pomiędzy mechanizmami pro- i przeciwzapalnymi. Dym tytoniowy u zdrowych osób wpływa nie tylko na wydolność układu oddechowego ale również na poziom wskaźników hematologicznych, biochemicznych i markerów nowotworowych. Duńskie badania prospektywne wskazują, że u 51,7% zdrowych palaczy tytoniu poziom CRP jest wyższy od 3 mg/l. Ta grupa cechuje się zwiększonym ryzykiem zachorowań na nowotwory. Zdrowi

palacze tytoniu mają wyższe poziomy TNF, niekiedy nawet 2-krotnie przekraczające wartości osób zdrowych niepalących tytoniu, ponadto niższe o około 10-20% poziomy immunoglobulin IgA, IgG i IgM. Przewlekły stan zapalny o umiarkowanym nasileniu będący skutkiem palenia tytoniu prowadzi do uszkodzeń środbłonka i zmiany profilu cząsteczek adhezyjnych. U palaczy tytoniu, w porównaniu z osobami niepalącymi obserwuje się wyższy poziom sICAM-1, E-selektyny, P-selektyny. Nadmierne utlenianie cząsteczek cholesterolu LDL sprzyja hipercholesterolemii. U zdrowych palaczy obserwuje się zwiększoną agregację płytek krwi, zwiększoną aktywność układu sympatycznego oraz częstsze skurcze naczyń wieńcowych. Palacze w porównaniu do osób niepalących mają wyższe skurczowe jak i rozkurczowe ciśnienie krwi, większą częstość skurczu serca, oraz wyższy poziom NT-proBNP. Poziom markera wykazuje zależność od ilości wypalanych papierosów. Palenie tytoniu wpływa także na poziom niektórych markerów nowotworowych. Stężenie CEA u zdrowych osób niepalących tytoniu nie powinno przekroczyć 3 ng/ml, jednak u 18,6% palaczy poziom CEA osiąga wartości pomiędzy 5 a 10 ng/ml, a u 5,1% nawet mieszczą się one w przedziale od 10 -12,5 ng/ml. Zmiany poziomu innych markerów są różnokierunkowe. O ile u kobiet palących tytoń poziom CA 125 jest niższy w porównaniu z niepalącymi, to poziom HE4 jest wyższy o ok. 29%. W porównaniu do zdrowych osób niepalących tytoniu, u zdrowych palaczy wyższy jest również poziom AFP. U ciężarnych kobiet palących, bez podwyższonego ryzyka urodzenia dziecka z wadą rozwojową, poziom AFP wzrasta o ok. 7-10%, obniża się poziom HCG o ok. 10-20%, i uE3 o ok. 3%, co w konsekwencji może prowadzić do fałszywie dodatnich lub ujemnych wyników testu potrójnego u kobiet ciężarnych. Przeprowadzone u palaczy tytoniu badania wskazują, że w celu właściwej interpretacji wyników oznaczeń różnych wskaźników u chorych należy zawsze dobierać grupy porównawcze, zarówno ze względu na BMI, wiek, płeć jak i obciążenia nałogami.

Udział śródbłonka naczyniowego w powstawaniu przerzutów u chorych na raka piersi Anna Thielemann, Zygmunt Kopczyński Powstawanie przerzutów nowotworowych u chorych na raka piersi jest procesem złożonym i wieloetapowym. Uważa się, że zdolność do przerzutowania zależy od stanu czynnościowego śródbłonka naczyniowego, na który ma wpływ wiele mechanizmów komórkowych i pozakomórkowych. Śródbłonek naczyniowy stanowi nie tylko półprzepuszczalną barierę oddzielającą światło naczynia od płynu pozakomórkowego, ale pełni też funkcję gruczołu wydzielania wewnętrznego i zewnętrznego. Stężenia substancji, wydzielanych przez endotelium, mogą być cennym wskaźnikiem jego dysfunkcji inicjującej proces przerzutowania. Celem badań było określenie stężenia wskaźników związanych z funkcjonowaniem endotelium u kobiet chorych na raka piersi: VEGF i jego swoistych białek receptorowych: VEGFR-1 i VEGFR-2, cząstek adhezyjnych śródbłonka naczyniowego: ICAM-1 (cząsteczki adhezji międzykomórkowej) i VCAM-1 (cząstki adhezji komórkowej naczyń), białek układu aktywacji plazminogenu : aktywatora plazminogenu typu urokinazowego (uPA) i tkankowego (tPA) w surowicy kobiet chorych na raka piersi oraz receptorów dla urokinazy (uPAR) i inhibitorów PAI-1 i PAI-2. Oznaczanie stężeń tych substancji odzwierciedlających stan czynnościowy śródbłonka, może ułatwić wyjaśnienie mechanizmu powstawania przerzutów u chorych na raka gruczołu piersiowego. Stężenia badanych czynników VEGF, sVEGFR-1 i sVEGFR-2, sVCAM-1 i sICAM-1 oraz uPA i tPA , receptorów uPAR i inhibitorów PAI-1 i PAI-2 oznaczano we krwi kobiet chorych na raka piersi w wieku 29 - 89 lat (średnia wieku 56 lat) przed zabiegiem chirurgicznym, leczonych w Katedrze i Klinice Onkologii UM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Grupę kontrolną stanowiły surowice 40 kobiet zdrowych w wieku 24-75 lat (średnia wieku 47 lat). Stężenie VEGF, sVEGFR-1 i sVEGFR-2, sVCAM-1 i sICAM-1 oraz tPA i uPAR, PAI-1 oceniano metodą immunoenzymatyczną ELISA w oparciu

o testy firmy R&D. Aktywność uPA oznaczano metodą ELISA firmy CHEMICON. Badania laboratoryjne wykonano w Katedrze i Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej UM w Poznaniu. W badaniach otrzymano istotnie wyższe stężenia VEGF, rozpuszczalnych form receptorów sVEGFR-1 i sVEGFR-2, cząsteczek adhezyjnych sVCAM-1 i sICAM-1oraz uPA, tPA i uPAR u kobiet chorych na raka piersi w porównaniu do wartości w grupie kontrolnej. Im wyższy był stopień zaawansowania klinicznego choroby tym wyższy uzyskano poziom cytokiny VEGF, receptorów sVEGFR-1 i sVEGFR-2, cząsteczek sVCAM-1 i sICAM-1 oraz tPA i uPA. Podobną zależność obserwowano w grupie kobiet chorych na raka piersi z przerzutami do węzłów chłonnych. Dodatnią korelację uzyskano także między średnim stężeniem badanych substancji a wielkością guza pierwotnego. Zmiany ilościowe badanych czynników u kobiet chorych na raka piersi mogą wskazywać na zaburzenie aktywności biologicznej komórek śródbłonka naczyniowego. Dysfunkcja biochemiczna i czynnościowa śródbłonka naczyniowego może z kolei ułatwiać rozwój guza nowotworowego i powstawanie odległych przerzutów. Metaloproteinazy u chorych na nowotwory złośliwe Barbara Mroczko Rozwój nowotworu złośliwego jest procesem wieloetapowym, charakteryzującym się wieloletnim przebiegiem. Jednym z kluczowych etapów rozwoju nowotworu jest proteoliza kolagenu błony podstawnej naczyń włosowatych. Migracja komórek nowotworowych jest związana z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), zbudowanej m.in. z kolagenu, fibronektyny, lamininy czy proteoglikanów tkanki łącznej. Macierz zewnątrzkomórkowa bierze udział w fizjologicznych procesach rozwoju, rozrostu i różnicowania komórek, a także formowania tkanek. Transformacja ECM jest również związana z różnymi procesami patologicznymi, zachodzącymi w organizmie, w tym z proliferacją komórek nowotworowych, jak również z naciekaniem narządów i tworzeniem przerzutów nowotworowych Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs) są enzymami proteolitycznymi o budowie wielodomenowej. Następstwem działania MMPs w obrębie naczyń krwionośnych jest migracja komórek śródbłonka oraz komórek nowotworowych do macierzy zewnątrzkomórkowej i neoangiogeneza – tworzenie nowych naczyń w degradowanej przez MMPs przestrzeni. Metaloproteinazy, a zwłaszcza żelatynazy MMP-2 i MMP-9, ze względu na zdolność degradacji kolagenu IV, znajdującego się w błonach podstawnych naczyń i w obrębie ECM, odgrywają szczególną rolę w progresji nowotworu. MMPs przez swoją właściwość przebudowywania macierzy zewnątrzkomórkowej i trawienia kolagenu typu IV, stwarzają możliwości do rozwoju nowotworu, migracji komórek nowotworowych i powstawania ognisk przerzutowych do węzłów chłonnych i narządów odległych. Metaloproteinazy regulują także różnicowanie i apoptozę komórek biorących udział w budowie śródbłonka naczyń i mogą wpływać na wzrost guza poprzez uwalnianie insulinopodobnego czynnika wzrostu. Uszkadzają też receptory dla interleukiny-2, znajdujące się na limfocytach T, co hamuje odpowiedź immunologiczną przeciw komórkom nowotworowym. Enzymy te odgrywają istotną rolę w regulacji układu immunologicznego, zaś funkcja ich jest złożona i nie sprowadza się tylko do przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej. Komórki nowotworowe mogą wytwarzać czynnik stymulujący syntezę MMPs przez fibroblasty. Aktywuje on fibroblasty do wytwarzania różnych metaloproteinaz, w tym stromielizyny, żelatynazy A, kolagenazy oraz ich aktywatorów. Prowadzi to do proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej w obrębie guza nowotworowego. W konsekwencji następuje migracja komórek nowotworowych, co umożliwia wzrost guza i tworzenie przerzutów. Po aktywacji metaloproteinaz zostają uwolnione ich tkankowe inhibitory (TIMPs), kontrolujące aktywność tych enzymów. Bardzo istotna w rozwoju nowotworów jest równowaga pomiędzy MMPs a ich inhibitorami. TIMPs wykazują działanie przeciwnowotworowe poprzez degradację i regulację wzrostu, różnicowania i apoptozy komórek. Jednakże w pewnych warunkach inhibitory metaloproteinaz mogą również stymulować wzrost nowotworu. Zwiększoną ekspresję MMPs oraz TIMPs wykazano w tkankach guzów o różnej lokalizacji, np. w raku trzustki, piersi, jelita grubego oraz raku żołądka. Ekspresja MMP-9 w tkankach raka przełyku i raka żołądka, a także w komórkach zapalnych podścieliska guza korelowała ze stopniem zaawansowania nowotworu (TNM), wielkością guza oraz obecnością przerzutów do węzłów chłonnych. W raku żołądka ekspresja TIMP-1 w komórkach nowotworowych wzrastała wraz ze stopniem zaawansowania nowotworu, a w komórkach zapalnych stanowiła niezależny, niekorzystny czynnik prognostyczny przeżycia chorych. Wykazano również znamienny wzrost stężeń MMP-9 i TIMP-1 we krwi chorych na raka żołądka, trzustki, jelita grubego oraz obniżone stężenia MMP-2 i TIMP-2 w surowicy chorych na raka żołądka i

jelita grubego. Stwierdzono, że MMPs mogą mieć znaczenie diagnostyczne jako markery nowotworowe. Pole powierzchni pod krzywą ROC (AUC) dla MMP-9 było wyższe niż CEA w raku przełyku. Inhibitory metaloproteinaz wykazały się również większą mocą diagnostyczną różnicowania między chorobą nowotworową a osobami zdrowymi. AUC dla TIMP-1 było wyższe niż CEA w raku żołądka; w raku jelita grubego i trzustki – wyższe niż dla CEA i CA 19-9, zaś dla TIMP-2 – wyższe niż dla CEA i SCC u chorych na raka przełyku. Podwyższone stężenia metaloproteinaz i ich inhibitorów mogą mieć także znaczenie rokownicze przeżycia chorych na nowotwory złośliwe. Zwiększone stężenie MMP-9 w surowicy okazało się niezależnym, niekorzystnym czynnikiem prognostycznym przeżycia chorych na raka trzustki. Chorzy na raka żołądka, u których obserwowano wyższe stężenia TIMP-1 w osoczu, mieli znamiennie krótszy czas przeżycia. Przedstawione wyniki sugerują użyteczność oznaczania MMPs i TIMPs jako markerów przydatnych w monitorowaniu i prognozowaniu przebiegu chorób nowotworowych.

XI. PROBLEM NIESPÓJNOŚCI WYNIKÓW BADAŃ LABORATORYJNYCH W

ENDOKRYNOLOGII Trudności w diagnostyce zespołu Cushinga Tomasz Bednarczuk Zespół Cushinga (ZC) jest zespołem różnorodnych objawów klinicznych związanych z nadmiarem glikokortykosteroidów (GKS). ZC ma najczęściej podłoże jatrogenne i wynika z długotrwałej terapii GKS. Endogenny ZC wynika z nadmiernego wydzielania kortyzolu przez korę nadnerczy i może być spowodowany przez nadmiar ACTH (ACTH-zależny ZC, najczęściej związany z guzem przysadki wydzielającym ACTH lub znacznie rzadziej z ektopowym wydzielaniem ACTH) lub występować niezależnie od ACTH (ACTH-niezależny ZC w przebiegu najczęściej guza nadnercza). Endogenny ZC występuje bardzo rzadko (zapadalność ok. 1-10 przypadków/mln/rok), ale nawet w łagodnej postaci, nieleczony ZC istotnie zwiększa umieralność w porównaniu z ogólna populacją. Stąd ZC należy uwzględnić w diagnostyce różnicowej różnych częstych chorób, takich jak nadciśnienie tętnicze, cukrzyca lub osteoporoza. Niestety nie istnieje pojedynczy test przesiewowy potwierdzający lub wykluczający ZC. Za podstawowe badania przesiewowe w kierunku ZC uznaje się: (i) test hamowania 1 mg deksametazonu (DXM), (ii) dobowe wydalanie wolnego kortyzolu, (iii) oznaczenie stężenia kortyzolu w surowicy (lub wolnego kortyzolu w ślinie) późnym wieczorem. Jednakże interpretacja wyników musi uwzględnić obraz kliniczny oraz możliwość wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. W przypadku łagodnej hiperkortyzolemii, konieczna jest nieraz obserwacja objawów klinicznych i wykonanie wielu badań. Dodatkowym utrudnieniem jest „zespół pseudo-Cushinga”; jest to stany nadmiernej aktywacji osi podwzgórze-przysadka i czynnościowej hiperkortyzolemii z towarzyszącymi czasami cechami klinicznymi ZC (np. ciąża, depresja, alkoholizm, otyłość olbrzymia, źle wyrównana metabolicznie cukrzyca, jadłowstręt psychiczny). Chromogranina A (CgA) – wpływ różnych czynników in vivo, in vitro oraz współistniejących chorób na jej stężenie we krwi. Piotr Glinicki, Chromogranina A (CgA) jest kwaśną glikoproteiną, należącą do rodziny białek określanych jako chromograniny / sekretograniny. Występuję ona w prawidłowych i zmienionych chorobowo komórkach neuroendokrynnych. Jest ona wydzielana do krążenia na drodze egzocytozy i może być oznaczana jako, tzw. krążący marker nowotworowy, w tym przede wszystkim jako niespecyficzny marker guzów neuroendokrynnych (NET). Czułość CgA w tych guzach wg różnych autorów waha się 10 – 100%, specyficzność 60 – 100%. CgA jest stabilnym białkiem (cykle rozmrażania / zamrażania nie uszkadzają cząsteczki) i może być długo przechowywana (-25°C). Wykazuje zmienność dobową (20-25%), wyższe stężenia obserwuje się późnym popołudniem i w nocy. Do tej pory uważano, iż stężenie CgA nie zależy od płci, jednak w jednej z ostatnich prac autorzy zaobserwowali wyższe stężenia u kobiet niż u mężczyzn. Wyższe

stężenia CgA obserwuje się w osoczu (EDTA, heparynowe) niż w surowicy. Po posiłku stężenie CgA może wzrosnąć o 20-30%. Liczne czynniki in vivo, in vitro i stany chorobowe mogą wpływać na stężenie CgA. Wysokie stężenia CgA poza guzami NET obserwuje się w przewlekłym atroficznym zapaleniu błony śluzowej żołądka typu A (gastritis atrophicans), w niewydolności nerek (eGFR < 30 ml/min/1,73m²), reumatoidalnym zapaleniu stawów przebiegającym z wysokim stężeniem czynnika RF w klasie IgM i w raku prostaty. Pośród innych różnych chorób lub stanów patologicznych i fizjologicznych w których stężenie CgA może być umiarkowanie podwyższone wymienia się najczęściej: niespecyficzne zapalenia błony śluzowej jelita (colitis ulcerosa, choroba Leśniowskiego-Crohna), upośledzenie funkcji wątroby (np. marskość), nadczynność tarczycy, ostre zespoły wieńcowe i nadciśnienie tętnicze, chorobę obturacyjną płuc, zespół jelita wrażliwego, chorobę Parkinsona, ciążę. Wśród leków które mogą wpływać znacząco na stężenie CgA wymienia się przede wszystkim leki z grupy inhibitorów pompy

protonowej (np. omeprazol, pantoprazol, lansoprazol), inhibitorów receptorów histaminowych typu H₂ (np. ranitydyna), chemioterapeutyki (np. streptozotocyna), oraz glikokortykoidy. W celu prawidłowego rozpoznania guza neuroendokrynnego, a następnie monitorowania skutków leczenia niezbędne jest uwzględnienie wszystkich wymienionych czynników mogących mieć wpływ na stężenie chromograniny A we krwi. Wpływ wysokocząsteczkowych izoform hormonów na wynik oznaczenia diagnostycznego. Zbigniew Bartoszewicz Stężenie zdecydowanej większości hormonów jest oznaczane metodami immunochemicznymi. Na wynik pomiaru wpływają czynniki związane z użytą metodą takie jak stosowane przeciwciała, analogi, sposób wprowadzania znaczników i ich detekcji oraz standaryzacją reakcji wieloetapowych. Rzadko zdajemy sobie sprawę z tego, że istotne różnice w wynikach mogą być spowodowane heterogennością hormonów, których stężenia oznaczamy, co w szczególnych przypadkach może prowadzić do niezgodności pomiędzy uzyskanymi wynikami a stanem klinicznym pacjenta i skutkować nieprawidłowym wyborem metody leczenia. Heterogenność hormonów, w szczególności hormonów białkowych związana jest z ich modyfikacjami posttranslacyjnymi (PTM -ang. posttranslational modifications). PTM prowadzą do powstawania różnych form tego samego hormonu: izoform wysokocząsteczkowych, niskocząsteczkowych oraz izoform o ciężarze podobnym do podstawowej izoformy monomerycznej ale o zmodyfikowanym składzie chemicznym. Dodatkowo niektóre geny kodujące w czasie obróbki mRNA mogą podlegać procesowi pomijania egzonu (ang. exon skipping), w wyniku którego powstają krótsze izoformy danego białka. Zdecydowana większość oznaczeń hormonalnych wykonywana jest z surowicy lub osocza krwi obwodowej, w których występują związki swoiście lub w sposób nieswoisty wiążące się z hormonami. Część hormonów ma również naturalną tendencję do agregacji tworząc dimery, oligomery i multimery. Powstałe izoformy wysokocząsteczkowe w różnym stopniu są rozpoznawalne przez przeciwciała użyte w teście immunochemicznym, co w konsekwencji prowadzi do uzyskania różnych wyników dla tej samej próbki pacjenta w zależności od rodzaju użytego testu. Udział izoform wysokocząsteczkowych w całkowitej puli izoform danego hormonu może być dominujący i one same mogą stanowić użyteczne markery diagnostyczne (np. wysokocząsteczkowa adiponektyna). Często izoformy wysokocząsteczkowe hormonów powstają w wyniki oddziaływań z krążącymi we krwi przeciwciałami. U części pacjentów z hiperprolaktynemią występuje izoforma prolaktyny wysokocząsteczkowej – tzw. makroprolaktyna, która poza prolaktyną monomeryczną zawiera izoformę glikozylowaną, przeciwciała przeciwprolaktynowe oraz prawdopodobnie rozpuszczalny fragment receptora dla prolaktyny. Dla surowic zawierających makroprolaktynę wyniki pomiaru stężeń prolaktyny w tej samej próbce pacjenta mogą różnić się nawet 5-krotnie ze względu na inne powinowactwo używanych w testach przeciwciał do cząsteczki makroprolaktyny. Tworzenie się izoform wysokocząsteczkowych na skutek oddziaływań z przeciwciałami występuje również dla innych hormonów np. gonadotropin (LH i FSH), insuliny i jest szczególnie częste w sytuacjach, gdy w krwiobiegu występuje wysokie stężenie przeciwciał np. w chorobach autoimmunologicznych, w stanach zapalnych, podczas stosowania terapii przeciwciałami oraz u pacjentów po długotrwałym kontakcie z alergenami roślinnymi i zwierzęcymi. Wysokocząsteczkowe izoformy immunokompleksu hormon białkowy-przeciwciało mogą w istotny sposób zmienić wynik oznaczenia stężenia hormonu niezwiązanego np. obecność przeciwciał przeciw tyreoglobulinie (TgAb) w chorobach autoimmunologicznych tarczycy może powodować zaniżenie stężenia tyreoglobuliny w surowicy. Hormony białkowe powstają z większych cząsteczek prekursorów i prohormonów, które w różnym stopniu są rozpoznawane przez używane w testach przeciwciała i mogą zawyżać wynik oznaczenia stężenia hormonu. Przykładowo testy immunochemiczne stosowane

dla oznaczeń stężenia hormonu adenokortykotropowego (ACTH), który powstaje z dużego białka proopiomelanokortyny (POMC) i poprzez pro-ACTH jest degradowany do biologicznie czynnej cząsteczki właściwego hormonu, reagują krzyżowo z POMC i proACTH wpływając na wynik oznaczenia ACTH. Sam prekursor lub prohormon może być użytecznym markerem diagnostycznym np. pomiar stężenia proinsuliny obok insuliny i C-peptydu jest pomocniczym oznaczeniem w nowotworach trzustki. Trudności w interpretacji wyników TSH, fT4 i fT3 Agnieszka Kondracka Interpretacja wyników laboratoryjnych testów tarczycowych (TSH, fT4 i fT3) jest zwykle jednoznaczna i zgodna za stanem klinicznym pacjenta. Jednak czasem występuje nietypowa konfiguracja wyników lub wyniki niezgodne ze stanem klinicznym pacjenta. Do najczęstszych należą stany subklinicznej niedoczynności (rzadziej subklinicznej nadczynności), kiedy stężeniu hormonów tarczycy w zakresie normy towarzyszy podwyższony (lub obniżony) poziom TSH. Także podczas leczenia L-tyroksyną lub lekami przeciwtarczycowymi obserwujemy konfiguracje nieadekwatne do stanu klinicznego, m.in. przez wiele miesięcy może utrzymywać się poziom TSH sprzed rozpoczęcia leczenia, występuje dysproporcja stężeń fT4 i fT3 i tp. Trudności w interpretacji wyników testów tarczycowych mogą także wynikać ze szczególnego stanu fizjologicznego jak ciąża (wymagająca stosowania odpowiednich wartości referencyjnych dla każdego z trymestrów), supresja osi podwzgórze-przysadka u pacjentów ze współistniejącymi przewlekłymi lub ostrymi schorzeniami pozatarczycowymi oraz stosowanie suplementacji lub leczenia hormonami sterydowymi. Leki, których efektem ubocznym jest modyfikacja funkcji tarczycy lub metabolizmu hormonów tarczycy oraz leki powodujące oddysocjowanie hormonów tarczycy od białek transportowych także zaburzają równowagę osi podwzgórze-przysadka-tarczyca, co może prowadzić do zaskakujących wyników szczególnie bezpośrednio po rozpoczęciu oraz po zaprzestaniu terapii. Do bardzo rzadko występujących przyczyn niezgodnych wyników należą: wydzielanie przez guzy przysadki nietypowo glikozylowanego TSH, wrodzona oporność na hormony tarczycy lub defekt konwersji T4 do T3. Źródłem niezgodności mogą ponadto być: obecność nietypowych białek wiążących hormony tarczycy (jak np w hipertyroksynemii związanej z rzadkimi genetycznymi wariantami albuminy lub transtyretyny), stężenia białek nośnikowych znacznie odbiegające od normy, obecność autoprzeciwciał przeciwko hormonom tarczycy lub TSH oraz obecność wysokich stężeń czynnika reumatoidalnego, przeciwciał heterofilnych i innych. Występowanie nietypowej konfiguracji wyników testów tarczycowych na skutek obecności przeciwciał interferujących może przejawiać się tylko przy zastosowaniu określonego testu immunochemicznego, podczas, gdy wyniki innych testów nie wykazują wpływu interferencji. Jeżeli podejrzewamy, że źródłem niezgodności są anomalie białek wiążących lub ich nietypowe stężenia wskazane może być wykonanie dodatkowych analiz, jak: oznaczenia poziomu całkowitych hormonów tarczycy, wykonanie testu wiązania tyroksyny, zastosowanie oznaczeń wskaźnikowych lub oznaczenie poziomu białek wiążących. Istnienie defektów genetycznych można potwierdzić wykazując obecność określonych mutacji. W przypadku podejrzenia, że nietypowa, trudna do interpretacji konfiguracja wyników testów tarczycowych jest skutkiem obecności przeciwciał lub innych czynników interferujących możliwe jest podjęcie następujących działań pomocnych niekiedy w wyjaśnieniu niezgodności: - wykonanie oznaczeń za pomocą testów innego producenta - wykonanie testu rozcieńczeń (może być bezpiecznie stosowany w przypadku TSH, interpretacja wyników oznaczeń wolnych hormonów wymaga znacznego doświadczenia) - związanie przeciwciał heterofilnych za pomocą odpowiednich przeciwciał lub proteiny A lub G - wytrącenie kompleksów z autoprzeciwciałami za pomocą glikolu polietylenowego. Zaprezentowano przypadki wskazujące na istnienie interferencji w próbkach pochodzących od pacjentów z nietypowymi wynikami testów tarczycowych wybrane z piśmiennictwa oraz z doświadczenia własnego Laboratorium Naukowego Kliniki Endokrynologii WUM.

XII. BIOMARKERY W PREWENCJI I DIAGNOSTYCE CHORÓB - TERAŹNIEJSZOŚĆ I PRZYSZŁOŚĆ

Nowe biomarkery w diagnostyce i monitorowaniu chorób neurologicznych. Agnieszka Słowik Streszczenia nie nadesłano Diagnostyka molekularna cukrzycy Maciej Małecki Streszczenia nie nadesłano Epigenetyka a pamięć metaboliczna – nowe narzędzie nutrigenomiki i diagnostyki Beata Kieć-Wilk Streszczenia nie nadesłano Lipidomika – od chorób rzadkich po choroby społeczne Iwona Wybrańska Streszczenia nie nadesłano

XIII. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZABURZEŃ UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO

Nowoczesne technologie w diagnostyce immunologicznej Urszula Demkow W ostatnich latach obserwujemy bardzo intensywny rozwój nowych technologii badawczych pozwalających na coraz dokładniejsze diagnozowanie zaburzeń odporności. Między innymi istotny postęp dokonał się w dziedzinie obrazowania komórek układu odpornościowego oraz oceny ich struktury wewnętrznej, funkcji i aktywności. Nową, udoskonaloną technologią diagnostyczną jest cytometria obrazowa. Ta technologia polega na ilościowym wieloparametrowym pomiarze budowy i funkcji komórek, (lokalizacji struktur w komórce, kształtów i wielkości organelli lub całych komórek, ruchu komórek itd.) korzystając z obrazu mikroskopowego. Metoda ta pozwala na obiektywny, niezależny od obserwatora, opis ilościowy funkcji komórek. Układ ten jest połączeniem cytometrii przepływowej i mikroskopu fluorescencyjnego z systemem komputerowej analizy obrazu. Analiza przestrzennej dystrybucji fluorochromu może służyć do wykrywania translokacji białek z jadra do cytoplazmy lub białek szlaków sygnałowych. Możliwa jest ocena statyczna – morfologiczna. Dodatkowo zapis rzeczywistego obrazu komórek pozwala na dostęp do informacji niemożliwej do uzyskania za pomocą klasycznego cytometru przepływowego. Jakość obrazu uzyskanego za pomocą cytometru obrazowego pozwala na analizę kilkuset różnych cech wybranych subpopulacji komórkowych. Cytometria obrazowa może służyć do oceny apoptozy komórki, do wykrywania translokacji różnych elementów w komórce, oceny zmiany kształtu komórki, formowania pseudopodii i migracji komórek, identyfikacji komórek o określonym profilu markerów, diagnostyki metodą FISH, oceny cyklu komórkowego, identyfikacji synaps immunologicznych pomiędzy limfocytem T a komórką prezentującą antygen. Metoda jest również niezwykle przydatna do poszukiwania populacji rzadkich komórek ( choroba resztkowa).Znajduje również zastosowanie w mikrobiologii.

Przedstawiona nowoczesna metoda rozpoznawania chorób pozwalają na wyjaśnienie molekularnej podstawy wielu chorób o podłożu immunologicznym i hematologicznym oraz dobór indywidualnej terapii tych chorób u każdego chorego. Diagnostyka niedoborów odporności Maciej Siedlar Diagnostyka pierwotnych niedoborów odporności (PNO) oparta jest na ścisłej współpracy lekarza immunologa klinicznego ze specjalistycznym laboratorium diagnostycznym. Diagnoza odpowiedniego PNO w zasadniczej mierze wspiera się o wyniki badań laboratoryjnych, możliwych do wykonania jeszcze poza ośrodkiem referencyjnym. Powinna rozpocząć się od oznaczenia morfologii krwi z rozmazem oraz od wykonania pomiarów poziomów poszczególnych klas immunoglobulin w surowicy krwi. Specjalistyczna diagnostyka PNO humoralnej obejmuje ponadto oznaczenia dotyczące poziomu podklas IgG, liczebności dojrzałych limfocytów B, a w szczególnych przypadkach – dziewiczych limfocytów B, limfocytów B strefy brzeżnej, pamięci po przełączeniu klas, przejściowych, tzw. class-switched plasmablasts, a także na ocenie produkcji swoistych przeciwciał. Z kolei, na ocenę odporności komórkowej składają się badania liczebności subpopulacji limfocytów T, subpopulacji komórek T dziewiczych oraz pamięci, a także komórek NK. Oceniany może być również tzw. chimeryzm matczyno-płodowy, ekspresja receptorów limfocycząsteczek HLA-DR, CD25, CD69 oraz CD71 na limfocytach T, a także poziom TREC (T-cell receptor excision circles). W szczególnych przypadkach, ocenie podlega ekspresja cząsteczek CD40 oraz CD40L oraz poziom tzw. „podwójnie ujemnych” (CD4

-CD8

-

funkcjonalnych dotyczących limfocytów T i B zalicza się testy transformacji blastycznej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po stymulacji mitogenami (PHA, ConA, PWM), przeciwciałami monoklonalnymi (np. anty-CD3) oraz antygenami (PPD, kandidyna). Stopień proliferacji limfocytów po nieswoistej stymulacji można również określać metodami cytofluorymetrycznymi (np. z wykorzystaniem barwnika CSFE lub bromodeoksyurydyny). Można również badać poziom uwalnianych mediatorów cytokinowych po nieswoistej aktywacji limfocytów in vitro -12p40/p70, a także cytofluorymetrycznie, na powierzchni limfocytów i/lub monocytów, poziom ekspresji receptorów dla tychże cytokin. W każdym przypadku stymulacji wynik należy odnieść do spoczynkowej aktywności komórek. Z kolei, aktywność komórek żernych (głównie granulocytów obojętnochłonnych) badamy oceniając produkcję wolnych rodników tlenowych w teście chemiluminescencji lub redukcji błękitu tetrazolowego (NBT) oraz cytofluorymetrycznie, z wykorzystaniem tzw. phagoburst-test. Możemy również cytofluorymetrycznie oceniać wewnątrzkomórkową ekspresję podjednostek NADPH oksydazy (np. gp91phox), mieloperoksydazy, a na ich powierzchni - poziom ekspresji wybranych cząsteczek adhezyjnych. W diagnostyce wybranych PNO istotne jest określenie chemotaksji komórek. Do rutynowych badań zaliczamy oznaczenie surowiczego poziomu wybranych składników kaskady dopełniacza – zwykle C3c oraz C4. Z uwagi na znaczący postęp w określaniu genetycznego podłoża PNO, diagnostyka molekularna stanowi obecnie podstawę rozpoznania większości poznanych ciężkich, złożonych niedoborów odporności. Testy laboratoryjne oceniające odporność komórkową Jarosław Baran Mechanizmy komórkowe odgrywają kluczową rolę zarówno w reakcjach odporności nieswoistej (wrodzonej), jak i swoistej (nabytej). Ta pierwsza, miediowana jest przez wyspecjalizowane komórki żerne – fagocyty, do których należą neutrofile i monocyty krwi obwodowej oraz makrofagi tkankowe. Z kolei odporność komórkowa swoista dla danego antygenu, mediowana jest przez limfocyty T i w dużej mierze zależy od sprawnego funkcjonowania monocytów i makrofagów tkankowych, które wraz z komórkami dendrytycznymi pełnią rolę komórek prezentujących antygen. Prawidłowy przebieg reakcji odpornościowej w trakcie toczącej się odpowiedzi immunologicznej wymaga więc współdziałania wszystkich komórek układu odpornościowego, zarówno odporności nieswoistej, jak i swoistej i podlega regulacji przez czynniki humoralne i komórkowe. W prezentacji przedstawione zostaną testy laboratoryjne stosowane w nowoczesnej diagnostyce immunologicznej do oceny jakościowej i ilościowej komórek zaangażowanych w nieswoiste i swoiste reakcje odpornościowe. Omówione zostaną również najczęstsze schorzenia (niedobory odporności) związane z upośledzeniem funkcji określonych populacji.

Diagnostyka laboratoryjna zespołu hemofagocytarnego. Katarzyna Popko Limfohistiocytoza hemofagocytarna (HLH) jest rzadko występującym zarówno w populacji dzieci jak i dorosłych zespołem objawów, związanych z hiperaktywacją makrofagów, pojawiającą się w konsekwencji upośledzenia mechanizmów regulacyjnych układu immunologicznego. Najbardziej charakterystyczne objawy obejmują: gorączkę, pancytopenię, hepatosplenomegalię, hiperferrytymemię, hipertriglicerydemię, hipofibrynogenemię oraz upośledzenie funkcji cytotoksycznych komórek NK i cytotoksycznych limfocytów T (CD8). W przypadku braku prawidłowej diagnozy zespół ten stanowi poważne zagrożenie życia pacjenta. Identyfikuje się dwie formy zespołu HLH: postać genetycznie uwarunkowaną, związaną z obecnością mutacji zaburzających proces cytolizy oraz postać wtórną rozwijającą się w konsekwencji występowania chorób autoimmunizacyjnych, nowotworów lub infekcji wirusowych. Postać wtórna stanowi ponad 90% wszystkich przypadków diagnozowanych w populacji polskiej. W przypadkach genetycznie uwarunkowanych jedyną skuteczną metodą leczenia jest transplantacja szpiku kostnego. Poza standardowymi badaniami laboratoryjnymi niezwykle istotną rolę w diagnostyce HLH pełnią badania immunologiczne. Diagnostyka zespołu HLH w dużej mierze opiera się na badaniu sprawności immunologicznej komórek zaangażowanych w regulację odpowiedzi zapalnej. Cytometria przepływowa stanowi obecnie jedną z podstawowych metod diagnostyki immunologicznej. Pozwala ona na precyzyjną identyfikację poszczególnych subpopulacji oraz ocenę ekspresji enzymów wewnątrzkomórkowych (perforyny, granzymy) biorących aktywny udział w reakcjach immunologicznych. Poprzez zastosowanie testów czynnościowych pozwala ona również na ocenę sprawności funkcjonowania komórek zdolnych do spontanicznej cytotoksyczności.

XIV. ALERGIA CZY SZARLATANERIA – JAK DIAGNOZOWAĆ Epidemiologia chorób alergicznych wyzwania dla medycyny XXI wieku Bolesław Samoliński Streszczenia nie dostarczono Nowoczesna diagnostyka alergii IgE-zależnej Sławomir Białek Alergia jest klasyfikowana jako rodzaj reakcji nadwrażliwości, gdzie objawy powstają na drodze mechanizmów immunologicznych. Wyniki badań epidemiologicznych wskazują, iż wśród osób cierpiących na choroby alergiczne największy odsetek stanowią pacjenci z alergią IgE-zależną. W rozpoznawaniu chorób alergicznych istotne jest stwierdzenie na co chory jest uczulony oraz czy mechanizm tego uczulenia ma podłoże alergiczne (immunologiczne). Ponadto istotne jest wykazanie czy to, na co chory jest uczulony, tłumaczy występowanie jego objawów. W przypadku trudności w wykazaniu związku przyczynowo-skutkowego pomiędzy uczulającymi alergenami a objawami uczulenia konieczne jest zastosowanie badań laboratoryjnych. Powszechnie stosowana w diagnostyce chorób alergicznych immunoglobulina E została odkryta i opisana w 1966 r. IgE wykazuje większe powinowactwo do połączeń z makrofagami, mastocytami,

bazofilami i eozynofilami poprzez wysoce swoisty receptor FcR1 (uczulanie komórek) niż do występowania w postaci wolnej w krwi. Stężenie IgE w surowicy krwi jest ściśle związane z wiekiem pacjenta, w krwi pępowinowej większości noworodków IgE występuje w ilościach śladowych. Oznaczenie stężenia IgE całkowitego w surowicy jest parametrem charakterystycznym dla procesu alergicznego. Należy jednak pamiętać, iż podwyższony poziom IgE całkowitego nie zawsze koreluje z alergią i może być związany np. z różnymi niedoborami, chorobami pasożytniczymi, z paleniem papierosów. Również prawidłowe stężenie IgE całkowitego nie pozwala na wykluczenie choroby

alergicznej. Rola oznaczeń IgE całkowitego zwiększyła się ponownie po wprowadzeniu do praktyki klinicznej Omalizumabu, leku który jest humanizowanym przeciwciałem pochodzenia mysiego, skierowanym przeciwko IgE. Lek jest stosowany w terapii ciężkiej astmy, pokrzywki oraz innych ciężkich alergii IgE-zależnych. Na podstawie odpowiednio wysokich stężeń IgE całkowitego pacjenci są klasyfikowani do prowadzenia terapii tym lekiem. Przy dobrym efekcie klinicznym leczenia, stężenie IgE całkowitego powinno wzrastać i wracać do wartości wyjściowych po roku od zakończenia leczenia. Natomiast oznaczenie IgE alergenowo-swoistych dla konkretnych alergenów jest podstawowym badaniem laboratoryjnym stosowanym w diagnostyce alergologicznej. Może być wykonywane u chorych w każdym wieku, u pacjentów ze zmniejszoną reaktywnością skóry i co najważniejsze nie wymaga odstawienia leków przeciwalergicznych. Obecnie można wyróżnić trzy generacje metod oznaczania IgE swoistych, różniących się przede wszystkim rodzajem fazy stałej, przeciwciałem wykrywającym, granicą wykrywalności, stopniem automatyzacji oraz czasem oczekiwania na wynik. W metodach trzeciej generacji granica wykrywalności IgE dla klasy I została przesunięta do wartości 0,1 IU/ml. Przede wszystkim ma to znaczenie przy diagnostyce alergii na roztocza u małych dzieci, gdzie wartości IgE swoistych przeciwko alergenom roztoczy wahają się w granicach 0,1 – 0,35 IU/ml. Wykrycie nawet tak małych stężeń przeciwciał IgE jest wskazaniem do eliminacji kurzu z otoczenia dziecka i prowadzi do zatrzymania marszu alergicznego. Ponadto u pacjentów diagnozowanych z powodu uczulenia na jady owadów błonkoskrzydłych, stężenia swoistych IgE przeciwko tym alergenom również mieszczą się w takich samych granicach. Istotną trudnością w interpretacji oznaczeń IgE swoistych, zwłaszcza w diagnozowaniu alergii na jady owadów błonkoskrzydłych i lateks jest obecność przeciwciał IgE dla tzw. determinant węglowodanowych (CCDs – ang. cross reactive carbohydrate determinants). Niektóre glikoproteiny posiadające specyficzne wiązania np. N-acetylo-glukozy z ksylozą, wiążą nieswoiście przeciwciała IgE. Przeciwciała IgE reagujące z CCD powodują fałszywie dodatnie wyniki oznaczeń z alergenami zawierającymi glikany. Występowanie tych przeciwciał nie ma jednak znaczenia klinicznego, ich oznaczanie wykonuje się przy stwierdzeniu obecności swoistych IgE np. dla jadów owadów i lateksu przy braku objawów klinicznych uczulenia na te alergeny. W ostatnim czasie dużego znaczenia nabiera zastosowanie diagnostyki molekularnej alergii czyli tzw. diagnostyki epitopowej. Epitop to fragment antygenu, który łączy się bezpośrednio z wolnym przeciwciałem. Dany epitop może silniej lub słabiej pobudzać układ odpornościowy. Diagnostyka epitopowa polega na oznaczaniu swoistych IgE dla poszczególnych epitopów alergenowych, co pozwala na rozróżnienie „prawdziwej” alergii na konkretny alergen od objawów wywołanych przez reakcje krzyżowe. Ponadto można dokonać oceny ryzyka wystąpienia groźnych reakcji systemowych po kontakcie z badanym alergenem. Uzyskanie powyższych informacji stwarza możliwość wyboru lepszej procedury postępowania z pacjentem np.: czy wymaga intensywnego leczenia przeciwalergicznego – podanie epinefryny, czy może zostać poddany próbie prowokacyjnej z testowanym alergenem bez zbyt wysokiego ryzyka wystąpienia reakcji systemowej, czy wystarczy tylko unikanie kontaktu z badanym alergenem. Ponadto immunoglobulina E jako marker laboratoryjny, zarówno całkowita jak i alergenowo-swoista jest parametrem stabilnym. Długie nawet kilkuletnie przechowywanie zamrożonych próbek w temperaturze

-20C nie wpływa wiarygodność uzyskanego wyniku. Również surowice żółtaczkowe, lipemiczne czy shemolizowane nie wpływają na jakość wyniku. Oznaczenia IgE można wykonywać w surowicy krwi, osoczu heparynowym, cytrynianowym, wersenianowym, oraz w popłuczynach z drzewa oskrzelowego i błon śluzowych nosa. Inne możliwości diagnostyki laboratoryjnej schorzeń alergicznych Urszula Demkow Złotym standardem w diagnostyce chorób atopowych są testy skórne i oznaczanie poziomu swoistego IgE. Obecnie możliwa jest również cytometryczna ocena aktywacji bazofilów jako komórek efektorowych w reakcjach atopowych. Do identyfikacji bazofilów wykorzystuje się m. in. antygen CRTH2. Do oceny stopnia aktywacji (degranulacji) bazofilów stosuje się ocenę powierzchniowej ekspresji antygenu CD63 lub antygenu CD203c. Antygen CD63 jest białkiem związanym z wewnątrzcytoplazmatycznymi ziarnistościami bazofilów. Po aktywacji komórek zachodzi uwalnianie z ich ziarnistości mediatorów, jak również dochodzi do fuzji błony komórkowej z błonami ziarnistości, w wyniku której antygen CD63 pojawia się na powierzchni bazofilów. Ekspresja tego białka jest ściśle zależna od stopnia degranulacji komórki. Antygen CD203c w bardzo niewielkiej ilości jest stale obecny w błonie bazofilów. Natomiast po degranulacji, wywołanej kontaktem z alergenem, bądź

przeciwciałami anty Ig-E, jego ekspresja znacząco wzrasta, co świadczy o rezerwach tego białka w cytoplazmie bazofilów. CD203c jest to neuronalny powierzchniowy antygen różnicowania neuronów, E-NPP3, PD-Iβ, B10, gp130

RB13-6 należący do wielogenowej rodziny pirofosfataz/fosfodiesteraz, który

jest aktywowany po pobudzeniu receptorów FcεRI. Powierzchniowa ekspresja antygenu CD203c wzrasta nagle po „mostkowaniu” receptorów FcεRI, zatem jest on bardzo dobrym markerem reakcji IgE zależnych. Test z wykorzystaniem detekcji antygenu CD63 i CD203c może być bardzo użyteczny w diagnostyce alergii i w monitorowaniu immunoterapii swoistej a także monitorowaniu terapii antyIgE. Wyciągi alergenowi czyli od trafnej diagnozy do skutecznej immunoterapii swoistej Piotr Kuna Streszczenia nie dostarczono

XV. BIOMARKERY W KARDIOLOGII – GDZIE JESTEŚMY, DOKĄD ZMIERZAMY Czy wynik badania laboratoryjnego może zmienić losy chorego? Janina Stępińska Streszczenia nie nadesłano Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach naglących Anna Konopka W kardiologicznych stanach nagłych najistotniejszym elementem postępowania diagnostyczno-leczniczego jest ratowanie życia chorych. Z tego powodu, czas potrzebny na zdiagnozowanie przyczyny ciężkiego stanu chorego powinien być jak najkrótszy. Do kardiologicznych przyczyn stanów nagłych zalicza się ostry zespół wieńcowy (OZW) z jego groźnymi powikłaniami takimi jak ostra niewydolność serca, mechaniczne powikłania zawału serca w tym perforacja przegrody międzykomorowej, ostra niedomykalność zastawki mitralnej czy tamponada serca. Stanem nagłym jest ostra niewydolność serca (obrzęk płuc i/lub wstrząs kardiogenny) wywołana np.: kardiomiopatią rozstrzeniową, zapaleniem mięśnia serca, ostrą niedomykalnością zastawki mitralnej lub aortalnej, zatorowością płucną wysokiego ryzyka czy też groźnymi zburzeniami rytmu serca. Do stanów nagłych zalicza się także: ostre rozwarstwienie aorty, choroby przebiegające z bardzo wysokim ciśnieniem tętniczym, towarzyszące chorobom kardiologicznym ostre uszkodzenie nerek oraz ciężkie powikłania krwotoczne w tym krwawienia z przewodu pokarmowego lub z dużych naczyń po zabiegach inwazyjnych i po operacjach kardiochirurgicznych. W OZW z uniesieniem odcinka ST (STEMI), czas upływający od chwili wystąpienia objawów do udrożnienia tętnicy wieńcowej odpowiedzialnej za STEMI decyduje o wielkości nieodwracalnego uszkodzenia mięśnia serca i wpływa na rokowanie. Oprócz nietypowych objawów klinicznych takich jak ból w klatce piersiowej, groźne zaburzenia rytmu serca, zasłabnięcie czy hipotonia oraz charakterystycznego obrazu EKG potwierdzeniem choroby jest wzrost stężenia biomarkerów w tym troponin we krwi. W STEMI biomarkery stanowią wskaźnik wielkości martwiczego/niedokrwiennego uszkodzenia mięśnia i mają znaczenie dla odległego rokowania chorych. W STEMI postępowanie interwencyjne na naczyniach wieńcowych nie jest uzależnione od wzrostu stężenia biomarkerów z wyjątkiem sytuacji nietypowego przebiegu choroby W OZW bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI) wzrost stężenia troponin decyduje o rozpoznaniu oraz o wskazaniach do pilnego leczenie i wyborze metody postępowania. Oznaczane troponin za pomocą testów wysokoczułych, to znaczy takich, które wykrywająją 10, a nawet 100-krotnie niższe stężenia troponiny niż testy klasyczne, umożliwiło wcześniejsze potwierdzenie niedokrwienia lub martwicy mięśnia serca. Oznaczanie stężenia D-dimerów ma zastosowanie u chorych z podejrzeniem ostrej zatorowości płucnej (ZP). D-dimery charakteryzuje wysoka negatywna wartość predykcyjna tzn. że przy prawidłowym stężeniu D-dimeru ZP i głęboka zakrzepica żylna są mało prawdopodobne. Z kolei

pozytywna wartość predykcyjna D-dimeru jest niska co wynika z faktu, że wzrost stężenia D-dimeru obserwuje się również w innych chorobach takich jak: nowotwór, stan zapalny, infekcja, martwica czy rozwarstwienie aorty. W zależności od rodzaju testu czułość i swoistość badania zmienia się. Według dwupoziomowego schematu oceny klinicznego prawdopodobieństwa ZP ujemny wynik oznaczenia stężenia D-dimeru wykonany za pomocą testów wysoce jak i umiarkowanie czułych w sposób bezpieczny wyklucza ZP u chorych z małym prawdopodobieństwem choroby. W około 1% przypadków potwierdzonej zatorowości płucnej wynik oznaczenia D-dimerów może być fałszywie ujemny. Ostre uszkodzenie nerek (AKI) jest częstym rozpoznaniem u pacjentów hospitalizowanych w oddziałach intensywnej terapii i charakteryzuje się wysoką śmiertelnością. Szybka diagnostyka potwierdzająca AKI umożliwia wczesne leczenie zabiegające dalszemu postępującemu uszkodzeniu nerek. Ocena funkcji nerek jest również istotna u chorych wymagających pilnej diagnostyki i/lub leczenia za pomocą metod wymagających użycia kontrastu radiologicznego, wyboru leczenia przeciwzakrzepowego oraz przy antybiotykoterapii. Obecnie do oceny funkcji nerek stosuje się oznaczanie stężenia kreatyniny z obliczeniem GFR. Duże nadzieje wiąże się z oznaczaniem NGAL (lipokalina związana z żelatynazą neutrofili). NGAL pojawia się w moczu i krwi już w pierwszych godzinach od momentu uszkodzenia nerek i poprzedza wzrost kreatyniny. Prokalcytonina (PCT) jest wykorzystywana jest do różnicowania ciężkich zakażeń bakteryjnych i wirusowych. Wielkość wzrostu stężenia PCT w surowicy koreluje ze stopniem uogólnienia stanu zapalnego. Antybiotykoterapia pod kontrolą stężeń PCT u chorych niechirurgicznych hospitalizowanych w oddziałach intensywnej terapii pozwala skrócić czas leczenia i potencjalnie ograniczyć antybiotykooporność bakterii. W diagnostyce i leczeniu stanów nagłych konieczne może być również pilne oznaczenie morfologii krwi a zwłaszcza HT, Hb i liczby płytek krwi, a także stężenia glukozy, elektrolitów oraz parametrów krzepliwości krwi, a zwłaszcza INR i APTT. Badania takie mogą być niezbędne dla rozpoznania i różnicowania w stanach nagłych oraz dla podjęcia decyzji o dalszej diagnostyce zwłaszcza inwazyjnej, a także wpływa na decyzje o pilnym leczeniu i determinuje jego rodzaj. Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach naglących: Komentarz laboratoryjny Dariusz Sitkiewicz Pod koniec ubiegłej dekady opublikowano pierwsze badania dotyczące wczesnej diagnostyki zawału mięśnia sercowego, w których oznaczenia troponin wykonywano testami o wysokiej czułości (hs-cTn). Zakres detekcji nowych testów obejmuje pełne spektrum chorób sercowo-naczyniowych a także obrazuje fizjologiczny obrót komórkowy. Wysoko czułe testy udowodniły, że stężenie troponin w surowicy jest zmienną ciągłą a interpretacja wyniku wymaga szczegółowego uwzględnienia kontekstu klinicznego. Jednym z problemów związanych z ultraczułymi testami troponinowymi jest fakt, iż samo podwyższenie stężenia troponin w surowicy powyżej 99-tego percentyla nie odzwierciedla mechanizmu odpowiedzialnego za uszkodzenie/martwicę kardiomiocytów. Mechanizm prowadzący do uwolnienia troponin jest kluczowy dla rozpoznania i podjęcia adekwatnych decyzji klinicznych. Niezwykle ważnym zadaniem badawczym stojącym zatem przed kardiologią kliniczną i medycyną laboratoryjną jest poszukiwanie relacji pomiędzy stężeniem troponin a obecnością w krążeniu innych markerów obrazujących przede wszystkim stan niedokrwienia mięśnia sercowego. W przypadku niedokrwienia mięśnia sercowego, N-końcowa część albuminy ulega modyfikacjom strukturalnym co prowadzi do utraty zdolności wiązania jonów Co

2+. Modyfikacja oksydacyjna

albuminy zachodzi bardzo szybko, w ciągu kilku minut niedotlenienia. Stężenie modyfikowanej niedokrwieniem albuminy (IMA) wzrasta więc szybko a maksimum osiąga po 2 - 4 godzinach i powraca do wyjściowego stężenia w ciągu 6 godzin. IMA jest jednak nieswoista dla mięśnia sercowego ( wzrost w udarach, niektórych nowotworach, w marskości wątroby, krańcowym stadium niewydolności nerek…) Obiecującym markerem, który może być pomocny w ocenie obecności niewielkich stężeń troponin w surowicy może być także sercowe białko wiążące kwasy tłuszczowe (h-FABP). h-FABP jest białkiem o niskim ciężarze cząsteczkowym (15 kDa) zlokalizowanym w cytoplazmie kardiomiocytów. Biologiczna funkcja h-FABP polega na wiązaniu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych działających jako aktywatory mitochondrialnych białek rozprzęgających i mieć związek z przemianą metabolizmu tlenowego na beztlenowy podczas niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ostatnio pojawia się coraz więcej doniesień o obecności w osoczu cząsteczek mikro-RNA i możliwości ich wykorzystania jako swoistych markerów uszkodzenia tkanek. Mikro-RNA są krótkimi, niekodującymi cząsteczkami RNA składającymi się z 20 – 25 nukleotydów, których podstawową funkcją jest negatywna regulacja ekspresji genów (tzw. „uśpienie genów”). Mechanizm działania miRNA polega na wiązaniu ze swoistymi nie ulegającymi translacji 3’ regionami mRNA, co w efekcie powoduje destabilizację transkryptów oraz blokowanie translacji. Wiele danych wskazuje, że cząsteczki miRNA, a w szczególności swoista dla mięśnia serca cząsteczka miRNA-208 może być użytecznym klinicznie markerem uszkodzenia mięśnia sercowego tak w następstwie zawału jak i pomostowania aortalno-wieńcowego. Ostanie badania wskazują na kluczową rolę cząsteczek miRNA 143 i 145 także w homeostazie komórek mięsni gładkich naczyń co może sugerować ich udział w procesach destabilizacji blaszek miażdżycowych a także w mechanizmach restenozy w stencie Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach przewlekłych Marcin Grabowski Zastosowanie w praktyce diagnostyki biochemicznej w przewlekłych chorobach kardiologicznych cechuje się pewną specyfiką i odmiennością w stosunku do ostrych stanów kardiologicznych. Jest to nie tylko związane zastosowaniem odmiennych markerów biochemicznych ale także z dynamiką ich stężeń, różnymi wartościami referencyjnymi oraz potencjalnym zastosowaniem w przewlekłym monitorowaniu i ewentualnym dostosowaniu terapii. Odmienność dotyczy także wartości rokowniczej i diagnostycznej wybranych wskaźników biochemicznych. W przypadku przewlekłych schorzeń kardiologicznych takich jak niewydolność serca, stabilna choroba wieńcowa czy miażdżyca ogólnoustrojowa znaczenie już mają podstawowe wskaźniki (wyrównanie glikemii, funkcja nerek, lipidogram, układ krzepnięcia, morfologia krwi), które z jednej strony wskazują na ogólne obciążenie stanami współistniejącymi, z drugiej zaś odzwierciedlają ryzyko progresji schorzenia sercowo-naczyniowego. Parametry te mają również znaczenie w kontekście możliwości zastosowani (wskazania i przeciwskazania) odpowiedniej terapii. Zastosowanie nowych testów troponinowych, tych o wysokiej czułości powoduje coraz częstsze wykrywanie cech uszkodzenia mięśnia sercowego u pacjentów z przewlekłą niewydolnością serca czy zaawansowaną chorobą wieńcową. Odzwierciedla to nie tylko gorsze rokowanie tych pacjentów ale także większe prawdopodobieństwo obecności istotnych i wielonaczyniowych zmian w tętnicach wieńcowych. W praktyce problematyczne jest rozróżnienie przewlekłego uszkodzenia mięśnia sercowego od świeżej martwicy spowodowanej ostrym niedokrwieniem. Coraz częściej dyskutuje się czy wykrycie biochemicznych cech uszkodzenia kardiomiocytu zawsze wynika z martwicy czy jednak w niektórych przypadkach może oznaczać odwracalne uszkodzenie. Markery stresu hemodynamicznego jakim są peptydy natriuretyczne mają ugruntowaną pozycję w algorytmie diagnostycznym niewydolności serca. W przypadku przewlekłej niewydolność serca zaleca się stosowanie różnych wartości odcięcia jako wartości wskazujących na niewydolność serca, w zależności od tego czy objawy dekompensacji krążenia narastały powoli czy nagle. Peptydy natriuretyczne, które mają potwierdzoną wartość rokowniczą w przewlekłych schorzeniach kardiologicznych, szczególnie w niewydolności serca, niestety nie potwierdziły jak na razie użyteczności w wykorzystaniu ich do optymalizacji terapii (tzw. „bnp-guided therapy”). Porównując z ostrymi stanami kardiologicznymi, w przypadku schorzeń przewlekłych wydaje się, że większe znaczenie mają markery zapalne (białko C-reaktywne, interleukiny 1, 6, 18), stresu oksydacyjnego (ox-LDL, mieloperoksydaza) czy wykładniki remodelingu zewnątrzkomórkowego (tkankowe inhibitory metaloproteinaz, propetydy kolagenu). Spośród nowych markerów badanych pod kątem użyteczności diagnostycznej i biochemicznej w stanach kardiologicznych można wymienić m.in.: ST2, galektynę, proadremodulinę, czy adiponektynę. Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach przewlekłych. Komentarz laboratoryjny Marek Paradowski Streszczenia nie nadesłano

Nowe biomarkery czy będą stosowane w praktyce klinicznej Piotr Pruszczyk Streszczenia nie nadesłano

XVI. ROLA BADAŃ LABORATORYJNYCH W TRANSFUZJOLOGII I WYBRANYCH CHOROBACH ZAKAŹNYCH

Badania przeglądowe czynników zakaźnych u dawców krwi w Polsce – metodyka, algorytmy potwierdzania zakażenia, kontrola jakości Piotr Grabarczyk W Polsce, u wszystkich dawców pierwszorazowych i wielokrotnych badane są znaczniki zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B i typu C, zakażenia ludzkim wirusem braku odporności (HIV-1/2) oraz kiłą. Badania anty-HCV, anty-HIV1/2 oraz HBsAg prowadzone są metodami immunoenzymatycznymi. DNA HBV, RNA HCV i RNA HIV wykrywane są testami typu multipleks wykorzystującymi metody powielania kwasów nukleinowych (NAT, ang nucleic acid testing). Badania NAT prowadzone są obecnie metodą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) oraz metodą amplifikacji przez transkrypcję (TMA) w pojedynczych donacjach (metodą TMA) lub w pulach osocza zlewanego z 6 (PCR) lub 8 (TMA) donacji. Osocze przeznaczone do produkcji immunoglobulin anty-D oraz anty-HBs jest dodatkowo badane ilościową metodą real-time PCR na obecność DNA parvowirusa B19. Procedury badań przeglądowych czynników zakaźnych niemal we wszystkich laboratoriach są całkowicie zautomatyzowane. W przypadku uzyskania wyniku reaktywnego, badanie jest powtarzane dwukrotnie. Próbki powtarzalnie reaktywne poddawane są odpowiednim badaniom potwierdzającym lub uzupełniającym, które obejmują analizę swoistości przeciwciał w teście Western blot lub immunoblot (HIV i HCV), ocenę stopnia neutralizacji antygenu HBs oraz badanie kwasów nukleinowych wirusów. Wynik dodatni przypisywany jest wyłącznie dawcom z wynikami potwierdzonymi. Rozpoczęcie badań przeglądowych technikami NAT poprzedza m.in. kontrola organizacji i wyposażenia pracowni, szkolenie pracowników oraz wykonanie badań walidacyjnych. Obecnie czułość badania DNA HBV, RNA HCV i RNA HIV w przeliczeniu na pojedynczą donację wynosi odpowiednio, nie mniej niż 17,4 IU/ml, 82,2 IU/ml oraz 220,8 IU/ml. Nadzór merytoryczny nad badaniami przeglądowymi u dawców krwi w Polsce prowadzi Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Najważniejszymi elementami systemu kontroli jakości wirusologicznych badań przeglądowych są: opiniowanie testu przeglądowego przed rozpoczęciem badań (IHiT), walidacja oraz systematyczna rewalidacja wszystkich stosowanych procedur w RCKiK, audyty laboratoriów wirusologicznych, udział w zewnętrznych programach kontroli jakości, codzienna kontrola jakości EDCNet, walidacja urządzeń i systemów automatycznych, kontrola warunków transportu i przechowywania próbek oraz odczynników, kwalifikacja odczynników i sprzętu jednorazowego użytku oraz tzw. batch release. Stan obecny i perspektywy praktycznych zastosowań badań molekularnych grup krwi Ewa Brojer,

Znajomość podłoża molekularnego polimorfizmów warunkujących zróżnicowanie antygenowe komórek krwi oraz dostępność odpowiednich technologii do ich identyfikacji umożliwiają wprowadzenie metod biologii molekularnej do praktyki w immunohematologii Oba te warunki są spełnione w odniesieniu do antygenów krwinek czerwonych (grup krwi) i płytek (HPA – human platelet antigens) i do większości antygenów leżących na granulocytach (HNA- human neutrophil antigens), które stanowią przedmiot zainteresowania immunohematologii. Praktyczne zastosowanie badań molekularnych w immunohematologii rozpoczęto w latach 90. XX wieku dla oznaczania antygenów płytek i granulocytów w diagnostyce alloimmunizacji i powikłań poprzetoczeniowych. Metody te są używane rutynowo, co wynika z ograniczeń metod serologicznych – ograniczonej dostępności surowic diagnostycznych oraz trudności w uzyskaniu odpowiedniej liczby i

jakości płytek i granulocytów do badań. Od roku 2000 dodatkowo biologia molekularna stanowi uzupełnienie badań antygenów krwinek czerwonych. Jest to możliwe ponieważ znane jest podłoże wszystkich układów grupowych, w skład których wchodzi około 300 antygenów krwinek czerwonych. Techniki biologii molekularnej w immunohematologii krwinki czerwonej stosowane są obecnie do: 1/rozwiązywania problemów wynikających z nietypowych wyników badań serologicznych u chorych i krwiodawców (np nietypowego dziedziczenia grup krwi ABO, słabego nasilenia aglutynacji, rozbieżnych reakcji otrzymywanych przy pomocy różnych odczynników lub różnych metod, konieczności rozróżnienia wariantów fenotypów wrodzonych i nabytych), 2/ diagnostyki prenatalnej w konfliktach matczyno-płodowych, 3/ ustalania genotypu u chorych po niedawnych, masywnych przetoczeniach, u chorych z niedokrwistością autoimmunohemolityczną (NAIH) czy przy podejrzeniu obecności przeciwciał do powszechnego antygenu. Badania molekularne antygenów krwinek czerwonych są też przydatne do badań u dawców krwi, np. do identyfikacji krwiodawców, u których występuje antygen RhD o bardzo słabej ekspresji, niewykrywalny metodami serologicznymi, a potencjalnie immunogenny, czy do identyfikacji dawców którzy nie posiadają pewnych klinicznie istotnych antygenów powszechnych. Krew od takich dawców jest konieczna do przetoczeń dla chorych z przeciwciałami do takich antygenów. Znajomość podłoża molekularnego wszystkich antygenów krwinek czerwonych otwiera też perspektywy potencjalnego rozszerzenia badań przedtransfuzyjnych i przetaczanie chorym krwi zgodnej w klinicznie istotnych antygenach tak by unikać alloimmunizacji tymi antygenami. . Procedury takie teoretycznie mogłyby znaleźć zastosowanie dla chorych zależnych od przetoczeń np. z wrodzonymi niedokrwistościami hemolitycznymi, głównie niedokrwistością sierpowato krwinkową i talasemią, dla których proces alloimmunizacji pociąga za sobą ciężkie powikłania kliniczne. W praktyce nie wprowadzono jak dotąd takich procedur w żadnym kraju. Podkreślić też należy, że nie ma perspektyw odstąpienia od badań serologicznych antygenów układu ABO i skierowanych do nich przeciwciał.

Diagnostyka laboratoryjna boreliozy Joanna M. Zajkowska Diagnostyka laboratoryjna boreliozy z Lyme stanowi mimo stałego rozwoju i udoskonalania testów duże wyzwanie. Wynika to z wielu przyczyn, m.in. kilku różniących się antygenowo genogatunków bakterii odpowiadających za boreliozę Lyme, zmiana prezentowanych antygenów w trakcie zakażenia, zmienność antygenowa pojedynczych antygenów. Ponadto trudności w interpretacji klinicznej sprawia długie utrzymywanie się odpowiedzi immunologicznej, brak standaryzacji obowiązujących testów, brak testu związanego z aktywnością choroby. Testy diagnostyczne są stale udoskonalane, jednak chronione patentami co utrudnia wprowadzenie identycznych kryteriów i jednostek. Zatem w boreliozie wywołanej przez krętka Borrelia burgdorferi s.l., do rozpoznania, niezbędna jest znajomość nie tylko obrazu klinicznego choroby, ale również znajomość parametrów diagnostycznych stosowanych testów laboratoryjnych i ich ograniczenia. Obowiązująca diagnostyka boreliozy w Europie to metoda dwuetapowa. Pierwszy etap to badanie obecności przeciwciał metodą ELISA, co z założenia jest metodą cechującą się nadrozpoznawalnościa(duża czułość), następnie weryfikacja swoistości wykrytych przeciwciał metodą Western blot lub immunoblot(duża swoistość-przeciwciała w klasie IgM we wczesnej, IgG późniejszej boreliozie).. Część komercyjnych testów diagnostycznych w Europie, które opierają się na antygenach szczepu B31, sensu stricto, a który jest źródłem choroby w USA, wypierane są przez testy oparte na antygenach szczepów europejskich. Ze względu na heterogenność genogatunków, porównywanie wyników rożnych testów stwarza wiele rozbieżności, będąc przyczyną nadrozpoznawalności lub nierozpoznawania boreliozy z Lyme. Rozpoznanie boreliozy z Lyme jest połączeniem rozpoznania klinicznego z potwierdzeniem immunoserologicznym zakażenia B.burgdorferi. Testy serologiczne kryją w sobie szereg pułapek interpretacyjnych. Przeciwciała IgM- pojawiają się najwcześniej, utrzymują się długo, również po skutecznym leczeniu. Odpowiedź w klasie IgG, pojawia się około 3-6 tygodnia po zakażeniu i może się utrzymywać po latach po wyleczeniu boreliozy. Negatywny wynik badania serologicznego nie wyklucza choroby, we wczesnych jej etapach W przebiegu erythema migrans (EM), wczesnej zlokalizowanej postaci choroby, większość komercyjnych testów wypada ujemnie (u ok. 50% badanych). Należy również wziąć pod uwagę, iż istnieje reakcja krzyżowa z niektórymi bakteriami jak i w czasie niektórych zakażeń wirusowych, wzbudzających

poliklonalną produkcje przeciwciał jak np. wirus EBV. Fałszywie dodatnia odpowiedź może się pojawić w chorobach autoimmunologicznych, chorobach wątroby (wzw C) jak i może być spowodowana bakteriami B.burgdorferi, które nie posiadają cech patogennych. Testy łączące antygeny kilku genogatunków B.burgdorferi natywne jak i rekombinowane cechują się wyższą czułością i swoistością. Obiecującym usprawnieniem diagnostyki, wydają się być testy oparte na konserwatywnym białku C6, fragmencie białka VlsE. W klasie IgM reaktywność surowicy z VlsE obserwowana jest u osób z wczesną jak i zaawansowaną boreliozą. W klasie IgG VlsE służy jako niezależny marker niezależny od stadium choroby. Testy oparte na konserwatywnym białku C6 z grupy VlsE, zwiększają wykrywalność łącząc możliwość wykrycia przeciwciał bakterii o dużej zmienności antygenowej nawet wewnątrzgatunkowej. Innowacją jest również zastosowanie testów w technice multiplex. Po leczeniu monitorowanie stężenia przeciwciał nie ma uzasadnienia jeśli nie podejrzewamy reinfekcji. Testy bezpośrednie- hodowla jak i metoda PCR mają liczne ograniczenia, wysokie koszty, trwają w czasie , co powoduje że nie mają zastosowania w standardowej diagnostyce klinicznej. Neuroborelioza w badaniach laboratoryjnych opiera się na wykonaniu badań w 2 kompartmentach: surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym. Pewność rozpoznania umożliwia wykazanie syntezy wewnątrzoponowej badanych przeciwciał. Wykorzystuje się metodę WB IB jak i obliczenie wskaźnika syntezy wewnątrzoponowej AI. Testy nie zalecane w diagnostyce boreliozy to:

Poszukiwanie krętków w kleszczu

Test transformacji limfocytów LTT Melisa,

Poszukiwanie postaci „cyst”

Testy VCS (visual contrast sensittivity test)

Ocena liczebności subpopulacji limfocytów CD57

Biorezonans, kanały energetyczne itd. Prokalcytonina w diagnostyce i leczeniu sepsy. Małgorzata Mikaszewska-Sokolewicz, Sepsa jest reakcją organizmu na zakażenie. Powstaje gdy wzajemna proporcja pomiędzy pozapalną i przeciwzapalną reakcją organizmu zostaje zaburzona; wtedy odpowiedź organizmu może przybierać różne nasilenie, w skrajnych sytuacja dochodzi do gwałtownie postępującego wstrząsu septycznego i zgonu. Cytokiny uwolnione w trakcie reakcji zapalnej ( IL-1 i TNF alfa) uruchamiają w makrofagach tkankowych i innych komórkach wytwarzanie prokalcytoniny. Prokalcytonina ma przewagę w stosunku do innych powszechnie używanych biomarkerów reakcji zapalnej takich jak białko CRP i wzrost liczby leukocytów w surowicy, gdyż jest wytwarzana przede wszystkim podczas uogólnionych zakażeń bakteryjnych. Prokalcytonina została włączona do protokołów diagnostycznych ciężkich infekcji między innymi w Stanach Zjednoczonych, Niemczech, Szwajcarii , Francji, Hiszpanii, Szwecji i Słowacji dlatego , że pozwala diagnozować sepsę wcześniej niż tradycyjnie używane markery reakcji zapalnej. Sepsa jest obarczona wysoka śmiertelnością ; pacjenci mają tym lepszą prognozę im szybciej zostanie włączone leczenie W wielu badaniach klinicznych wykazano, że stężenie prokalcytoniny zmienia się wraz z ciężkością zakażenia, natomiast dynamika zmian jej stężenia, może mieć znaczenie prognostyczne. Biomarker należy do rodziny białek kalcytoniny. Ze względu na swój złożony charakter i łączenie cech prohorrmonu i cytokiny prokalcytonina jest zaliczana do grupy hormokin. Zainteresowanie prokalcytoniną w kontekście infekcji powstało w latach 70. Przez niemal pół wieku parametr został bardzo dokładnie przebadany w badaniach laboratoryjnych i klinicznych , w kontekście ostrej infekcji pierwotnej i wtórnej, urazów, operacji chirurgicznych i chorób nowotworowych. Opracowano protokoły antybiotykoterapii w infekcjach płucnych, zakażeniach ośrodkowego układu nerwowego i w sepsie. Przeprowadzono i opisano badania, w których terapia antybiotykowa była rozpoczynana, intensyfikowana, modyfikowana lub kończona w oparciu z stężenie prokalcytoniny w surowicy. Umożliwiło to zmniejszenie zużycia i skrócenie antybiotykoterapii, skrócenie hospitalizacji, zmniejszenie liczby powikłań i kosztów leczenia. Oznaczenie prokalcytoniny stanowi wartość dodana do oceny stanu klinicznego i oznaczeń liczby leukocytów i stężenia CRP. Parametr może również wzrastać po operacji , urazach, we wstrząsie, w reakcji odrzucania przeczepionego narządu, malarii, niektórych zakażeniach grzybiczych jednak dynamika narastania i obniżania stężenia biomarkera w surowicy jest zdecydowanie różna od obserwowanej podczas uogólnionych infekcji bakteryjnych. U osób zdrowych poziom prokalcytoniny

jest bardzo niski (<0,05 ng/ml) w zakażenia wzrasta powyżej 0,5 ng/ml i może osiągać wartości 100 krotnie wyższe bowiem rozpiętość stężeń jakie w surowicy może osiągać prokalcytonina waha się od 0,01- 1000ng/ml. W Polsce prokalcytonina , może być oznaczana metoda ilościową i jakościową we krwi . Czas oczekiwania na wynik testu wynosi od 19 minut do 2,5 godziny. Wielu autorów podkreśla nadrzędną role PCT w diagnostyce sepsy jako biomarkera który jest bardziej specyficzny niż inne markery rekcji zapalnej , stabilnego w próbce krwi ( zarówno w temperaturze pokojowej jak i temperaturze 4C i -20C), którego można oznaczyć łatwo i szybko a tym samym można skrócić do minimum czas wdrożenia antybiotykoterapii. Bowiem każda godzina opóźnienia antybiotykoterapii zwiększa ryzyko niepowodzenia terapii o 7 %.

STRESZCZENIA POSTERÓW 3. Wiedza pielęgniarek na temat pobierania materiału Agnieszka Kitowska

1, Urszula Skalska

1, Joanna Bicka

1, Iwona Kowalczyk

1, Marek Drozdowski

1,

Jolanta Gruchacz1, Marek Jurkowski

1

1 Katedra Analityki Medycznej, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Polska

Zgodnie z aktualnie obowiązującym w Polsce prawem, osoba z wykształceniem pielęgniarskim posiada uprawnienia między innymi do pobierania materiałów biologicznych, w tym krwi. W chwili obecnej aż w 80 placówkach można zdobyć wykształcenie pielęgniarskie, a w obowiązujących programach nauczania nie ma przedmiotu diagnostyka laboratoryjna. Na wiarygodność uzyskanych wyników w dużej mierze wpływa poprawne wykonanie fazy przedlaboratoryjnej, które zgodnie z danymi literaturowymi może warunkować aż 60% błędnych wyników badań. Zważywszy na fakt, iż w polskich szpitalach personel pielęgniarski pobiera krew do praktycznie wszystkich badań, podjęliśmy próbę oceny stanu wiedzy pielęgniarek i pielęgniarzy na temat przygotowania pacjenta, pobierania materiału biologicznego oraz sposobu i czasu przechowywania próbki. Badaniem ankietowym objęto 130 osób personelu pielęgniarskiego pracujących na olsztyńskich oddziałach zabiegowych i zachowawczych oraz studentów I roku pielęgniarstwa Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego, którzy zaliczyli przedmiot „podstawy pielęgniarstwa”. 64% respondentów oceniło swoją wiedzę, zdobytą w toku kształcenia, jako wystarczającą do pobierania materiału analitycznego. 11% ankietowanych nie pogłębia tej wiedzy, natomiast osoby dokształcające się korzystają głównie z informacji zawartych w literaturze (75%) oraz z uwag koleżanek i kolegów (41%). Niepokojącym jest fakt, iż bardzo mała grupa (12%) personelu pielęgniarskiego pogłębia swoją wiedzę korzystając z uwag lekarzy. Blisko 60% respondentów błędnie sądzi, że nie można pobierać krwi z kaniuli obwodowej i tylko 39% badanych słusznie uważa, że należy odrzucić pierwszą porcję krwi pobranej z kaniuli. Tylko 62% ankietowanych wie, że czas jaki powinien upłynąć od spożycia posiłku powinie wynosić co najmniej 8 godzin. Znaczną część błędnych odpowiedzi na powyższe pytanie udzielił personel pracujący na oddziałach zachowawczych (71%). Z uzyskanych rezultatów wynika, iż 80% badanych jest świadoma wpływu wysiłku fizycznego na wynik badania laboratoryjnego, ale tylko 54% z nich zdaje sobie sprawę z tego, że również sposób postępowania z pacjentem w trakcie pozyskiwania materiału do analizy może wpłynąć na wartość uzyskanego wyniku. Tylko 19% spośród badanego personelu pielęgniarskiego wie, że pozycja ciała pacjenta podczas pobierania krwi ma wpływ na wynik badania. Aż 48% ankietowanych błędnie odpowiedziało na pytanie dotyczące maksymalnego czasu użycia opaski uciskowej podczas pobierania krwi. Tylko 1/3 badanych znała poprawną kolejność pobierania próbek krwi, a 24% ankietowanych wiedziało o konieczności stosowania konserwantu w dobowej zbiórce moczu. Z przeprowadzonych przez nas badań wynika, iż wiedza na temat błędu przedlaboratoryjnego pielęgniarek posiadających wykształcenie wyższe i tytuł specjalisty pielęgniarstwa nie jest znacznie wyższa niż wiedza osób posiadających średnie wykształcenie pielęgniarskie. Biorąc pod uwagę fakt, iż 56% respondentów pobiera krew przynajmniej jeden raz dziennie można przypuszczać, że lepsze przygotowanie teoretyczne osób pobierających materiał biologiczny wpłynie na poprawę jakości otrzymywanych wyników. Uzyskane dane podkreślają konieczność szkolenia personelu pielęgniarskiego z podstaw diagnostyki laboratoryjnej w celu zmniejszenia błędu przedlaboratoryjnego. 4. Modulacja metabolizmu energetycznego komórek C6 Małgorzata Zielińska-Przyjemska

1, Wanda Baer-Dubowska

1.

1 Katedra Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w

Poznaniu, Polska Zmiany w metabolizmie komórek rakowych są jedną z podstawową cech charakteryzujących nowotwory. Najistotniejszą z nich jest wykorzystywanie tlenowej glikolizy jako podstawowego źródła energii. Choć zjawisko to zostało zaobserwowane już w latach dwudziestych ubiegłego wieku, dopiero niedawno poznawane są jego mechanizmy na poziomie molekularnym i komórkowym, a także powiązanie m.in z opornością komórek rakowych na apoptozę. Z tego powodu inhibicja glikolizy jest uważana za bardzo obiecującą strategię prewencji i terapii, zdolną pokonać oporność komórek rakowych na chemio- i radioterapię w warunkach hipoksji. Do tej

pory opisano jednak tylko nieliczne związki zdolne do ingerencji w te mechanizmy, a badania ograniczały się tylko do niektórych modeli nowotworów. Celem niniejszych badań była ocena oddziaływania roślinnych związków fenolowych - kwasu taninowego i resweratrolu oraz jego pochodnych - pterostilbenu i trimetoksystilbenu na żywotność i podstawowe parametry tlenowej glikolizy w komórkach glejowych szczura C6. Badane związki w naszych wcześniejszych badaniach wykazały aktywność chemoprewencyjną, o zróżnicowanym mechanizmie w odniesieniu do komórek prawidłowych lub w modelach zwierzęcych na etapie inicjacji i/lub promocji. Badania poprzedzono oceną cytotoksyczności badanych związków z wykorzystaniem metabolicznego testu przeżywalności/proliferacji MTT. Resweratrol i jego analogi oraz kwas taninowy w zastosowanym zakresie stężeń obniżały przeżywalność badanych komórek. Stosując technikę Western blot w komórkach C6 traktowanych przez 48 godzin badanymi związkami (1 i 10 µM) zaobserwowano nieznaczne obniżenie poziomu białka HIF 1α, LDH i PDK-kinazy1 dehydrogenazy pirogronianowej, w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Najskuteczniejsze działanie wykazał trimetoksystilben oraz kwas taninowy. Ponadto badane polifenole w stężeniu 10 µM zwiększały uwalnianie LDH do medium hodowlanego świadczący o zakłóceniu integralności błony komórkowej. Podstawowym wskaźnikiem tlenowej glikolizy w komórkach nowotworowych jest zwiększona produkcja kwasu mlekowego. Wszystkie badane związki za wyjątkiem pterostilbenu albo nie miały wpływu na poziom tego parametru, albo nieznacznie (~10%) go podwyższały. Pterostilben w stężeniu 10 µM obniżał produkcję kwasu mlekowego w porównaniu do komórek kontrolnych (~10%) w wyniku 24 godz. ekspozycji. Choć obserwowana różnica była niewielka, może ona wskazywać, że pterostilben może hamować wzrost komórek glejowych poprzez hamowanie tlenowej glikolizy. Dalsze badania przy wykorzystaniu bardziej czułych wskaźników są konieczne, aby ten efekt potwierdzić i wyjaśnić mechanizm oddziaływania. 5. Modulacja AZS przez mikrobiota. Iwona Dorożyńska

1, Monika Majewska-Szczepanik

2, Anna Strzępa

1, Marian Szczepanik

1

Katedra Biologii Medycznej, Collegium Medicum UJ, 2 Zakład Biologii Rozwoju Człowieka, Katedra

Biologii Medycznej, Collegium Medicum UJ, Polska Atopowe zapalenie skóry (AZS) jest schorzeniem skóry, u podstaw którego leży reakcja nadwrażliwości typu I. Modelem zwierzęcym imitującym AZS jest atopowe zapalenie skóry (AD) u myszy, które można wywołać poprzez naskórną (EC) immunizację białkiem jaja kurzego- owalbuminą (OVA). W przedstawionych badaniach podjęto próbę oceny wpływu częściowej eliminacji naturalnej flory jelitowej na przebieg AD u myszy. Atopowe zapalenie skóry wywoływano u myszy BALB/c poprzez EC aplikację OVA. Częściowej eliminacji naturalnej flory jelitowej dokonano poprzez doustne podanie antybiotyku w wodzie do picia przez 2 tygodnie przed EC immunizacją OVA. Podawanie antybiotyku kontynuowano przez pierwszy tydzień immunizacji OVA. Immunizacja OVA polegała na dwutygodniowym podaniu OVA w opatrunku z gazy (patch method) na uprzednio ogoloną skórę grzbietu. Następnie reakcję wywoływano po tygodniowej przerwie poprzez EC podanie OVA w opatrunku. W kontroli pozytywnej myszy otrzymywały wodę bez antybiotyku przez cały okres trwania eksperymentu. Dodatkowo do doświadczenia dołączono kontrolę myszy nieimmunizowanych, a które były pojone wodą z antybiotykiem lub samą wodą. Eliminację flory bakteryjnej oceniano poprzez określenie ilości kolonii bakteryjnych [colony forming unit (CFU)] wzrastających w warunkach tlenowych i beztlenowych wyizolowanych z treści jelitowej. Poziom przeciwciał anty-OVA IgE I IgG2A oznaczono w surowicy krwi metodą immunoenzymatyczną (ELISA). Niniejsze badania wykazały, że trzytygodniowe pojenie myszy antybiotykiem w wodnym roztworze znacząco zmniejsza ilość CFU zarówno w obrębie bakterii beztlenowych jak i również tlenowych w odniesieniu do grupy kontrolnej. Ponadto stwierdzono, że częściowa eliminacja flory jelitowej zmniejsza poziom przeciwciał OVA-swoistych klasy IgE i IgG2A w surowicy. Otrzymane wyniki oznaczenia poziomu przeciwciał OVA-swoistych klasy IgG2A są znamienne statystyczne.

7. Porównanie osmolalności zmierzonej i obliczonej u dzieci IWONA ROGATKO

1, OLGA CHLIPALSKA

1, KRYSTYNA SZTEFKO

1

1 ZAKŁAD BIOCHEMII KLINICZNEJ, INSTYTUT PEDIATRII UJCM, Polska

Pomiar osmolalności surowicy wykorzystywany jest jako badanie pomocnicze w ocenie zaburzeń gospodarki wodno-elektrolitowej, zdolności wytwarzania i zagęszczania moczu, w diagnostyce hiponatremii , w zatruciach lub leczeniu substancjami osmotycznie czynnymi jak również w diagnozowaniu przewlekłych biegunek o nieznanej etiologii. Osmolalność surowicy może być także obliczona poprzez wykorzystanie wzorów uwzględniających stężenie jonów sodowych, glukozy i mocznika. Porównywalność osmolalności zmierzonej i obliczonej w dużej mierze zależy z jednej strony od zastosowanego do obliczeń wzoru a z drugiej od wiarygodności wyników oznaczeń substancji osmotycznie czynnych. Obliczanie osmolalności u osób dorosłych ma już ustaloną wartość diagonostyczną natomiast mało jest danych na ten temat u dzieci, zwłaszcza, że wartości referencyjne jonów sodowych, glukozy i mocznika u małych dzieci są odmienne niż u osób dorosłych. Cel pracy: Porównanie zmierzonej i obliczonej osmolalności u dzieci w wieku od sześciu miesięcy do czterech lat. Materiał i metody: Analizie poddano wyniki oznaczenia osmolalności uzyskane u 62 dzieci w wieku od 6 miesięcy do 4 lat (średnia wieku 25.4±3,4 miesiące, dziewczynki/chłopcy 28/34). Dzieci hospitalizowane były w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Krakowie. Do analizy wykorzystano wyniki osmolaności uzyskane u tych dzieci, u których rutynowo zlecono oznaczenie stężenia jonów sodowych, glukozy i mocznika. Osmolalności mierzono na osmometrze 800 CL metodą krioskopową, a oznaczenia biochemiczne wykonywano na analiztorze Vitros 5,1 (sucha chemia). Do obliczenia osmolalności wykorzystano cztery wzory: 1. [mOsm/kg H2O] = 2 x [Na+ [mmol/l] + glukoza [mmol/l]; 2. [mOsm/kg H2O] = 2 x [Na+ [mmol/l] + glukoza [mmol/l] + mocznik [mmol/l]; 3. [mOsm/kg H2O] = 1,86 x [Na+ [mmol/l] + glukoza [mmol/l] + mocznik [mmol/l] +9; 4. [ mOsm/kg H2O] = 2 x [Na+ [mmol/l] + mocznik [mmol/l] . Wyniki: Średnia wartość osmolalności zmierzonej wynosiła 292,9±9,1 mOsm/kg H2O i była wyższa w porównaniu do średnich uzyskanych w oparciu o każdy wzór, chociaż różnice nie były istotne statystycznie i wynosiły odpowiednio: (×%u03051= 280,5± 5,3 mOsm/kg H2O ; (×%u03052= 285,3±6,2 mOsm/kg H2O; (×%u03053 =273,2±5,8 mOsm/kg H2O; (×%u03054= 279,0±6,2 mOsm/kg H2O). Największe procentowo różnice stwierdzono w przypadku zastosowania wzoru 3 i 4. Uzyskano istotnie statystycznie korelacje pomiędzy zmierzoną osmolalnością a wartościami wyliczonymi, niezależne od zastosowanego wzoru (p<0.001 w każdym przypadku). Nie stwierdzono zależności pomiędzy wiekiem dzieci a otrzymanymi wartościami. Jednakże dokonując porównania zmierzonej i obliczonej osmolalności dla dzieci do lat 2 stwierdzono wyższe wartości osmolalności zmierzonej w porównaniu do dzieci od 2do 4 lat . Wniosek: Obliczanie osmolalnosci surowicy u małych dzieci ma podobną wartość diagnostyczną jak u osób dorosłych. 8. EC with protein TNP-Ig alleviates TNBS-colitis. Iwona Dorożyńska

1, Monika Majewska-Szczepanik

2, Marta Góralska

1, Katarzyna Marcińska

1,

Magdalena Zemelka-Wiącek1, Anna Strzępa

1, Marian Szczepanik

1

1Katedra Biologii Medycznej, Collegium Medicum UJ, Polska,

2 Zakład Biologii Rozwoju Człowieka,

Katedra Biologii Medycznej, Collegium Medicum UJ, Polska Ulcerative colitis (UC) is a chronic inflammatory autoimmune disease with limited treatment modalities. The animal model of colitis induced by treatment with trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS-colitis) is commonly used to test new therapies of this disease. In our previous work we found that epicutaneous (EC) immunization with protein antigen induced a state of profound immunosuppression that inhibited inflammatory response in contact sensitivity, in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and in allogeneic skin graft rejection. In our current work, we showed that EC immunization with TNP-Ig (TNP-conjugated mouse immunoglobulin) prior to induction of TNBS-colitis alleviates disease severity what was determined by the body weight, the length and the weight of the colon, the histological activity index (HAI) and myeloperoxidase activity (MPO). Observed amelioration of the disease in TNP-Ig patched mice was accompanied with decreased production of IFN-g and IL-17A by splenocytes. Additionally, spleen cells isolated from mice EC immunized with TNP-Ig prior to colitis induction showed increased production of IL-10 suggesting that this cytokine might be involved in inhibiting inflammatory response in the colon.

9. Fibulina-1 w ocenie ryzyka CVD u osób bez cukrzycy. Katarzyna Bergmann

1, Aneta Mańkowska-Cyl

1, Kamil Olender

1, Marek Kretowicz

2, Jacek Manitius

2,

Grażyna Odrowąż-Sypniewska1

Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Collegium Medicum UMK im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Polska Katedra i Klinika Nefrologii, Nadciśnienia Tętniczego i Chorób Wewnętrznych Collegium Medicum UMK im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Polska Wstęp: Fibulina-1 (FBLN1) jest białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej występującym w naczyniach krwionośnych. Najnowsze badania wskazują na jej udział w rozwoju miażdżycy, chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i powikłań naczyniowych w przebiegu cukrzycy. Celem badania była ocena zależności pomiędzy stężeniem fibuliny-1 w surowicy a biochemicznymi wskaźnikami ryzyka sercowo-naczyniowego u młodych osób bez cukrzycy. Materiał i metody: Badaniem objęto 120 nieotyłych, niepalących osób z normoglikemią, w wieku 25-40 lat (66 kobiet i 54 mężczyzn). U badanych wykonano na czczo oznaczenia glukozy w osoczu, hemoglobiny glikowanej w krwi pełnej, profilu lipidowego, białka C-reaktywnego, bilirubiny całkowitej, insuliny, apolipoprotein B100 i AI (apoB, apoAI), witaminy 25(OH)D, wysokoczułej troponiny sercowej T (hs-cTnT), adiponektyny oraz FBLN1 w surowicy. Wskaźniki antropometryczne (BMI, WHR), HOMA-IR i wskaźnik aterogenności apoB:apoAI zostały obliczone za pomocą odpowiednich równań. Grubość kompleksu intima-media (IMT) tętnic szyjnych została zmierzona w badaniu ultrasonograficznym. Badanych podzielono ze względu na tercyle stężenia FBLN1. Wyniki: Stężenie FBLN1 po uwzględnieniu wieku, BMI i ciśnienia krwi wykazało istotną statystycznie dodatnią korelację z profilem lipidowym, apoB:apoAI (β=0,19; p=0,02), apoB (β=0,28; p=0,016), hs-cTnT (β=0,39; p=0,003) oraz korelowało ujemnie z 25(OH)D (β=-0,23; p=0,015). W kolejnych tercylach stężenia FBLN1 zaobserwowano rosnące wartości glukozy, hs-cTnT, apoB i cholesterolu nie-HDL. Stężenie 25(OH)D, adiponektyny i bilirubiny całkowitej były istotnie obniżone w grupie III tercyla FBLN1 w porównaniu do tercyla I. Stężenie FBLN1 ≥1,0 ng/mL było niezależnie związane z podwyższonym stężeniem apoB >90 mg/dl (OR= 3,11; CI 1,1-9,0; p=0,03) i hs-cTnT ≥4,75 pg/ml (OR=4,26; CI: 1,9-9,7; p<0,001). Wnioski: Fibulina-1 wydaje się być obiecującym nowym czynnikiem ryzyka sercowo-naczyniowego u młodych, nie-otyłych osób bez cukrzycy. 10. Manualna i automatyczna ocena obrazów krwi obwodowej pacjentów pediatrycznych z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) leczonych wg ALL-IC-BFN 2009 Monika Nowakowska

1, Joanna Cieślik

1, Walentyna Balwierz

2, Krystyna Sztefko

1

1 Zakład Biochemii Klinicznej, Instytut Pediatrii CMUJ Kraków, Polska,

2 Klinika onko-hematologii,

Instytut Pediatrii CMUJ Kraków, Polska Wstęp: Białaczka limfoblastyczna (ALL) jest najczęstszą białaczką występującą w populacji pediatrycznej (ok. 80% białaczek) w przeciwieństwie do populacji dorosłych (ok. 20% białaczek). Automatyczne analizatory hematologiczne pozwalają na różnicowanie leukocytów, jednak wiarygodność wyników uzależniona jest od rodzaju komórek obecnych we krwi. Cel: Porównanie wyników morfologii dzieci z ALL leczonych wg ALL-IC-BFN 2009 uzyskanych metodą manualną i automatyczną. Materiał i metody: Grupę badaną stanowiło 20 dzieci :8 dziewczynek i 12 chłopców w wieku od 1 roku do 15,5 lat( średnia wieku 6,5 lat). Próbki krwi pobierano w dniu zdiagnozowania białaczki, po 7 dniach sterydoterapii, w 15 dniu po podaniu sterydów i cytostatyków oraz w 33 dniu leczenia. Analizie poddano 80 wyników obrazów krwi obwodowej ocenionych metodą manualną (barwienie May-Gr%u0171nwalda-Giemsy, mikroskop OLYMPUS BX 40) i metodą automatyczną (Sysmex XS 800i). Wyniki: W pierwszym dniu zdiagnozowania choroby odsetek limfocytów uzyskany metodą automatyczną był istotnie statystycznie wyższy w porównaniu do uzyskanego metodą manualną (p<0.001) i nie stwierdzono korelacji pomiędzy porównywanymi metodami. Po leczeniu uzyskano korelację pomiedzy odsetkiem limfocytów uzyskanym obiema metodami (po 7 dniach r=0.58, p<0.05, po 15 dniach r=0.987, p<0.001, po 33 dniach r=0.982, p<0.001) niezależnie od liczby krwinek białych. Metodą manualną identyfikowano blasty przed leczeniem i po 7 dniach sterydoterapii, natomiast w metodzie automatycznej blasty zaliczane były w 98% przypadków do limfocytów, a u jednego dziecka do monocytów. Stwierdzono istotną korelację różnicy odsetka limfocytów i odsetka blastów pomiędzy

metodą manualną a metodą automatyczną (p<0.001). Wyniki odsetka limfocytów uzyskane z analizatora hematologicznego flagowane były alarmem „blasts” tylko w 6 próbkach, niezależnie od liczby krwinek białych. Dla neutrofili, eozynofili i bazofili różnice pomiędzy wynikami uzyskanymi z analizatora hematologicznego i metodą manualną nie były istotne statystycznie. Wnioski: U dzieci z ALL wyniki z analizatora hematologicznego powinny być zawsze weryfikowane metodą manualną, niezależnie od rodzaju leczenia i liczby krwinek białych. 11. Wpływ PLTP na metabolizm cząstek HDL. Anna Wolska

1, Joanna Pawłowska

1, Marta Bednarek

1, Andrzej Szutowicz

1, Małgorzata Wróblewska

1

1 Zakład Medycyny Laboratoryjnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska

W metabolizmie osoczowym lipoprotein istotną rolę odgrywa białko transportujące fosfolipidy (PLTP). PLTP transportuje fosfolipidy pomiędzy cząstkami bogatolipidowymi i lipoproteinami wysokiej gęstości (HDL), przyczyniając się m. in. do przebudowy cząstek HDL powodując powstawanie nowej frakcji ubogiej w lipidy tzw. pre-beta HDL. Celem pracy było zbadanie wpływu PLTP na oddziaływania zachodzące pomiędzy HDL i liposomami lecytynowymi, związane z takimi procesami jak transfer fosfolipidów z liposomów lecytynowych do cząstek HDL, wypływ cholesterolu z HDL, uwalnianie apolipoprotein (apo) A-I i A-II przez HDL i tworzenie cząstek pre-beta HDL. Do doświadczeń używano natywnych HDL surowicy (sHDL), ultrawirowanych HDL (uHDL) i rekonstytuowanych w surowicy bezlipoproteinowej ultrawirowanych HDL (rHDL). Cząstki HDL inkubowano 1 godz. w temp. 37°C z liposomami lecytynowymi, przy stosunku wagowym fosfolipidów liposomalnych do fosfolipidów HDL wynoszącym 3:1. Inkubację prowadzono w warunkach: 1) zachowanej aktywności PLTP obecnego w surowicy, 2) zahamowanej termicznie aktywności PLTP i 3) modyfikowanej przeciwciałami anty-PLTP aktywności białka PLTP. Przed i po reakcji mierzono stężenia lipidów oraz apo A-I i A-II zarówno w HDL, jak i rozdzielonych precypitacyjnie produktach reakcji. Powstawanie nowej frakcji pre-beta HDL, w wyniku oddziaływania HDL z liposomami, oceniano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Badania wykazały, że interakcja liposomów lecytynowych z cząstkami HDL prowadzi do zależnego od aktywności PLTP transportu fosfolipidów do cząstek alfa-HDL. Obecność białek surowicy innych niż PLTP nie wpływa na powyższy transfer. Wypływ cholesterolu z cząstek HDL, w wyniku oddziaływania z liposomami, jest procesem niezależnym od aktywności PLTP. Tak samo procesy uwalniania apo A-I i apo A-II z alfa-HDL oraz powstawanie nowej frakcji pre-beta HDL są niezależne od aktywności PLTP. Reasumując, wyniki zawarte w pracy potwierdzają, że białko PLTP odgrywa ważną rolę w metabolizmie lipoprotein HDL, a jego główną funkcją jest transport fosfolipidów do cząstek HDL. 12. Rola bekliny 1 w autofagii komórek HELA z nadekspresją PKCε Paulina Sawicka

1, Ewa Totoń

2, Maria Rybczyńska

2

1 Katedra i Zakład Genetyki i Mikrobiologii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola

Marcinkowskiego w Poznaniu, Polska, 2 Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Molekularnej,

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Polska Wstęp. Współczesna strategia walki z chorobami nowotworowymi jest następstwem intensywnego rozwoju wiedzy o molekularnym podłożu chorób nowotworowych. Ogromna ilość prac poświęcona jest próbom identyfikacji mechanizmów prowadzących do programowanej śmierci komórki. Jednym z typów programowanej śmierci komórki jest autofagia. Mechanizm procesu polega na lizosomalnym trawieniu elementów komórki zawartych w utworzonych autofagosomach. Autofagia wykazuje dualistyczny charakter, z jednej strony utrzymuje homeostazę pomiędzy biosyntezą a rozkładem makrocząsteczek, dostarczając niezbędnych składników w warunkach deficytu bioenergetycznego, z drugiej jest narzędziem eliminacji komórek nowotworowych, co wskazuje na jej rolę w hamowaniu procesu nowotworzeni. Białkiem uczestniczącym w procesie inicjacji autofagii jest Beklina 1, pełniąca rolę genu supresorowego. Istnieją doniesienia, w których wykazano dodatnią korelację między ekspresją i/lub aktywnością Bekliny 1 a procesem kancerogenezy. Kluczowe znaczenie w prawidłowym funkcjonowaniu komórki odgrywają kinazy białkowe C (PKC). PKC epsilon (PKCε) jest przedstawicielem grupy nowych PKC. Jej aktywacja odgrywa rolę w regulowaniu wielu procesów m.in.: proliferacji, różnicowaniu, ekspresji genów oraz promocji nowotworów. Dotychczasowe badania

naukowe na temat PKCε wskazują, że jest jedyną izoformą w rodzinie kinaz białkowych C, która przejawia wysoki potencjał onkogenny, a jej nadekspresja kieruje komórki na drogę transformacji nowotworowej. Cel projektu. Celem projektu była ocena poziomu białka Bekliny 1 w komórkach raka szyjki macicy charakteryzujących się nadekspresją kinazy białkowej C epsilon. Ponadto oceniono wpływ modulatorów procesu autofagii (Rapamycyny i 3-metyloadeniny) oraz inhibitora PKC- BIM ( bisindolylmaleimide) na przebieg autofagii. Materiał i metody. Jako model badawczy zastosowano komórki raka szyjki macicy z nadekspresją konstytutywnie aktywnej PKCε (Hela PKCεA/E). Linia komórkowa Hela PKCεA/E charakteryzuje się wprowadzoną mutacją punktową alaniny (A) na kwasem glutaminowym (E), co powoduje ciągłą aktywność enzymu. Nadekspresję konstytutywnie aktywnej PKCε uzyskano poprzez indukcję ekspresji genu PKCεA/E doksycykliną (DOX) w stężeniu 2 μg/ml. Materiałem do badań był lizat, uzyskany z komórek Hela PKCεA/E. W lizatach oznaczono ilość białka za pomocą metody Bradford Obecność badanych białek wykazano techniką elektroforezy, transferu (Western Blot) oraz immunoidentyfikacji z zastosowaniem odpowiednich przeciwciał. Wyniki. W badaniach własnych wykazano brak wpływu stosowanych modulatorów procesu autofagii na podstawowy poziom białka PKCεA/E (komórki nieindukowane). Zaobserwowano natomiast wyraźny wpływ zarówno Rapamycyny jak i 3-MA na komórki z nadekspresją konstytutywnie aktywnej PKCε. Wykazano obniżenie poziomu białka PKCεA/E pod wpływem działania modulatorów autofagii w porównaniu z próbą traktowaną induktorem. Efekt ten jest dodatkowo wzmacniany w próbach, gdzie zastosowano inhibitor PKC – BIM Wykazane obniżenie poziomu białka PKCεA/E w próbach potraktowanych modulatorami procesu autofagii jest z biologicznego punktu widzenia, w kontekście procesu onkogenezy, korzystne i stało się przyczynkiem do oceny poziomu Bekliny 1 – inicjatora procesu autofagolizy. W komórkach z nadekspresją konstytutywnie aktywnej PKCε poziom Bekliny 1 nie zmienia się w stosunku do kontroli, wykazano natomiast wzrost poziomu Bekliny 1 w próbie z Rapamycyną oraz brak zmian w ilości białka po potraktowaniu 3-MA. Ponadto, co wydaje się bardzo interesujące, zaobserwowano wysoki poziom Bekliny 1 w komórkach z nadekspresją PKCεA/E potraktowanych inhibitorem PKC – BIM. Podsumowanie. Beklina 1 jest postrzegana jako pozytywny czynnik rokowniczy w procesie kancerogenezy, jej nadekspresja hamuje proliferacje komórek nowotworowych. Światowa literatura donosi, że im mniejsza ekspresja genu BECN1 tym większa zdolność komórek do metastazy. Badania naukowe finansowane przez Narodowe Centrum Nauki w ramach projektu nr UMO-2011/03/B/NZ7/06244.

13. Zarządzanie jakością w banku komórek macierzystych. Paula Matuszak

1, Ewa Bembnista

1, Agnieszka Kubiak

1, Maria Kozłowska-Skrzypczak

1

1 Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego Uniwersytetu

Medycznego w Poznaniu, Polska Wdrażanie systemu jakości w Banku Komórek Macierzystych (BKM) jest procesem długotrwałym i podlegającym ciągłemu doskonaleniu. Wszelkie czynności wykonywane są zgodnie z obowiązującymi dyrektywami Unii Europejskiej oraz Ustawą Transplantacyjną wraz z rozporządzeniami. BKM jest nadzorowany i kontrolowany przez Krajowe Centrum Bankowania Tkanek i Komórek (KCBTiK) oraz podlega audytom wewnętrznym szpitala. Posiada certyfikat ISO 9001:2008. BKM funkcjonował wcześniej jako Pracownia Preparatyki Szpiku Laboratorium Diagnostyki Hematologicznej. Obecnie jest wyodrębnioną jednostką, ściśle współpracującą z Ośrodkiem Transplantacyjnym. BKM zatrudnia specjalistę laboratoryjnej hematologii medycznej, diagnostów laboratoryjnych, biotechnologów, technika analityki medycznej oraz pomoce laboratoryjne. Zgodnie z ustawą w Banku wyznaczono „osobę odpowiedzialną”, która nadzoruje przestrzeganie zgodności pracy BKM z przepisami ustawy. Do zadań BKM należy gromadzenie, testowanie, przetwarzanie, przechowywanie oraz dystrybucja materiału przeznaczonego do transplantacji.Działalność BKM opisuje mapa procesów zawarta w Księdze Jakości szpitala. Zgodnie z systemem zapewnienia jakości każdego pracownika BKM obowiązują standardowe procedury operacyjne oraz instrukcje. Wszystkie czynności podlegają kontroli i są każdorazowo odnotowywane w odpowiednich protokołach. Materiał przyjęty do Banku otrzymuje unikalny, niepowtarzalny numer, zgodny z wymogami Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 2 kwietnia 2010 r. W Pracowni Preparatyki obowiązuje surowy reżim sanitarny. Raz w miesiącu kontrolowana jest czystość mikrobiologiczna powietrza metodą swobodnej sedymentacji. W celu uzyskania jak najlepszych parametrów jakościowych i ilościowych materiału przeznaczonego do transplantacji procedury preparatywne są przeprowadzane w systemie zamkniętym, w komorze z laminarnym przepływem jałowego powietrza. Każdy pracownik przed przystąpieniem do pracy w

Pracowni Preparatyki musi się odpowiednio przygotować zakładając sterylną odzież ochronną. Materiał podlega ocenie liczby komórek jądrowych, odsetka komórek CD34+, ich żywotności, potencjału proliferacyjnego oraz kontroli mikrobiologicznej zarówno przed jak i po zakończeniu czynności preparatywnych. Każdorazowo w trakcie pracy kontrolowana jest czystość mikrobiologiczna powietrza w komorze laminarnej. W BKM przygotowuje się materiał do przeszczepienia w układzie autologicznym oraz allogenicznym od dawców rodzinnych oraz niespokrewnionych. Krwiotwórcze komórki macierzyste pozyskane z mobilizowanej krwi obwodowej lub ze szpiku podlegają programowanemu zamrażaniu w parach ciekłego azotu celem ich późniejszego wykorzystania. Zabezpieczony w ten sposób materiał jest przechowywany w temperaturze -160ºC. Lokalizacja preparatu jest każdorazowo odnotowywana w elektronicznej bazie danych. Zbiorniki magazynowe podlegają ścisłej kontroli poziomu azotu oraz temperatury. Transport krwiotwórczych komórek macierzystych z ośrodka zewnętrznego do BKM odbywa się w temperaturze 2-8ºC w profesjonalnym zbiorniku transportowym. Osoba przewożąca materiał wypełnia kartę kontroli temperatury od momentu przyjęcia do wydania materiału w ośrodku docelowym. Natomiast dostarczanie krwiotwórczych komórek macierzystych z miejsca pobrania w ośrodku macierzystym do BKM odbywa się w temperaturze pokojowej, a warunki transportu są notowane w odpowiednim protokole. Materiał z BKM wydawany jest na podstawie zlecenia bądź do ośrodka macierzystego lub ośrodków zewnętrznych. Wieloetapowe procedury i szereg czynności wykonywanych przy przygotowywaniu materiału transplantacyjnego wiążą się z możliwością popełnienia błędu. Każda nieprawidłowość jest odnotowana i niezwłocznie zgłoszona jako zdarzenie niepożądane do KCBTiK. Następnie wdrażane są działania korygujące i naprawcze, dla zminimalizowania ryzyka ponownego wystąpienia podobnego zdarzenia. Bank Komórek Macierzystych ciągle doskonali procedury i czynności wykonywane przy przyjmowaniu, dystrybucji, magazynowaniu i przeszczepianiu materiału transplantacyjnego. Wszyscy pracownicy uczestniczą w wielu szkoleniach zarówno wewnętrznych jak i zewnętrznych. Działania te mają na celu uzyskanie materiału najwyższej jakości. 14. Interleukina 23 w toczniu rumieniowatym układowym. Katarzyna Fischer

1, Hanna Przepiera-Będzak

2, Jacek Fliciński

2, Anna Walecka

3, Marcin Sawicki

3,

Lidia Ostanek2, Marek Brzosko

2, Iwona Brzosko

1, Agnieszka Winikajtis-Burzyńska

4

1Samodzielna Pracownia Diagnostyki Reumatologicznej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w

Szczecinie, Polska, 2Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych, Pomorski Uniwersytet Medyczny w

Szczecinie, Polska, 3Zakład Diagnostyki Obrazowej i Radiologii Interwencyjnej, Pomorski Uniwersytet

Medyczny w Szczecinie, Polska, 4Laboratorium Kliniki Reumatologii, Samodzielny Publiczny Szpital

Kliniczny nr 1 Pomorskiego Uniwersytetu medycznego w Szczecinie, Polska Wstęp: Interleukina 23 (IL-23) jest wytwarzana przez komórki dendrytyczne i wpływa na proliferację i cytotoksyczność limfocytów T. Silnie indukuje wydzielanie interferonu γ z tych komórek, reguluje proces krwiotworzenia (pobudza wytwarzanie płytek krwi i neutrofilów) oraz indukuje wytwarzanie białek ostrej fazy. Jest też najważniejszym czynnikiem wzrostu dla subpopulacji limfocytów Th17, odpowiedzialnym za ich stabilizację i różnicowanie. Jak pokazały badania ostatnich lat IL-23 może uczestniczyć w patogenezie wybranych chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego układowego (TRU). Ponadto, trwają badania nad możliwością wykorzystania IL-23 jako celu terapeutycznego w leczeniu tych chorób. Cel: Celem badania była ocena związku między stężeniem IL-23 a wybranymi cechami immunologicznymi i klinicznymi TRU. Materiał i metody: Badanie przeprowadzono w grupie 94 chorych na TRU (82 kobiet i 12 mężczyzn) w wieku 19-73 lata i u 27 osób z grupy kontrolnej dobranych pod względem wieku i płci do grupy chorych. Pomiaru stężeń IL-23 dokonano przy użyciu metody immunoenzymatycznej ELISA z zastosowaniem testów R&D Systems. Oceny obecności zmian miażdżycowych dokonano na podstawie: pomiaru grubości kompleksu błony wewnętrznej i środkowej tętnic szyjnych oraz obecności blaszek miażdżycowych w tętnicach szyjnych i tętnicach kończyn dolnych za pomocą badania ultrasonograficznego w prezentacji B oraz pomiaru wskaźnika kostka-ramię pod kontrolą badania ultrasonograficznego metodą Dopplera. Dodatkowo oceniono opór naczyniowy na podstawie pomiaru wskaźnika wysokooporowego na podstawie dopplerowskiego spectrum tętnic kończyn podkolanowych. Badania obrazowe przeprowadzono przy użyciu aparatu HDI 3500 (ATL) z głowicą linearną 5-12 MHz. Uwzględniono także klasyczne czynniki ryzyka miażdżycy (nadciśnienie tętnicze, dyslipidemię, hiperglikemię, nadwagę/otyłość, palenie tytoniu, stosowanie doustnych leków antykoncepcyjnych i dodatni wywiad rodzinny w kierunku chorób sercowo-naczyniowych), wybrane

objawy kliniczne TRU (sercowo-naczyniowe, mózgowo-naczyniowe, nefropatię toczniową, objaw Raynaud’a, livedo reticularis, zapalenie naczyń, powikłania zakrzepowo-zatorowe) oraz profil autoprzeciwciał (przeciwjądrowych, przeciwfosfolipidowych, przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych i przeciwendotelialnych). Analizę statystyczną przeprowadzono w oparciu o testy: chi

2Yates, chi

2Pearson, korelacji rank Spearmana, regresję logistyczną i analizę wieloczynnikową.

Wyniki: Stężenia IL-23 różniły się istotnie między grupą badaną a kontrolną (p= 0,0005). U chorych na TRU z obecnością dużych stężeń IL-23 istotnie częściej stwierdzano zmiany miażdżycowe w prawej tętnicy udowej oraz nefropatię toczniową (OR=10,1; 95%CI:1,2-85,1 i OR=3,2; 95%CI:1,1-9,6 odpowiednio). Natomiast z klasycznych czynników ryzyka miażdżycy jedynie otyłość istotnie wiązała się z IL-23 (OR=3,8; 95%CI:1,2-12,3). Spośród szerokiego profilu analizowanych markerów serologicznych przeciwciała przeciw fosfatydyloserynie, głównie klasy IgG (OR=12,7; 95%CI:1,5-108,1) oraz przeciw SS-B (OR=11,8; 95%CI:1,5-94,8) istotnie korelowały z IL-23. Ponadto, związek IL-23 i przeciwciał antykardiolipinowych i przeciw protrombinie w klasie IgG był na granicy istotności statystycznej (OR=2,3; 95%CI:0,9-5,7 i OR=8,4; 95%CI:1,0-71,1 odpowiednio). Wnioski: 1. IL-23 może być zaangażowana w patogenezę nefropatii toczniowej. 2. IL-23 poprzez istotny związek z otyłością i przeciwciałami antyfosfolipidowymi może sprzyjać pojawieniu się stanu nadkrzepliwości i w konsekwencji rozwoju aterotrombozy u chorych na TRU. 15. Wybrane przeciwciała antyfosfolipidowe w toczniu. Katarzyna Fischer

1, Agnieszka Winikajtis-Burzyńska

2, Jacek Fliciński

3, Anna Walecka

4, Marcin

Sawicki4, Lidia Ostanek

3, Marek Brzosko

3, Iwona Brzosko

1

1Samodzielna Pracownia Diagnostyki Reumatologicznej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w

Szczecinie, Polska, 2Laboratorium Kliniki Reumatologii, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 1

Pomorskiego Uniwersytetu medycznego w Szczecinie, Polska, 3Klinika Reumatologii i Chorób

Wewnętrznych, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Polska, 4Zakład Diagnostyki

Obrazowej i Radiologii Interwencyjnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Polska Wstęp: Rola przeciwciał antyfosfolipidowych, innych niż te uwzględnione w kryteriach zespołu antyfosfolipidowego (APS), w patogenezie wybranych powikłań narządowych u chorych na toczeń rumieniowaty układowy (TRU) jak dotąd jest mało poznana. Cel pracy: Ocena związku między obecnością przeciwciał przeciw fosfatydyloetanolaminie (aPE) i fosfatydyloserynie (aPS) a wybranymi zmianami naczyniowymi u chorych na TRU. Materiał i metody: Badanie przeprowadzono u 93 chorych na TRU oraz 30 zdrowych osób. Przeciwciała aPE i aPS oznaczono metodą ELISA. Uwzględniono manifestacje sercowo-naczyniowe, mózgowo-naczyniowe, nefropatię, inne powikłania zatorowo-zakrzepowe, objaw Raynaud’a oraz vasculitis. Dokonano oceny zmian miażdżycowych w oparciu o pomiar grubości kompleksu intima-media (IMT), wskaźnika kostka-ramię oraz wskaźnika wysokooporowego. Analizę statystyczną przeprowadzono testami chi

2Yatesa, chi

2Pearsona, korelacji rang Spearmana, analizy regresji

logistycznej oraz analizy wieloczynnikowej krokowej. Wyniki: Częstość występowania aPS i aPE różniła się istotnie między grupą badaną i kontrolną (p< 0,05).U chorych z obecnością aPS IgG/IgM istotnie częściej stwierdzano objaw Raynaud’a (OR= 4,5; 95%CI: 1,26-16,11). Obecność aPE IgG istotnie wiązała się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia nefropatii toczniowej (OR= 3,5; 95%CI: 1,01-12,18), zaś aPE IgM - udaru niedokrwiennego mózgu (OR= 20,4; 95%CI: 1,01-413,06). U chorych z obecnością aPE IgG/IgM istotnie częściej dochodziło do pogrubienia IMT (OR= 4,2; 95%CI: 1,06-16,26). Wnioski: 1. U chorych na TRU z obecnością aPS istotnie zwiększone jest ryzyko rozwoju mikroangiopatii. 2. Obecność aPE istotnie zwiększa ryzyko rozwoju wczesnych zmian miażdżycowych i powikłań narządowych, głównie o charakterze mózgowo-naczyniowym. 16. Rozpoznawalność elementów osadu moczu w EQA. Agnieszka Ćwiklińska

1, Aleksandra Fijałkowska

2, Joanna Skibicka

1, Adrian Strzelecki

3, Małgorzata

Wróblewska1

1 Zakład Chemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska,

2 SOWA-med, Polska,

3 Katedra i

Klinika Chorób Wewnętrznych, Chorób Tkanki Łącznej i Geriatrii, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska

Badanie ogólne moczu to jedno z najczęściej wykonywanych badań laboratoryjnych. W jego skład wchodzi badanie elementów upostaciowanych moczu, tzw. badanie osadu moczu. Technika wykonania tego badania nie jest skomplikowana, natomiast już rozpoznanie obserwowanych struktur wymaga od diagnosty dużej wiedzy merytorycznej, zaangażowania i doświadczenia. Celowe jest więc prowadzenie kontroli zewnętrznej (EQA – external quality assessment) badania osadu moczu, która pozwala na ocenę i międzylaboratoryjne porównanie jakości uzyskiwanych wyników, a jednocześnie może pełnić rolę edukacyjną. Polskie laboratoria uczestniczą w sprawdzianie oceniającym umiejętność rozpoznawania elementów osadu moczu od stycznia 2009 roku. Sprawdzian ten jest sprawdzianem internetowym. Organizowany jest cztery razy w roku. W każdym sprawdzianie uczestnicy na stronie internetowej Labquality otrzymują dostęp do czterech zdjęć cyfrowych, na których prezentowane są różne elementy osadu moczu pochodzące od jednego pacjenta. Do zdjęć dołączony jest wynik z badania moczu paskiem testowym oraz krótkie dane na temat pacjenta. Elementy osadu prezentowane są na zdjęciach cyfrowych wykonanych w mikroskopie świetlnym (po wcześniejszym wybarwieniu próbki) i w mikroskopie kontrastowo-fazowym. Uczestnicy mają za zadanie zidentyfikować strukturę przedstawioną na zdjęciu. Odpowiedź wybierają z listy zamieszczonej na stronie internetowej. Po zakończeniu sprawdzianu uczestnicy otrzymują raport, gdzie przedstawione są prawidłowe odpowiedzi wraz z uzasadnieniem zaklasyfikowania elementów do danych grup. Przedstawiony jest również opis kliniczny pacjenta z powiązaniem elementów osadu moczu z występującą jednostką chorobową. W siedemnastu sprawdzianach przeprowadzonych od stycznia 2009 roku do marca 2013 roku uzyskano 184 zestawów wyników (736 odpowiedzi). W sprawdzianach wzięło udział 65 polskich laboratoriów. Spośród nich 39 uczestniczyło w sprawdzianie więcej niż jeden raz. Uczestnikom zaprezentowano 21 różnych struktur występujących w osadzie moczu. Zaprezentowano zdjęcia elementów osadu pochodzących od pacjentów cierpiących na różne jednostki chorobowe, m.in. łagodny rozrost prostaty, cukrzycę typu 2 powikłaną nefropatią, nowotwór pęcherza moczowego, zakażenie układu moczowego, plamicę Henocha i Schönleina czy ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń (ziarniniakowatość Wegenera). Najczęściej w sprawdzianach prezentowano erytrocyty oraz granulocyty. Średnia rozpoznawalność dla tych elementów była wysoka i wyniosła ponad 85%. Równie dobrą rozpoznawalność stwierdzono dla komórek nabłonka płaskiego (85%), kryształów szczawianu wapnia (100%), plemników (100%), bakterii (93%) i drożdży (100%). Rozpoznawalność poniżej 60% stwierdzono dla makrofagów (57%), komórek nabłonka nerkowego (39%), które mylono najczęściej z leukocytami i komórkami nabłonka przejściowego, jak również dla wałeczków nabłonkowych (57%), woskowych (50%) i szklistych (47%). Wśród uczestników, którzy przystąpili do sprawdzianu co najmniej dwukrotnie, zaobserwowano tendencję do wzrostu udziału prawidłowych odpowiedzi wraz ze wzrostem częstości uczestnictwa w sprawdzianach. Badanie osadu moczu jest badaniem subiektywnym, wymagającym od diagnostów rzetelności, dużego doświadczenia i wiedzy. Wskazane jest więc ciągłe doskonalenie swoich umiejętności w zakresie rozpoznawalności elementów osadu moczu. Kontrola zewnętrzna to użyteczne narzędzie oceny jakości analiz laboratoryjnych, mogące pełnić również ważną rolę edukacyjną. 17. VEGF w toczniu rumieniowatym układowym. Katarzyna Fischer

1, Agnieszka Winikajtis-Burzyńska

2, Iwona Brzosko

1, Marek Brzosko

3, Anna

Walecka4, Marcin Sawicki

4

1 Samodzielna Pracownia Diagnostyki Reumatologicznej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w

Szczecinie, Polska, 2 Laboratorium Kliniki Reumatologii, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 1

Pomorskiego Uniwersytetu medycznego w Szczecinie, Polska, 3 Klinika Reumatologii i Chorób

Wewnętrznych, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Polska, 4 Zakład Diagnostyki

Obrazowej i Radiologii Interwencyjnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Polska Wstęp: Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), działający jak cytokina prozapalna, stymuluje angiogenezę zarówno w procesach fizjologicznych, jak i przy zaburzonej homeostazie naczyniowej. Cel: Ocena związku między stężeniem VEGF a wybranymi parametrami immunologicznymi, markerami stanu zapalnego oraz zmianami naczyniowymi u chorych na SLE. Materiał i metody: Badanie przeprowadzono u 83 chorych na toczeń rumieniowaty układowy (TRU) (72 kobiet i 11 mężczyzn) w wieku od 19 do 74 lat (średnia 44,8 lat). Czas trwania choroby wynosił od 1 roku do 30 lat (średnio 9,7 lat). Współistnienie zespołu antyfosfolipidowego stwierdzono u 29

chorych (34,9%). Grupę kontrolną stanowiło 20 zdrowych osób (17 kobiet i 3 mężczyzn) w wieku od 22 do 74 lat (średnio 45,2 lat). Stężenie VEGF oznaczono metodą ELISA testami R&D Systems. Oceniono obecność wybranych autoprzeciwciał - profilu przeciwciał przeciwjądrowych, przeciwfosfolipidowych (aPL) i przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych oraz przeciwciał przeciwendotelialnych (AECA) oraz markery stanu zapalnego - białko C-reaktywne, szybkość opadania krwinek czerwonych, fibrynogen. Uwzględniono wybrane manifestacje sercowo-naczyniowe, w ośrodkowym układzie nerwowym, nefropatię, powikłania zatorowo – zakrzepowe oraz zapalenie naczyń. Występowanie zmian miażdżycowych oceniono w badaniu ultrasonograficznym w prezentacji B przy użyciu aparatu HDI 3500 (ATL) z wieloczęstotliwościową głowicą liniową 5 – 12 MHz. Analizę statystyczną przeprowadzono testami chi

2Yatesa, chi

2Pearsona, korelacji rang Spearmana.

Wykonano analizę regresji logistycznej oraz analizę wieloczynnikową krokową. Wyniki: Stężenie VEGF nie różniło się istotnie między grupą badaną a kontrolną (p> 0,1). Za wartość odcięcia uznano stężenie 382,4 pg/ml (75 percentyl). Wykazano, że stężenie VEGF > 382,4 pg/ml istotnie wiązało się z wydłużeniem czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (OR= 22,8; 95% CI: 2,3-230,6) oraz obecnością aPL: przeciw protrombinie (aPT) w klasie IgA (OR= 10,7; 95% CI: 2,1-53,4), przeciw beta2-glikoproteinie I (aβ2-GPI) w klasie IgA (OR= 3,5; 95% CI: 1,1-10,8) oraz przeciw utlenionym lipoproteinom o niskiej gęstości (OR= 4,8; 95% CI: 1,0-22,8). Również u chorych z dużymi wartościami VEGF istotnie częściej dochodziło do zaburzeń relaksacji mięśnia sercowego (OR= 8,0; 95% CI: 1,6-39,5). Małe stężenia VEGF istotnie zmniejszały ryzyko wystąpienia wybranych przeciwciał: aPT IgA (OR= 0,18; 95% CI: 0,0-0,72), aβ2-GPI IgA (OR= 0,17; 95% CI: 0,04-0,71), przeciw natywnemu DNA (OR=0,31; 95% CI: 0,11-0,91) oraz AECA (OR= 0,30; 95% CI: 0,11-0,85). Ponadto wiązały się z redukcją ryzyka rozwoju zmian miażdżycowych w tętnicach biodrowych (OR= 0,24; 95% CI: 0,0-0,99) oraz vasculitis (OR= 0,17; 95% CI= 0,03-0,91). Wnioski: 1. Duże stężenie naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu mogą zwiększać ryzyko prozakrzepowe poprzez istotny związek z obecnością przeciwciał przeciwfosfolipidowych u chorych na toczeń rumieniowaty układowy 2. Mniejsze stężenia naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu istotnie zmniejszają ryzyko występowania wybranych autoprzeciwciał oraz zmian miażdżycowych i vasculitis u chorych na toczeń rumieniowaty układowy. 18. Liposomy lecytynowe a powstawanie gamma-LpE Agnieszka Ćwiklińska

1, Barbara Kortas-Stempak

1, Anna Gliwińska

1, Agnieszka Kuchta

1, Anastasis

Pacanis1, Małgorzata Wróblewska

1

1 Zakład Chemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska

Wstęp i cel pracy: Wydajność zwrotnego transportu cholesterolu do wątroby (RCT – reverse cholesterol transport) jest ważnym czynnikiem zapobiegającym rozwojowi miażdżycy. Liposomy lecytynowe oddziałując na lipoproteiny osocza zwiększają efektywność RCT, tym samym wykazując działanie przeciwmiażdżycowe. Jedną z podfrakcji HDL biorących udział w odbieraniu cholesterolu z komórek są cząstki γ-LpE, zawierające jako jedyny składnik białkowy apolipoproteinę E (apoE) i charakteryzujące się ruchliwością elektroforetyczną gamma (γ). Nieliczne doniesienia naukowe wskazują, że stężenie γ-LpE wzrasta w wyniku oddziaływania egzogennych fosfolipidów ze składnikami osocza, jednak niewiadome było do tej pory, które ze struktur osocza odpowiadają za ich powstawanie. Celem pracy była więc ocena możliwości powstawania nowych cząstek lipoproteinowych na skutek oddziaływania między VLDL a liposomami lecytynowymi, a następnie izolacja oraz charakterystyka powstających cząstek. Metodyka badań: Materiałem do badań była surowica, uzyskiwana od zdrowych osób na czczo. Liposomy lecytynowe oraz cząstki VLDL, wyizolowane metodą ultrawirowania (d<1,006 g/mL), inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji składniki mieszaniny inkubacyjnej rozdzielano metodą ultrawirowania i poddawano ocenie pod względem ruchliwości elektroforetycznej, wielkości oraz składu białkowego i lipidowego. Wyniki: Na skutek oddziaływania liposomów lecytynowych z VLDL powstawały nowe frakcje lipoproteinowe, niezawierające apolipoproteiny B. Stanowiły one heterogenne populacje cząstek, złożone z apolipoproteiny E (jedynego składnika białkowego) oraz fosfolipidów. LpE miały gęstość w przedziale 1,063 g/ml < d < 1,21 g/ml, charakterystycznym dla HDL oraz wielkość cząstek od 8,58 do 22,07 nm i od 9,9 do 21,08 nm, odpowiednio w zakresie ruchliwości elektroforetycznej gamma i pre-beta.

Wnioski: Uzyskane wyniki potwierdzają, że jednym z mechanizmów przeciwmiażdżycowego oddziaływania liposomów lecytynowych może być powstawanie nowych generacji cząstek HDL, w skład których wchodzi apoE uwalniana z VLDL. 19. Ocena stężenia witaminy d we krwi u przypadkowo wybranych osób.próba ustalenia optymalnej dawki witaminy d u osób z jej niedoborem. Krystyna Staniszewska

1, Jolanta Miazga

1, Urszula Wieczorkiewicz

1, Agata Pabin

1

1 Warszawa, DIAGNOSTYKA Sp. z o.o., Polska

Ocena stężenia witaminy D we krwi u przypadkowo wybranych osób. Próba ustalenia optymalnej dawki witaminy D u osób z jej niedoborem. Odpowiedni poziom metabolitu witaminy D,25(OH)D we krwi ma podstawowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania wszystkich układów naszego organizmu, a co za tym idzie jest warunkiem utrzymania zdrowia. Obecnie niedobór witaminy D jest poważnym problemem o charakterze globalnym ponieważ dotyczy osób różnej rasy, płci i wieku. Nie ma wątpliwości, że zbyt mała podaż fotosyntetyzowanej witaminy D powinna być uzupełniana preparatami witaminy D. Kwestią nierozstrzygniętą pozostaje jednak nadal wartość dziennej dawki zalecanej pacjentom, niezbędnej do zachowania optymalnego jej stężenia we krwi. Najlepszym wskaźnikiem poziomu witaminy D w organizmie jest stężenie 25(OH)D (kalcydiol) we krwi. Stężenie krążącego aktywnego metabolitu witaminy D - 1α,25(OH)2D3(kacytriol) zdecydowanie nie jest dobrym wskaźnikiem aktualnego poziomu witaminy D w organizmie, jako że związek ten pozostaje pod kontrolą PTH (parathormon) i zależy od stężenia wapnia i fosforu. Synteza kalcytriolu jest ponadto regulowana przez czynnik wzrostowyfibroblastów (fibroblast growthfactor – FGF-23) wytwarzany przez tkankę kostną. Nadmierne stężenie kalcytriolu we krwi indukuje ekspresję enzymu D-24-hydroksylazy (CYP24), która katabolizuje kalcytriol do biologicznie nieaktywnego kwasu kalcytriolowego. Celem pracy jest:

ocena częstości występowania niedoboru witaminy D u pacjentów badanych w komercyjnym laboratorium medycznym.

ustalenie optymalnej dawki u osób z niedoborem witaminy D Przebadano 1079 pacjentów i tylko u 99 osób stwierdzono prawidłowe stężenie witaminy D, co stanowi 9,2% przebadanej populacji. 39 osób z prawidłowym stężeniem witaminy D to dzieci do lat 3. Pacjentów podzielono na grupy w zależności od wieku: I. 0-3 lata II. 3 – 18 lat III. > 18 lat aby ustalić w jakiej grupie wiekowej występują największe niedobory.Biorąc pod uwagę fakt, że dzieci do lat trzech mają suplementowaną witaminę D w postaci leku lub pożywieniem wzbogaconym w tę witaminę w tej grupie występują mniejsze niedobory. Dodatkowo wykonano oznaczenia u 22 pracowników laboratorium przed podaniem witaminy D. Następnie wybrano preparat witaminy D (Bio-Witamina D3D-Pearls, Pharma Nord) i podawano go w dawce 3200 UI przez określony czas - luty – czerwiec 2013 r. Oznaczono stężenie witaminy D przed podaniem ustalonej dawki. U wszystkich stwierdzono stężenie witaminy D < 30 ng/ml, czyli poniżej dolnej wartości referencyjnej. Zaplanowano kolejne oznaczenia po dwóch, po trzech i po czterech miesiącach przyjmowania ustalonej dawki witaminy D, celem oceny reakcji organizmu na ustaloną dawkę oraz potwierdzenia skuteczności tej dawki w uzyskaniu referencyjnego stężenia > 30 ng/ml. Praca ta jest wstępem do dalszych badań, które obejmą większą grupę – 2000 osób, niezbędną do ustalenia prawidłowego dawkowania witaminy D. Problem prawidłowej dawki witaminy D dla osób dorosłych do dnia dzisiejszego jest wciąż w fazie dyskusji. 20. Ocena przydatności linii hematologicznej w optymalizacji pracy na pracowni hematologii. Jarosław Kamiński

1

1 Centralno-Wschodni, DIAGNOSTYKA Sp. z o.o., Polska

Linia hematologiczna jest rozwiązaniem scalającym aparaturę analityczną, organizację pracy, wiedzę naukową oraz informatykę w obszarze hematologii laboratorium. Głównym założeniem jej powstania jest zoptymalizowanie organizacji pracy obejmujące etap przedanalityczny, analityczny oraz

postanalityczny. W przedstawionej pracy oceniano użyteczność i przydatność linii hematologicznej korzystając z własnego doświadczenia oraz obserwacji jej obsługi przez pracowników laboratorium. Porównano także czas uzyskiwania wyników morfologii krwi od momentu przyjęcia badanych próbek w laboratorium do wcześniejszego okresu przed instalacją linii hematologicznej. Przeanalizowano także standardową aplikację do zarządzania obszarem roboczym czyli program Extended IPU, będący integralną częścią linii hematologicznej z wyszczególnieniem możliwości , różnorodności opcji oraz funkcjonalności jakie to oprogramowanie daje operatorowi. Program Extended IPU wspiera pracowników laboratorium w poprawnej analizie i zatwierdzaniu wyników diagnostycznych, udoskonalając pracę na poszczególnych etapach całego procesu badawczego. Podsumowując ocenę linii hematologicznej, stwierdzono szereg zalet, korzyści i udogodnień jakie jej zastosowanie wnosi do systemu zarządzania pracą w pracowni hematologii, zwłaszcza przy dużej liczbie wykonywanych rutynowo badań. 21. Stężenia witaminy D w grupie pacjentów hospitalizowanych i ambulatoryjnych, a wartości optymalne. Ewa Szulc-Mysińska

1, Barbara Serafińska

1, Agnieszka Wiśniewska

2

1 Laboratorium Centralne, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny w Warszawie, Polska,

2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Wydziału Nauki o Zdrowiu WUM w Warszawie, Polska

Wprowadzenie: Stężenie 25(OH)D w surowicy jest wykładnikiem zasobów ustrojowych witaminy D. Metabolit ten powstaje w procesie hydroksylacji zarówno cholekalcyferolu (witamina D3) jak i ergokalcyferolu (witamina D2). 25(OH)D jest główną formą magazynowania witaminy D, a za jej optymalne stężenie uznaje się wartość >30,00 ng/ml. Nie wyznaczono restrykcyjnych zakresów wskazujących na niedobór witaminy D, jednak uważa się, że stężenie <10,00 ng/ml świadczy o znacznym jej deficycie. Celem pracy była ocena stężenia witaminy D w populacji osób hospitalizowanych i leczonych ambulatoryjnie w odniesieniu do wartości optymalnych. Materiał i metody: Grupę badaną stanowiły 353 osoby w wieku 18-90 lat, w tym 171 pacjentów hospitalizowanych i 182 pacjentów ambulatoryjnych, ze wskazaniami lekarskimi do oznaczenia witaminy D. W badanej grupie hospitalizowanej 83 osoby stanowili chorzy hemodializowani, nie stosujący suplementacji witaminy D. Badania przeprowadzono w okresie od listopada 2012 r. do lutego 2013 r. Oznaczenie stężenia 25(OH)D wykonano metodą elektrochemiluminescencji (ECLIA) przy użyciu systemu Cobas 6000, firmy Roche. Wyniki: Średnie stężenie witaminy D w badanej populacji wynosiło 16,57 ng/ml, w tym w grupie osób hospitalizowanych 14,10 ng/ml, w grupie chorych dializowanych 11,80 ng/ml i w grupie ambulatoryjnej 18,98 ng/ml. Wartości optymalne witaminy D stwierdzono u 9 % badanych pacjentów. W grupie chorych hemodializowanych odsetek osób z poziomem optymalnym 25(OH)D był niższy (5%) niż w pozostałych grupach. Nie stwierdzono znaczących różnic w odsetku osób z optymalnymi wartościami stężenia witaminy D pomiędzy grupami hospitalizowaną (8%) i ambulatoryjną (9%). W grupie dializowanej i hospitalizowanej zaobserwowano wyższy odsetek osób ze znacznym deficytem witaminy D (odpowiednio 54 % i 50 %) niż w populacji ambulatoryjnej (33%). Wnioski: Zarówno w populacji osób hospitalizowanych jak i leczonych ambulatoryjnie stężenia witaminy D w okresie jesienno-zimowym są obniżone, a w 50% przypadków osób hospitalizowanych osiągają wartości sugerujące deficyt. 22. Cholesterol LDL: wyliczony czy oznaczony? MARCIN SAWICKI

1, GRAŻYNA SYGITOWICZ

2, ANDRZEJ MARSZAŁEK

3

1 BYDGOSZCZ, Synevo Polska Sp z o.o., Polska,

2 WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY,

Polska, 3 Synevo Polska Sp z o.o., Polska

Cholesterol frakcji LDL jest niezależnym, modyfikowalnym czynnikiem ryzyka chorób układu sercowo – naczyniowego. Stosowany jest rutynowo do rozpoznawania i monitorowania leczenia hipercholesterolemii. Obecnie w praktyce laboratoryjnej stężenie LDL można uzyskać metodą wyliczeniową wykorzystując równanie Friedewalda (LDL-W) i bezpośrednią przy użyciu analizatorów biochemicznych (LDL-D).

Celem pracy była analiza stężeń LDL wyliczonych i oznaczonych bezpośrednio. Badano również wpływ użytej metody na klasyfikację pacjentów do określonych grup ryzyka występowania chorób sercowo–naczyniowych według PTDL. Cholesterol LDL oznaczono w 200 próbkach niemrożonych surowic krwi żylnej, w których wykonano badanie profilu lipidowego w Laboratorium Medycznym Synevo Sp z o.o. w Bydgoszczy. Cholesterol LDL-W wyliczono z zastosowaniem równania Friedewalda przy wartości stężenia trójglicerydów poniżej 350 mg/dl, natomiast LDL-D określono z zastosowaniem jednorodnej kolorymetrycznej metody enzymatycznej (Integra 400 plus Roche, IL USA). Stwierdzono nieznacznie wyższe stężenia LDL-D w porównaniu z LDL-W oraz wysoką, istotną korelację wyników uzyskanych obiema metodami (R=0,96; p<0,001). W 20% przypadków stwierdzone rozbieżności pomiędzy stężeniami LDL-W i LDL-D przekładały się na zmianę klasyfikacji grup ryzyka wg. PTDL. Wybór metody oznaczania stężenia LDL może nieść konsekwencje kliniczne i mieć znaczenie w monitorowaniu hipercholesterolemii i ocenie ryzyka. Wydaje się, że stosując LDL-W ryzyko występowania chorób sercowo – naczyniowych może być niedoszacowane. 24. Zakażenia kiłą,HIV,HCV i HBV u dawców banku tkanek Lidia Basta

1, Stanisław Dyląg

1, Bożena Drybańska

1

1 Katowice ul Raciborska 15, Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa , Polska

Wstęp. Znajomość statusu wirusologicznego dawcy tkanek lub narządów jest konieczna do przeprowadzenia całej procedury koordynacji transplantacji narządów. Przeniesienie infekcji od dawcy narządu może spowodować wzrost chorobowości i śmiertelności u biorcy i w efekcie wpływać niekorzystnie na przeżycie biorców przeszczepów. Dawcy tkanek i narządów w Polsce są badani w kierunku zakażeń kiłą oraz wirusami HIV, HCV i HBV. W surowicy krwi dawców tkanek i narządów oznacza się: p/c przeciwko kile, antygen HBsAg, przeciwciała anty-HBc (Total, rzadziej w klasie IgM), przeciwciała anty-HCV oraz przeciwciała anty HIV 1,2. Pomimo uzyskania ujemnych wyników wirusologicznych u dawców, istnieje ryzyko przeniesienia zakażenia wraz z przeszczepionym narządem. Może mieć to związek z tzw. „oknem serologicznym”, w którym znajduje się zmarły dawca narządów. W Polsce obecnie nie wykonuje się u dawców tkanek i narządów badań metodami biologii molekularnej, które mogły by zmniejszyć ryzyko przeniesienia zakażenia z dawcy na biorcę. Cel pracy. Określenie częstości występowania markerów zakażenia wirusem HIV, HBV, HCV i kiły. Materiał i metody. Analizą objęto 943 zmarłych dawców tkanek i narządów od których pobrano próbki krwi w latach 2008 do 2012. Badano częstość występowania dodatniego wyniku markerów zakażeń kiłą, WZW B i C oraz HIV. Badania wykonano testami firmy Abbott Architect oraz testami firmy Ortho Vitros 3600. Korzystano z systemu komputerowego Bank Tkanek. Uzyskane dane analizowano przy pomocy programu Microsoft Office Excel 2007. Wyniki. W wyniku przeprowadzonych badań uzyskano 177 wyników dodatnich markerów HIV 1,2; HCV, HBV i kiły, co stanowiło 18.8% wszystkich dawców. Dodatnie miano przeciwciał anty-HBc Total stwierdzono u największego odsetka zmarłych dawców - 9,12%. Antygen HBsAg odnotowano u 4,35% dawców, dodatnie przeciwciała anty-HCV – u 0,95%. Przeciwciała HIV stwierdzono u 0,53% dawców. Najmniej wyników dodatnich stwierdzono w teście wykrywającym kiłę, tylko 0,21%. U 34 (3,61%) dawców zaobserwowano współwystępowanie kilku markerów wirusowych w surowicy krwi. Dodatnie miano anty HBc Total stwierdzono u 23 (2,44%) dawców u których wykryto także antygen HBs, u 3 (0,32%) dawców u których wykryto HCV, u 1 (0,1%) dawcy z przeciwciałami przeciw kile oraz u 1 dawcy z wykrytym markerem anty HIV i antygenem HBs. Wśród dawców z przeciwciałami anty HIV wykryto dodatkowo u 1 dawcy przeciwciała kiłowe, 1 dawca miał dodatni wynik anty HCV i 1 miał dodatni antygen HBsAg. Wnioski.

1. W wyniku przeprowadzonych badań zdyskwalifikowano 177 (18,8%) zmarłych dawców Banku Tkanek.

2. Najwięcej dawców zdyskwalifikowano z powodu dodatniego wyniku anty HBc Total (9,12%) i antygenu HBs (4,35%).

3. 0,95% dawców zdyskwalifikowano z powodu dodatniego wyniku anty HCV, 0,53% dawców zdyskwalifikowany z powodu dodatnich przeciwciał anty HIV 1,2.

4. Z powodu dodatniego wyniku przeciwciał kiłowych zdyskwalifikowano 0,21% dawców. 5. 3,61% dawców zdyskwalifikowano z powodu wykrycia więcej niż 1 markera.

25. Wybrane parametry płytkowe u chorych na cukrzycę typu 2. Olga Martyna Koper

1, Joanna Kamińska

1, Halina Kemona

1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska

Cukrzyca typu 2 jest przewlekłą chorobą metaboliczną o wysokim ryzyku śmiertelności z powodu powikłań zakrzepowo-zatorowych. Wskaźnikiem wyrównania metabolicznego cukrzycy jest odsetek hemoglobiny glikowanej (HbA1C). Dane literaturowe na temat parametrów morfologicznych płytek krwi w zależności od HbA1C są niejednoznaczne i bardzo skąpe. Dlatego celem pracy była ocena wybranych parametrów morfologicznych płytek krwi: liczby płytek krwi (PLT) oraz średniej objętości płytek krwi (MPV) w zależności od wyrównania metabolicznego u chorych na cukrzycę typu 2 oraz w porównaniu do osób z prawidłową gospodarką węglowodanową. Badania wykonano u 143 chorych na cukrzycę typu 2, podzielonych na dwie grupy: I grupa z HbA1C ≤ 7,0% - 74 chorych (34 K/40 M; średnia wieku 68,30 lat; średni czas trwania cukrzycy 5,9 lat); II grupa z HbA1C > 7,0% - 69 chorych (40 K/ 29 M; średnia wieku 68,19 lat; średni czas trwania cukrzycy 6,8 lat). Grupę kontrolną (K) stanowiło 48 osób z prawidłową gospodarką węglowodanową (27 K/21 M; średnia wieku 60,98 lat). Parametry płytkowe oznaczono we krwi pobranej na EDTA – K2 na analizatorze hematologicznym ADVIA 2120i. Liczba płytek krwi (PLT) nie wykazała rozkładu normalnego. Mediana PLT u chorych na cukrzycę typu 2 z HbA1C ≤ 7,0% (I) wyniosła 232 x 10

3/µL (zakres 105 – 422 x 10

3/µL); u chorych na cukrzycę typu 2

z HbA1C > 7,0% (II) wyniosła 239 x 103/µL (zakres 67 – 734 x 10

3/µL); w grupie kontrolnej (K) wyniosła

233 x 103/µL (zakres 141 – 347 x 10

3/µL). Mediana PLT w I grupie chorych była niższa w porównaniu

do II grupy chorych oraz do grupy kontrolnej, jednak uzyskane różnice nie wykazały istotności statystycznej (p= 0,734). Średnia objętość płytek krwi (MPV) nie wykazała rozkładu normalnego. Mediana MPV u chorych na cukrzycę typu 2 z HbA1C ≤ 7,0% wyniosła 9,40 fL (zakres 7,10 – 12,40 fL); u chorych na cukrzycę typu 2 z HbA1C > 7,0% wyniosła 9,05 fL (zakres 6,60 – 12,30 fL); w grupie kontrolnej (K) wyniosła 8,45 fL (zakres 7,30 – 9,90 fL). Mediana średniej objętości płytek krwi w I grupie chorych była wyższa w porównaniu do II grupy chorych oraz do grupy kontrolnej. Mediana MPV w obu badanych grupach była istotnie statystycznie wyższa w porównaniu do grupy kontrolnej (I vs. K p < 0,000; II vs. K p=0,014), natomiast nie wykazała różnic istotnych statystycznie pomiędzy badanymi grupami chorych (I vs. II p=0,949). W obu grupach badanych uzyskano ujemną korelację między liczbą płytek krwi a ich średnią objętością (grupa z HbA1C ≤7,0% r = -0,52, p < 0,000; grupa z HbA1C

>7,0% r = -0,32, p=0,021). Podsumowując, można stwierdzić, iż liczba płytek krwi nie zmienia się u chorych na cukrzycę typu 2 w porównaniu do osób z prawidłową gospodarką węglowodanową oraz w zależności od HbA1C. Wskaźnik MPV u chorych na cukrzycę typu 2 jest większy w porównaniu do grupy kontrolnej, co może wskazywać na obecność bardziej reaktywnych płytek krwi. OM. Koper i J. Kamińska są stypendystkami projektu „Studiuję, badam, komercjalizuję – program wsparcia doktorantów UMB”, Poddziałanie 8.2.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

26. Wybrane typy świecenia w immunofluorescencji pośredniej na komórkach HEP-2 a antygeny wykrywane testem typu blot-porównanie metod. Hanna Łabęcka-Modzelewska

1, Karina Lipartowska

1, Ewa Walińska

1, Iwona Marzec

2

1 Centralno- Wschodni, Diagnostyka Sp.z o.o., Polska,

2 ODZDZIAŁ CENTRALNO WSCHODNI,

DIAGNOSTYKA Sp Z O.O., Polska Wprowadzenie:. Testem pierwszego rzutu w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej jest badanie przeciwciał przeciwjądrowych i przeciwcytoplazmatycznych metodą immunofluorescencji pośredniej (IIF), która służy do ich wykrywania. Wynik zawiera typ świecenia oraz miano przeciwciał, jednak nie wskazuje jednoznacznie rodzaju przeciwciała. Testem pozwalającym na dalszą identyfikację przeciwciał jest test typu blot, dzięki któremu możliwe jest dokładne określenie podjednostki antygenów specyficznych dla przeciwciał. Materiał i metody: Przeanalizowano wyniki badań 50 pacjentów, które w badaniu metodą immunofluorescencji pośredniej na komórkach HEp-2 , wykazały typ świecenia ziarnisty, homogenny bądź homogenno-obwodowy. Dalszą identyfikację przeprowadzono testem typu blot . Wyniki: Wyniki uzyskane metodą immunofluorescencji pośredniej w większości przypadków pokrywały się z wynikami uzyskanymi testem typu blot. Zgodnie z oczekiwaniami w pierwszej grupie najczęściej wykrywanymi antygenami przy ziarnistym typie świecenia były kolejno: Ro/SS-A (46,67

%), Ro 52 (40 %) i La/SS-B (26,67 %) oraz dla typu świecenia homogennego i homogenno-obwodowego antygeny: dsDNA (35%), histony (30%) i nukleosomy (20%). W drugiej grupie pacjentów wykryto antygeny nie odpowiadające danemu typowi świecenia. Trzecią grupę stanowili pacjenci u których nie wykryto antygenów w teście typu blot. Wnioski: Przeprowadzona analiza porównawcza dwóch metod wykazała zależność między uzyskanymi typami fluorescencji a antygenami w teście typu blot. Pozwala to na wykorzystanie metody immunoblotingu do potwierdzenia oceny mikroskopowej, eliminując problemy związane z subiektywną oceną typu świecenia. Pozostałe wyniki, które nie pokrywały się jednoznacznie z uzyskanym typem fluorescencji mogą świadczyć o nakładaniu różnych typów świecenia lub wzajemnym maskowaniu, co jest związane z występowaniem wielu przeciwciał jednocześnie. Ujemne wyniki testu typu blot przy pozytywnych wynikach IIF mogą być związane z występowaniem antygenów, które nie zostały zawarte w panelu. Komórki linii Hep-2 w teście immunofluorescencji pośredniej pozwalają na wykrycie szerokiego kręgu przeciwciał przeciwjądrowych i przeciwcytoplazmatycznych . Natomiast test typu blot dzięki zastosowaniu wysokooczyszczonych antygenów jest testem bardzo czułym, który pozwala wykryć nawet niskie miana przeciwciał. Badania wykonane za pomocą tych dwóch odmiennych metod stanowią wzajemne uzupełnienie, które jest bardzo istotne w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej. 27. Kostna frakcja fosfatazy alkalicznej i adipokiny u dzieci z otyłością prostą. Joanna Gajewska

1, Witold Klemarczyk

2, Jadwiga Ambroszkiewicz

1, Magdalena Chełchowska

1,

Katarzyna Szamotulska3, Halina Weker

2, Teresa Laskowska-Klita

1

1 Zakład Badań Przesiewowych, Instytut Matki i Dziecka, Polska,

2 Zakład Żywienia, Instytut Matki i

Dziecka, Polska, 3 Zakład Epidemiologii, Instytut Matki i Dziecka, Polska

Wstęp. Pomimo powszechnie występującej otyłości w okresie rozwojowym i częstego stosowania terapii odchudzającej, jej efekt na metabolizm kostny u dzieci nie jest w pełni poznany. U otyłych dorosłych wraz z obniżeniem masy ciała obserwowano utratę masy kostnej w powiązaniu z obniżeniem aktywności kostnej frakcji fosfatazy alkalicznej (BALP), markera procesu kościotworzenia. Przypuszcza się, że istotną rolę w regulacji metabolizmu kostnego mogą odgrywać wydzielane przez tkankę tłuszczową hormony, szczególnie leptyna. Celem pracy było zbadanie zależności pomiędzy kostną frakcją fosfatazy alkalicznej a adipokinami u dzieci otyłych w okresie przedpokwitaniowym poddanych terapii odchudzającej. Materiały i metody. Oceniono zmiany parametrów antropometrycznych, żywieniowych i biochemicznych u 100 pacjentów z otyłością prostą (z-score BMI≥2SD) w wieku 4-10 lat przed i po zastosowaniu 3-miesięcznego programu leczniczego obejmującego wprowadzenie diety ubogoenergetycznej (1200-1400 kcal/dzień), zwiększenie aktywności fizycznej i poradnictwo psycho-edukacyjne. Grupę kontrolną stanowiło 70 dzieci zdrowych (z-score BMI<-1+1>) w wieku odpowiadającym grupie badanej. Aktywność BALP oraz stężenie leptyny, receptora leptyny i adiponektyny we krwi oznaczono metodami immunoenzymatycznymi ELISA. Wyniki. Aktywność BALP była wyższa u dzieci otyłych niż kontrolnych (132.3±25.6 U/L vs 113.5±20.4 U/L; p<0.001). U otyłych w porównaniu do kontroli, stężenie leptyny było 10-krotnie wyższe p<0.001, a stężenie receptora leptyny i adiponektyny niższe odpowiednio o 45% (p<0.001) i 10% (p=0.057). Po 3 miesiącach terapii, u pacjentów stwierdzono obniżenie wskaźnika BMI o około 10% (p<0.05). W porównaniu do wartości uzyskanych przed leczeniem, u pacjentów po zastosowanej terapii wartość BALP i leptyny była niższa odpowiednio o 10% (p<0.001) i 60% (p<0.001), natomiast stężenie receptora leptyny i adiponektyny było wyższe odpowiednio o 15% (p<0.002) i 10% (p<0.01). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy zmianą aktywności BALP a zmianą stężeń badanych adipokin. Natomiast, aktywność BALP pozytywnie korelowała ze zmianami wskaźnika BMI (r=0.352, p<0.001). Ponadto, obserwowano większy spadek aktywności BALP (p=0.04) i stężenia leptyny (p<0.001) oraz większy wzrost stężenia receptora leptyny (p<0.005) przy większej redukcji masy ciała po terapii. Wnioski. U dzieci z otyłością prostą obserwuje się zmieniony profil adipokin i podwyższoną aktywność BALP. Zastosowanie programu terapeutycznego u dzieci otyłych prowadzi do obniżenia aktywności tego enzymu, co może wskazywać na normalizację procesu kościotworzenia wraz ze spadkiem masy ciała. Dalsze badania dotyczące długoterminowej terapii pozwolą ocenić efekt obniżenia aktywności BALP na masę kostną u otyłych dzieci w okresie przedpokwitaniowym.

28. Porównanie wyników badania osadu moczu przy użyciu analizatora urised z metodą mikroskopową. Katarzyna Mamica

1, Przemysław Tomasik

1, Krystyna Sztefko

1

1 Zakład Biochemii Klinicznej , P-A Instytutu Pediatrii Collegium Medicum UJ, Polska

Wstęp: Standaryzacja oznaczeń i przyspieszenie pracy są głównymi motywami wprowadzania automatycznych analizatorów osadu moczu do laboratoriów medycznych. Automat Urised wykonuje zdjęcia osadu moczu i identyfikuje elementy morfotyczne poprzez ich porównanie z bazą danych obrazów poszczególnych elementów osadu moczu zapisanych w pamięci komputera. Niestety niektóre elementy osadu moczu zostają przez automat pominięte co wymaga manualnej korekcji. Chociaż automatyczne analizy osadu moczu są coraz powszechniejsze, niewiele wiadomo na temat wiarygodności w ten sposób uzyskanych wyników u małych dzieci. Cel pracy: porównanie wyników analizy osadu moczu metodą manualną i przy pomocy analizatora Urised (przed i po manualnej korekcji) w moczach populacji noworodkowej i niemowlęcej. Materiał i metody: Badaniem objęto 148 rutynowych próbek moczu dzieci w wieku do 2 lat (średnia w miesiącach 8,07±8,45). Każda próbka moczu analizowana była automatycznie przy użyciu analizatora Urised oraz manualnie przy użyciu mikroskopu. W metodzie automatycznej identyfikowano elementy morfotycznych z 15 i 20 obrazów. 15 obrazów w analizatorze Urised odpowiada wynikom z 10 pól widzenia w mikroskopie przy powiększeniu 40x, natomiast wykorzystanie 20 obrazów jest najbardziej dokładną standardową procedurą analizy osadu moczu przewidzianą przez producenta aparatu. Elementy osadu moczu widoczne na ekranie, pominięte przez system analizatora lub błędnie zakwalifikowane korygowano. W metodzie manualnej 5 ml moczu wirowano 5 minut przy 1600 obrotach (400 G). Osad zawieszano w 0,5 ml supernatantu. W metodzie manualnej oglądano dziesięć pól widzenia (kwadratów) w komorze (Vetriplast, Włochy) przy powiększeniu 40x. W obu metodach wyniki przeliczano podając liczbę elementów na mikrolitr moczu. Porównano statystycznie wyniki liczby elementów morfotycznych osadu moczuz analizatora przed i po korekcji względem wyników uzyskanych metodą mikroskopową. Analizowano liczbę leukocytów i erytrocytów testem t-studenta dla par oraz obliczono współczynniki korelacji pomiędzy metodami. Wyniki: Wszystkie wyniki uzyskane z analizatora Urised wymagały korekty operatora. W 90% próbek korygowano liczbę leukocytów i/lub liczbę erytrocytów. Analizując leukocyty w granicach prawidłowych nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy niekorygowanymi wynikami z Urisedu zarówno przy ocenie 15 jak i 20 obrazów a wynikami uzyskanymi manualnie. Istotne zaniżenie liczby leukocytów przez analizator Urised stwierdzono przy wynikach w zakresie patologicznym. Dla całego zakresu liczba leukocytów uzyskana z analizatora (15 i 20 obrazów) i metodą manualną była istotnie niższa w porównaniu do wyników uzyslanych metodą manualną (w obu przypadkach p<0.0005), chociaż korelacje uzyskane pomiędzy oboma metodami były znamienne statystycznie ( r = 0.88 dla 15 obrazów i 0.87 dla 20 obrazów; p<0.001 w obu przypadkach). Średnia liczba erytrocytów obliczona z 15 obrazów wynosiła 2.52±3.20 z 20 obrazów dla 2.38 ±2.8 a średnia uzyskana metodą manualną wynosiła 9.2±7.4. Różnice te były istotne statystycznie (p<0.001 w obu przypadkach), ale nadal uzyskano korelację pomiędzy porównywanymi metodami: dla 15 obrazów r=0.64, p<0.05; dla 20 obrazów r= 0.62, p<0.05 w porównaniu do metody manualnej. Wnioski: Niezależnie od ilości ocenianych obrazów automat Urised zaniża liczbę leucytów i eytrocytow,co wymaga korekty wyników. Ocena osadu moczu metodą cyfrową polepsza jakość analizy a możliwość przechowywania obrazów osadu moczu w pamięci komputera pozwala na weryfikację wyniku nawet po kilku miesiącach co jest istotne w przypadku monitorowania pacjenta. 29. Stężenie adiponektyny we krwi kobiet ciężarnych palących tytoń. Magdalena Chełchowska

1, Tomasz M. Maciejewski

2, Joanna Gajewska

1, Jadwiga Ambroszkiewicz

1,

Teresa Laskowska-Klita1

1 Zakład Badań Przesiewowych, Instytut Matki i Dziecka, Polska,

2 Klinika Położnictwa i Ginekologii,

Instytut Matki i Dziecka, Polska Wstęp. Pod wpływem dymu tytoniowego dochodzi do uszkodzenia nie tylko tkanek płodu, ale również struktury i funkcji łożyska. Następstwem tych zmian może być upośledzenie aktywnego transportu niezbędnych dla płodu składników odżywczych. Obserwowany zaburzony przepływ glukozy może skutkować zmianami w gospodarce węglowodanowej, obniżonym poziomem insuliny, a w

konsekwencji spowolnieniem rozwoju płodu. Istotną rolę w regulacji metabolizmu glukozy odgrywa adiponektyna – białko wydzielane przez tkankę tłuszczową, stymulujące wzrost insulinowrażliwości. W surowicy ludzkiej można wyróżnić trzy główne formy adiponektyny różniące się masą cząsteczkową (forma o wysokiej masie cząsteczkowej HMW- high molecular weight; średniocząsteczkowa MMW- middle molecular weight; niskocząsteczkowa LMW- low molecular weight). Niski poziom tego białka notowano u noworodków matek palących a w przypadku porzucenia nałogu poziom adiponektyny wzrastał do obserwowanego u dzieci abstynentek tytoniowych. Celem pracy była ocena wpływu palenia tytoniu na stężenia adiponektyny oraz jej form we krwi kobiet ciężarnych. Ponadto, sprawdzono czy zachodzi korelacja pomiędzy badanymi parametrami we krwi matek i krwi pępowinowej ich dzieci. Materiał i metody. Badaniami objęto 45 zdrowych kobiet ciężarnych w wieku 22–39 lat, będących pod opieką Poradni Ginekologiczno-Położniczej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Po uzyskaniu zgody na udział w badaniu, pacjentki podzielono na podstawie ankiety na grupę niepalących (n=25) i palących papierosy (n=20). Z grupy abstynentek tytoniowych wyłączono kobiety narażone na ekspozycję bierną na dym tytoniowy. Grupa kobiet palących objęła pacjentki deklarujące palenie papierosów w liczbie co najmniej 5 sztuk/dobę przez okres co najmniej 2 lat. Kwalifikację do grup potwierdzono oznaczaniem kotyniny w surowicy krwi. Stężenia kotyniny, adiponektyny całkowitej oraz jej izoform oznaczano metodami immunoenzymatycznymi (ELISA) przy użyciu gotowych zestawów handlowych. Wyniki. W grupie kobiet palących poziom kotyniny mieścił się w zakresie od 56.0 do 124.3 µg/L podczas gdy w grupie kobiet niepalących kotynina występowała jedynie w śladowych ilościach. Stężenie kotyniny było zależne od ilości wypalanych papierosów (r=0.59; p<0.05). W grupie matek palących tytoń stężenia adiponektyny całkowitej w surowicy były znamiennie niższe (p<0.05) niż w grupie abstynentek tytoniowych zarówno w I trymestrze (5.3 vs 7.1 μg/ml), jak i w III trymestrze ciąży (5.1 vs 6.4 μg/ml) oraz we krwi pępowinowej ich potomstwa (14.5 vs 18.6 μg/ml). Kobiety palące tytoń miały również statystycznie niższe stężenia formy HMW adiponektyny w porównaniu z ciężarnymi niepalącymi. Średnie stężenia izoformy MMW oraz LMW były podobne w obu badanych grupach. Analizując zależności pomiędzy stężeniem adiponektyny a wskaźnikami intensywności palenia tytoniu wykazano, że stężenie formy HMW jest powiązane zarówno z poziomem kotyniny we krwi (r=-0.4; p<0.05) jak również liczbą wypalanych dziennie papierosów (r=-0.37; p<0.05). Zaobserwowano również pozytywną korelację pomiędzy stężeniem adiponektyny całkowitej oraz izoformy HMW we krwi matki i krwi pępowinowej (r=0.4; p<0.05). Wnioski. Uzyskane wyniki wskazują, że palenie tytoniu przez kobiety ciężarne redukuje stężenie adiponektyny całkowitej i jej formy HMW zarówno w surowicy krwi matki jak i we krwi pępowinowej, a ich poziom jest zależny od ilości wypalanych dziennie papierosów. Niekorzystny wpływ palenia na stężenie adiponektyny może być powiązany z mniejszą masą urodzeniową dziecka. 30. Ocena przesączania kłębuszkowego (GFR) u dzieci przed i po standaryzacji kreatyniny. Jolanta Bugajska

1, Joanna Berska

1, Zachwieja Katarzyna

2, Korohoda Przemysław

3, Krystyna Sztefko

1

1 Zakład Biochemi Klinicznej, INSTYTUT PEDIATRII UJCM KRAKÓW, Polska,

2 Klinika Nefrologii

Dziecięcej, Uniwersytecki Szpital Dziecięcy w Krakowie, Polska, 3 Katedra Elektroniki , AGH Kraków,

Polska Wstęp. Ocena przesączania kłębuszkowego (eGFR) stanowi podstawę klasyfikacji stopnia przewlekłej choroby nerek (pchn). Referencyjną metodą oceny GFR jest obecnie klirens ioheksolu. W codziennej praktyce u dzieci stosuje się ocenę GFR w oparciu o klirens kreatyniny obliczany według wzorów Schwartza oraz Counhana-Barrata. Wraz z wprowadzeniem nowego wzorca dla kreatyniny oczekiwano polepszenia oceny pchn w oparciu o eGFR. Wzory Schwartza (z 1976 roku zmodyfikowany w 1985 r.) i Counhana-Barrata (z 1976 r.) opracowane były dla kreatyniny oznaczanej w reakcji Jaffego. Nowy wzór Schwartza z 2009 r. do oceny eGFR u dzieci uwzględnia stężenie kreatyniny oznaczaną metodą enzymatyczną wystandaryzowaną zgodnie z zaleceniami NKDEP, ale wzór ten najlepiej sprawdza się w zakresie GRF od 32,0 do 51,7 ml/min/1,73m

2.

Cel. Ocena GFR u dzieci w oparciu o klirens kreatyniny przed i po nowej standaryzacji metody jej oznaczania. Materiał i metody. Analizie poddano wyniki eGFR uzyskane u 316 pacjentów (w wieku 2 – 22,5 lat, średnia 12,07±4,18 lat) leczonych w Klinice Nefrologii Dziecięcej Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie z powodu pchn. U 166 pacjentów eGFR uzyskano z wartości stężenia kreatyniny oznaczanonej przed wprowadzeniem standaryzacji (grupa I), a u pozostałych 150

pacjentów po wprowadzeniu standaryzacji zalecanej przez NKDEP (grupa II). Stężenie kreatyniny w surowicy krwi mierzono metodą enzymatyczną (VITROS FS). GFR szacowano za pomocą wzoru Schwartza z 2009 r. [GFR1(Cr)], wzoru Schwartza z 1976 r. zmodyfikowanego w 1985 r. [GFR2(Cr)] oraz wzoru Counhana-Barrata [GFR3(Cr)]. Iohexol oznaczono w osoczu krwi metodą HPLC/UV. Na podstawie trzykrotnych oznaczeń stężenia iohexolu w osoczu GFR obliczono wg wzoru Bröchner-Mortensena [GFR(I)]. Jako maksymalny akceptowalny błąd całkowity dla oszacowanego GFR przyjęto 15%. Wartości GFR obliczono dla każdego stadium pchn. Wyniki. W grupie I błąd całkowity dla eGFR obliczony dla średnich wartości [GFR1(Cr)] oraz [GFR3(Cr)] w drugim, trzecim i czwartym stadium pchn wynosił odpowiednio dla GFR1(Cr) 13%, 2,8%, 4,0%; natomiast dla [GFR3(Cr)] 9,3%, 7,1%, 0%. Podobnie w grupie II w drugim, trzecim i czwartym stadium pchn błąd całkowity dla [GFR1(Cr)] wynosił odpowiednio 3,6%, 6,7%, 8,9%; a dla [GFR3(Cr)] 0,3%, 11,1%, 5,5%. W pierwszym stadium pchn [GFR1(Cr)] i [GFR3(Cr)] istotnie niedoszacowały filtracji kłębuszkowej: w grupie I odpowiednio o: 31,8%, 29% a w grupie II odpowiednio o 23,8%, 20,7%. [GFR3(Cr)] przeszacowało filtrację kłębuszkową w obu grupach w stadium drugim, trzecim i czwartym (odpowiednio: grupa I o 21,7%, 48,7%, 47,5%; grupa II o 22%, 52,2%, 21,1%). Natomiast w pierwszym stadium pchn średnia wartość [GFR3(Cr)] była niższa w grupie I o 4,2%, a w grupie II wyższa o 7,1% w porówananiu do średniej wartości [GFR(I)]. Wniosek. U pacjentów z przewlekłą chorobą nerek monitorowanych przez wiele lat istnieje konieczność przeliczania wartości eGFR uzyskanych w oparciu o stężenie kreatyniny uzyskane przed i po wprowadzeniu standaryzacji zalecanej przez NKDEP. 31. Ocena stężenia witaminy D w niewyselekcjonowanej populacji pediatrycznej. Joanna Berska

1, Jolanta Bugajska

1, Anna Litwin

2, Dorota Roztoczyńska

3, Krystyna Sztefko

1

1 Zakład Biochemi Klinicznej, INSTYTUT PEDIATRII UJCM KRAKÓW, Polska,

2 Zakład Biochemii

Klinicznej , Uniwersytecki Szpital Dziecięcy w Krakowie, Polska, 3 Klinika Endokrynologii Dzieci i

Młodzieży , Uniwersytecki Szpital Dziecięcy w Krakowie, Polska Wstęp. Dane z ostatnich lat podkreślają korzystny wielokierunkowy wpływ witaminy D na organizm człowieka. Niedobory witaminy D mogą przyczyniać się nie tylko do upośledzonej mineralizacji kości ale i zwiększenia ryzyka zachorowalności na choroby cywilizacyjne np. cukrzycę, choroby serca czy nowotwory. Z tego powodu istotne jest jak najwcześniejsze zapobieganie niedoborom tej witaminy, szczególnie u pacjentów pediatrycznych. Materiał i metody. Analizie poddano wyniki stężenia witaminy D uzyskane od 333 pacjentów (chłopcy/dziewczęta 180/153, średnia wieku 9,63±5,36 lat) konsultowanych w Poradni Endokrynologicznej i/lub oddziale endokrynologicznym Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie w okresie paździenik 2011 – luty 2013. Wyodrębniono trzy grupy wiekowe: poniżej 10 lat (grupa I, n=150), od 10 do 15 lat (grupa II, n=110), powyżej 15 lat (grupa III, n=73). 50,5% dzieci pochodziło z rejonów wiejskich. U 13,8% dzieci zdiagnozowano otyłość. Do oceny statusu witaminy D wykorzystano stężenie 25(OH)D3 oznaczone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC/UV w surowicy krwi (zestaw firmy Recipe). Metoda podlegała kontroli DEQAS. Wyniki. Najniższe średnie wartości stężenia 25(OH)D3 uzyskano w styczniu w porównaniu do wartości uzyskanej w paździeniku (p<0,008), w marcu w porówanniu do maja, sierpnia i października (odpowiednio p<0,03, p<0,002, p<0,00007) oraz w kwietniu w porównaniu do sierpnia i października (odpowiednio p<0,04, p<0,03), niezależnie od miejsca zamieszkania dzieci. Średnie wartości stężenia witaminy 25(OH)D3 obniżały się z wiekiem dzieci. W grupie I stwierdzono istotnie statystycznie wyższe stężenia 25(OH)D3 w porównaniu do grupy II i III (p<0,00003). Średnie dla grup wiekowych wynosiły: grupa I – 28,3± 0,8 ng/ml, grupa II – 21,3±1,0 ng/ml, grupa III – 19,1±1,2 ng/ml. Dzieci, u których stwierdzono otyłość miały istotnie statystycznie niższe stężenie 25(OH)D3 w porównaniu do dzieci o prawidłowej masie ciała (p<0,03). Wniosek. Suplementacja witaminy D powinna być polecana dla dzieci powyżej 10 roku życia.

33. Mikrocząstki u krwiodawców i w składnikach krwi. Agnieszka Wróbel

1, Krystyna Maślanka

1, Małgorzata Uhrynowska

1, Patrycja Łopacz

1, Halina Michur

1,

Alina Ostas2, Ewa Brojer

1

1 Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii,

Polska, 2 Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Polska

Wstęp: Mikrocząstki (MPs) są pęcherzykami o średnicy od 100nm do 1µm, uwalnianymi z błon płytek (PMPs), erytrocytów (EMPs) i leukocytów (LMPs) wskutek aktywacji lub apoptozy tych komórek. Potwierdzono ich rolę w przebiegu wielu procesów patofizjologicznych, lecz ich poziom w przechowywanych składnikach krwi oraz udział w powstawaniu niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych przebiegających z dusznością pozostają nieznane. Cel: Analiza MPs (PMPs, EMPs i LMPs) w osoczu dawców krwi oraz w składnikach krwi w czasie ich rutynowego przechowywania oraz w składnikach krwi przetaczanych pacjentom, u których po transfuzji wystąpiły niehemolityczne odczyny poprzetoczeniowe przebiegające z dusznością. Materiał: 1/ Odsetek MPs oceniono w osoczu 16 dawców krwi oraz w składnikach krwi: 3 koncentratach krwinek czerwonych (KKCz), 3 ubogoleukocytarnych koncentratach krwinek czerwonych (UKKCz) oraz 3 koncentratach krwinek płytkowych (KKP) z aferezy w dniu pobrania i w ostatnim dniu przechowywania. 2/ Odsetek MPs w składnikach, po przetoczeniu których wystąpiły u pacjentów odczyny niehemolityczne z dusznością oceniano w: 26 KKCz, 7 UKKCz i 3 KKP. Analizowano pacjentów z ostrym potransfuzyjnym uszkodzeniem płuc (TRALI; n=2), z niehemolitycznymi reakcjami potransfuzyjnymi przebiegającymi wyłącznie z dusznością (TRD; n=12) i z potransfuzyjnym przeciążeniem krążenia (TACO; n=14). Badania kontrolne wykonano w 6 KKCz, 26 UKKCz i 9 KKP przetoczonych pacjentom bez żadnych odczynów poprzetoczeniowych. Metody: Izolowane MPs znakowano aneksyną V-PE i odpowiednio: CD61-FITC dla PMPs, CD235a-FITC dla EMPs i CD66c-FITC dla LMPs i oceniano w cytometrze BD FACSCanto II z użyciem programu FACSDiva. Wyniki : Odsetek MPs u 16 zdrowych dawców wynosił: PMPs = 25,86±15,18%, EMPs = 37,88±15,27%, LMPs = 13,76±7,82%. W czasie przechowywania składników krwi, w Dniu 0 odsetek MPs w KKCz i KKP utrzymywał się w zakresie wartości uzyskiwanych u zdrowych dawców, a w UKKCz był niższy. W ostatnim dniu przechowywania, w porównaniu do Dnia 0 poziom MPs wynosił: 1/ PMPs: w KKCz – 37,7% vs 81,4%, w UKKCz – 3,9% vs 1,2%, w KKP – 57,8% vs 86,5% 2/ EMPs: w KKCz – 35,0% vs 49,5%, w UKKCz – 48,0% vs 60,5%, w KKP – 54,0% vs 52,2% 3/ LMPs we wszystkich badanych składnikach krwi pozostawały na stałym poziomie (4,7-11,4%), bez zauważalnych zmian. W składnikach krwi przetoczonych pacjentom bez odczynów poprzetoczeniowych odsetek wszystkich MPs nie różnił się od poziomu w osoczu dawców krwi. Pacjenci, u których wystąpiło TRALI, otrzymali wyłącznie transfuzje KKCz. Wartości EMPs w tych składnikach były statystycznie istotnie wyższe (84,8±8,49%) niż u dawców i w składnikach, po których nie wystąpiło TRALI (p<0,05), podczas gdy wartości PMPs i LMPs utrzymywały się w granicach przyjętych dla obu grup kontrolnych. Pacjenci z rozpoznaniem TRD i TACO otrzymali transfuzje KKCz, UKKCz i KKP. Wartości MPs w tych składnikach krwi nie wykazywały statystycznie istotnej różnicy w porównaniu z grupą kontrolnych składników krwi i grupą zdrowych dawców. Wnioski: Wzrastający w trakcie przechowywania składników krwi odsetek MPs może wpływać na aktywację neutrofilów, indukujących niehemolityczne reakcje poprzetoczeniowe z dusznością u predysponowanych pacjentów.Istotną rolę w patogenezie TRALI wydają się pełnić EMPs, których zwiększony odsetek stwierdzono w składnikach przetoczonych pacjentom, u których wystąpił ten odczyn. W celu potwierdzenia ich znaczenia konieczne są dalsze badania. 34. Ocenia stężenia interleukiny 6 (IL-6) i jej rozpuszczalnego receptora (sIL-6 r) u chorych na szpiczaka mnogiego w zależności od stopnia zaawansowania choroby. Joanna Kamińska

1, Olga Martyna Koper

1, Beata Polińska

1, Joanna Matowicka - Karna

1, Halina

Kemona1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska

Szpiczak mnogi (MM) jest złośliwym nowotworem układu krwiotwórczego. Charakteryzuje się niekontrolowanym rozrostem komórek plazmatycznych syntetyzujących monoklonalną

immunoglobulinę. Infiltracja szpiku przez komórki nowotworowe może niekorzystnie wpływać na hematopoezę, a także na trombocytopoezę. Główną cytokiną regulującą trombocyropoezę jest trombopoetyna (TPO) ale również nieswoiste czynniki takie jak interleukiny 1, 3, 6, 11, czynnik wzrostu komórek pnia, czynnik stymulujący kolonie granulocytów, czynnik hamujący białaczkę, erytropoetyna. IL-6 u chorych na szpiczaka mnogiego pełni szczególną rolę ze względu na udział zarówno w patogenezie choroby, jak również w regulacji trombocytopoezy. Wydzielana na drodze parakrynnej i/lub autokrynnej pobudza proliferację komórek plazmatycznych i zapobiega ich apoptozie, natomiast działając na hepatocyty wątroby stymulacje syntezę TPO. Dodatkowo rozpuszczalny receptor dla IL-6 (sIL-6R) wzmaga działanie IL-6, co wyróżnia go od większości rozpuszczalnych receptorów cytokinowych, które zwykle w momencie utworzenia kompleksu z ligandem tracą swoją aktywność. Celem pracy była ocena stężenie IL-6 i jej rozpuszczalnego receptora (sIL-6) u chorych na szpiczaka mnogiego w zależności od stopnia zaawansowania choroby. Grupę badaną stanowiło 41 chorych ze świeżo zdiagnozowanym szpiczakiem mnogim (67,7 lat), które nie zostały jeszcze poddane leczeniu. Grupę badaną podzielono w zależności od stadium zaawansowania choroby na podstawie klasyfikacji prognostycznej wg Duriego i Salmona: I stadium - 14 chorych, 5K/9M (65,9 lat), II stadium - 17 chorych, 9K/8M (65,9 lat), III stadium - 10 chorych, 4K/6M (75,3 lat). Grupę kontrolną stanowiło 30 osób zdrowych, ochotników (65,5 lat). Stężenie IL- 6 i sIL-6R oznaczono w surowicy krwi metodą ELISA (zestaw odczynnikowy Quantikine - Kit R&D). Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznie w oparciu o program STATISTICA 9.0 PL, a różnice za istotne statystycznie uznano przy p < 0,05. Mediana stężenia IL-6 (13,09 pg/ml) u chorych na MM była istotnie statystycznie wyższa w porównaniu do osób zdrowych (7,78 pg/ml, p = 0,0001). Obserwowano istotny wzrost mediany stężenia IL-6 wraz ze stadium zaawansowania choroby (p = 0,0001). W I stadium choroby mediana stężenia IL-6 wyniosła 7,9 pg/ml przy czym w II i III stadium była już niemalże 2 - i 3 - krotnie wyższa, odpowiednio 14,42 pg/ml i 29,77 pg/ml. Mediana stężenia sIL-6R (81,16 ng/ml) również była istotnie wyższa u chorych na MM w porównaniu do osób zdrowych (54,88 ng/ml, p = 0,0001) i ulegała istotnemu wzrostowi wraz ze stadium choroby. U chorych w I stadium mediana stężenia sIL-6R wyniosła 54,15 ng/ml, przy czym w II i III stadium była wyższa, odpowiednio 84,58 ng/ml i 126,96 ng/ml. Wykazano dodatnią korelację pomiędzy: stężeniem IL-6 a sIL-6R, r = 0,82 przy p = 0,0001. Reasumując, u chorych na szpiczaka mnogiego obserwowano istotnie wyższe stężenie IL-6 i sIL-6R w porównaniu do osób zdrowych oraz wraz z rozwojem choroby. Uzyskane wyniki mogą potwierdzać istotną rolę cytokiny w patogenezie choroby oraz pozwalają przypuszczać, iż IL-6 i sIL6R w sposób pośredni mogą uczestniczyć w regulacji trombocytopoezy, stymulując syntezę TPO w wątrobie u chorych na szpiczaka mnogiego. J. Kamińska, OM. Koper, B. Polińska były stypendystkami projektu „Studiuję, badam, komercjalizuję - program wsparcia doktorantów UMB”, Poddziałanie 8.2.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

35 . Wpływ atorwastatyny na poziom 25-hydroksywitaminy D oraz markerów metabolizmu lipidowego i stanu zapalnego u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym. Grażyna Sygitowicz

1, Łukasz Pera

1, Marta Tracz

1, Maciej Pawlak

2, Joanna Piniewska

3, Grzegorz

Opolski2, Mirosław Dłużniewski

3, Dariusz Sitkiewicz

1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Medycznej Katedry Biochemii i Chemii Klinicznej, Warszawski

Uniwersytet Medyczny, Polska, 2 I Katedra i Klinika Kardiologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny,

Polska, 3 Katedra i Klinika Kardiologii, Nadciśnienia Tętniczego i Chorób Wewnętrznych, Warszawski

Uniwersytet Medyczny, Polska Wstęp: Statyny, inhibitory reduktazy HMG-CoA, wykazują rozległe efekty plejotropowe niezależnie od hamowania syntezy cholesterolu obejmujące przede wszystkim działanie antyoksydacyjne i przeciwzapalne. Hamowanie aktywności reduktazy HMG-CoA prowadzi do zmniejszenia syntezy 7-dehydrocholesterolu, niezbędnego do syntezy cholekalcyferolu (witamina D3). W kilku wieloośrodkowych badaniach wykazano, że podawanie atorwastatyny zwiększa poziom 25-hydroksywitaminy D (25(OH)D) w surowicy. Badania kliniczne wskazują, że obniżony poziom tej witaminy w surowicy zwiększa ryzyko wystąpienia epizodów sercowo-naczyniowych. Celem niniejszej pracy była próba oceny efektywności miesięcznej terapii atorwastatyną u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym w zależności od poziomu witaminy D oraz statusu lipidowego i zapalnego. Materiał: Programem badawczym objęto 33 pacjentów z zawałem serca (56.3±10.7 lat), w tym 25 pacjentów z zawałem serca typu STEMI oraz 8 pacjentów z zawałem serca typu NSTEMI, u których zastosowano terapię atorwastatyną. Badania laboratoryjne, wykonane zarówno przed wprowadzeniem

leczenia (I pobranie, n=33), jak i po 30-dniach terapii atorwastatyną (II pobranie, n=33) obejmowały oznaczenie stężeń: 25-hydroksywitaminy D, parametrów podstawowego lipidogramu wraz z apolipoproteinami A1 i B oraz białka C-reaktywnego (hsCRP). Wyniki: W obydwu grupach pacjentów (STEMI i NSTEMI), poddanych leczeniu atorwastatyną uzyskano obniżenie stężenia cholesterolu całkowitego, cholesterolu frakcji LDL, apolipoproteiny B, przy pozostającym na tym samym poziomie stężeniu cholesterolu frakcji HDL i apolipoproteiny A1. Zaobserwowano istotny statystycznie spadek stężenia hsCRP (I pobranie vs II pobranie), który był znacznie silniej zaznaczony u pacjentów z zawałem serca typu STEMI: 10.2 (5.8-26.1) mg/L vs 2.16 (1.55-6.54) mg/L; p=0.0014 niż NSTEMI: 2.36 (1.85-10.64) mg/L vs 1.64 (1.31-4.11) mg/L; p=0.0117. W czasie trwania terapii uzyskano wzrost stężenia 25(OH)D (I pobranie vs II pobranie), który był tylko nieco silniej zaznaczony u pacjentów z zawałem serca typu STEMI (12.96±6.18 ng/mL vs 14.02±7.37 ng/mL; p=0.171) niż NSTEMI (14.98±5.28 ng/mL vs 15.62±5.01 ng/mL; p=0.377). Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują, że atorwastatyna poza korzystnym działaniem na metabolizm lipidowy wykazuje wiele efektów plejotropowych. Efekty te dotyczą stanu zapalnego oraz wzrostu stężenia witaminy D. Wydaje się, że istotną jest obserwacja dotycząca występowania niedoborów witaminy D u wszystkich badanych pacjentów. Poszukiwanie odpowiedzi na pytanie, czy antyaterogenny efekt działania statyn jest związany ze wzrostem stężenia witaminy D, będzie przedmiotem dalszych badań z udziałem większej liczby pacjentów i w oparciu o różne statyny. 36. Status lipidowy i zapalny u pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową po miesięcznej terapii wybranymi statynami. Grażyna Sygitowicz

1, Marta Bobruk

1, Maciej Pawlak

2, Grzegorz Opolski

2, Dariusz Sitkiewicz

1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Medycznej Katedry Biochemii i Chemii Klinicznej, Warszawski

Uniwersytet Medyczny, Polska, 2 I Katedra i Klinika Kardiologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny,

Polska Wstęp: Stabilna choroba wieńcowa jest często pierwszym objawem klinicznym choroby niedokrwiennej serca, zaś za jej przyczynę uznaje się miażdżycowe zmiany w tętnicach wieńcowych. Zaburzenia o charakterze lipidowym i zapalnym szczególnie przyczyniają się do dysfunkcji śródbłonka naczyń, a w dalszej kolejności do formowania stabilnej blaszki miażdżycowej. Statyny wykazują znaczny potencjał terapeutyczny w odniesieniu do powyższych zaburzeń. W niniejszej pracy podjęto próbę oceny wpływu 30-dniowej terapii atorwastatyną, rozuwastatyną lub simwastatyną na status lipidowy i zapalny u pacjentów ze zdiagnozowaną stabilną chorobą wieńcową, udokumentowaną koronarograficznie. Materiał: Programem badawczym objęto 23 pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową (64.8±10.2 lat), u których zastosowano po raz pierwszy terapię atorwastatyną (n=12), rozuwastatyną (n=7) oraz simwastatyną (n=4). Wszystkich pacjentów poddano dwukrotnym badaniom tzn. przed wprowadzeniem leczenia (I pobranie, n=23), jak i w obserwacji miesięcznej wybranymi statynami (II pobranie, n=23). W obydwu punktach czasowych oznaczano stężenia podstawowego lipidogramu wraz z apolipoproteinami A1 i B, mieloperoksydazy (MPO), rozpuszczalnej postaci P-selektyny (sP-selektyny), reaktywnych form tlenu (ROS) oraz aktywności aminotransferaz (AST i ALT). Wyniki: Miesięczna terapia atorwastatyną i rozuwastatyną u badanych pacjentów powodowała obniżenie stężenia cholesterolu całkowitego, cholesterolu frakcji LDL, apolipoproteiny B, czego nie zaobserwowano po zastosowaniu simwastatyny. Bez względu na rodzaj włączonej statyny - stężenia cholesterolu frakcji HDL i apolipoproteiny A1 pozostawały na podobnym poziomie (I pobranie vs II pobranie). Rodzaj statyny nie miał również znaczącego wpływu na wartości aktywności obydwu aminotransferaz. Zaobserwowano obniżenie (I pobranie vs II pobranie) stężenia MPO po atorwastatynie (165.9±78.5 vs 118.7±34.0 pmol/L; p=0.09), po simwastatynie (151.2±86.7 vs 132.7±86.6 pmol/L; p=0.806); stężenia rozpuszczalnej postaci P-selektyny po atorwastatynie (97.2±45.5 vs 82.5±36.5 ng/mL; p=0.248), po simwastatynie (84.6±28.8 vs 71.1±26.2 ng/mL; p=0.192) oraz stężenia ROS po atorwastatynie (403.9±163.2 vs 382.5±169.1 µmol/L; p=0.380), po rozuwastatynie (468.3±270.1 vs 317.2±203.9 µmol/L; p=0.148) i po simwastatynie (316.3±123.5 vs 314.6±131.2 µmol/L; p=0.959). Wnioski: Badania profilu lipidowego oraz stanu zapalnego po zastosowaniu jednej z trzech omawianych statyn u pacjentów ze zdiagnozowaną stabilną chorobą wieńcową ukazały różną moc działania statyn. W ocenie efektu terapeutycznego statyn istotnym elementem jest nie tylko ich działanie hipolipemizujące ale także przeciwzapalne. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że atorwastatyna działa najsilniej przeciwzapalnie, zaś rozuwastatyna – najsilniej hipolipemizująco.

Potwierdzenie powyższego wniosku wymaga zwiększenia liczby pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową i z ewentualnym wydłużeniem czasu obserwacji. 37. Cytometryczna ocean ekspresji perforyny w komórkach NK i limfocytach CD8+ w grupie dzieci z autoimmunizacyjnym zapaleniem tarczycy typu hashimoto Iwona Osińska

1, Katarzyna Popko

2, Anna Stelmaszczyk-Emmel

2, Anna Kucharska

3, Urszula

Demkow2

1I Wydział Lekarski, Studia doktoranckie , WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska

2Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, ul. Marszałkowska

24, 00-576 Warszawa, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska 3Oddział Kliniczny Endokrynologii i Pediatrii, ul. Marszałkowska 24, 00-576 Warszawa, WARSZAWSKI

UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska Perforyna jest białkiem odpowiedzialnym za permabilizację błony cytoplazmatycznej komórki docelowej w czasie reakcji cytotoksycznej. Jest ona obecna w ziarnach cytolitycznych komórek zdolnych do spontanicznej lub indukowanej cytolizy takich jak komórki NK i limfocyty CD8. Choroba Hashimoto jest chorobą autoimmunizacyjną, z przewagą mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za niszczenie własnych antygenów. Spontaniczna cytotoksyczność, fagocytoza czy uwalnianie cytokin wydają się pełnić kluczową rolę w rozwoju tego schorzenia. Celem pracy była ocena ekspresji perforyny w komórkach NK i limfocytach CD8 w grupie dzieci z autoimmunizacyjnym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto oraz w grupie kontrolnej. Ekspresję perforyny i antygenów powierzchniowych, charakterystycznych dla badanych populacji zbadano z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Wykazano, że w grupie dzieci z autoimmunizacyjnym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto występuję istotny spadek ekspresji perforyny zarówno w limfocytach CD8 jak i w komórkach NK w porównaniu z grupą kontrolną (p=0,01 i p=0,004). W grupie dzieci chorych spadek poziomu ekspresji perforyny w limfocytach CD8 koreluję z jednoczesnym obniżeniem poziomu ekspresji perforyny w komórkach NK. Przeprowadzone badania potwierdzają istotną rolę perforyny w patomechanizmie autoimmunizacyjnego zapalenia tarczycy typu Hashimoto, jednakże niewielka liczba analizowanych pacjentów wymaga przeprowadzenia dalszych obserwacji. 38. Podwyższone d-dimery–objaw aktywacji krzepnięcia/fibrynolizy czy błąd pobrania? Opis doświadczeń własnych Małgorzata Wituska

1, Elżbieta Przybyszewska-Kazulak

1, Agnieszka Wiśniewska

2

1 Centralne Laboratorium, SP CSK, Polska,

2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Wydział Nauki o

Zdrowiu WUM, Polska Szacuje się, że około 70% błędów laboratoryjnych jest związanych z fazą przedanalityczną, z czego większość stanowią błędne pobrania: nieodpowiednia objętość, zła jakość próbki (hemoliza, skrzep, kontaminacja). W przypadku badań układu hemostazy nieprzestrzeganie ściśle określonych procedur pobierania materiału ma znamienny wpływ na uzyskanie wiarygodnego wyniku, a tym samym na odzwierciedlenie stanu hemostazy in vivo. W trakcie rutynowej pracy dużego laboratorium szpitalnego zaobserwowano kilka próbek z wysokim stężeniem d-dimerów, które nie korespondowały ze stanem klinicznym pacjenta. Czynnikiem wskazującym możliwość wystąpienia nieprawidłowego pobrania tych materiałów było skrócenie czasu APTT poniżej ustalonego zakresu wartości odniesienia (25-37 s). Celem pracy było sprawdzenie czy otrzymanie wysokiego stężenia d-dimerów zawsze odzwierciedla rzeczywisty stan pacjenta czy też może wynikać z błędnego pobrania próbki. Materiał i metody: Analizą objęto próbki dziesięciu pacjentów, skierowane na rutynowe badania koagulologiczne. W każdej z nich otrzymano podwyższone stężenie d-dimerów ( w przedziale od 819 ng/ml do wartości powyżej 10000ng/ml) oraz skrócenie APTT. Oznaczenie d-dimerów wykonano techniką immunoenzymofluorescencyjną na aparacie Vidas (bioMereiux), oznaczenie APTT wykonano metodą wykrzepiania na aparacie BCSXP (Siemens). Przed wykonaniem oznaczeń próbki nie wykazywały cech błędnego pobrania (odpowiednia ilość krwi, brak hemolizy, skrzepu) mimo to, poproszono o ponowne pobranie krwi od każdego z pacjentów. Wyniki: W próbkach z kolejnego pobrania we wszystkich przypadkach uzyskano wydłużenie czasu APTT oraz znaczny spadek stężenia d-dimerów w stosunku do wartości wyjściowych.

Wnioski: Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, że nie zawsze wysokie stężenie d-dimerów świadczy o aktywacji in vivo krzepnięcia/fibrynolizy, może być efektem błędu przedlaboratoryjnego. Skrócenie APTT może sugerować nieprawidłowości podczas procesu przedanalitycznego np. użycie zbyt cienkich igieł, zbyt długi ucisk stazy, jednakże laboratorium nie może stwierdzić, jaki błąd został popełniony zanim próbka trafiła do oznaczenia. Otrzymane wyniki wskazują na to jak ogromne znaczenie ma wnikliwa analiza i weryfikacja otrzymanych wyników na poziomie laboratorium. 39. Czy fikolina H może brać udział w patogenezie toczniowego zapalenia nerek? Magdalena Polcyn-Adamczak

1, Zofia Niemir

1, Anna Świerzko

2, Maciej Cedzyński

2, Anna

Maciejewska3, Jolanta Łukasiewicz

3

1 Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego Poznań, Pracownia Nefrologii Molekularnej, Polska,

2Polska Akademia Nauk w Łodzi, Instytut Biologii Medycznej, Polska,

3 Polska Akademia Nauk we

Wrocławiu, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Polska Wstęp: W ostatnich latach wykazano wzrost stężenia fikoliny H w surowicy chorych z układowym

toczniem rumieniowatym (TRU). Ze względu na prawdopodobne znaczenie tego białka w autoimmunizacji, w obecnej pracy porównano stężenia fikoliny H w surowicy chorych z różnymi formami morfologicznych pierwotnego kłębuszkowego zapalenia nerek (PKZN), aktywnego i nieaktywnego toczniowego zapalenia nerek (TZN) oraz grupy kontrolnej (K). Materiał i metody: Badaniami objęto 120 chorych na PKZN (43 z IgA mezangialnym rozplemowym

KZN, 36 z nie-IgA mezangialnym rozplemowym KZN, 6 z błoniasto-rozplemowym KZN, 19 z idiopatycznym błoniastym KZN i 16 z ogniskowym-segmentalnym stwardnieniem kłębuszków nerkowych) oraz 55 chorych na TZN (40 z aktywną i 15 z nieaktywną fazą choroby). Grupę kontrolną stanowiło 65 osób zdrowych. Aktywność TZN oceniano zliczając punktację objawów TRU według skali SLEDAI-2K. Stężenie fikoliny H w surowicy oznaczano przy użyciu płytek Maxisorp firmy Nunc, opłaszczonych LPS 1200 z H. alvei, mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw fikolinie H i anty-mysich IgG sprzężonych z HRP

Wyniki: Średnie stężenie fikoliny H wynosiło 23,9 g/ml (zakres od 1,6 do 59) u chorych na TZN, 16,8

g/ml (zakres: 2,6 do 53,5) u chorych na PKZN i 18,9 g/ml (zakres: 6,4 do 35,9) w K (TZN vs PKZN i

K, p <0,0001). Porównanie liczby chorych ze stężeniami fikoliny H odpowiadającymi czwartemu kwartylowi w grupie K wykazało statystycznie istotnie wyższy odsetek chorych z wysokimi stężeniami fikoliny H w grupie z TZN. Wartości te wynosiły odpowiednio: 24,6% w grupie K, 29,1% w PKZN i 63,6% u chorych TZN (TZN vs PKZN i K p <0,0001). Wśród chorych na TZN stężenie fikoliny H było wyższe u tych z aktywną fazą choroby, ale różnica między chorymi z aktywną i nieaktywną fazą choroby nie osiągnęła istotności statystycznej. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między chorymi z różnymi formami morfologicznymi PKZN. Wnioski: Nasze wyniki wskazują na udział fikoliny H w patogenezie TZN. Wyniki te wymagają jednak

potwierdzenia na większej grupie chorych. 40. Diagnostyka defektu nocnej napadowej hemoglobinurii. Justyna Spychalska

1, Hanna Pyl

1, Paweł Turowski

1, Karolina Pieńko

1, Małgorzata Uhrynowska

1, Ewa

Brojer1

1 Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii,

Polska Nocna napadowa hemoglobinuria (NNH) to choroba klonalna wywołana mutacją somatyczną w genie PIG-A w hematopoetycznej komórce macierzystej. Na komórkach potomnych obserwuje się niedobór lub całkowity brak cząsteczek glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) i wielu białek z nimi związanych. Klasyczna postać NNH charakteryzuje się wysokim odsetkiem komórek GPI ujemnych (GPI-) we krwi obwodowej oraz triadą objawów klinicznych: wewnątrznaczyniową hemolizą, zakrzepicą i cytopeniami. Klon komórek GPI- (o fenotypie NNH) może towarzyszyć niedokrwistości aplastycznej (AA), zespołom mielodysplastycznym (MDS) i innym chorobom związanym z niewydolnością szpiku. W ostatnich latach wprowadzano do diagnostyki NNH coraz czulsze metody z zastosowaniem cytometrii przepływowej, służące rozpoznawaniu niewielkich populacji komórek z defektem NNH (poniżej 1%).

Celem pracy była ocena wykrywalności populacji leukocytów GPI- za pomocą unowocześnionych testów cytometrycznych opartych na wiązaniu do leukocytów aerolizyny znakowanej fluorescencyjnie (fluorescently labeled aerolysin, FLAER). Materiał i metody: Przebadano 80 próbek krwi od osób kierowanych pierwszy raz na badania w kierunku NNH, ze wstępnym rozpoznaniem: niedokrwistości i niedokrwistości hemolitycznej, aplazji lub hipoplazji szpiku, MDS, pancytopenii lub cytopenii oraz zakrzepicy. Pełną krew (EDTA) poddano lizie erytrocytów i znakowano: 1) FLAER (badanie przesiewowe), 2) FLAER i.przeciwciałami monoklonalnymi: CD24 PE, CD45 PerCP i CD15 APC (ultraczuła ocena granulocytów obojętnochłonnych), 3) FLAER oraz przeciwciałami: CD14 APC, CD45 PerCP i CD33 PE (ultraczuła ocena monocytów). Następnie komórki odpłukano i utrwalono 2% paraformaldehydem. Akwizycję i analizę komórek przeprowadzono w cytometrze FACSCalibur. Wyniki wyrażano jako % komórek GPI-. Wyniki: Komórki GPI- wykryto u 29 na 80 osób (36%). Częstość wykrywania klonu wynosiła u chorych z rozpoznaniem AA - 67%, pancytopenii - 61%, hipoplazji szpiku - 50%, MDS - 25 %, niedokrwistości hemolitycznej - 17% oraz cytopenii (granulocytopenia z trombocytopenią lub z niedokrwistością) - 12,5%. W przypadkach niewyjaśnionej zakrzepicy bez objawów niedokrwistości i niewydolności szpiku oraz niedokrwistości bez objawów hemolizy w próbkach krwi nie stwierdzono obecności leukocytów GPI-. U 9 osób defekt NNH oceniony wysokoczułymi metodami wynosił poniżej 1 % - u 5 z nich jego rozmiar określono jako nieznaczny klon NNH (zakres 0,1-1,0%), a u 4 - jako pojedyncze komórki o fenotypie NNH (0,01-0,09%). Poniżej 1% komórek GPI- obserwowano jedynie u chorych z zaburzeniami szpiku - aplazją, MDS oraz z pancytopenią i cytopeniami. Ultraczułą analizę wykorzystano też dla weryfikacji przesiewowego testu FLAER, gdy jego wyniki były trudne do oceny. Test FLAER okazał się fałszywie dodatni u 1 chorego z MDS, natomiast fałszywie ujemny u 1 chorego z AA. Zaobserwowano, że w 16 na 29 (55%) przypadków klon NNH był większy w populacji monocytów niż w populacji granulocytów. Wnioski: Analiza cytometryczna przy zastosowaniu FLAER wraz z przeciwciałami skierowanymi do białka związanego z GPI (CD24, CD14) i markerów linii komórkowych (CD45, CD15, CD33) zalecana jest do badania próbek krwi pochodzących od chorych z niewydolnością szpiku, ponieważ pozwala na wykrycie nielicznych komórek o fenotypie NNH. Ultraczuła diagnostyka eliminuje wyniki niejednoznaczne, co nie zawsze było możliwe przy zastosowaniu przeciwciał skierowanych do różnych białek związanych z cząsteczkami GPI oraz w przesiewowym teście FLAER. Czułość i swoistość tych testów pozwala na wykrycie defektu NNH również w przypadkach odmłodzenia komórek z linii mieloidalnej lub ich dysplazji. 41. Metody diagnostyczne przecieku płodowo-matczynego. Małgorzata Uhrynowska

1, Justyna Spychalska

1, Maria Nowaczek-Migas

1, Izabella Kopeć

2, Ewa

Brojer1

1 Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii,

Polska, 2 Poradnia Hematologiczna dla Kobiet w Ciąży, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Polska

Wykrywanie krwinek płodowych we krwi obwodowej matki ma istotne znaczenie w diagnostyce niedokrwistości noworodków. Ocena przecieku płodowo-matczynego wykonywana jest również w czasie ciąży np. po urazie brzucha ciężarnej, czy przedwczesnym odklejeniu łożyska. U kobiet RhD ujemnych metoda ta wykorzystywana jest w wielu krajach do ustalania dawki immunoglobuliny anty-RhD koniecznej do zneutralizowania krwinek immunizujących matkę zarówno w podczas ciąży jak i po porodzie w celu profilaktyki konfliktu płodowo-matczynego i choroby hemolitycznej noworodków związanej z antygenem RhD. Powszechnie znaną metodą manualną wykrywającą krwinki płodowe we krwi obwodowej matki jest metoda mikroskopowa Kleihauera-Betke. Ze względu na brak możliwości standaryzacji obecnie zaleca się stosowanie jej tylko jako jakościowego badania przesiewowego. Coraz większe znaczenie w ilościowej ocenie przecieku płodowo-matczynego mają techniki cytometrii przepływowej. Wykrycie erytrocytów płodu w krążeniu matki możliwe jest na podstawie różnic w fenotypie ich krwinek lub zawartości hemoglobiny płodowej (HbF). U kobiet RhD ujemnych, których płody są RhD dodatnie stosuje się przeciwciała anty-D. Celem pracy jest porównanie testów diagnostycznych służących wykrywaniu przecieku płodowo-matczynego u kobiet ciężarnych. Materiałem była krew obwodowa pobrana na antykoagulant (EDTA) od 85 kobiet kierowanych do Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT. Oznaczenia odsetka krwinek płodowych wykonywano równolegle w dniu dostarczenia materiału metodą manualną Kleihauera-

Betke i cytometrią przepływową z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych anty-HbF, a u kobiet RhD ujemnych dodatkowo z przeciwciałami anty-D. W teście Kleihauera-Betke cieńkie rozmazy krwi poddano działaniu buforu McIlvine’a (pH 3.3-3.4), następnie barwiono hematoksyliną i erytrozyną. Kontrolę dodatnią stanowiły mieszaniny krwi dawcy i krwi pępowinowej (10:1). Każdorazowo liczono pod mikroskopem 2 000 erytrocytów. Krwinki intensywnie zabarwione na różowo uznawano za erytrocyty pochodzące od płodu, natomiast odbarwione (cienie komórkowe) za erytrocyty matki. W testach cytometrycznych równolegle badano krew pacjentki i komercyjny zestaw kontrolnych krwinek płodowych (FETALtrol, Trillium Diagnostics) lub krew dawcy (kontrola negatywna) oraz mieszaniny krwi dawcy i krwi pępowinowej (kontrola dodatnia). W teście anty-HbF erytrocyty utrwalano 0,05% glutaraldehydem, permeabilizowano 0,1% roztworem detergentu Triton X-100 i znakowano przeciwciałami anty-HbF sprzęgniętymi z fikoerytryną (PE) (CALTAG Laboratories). W badaniu anty-D erytrocyty znakowano bezpośrednio przeciwciałami anty-RhD sprzęgniętymi z 5-izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (IBGRL, Bristol). W cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton-Dickinson) analizowano po 100 000 erytrocytów. Za krwinki płodu uznawano erytrocyty znajdujące się w regionie wyznaczonym przez kontrolę pozytywną. Wyniki testów wyrażano jako % krwinek płodu w krwioobiegu matki. Ilościowa ocena krwinek płodowych metodami cytometrycznymi jest równie czuła jak standardowa metoda Kleihauera-Betke (r=0,984), ale zaletą tych testów jest krótszy czas wykonania (do 2 godzin) oraz analiza automatyczna umożliwiająca większą powtarzalność i obiektywizm wyników. 42. Czy tlenek azotu wpływa na płytki krwi u chorych na wrzodziejące zapalenie jelita grubego (colitis ulcerosa)? Beata Polińska

1, Joanna Matowicka-Karna

1, Joanna Kamińska

1, Halina Kemona

1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (colitis ulcerosa) należy do nieswoistych zapalnych chorób jelit o przebiegu przewlekłym z okresami zaostrzeń i remisji. Wskaźnikami stanu zapalnego są leukocytoza (WBC) i IL-6. Uwalniane cytokiny oraz interakcje międzykomórkowe powodują aktywację płytek krwi. Następstwem tego procesu jest zmiana kształtu płytek krwi z dyskoidalnego na nieregularny z licznymi wypustkami, co prowadzi do zmiany ich parametrów morfologicznych, takich jak: średnia objętość płytek krwi (MPV) i odsetek dużych płytek krwi (LPLT). Młode, duże płytki krwi „megatrombocyty” o objętości powyżej 20 fl (LPLT) mają dłuższy czas przeżycia, wykazują szybsze przemiany energetyczne, są najbardziej aktywne w procesach adhezji, agregacji i reakcji uwalniania. Zwiększenie odsetka LPLT może być związane z odpowiedzią na przyśpieszenie ich obrotu, spowodowanego zużywaniem płytek krwi w miejscu toczącego się procesu zapalnego. Cytokiny prozapalne stymulują produkcję i uwalnianie tlenku azotu (NO), który wchodzi w skład mechanizmów obronnych ustroju, a wzrost jego stężenia odzwierciedla zaburzenie równowagi pomiędzy czynnikami pro- i przeciwzapalnymi. Zwiększenie stężenia NO jest odpowiedzią na działanie między innymi IL-6 i tym samym potwierdza występowanie stanu zapalnego. Dlatego też IL-6 i NO (oprócz OB, CRP, WBC) mogą być brane pod uwagę jako wskaźniki stanu zapalnego w przebiegu colitis ulcerosa. Utrzymujący się stan zapalny u chorych na colitis ulcerosa może być przyczyną wewnątrznaczyniowej aktywacji płytek krwi oraz zmiany ich parametrów morfologicznych. Celem pracy było wykazanie czy u chorych na colitis ulcerosa zaostrzenie stanu zapalnego może prowadzić do zmiany liczby płytek krwi (PLT), ich objętości, odsetka dużych płytek. Ponadto interesującym jest, czy wzrost stężenia NO u chorych w przebiegu zaostrzenia colitis ulcerosa może wpływać na liczbę płytek krwi oraz ich parametry morfologiczne. Badaniami objęto 30 chorych (17 M i 13 K) z ostrym rzutem colitis ulcerosa. Grupę kontrolną (K) stanowiło 30 zdrowych ochotników (16 K i 14 M). Oznaczenia morfologii krwi wykonywano na analizatorze hematologicznym ADVIA 2120, a stężenia IL-6 i NO oznaczano zestawami firmy R&D Systems metodą ELISA. Analizę statystyczną wykonano w oparciu o program STATISTICA 10.0 PL. Wyniki uznano za znamienne statystycznie przy poziomie istotności p < 0,05. W grupie chorych na colitis ulcerosa (CU) średnie stężenie IL-6 wynosiło 7,14 ± 3,91 pg/mL i było istotnie statystycznie wyższe (p< 0,01) w porównaniu do wartości uzyskanych w grupie kontrolnej. Średnie stężenie NO w grupie CU wynosiło 189,67 ± 64,21 µmol/L i było ośmiokrotnie wyższe od wartości średniej uzyskanej w grupie K. Uzyskana różnica była wysoce znamienna statystycznie (p < 0,0001). Również średnie wartości PLT i WBC były istotnie statystycznie wyższe (p < 0,05) w grupie badanej w porównaniu do grupy

kontrolnej. Natomiast średnia wartość MPV (8,30 ± 1,08 fL) była znamiennie statystycznie niższa (p < 0,05) w grupie CU niż w grupie K. U chorych na colitis ulcerosa niewielka aktywacja płytek krwi może być efektem hamującego działania tlenku azotu. Zwiększenie liczby płytek krwi i zmniejszenie ich średniej objętości u chorych na colitis ulcerosa jest prawdopodobnie wynikiem zaostrzenia stanu zapalnego. B. Polińska i J. Kamińska były stypendystkami projektu „Studiuję, badam, komercjalizuję - program wsparcia doktorantów UMB”, Poddziałanie 8.2.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

45. Modyfikowane oksydacyjnie postaci albuminy a czynniki ryzyka zespołu metabolicznego. Agnieszka Piwowar

1, Ewa Grzebyk

1, Ewa Żurawska-Płaksej

1, Anna Szymańska-Chabowska

2, Sylwia

Płaczkowska3, Lilla Pawlik-Sobecka

3

1 Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej,

Katedra i Zakład Biochemii Farmaceutycznej , Polska, 2 Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Wydział

Lekarski, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Zawodowych i Nadciśnienia Tętniczego, Polska, 3

Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Zakład Praktycznej Nauki Zawodu Analityka , Polska Zespół metaboliczny (ZM) jest niejednorodną jednostką chorobową, na którą składają się współwystępujące i powiązane ze sobą czynniki ryzyka pochodzenia metabolicznego, sprzyjające rozwojowi chorób sercowo-naczyniowych o podłożu miażdżycowym. Istotnym jest jego diagnozowanie, monitorowanie i prognozowanie przebiegu. Jako najważniejsze elementy składowe ZM wymienia się otyłość brzuszną, stanowiącą obecnie podstawowe kryterium diagnozowania tego schorzenia, ponadto upośledzoną tolerancję glukozy lub cukrzycę, aterogenną dyslipidemię tj. hipertriglicerydemię i obniżone stężenie cholesterolu frakcji HDL oraz podwyższone ciśnienie tętnicze krwi. Istotnym elementem związanym z rozwojem zaburzeń biochemiczno-klinicznych w ZM jest często współwystępujący z cukrzycą i miażdżycą stres oksydacyjny (OS), który jest wskazywany jako istotny czynnik patogenetyczny tych chorób. Oddziałuje on negatywnie na strukturę i funkcję wielu makrocząstek i komórek. Szczególnie podatne na działanie OS są białka, spośród których oksydacyjne modyfikacje albuminy, ze względu na pełnione przez to białko funkcje, są niezwykle ważne dla przebiegu choroby oraz skuteczności leczenia. W osoczu krwi 84 pacjentów z rozpoznanym ZM oraz 15 osób zdrowych oznaczono stężenie zaawansowanych produktów utleniania białek (ang. Advanced Oxidation Protein Products - AOPP), albuminy modyfikowanej niedokrwieniem (ang. Ischemia Modified Albumin – IMA) oraz stężenie grup tiolowych (grupy SH). AOPP są definiowane jako zmodyfikowana w warunkach OS cząsteczka albuminy, jej agregaty i/lub fragmenty, w której dochodzi do zmian strukturalnych w obrębie cząsteczki (jako charakterystyczne wskazuje się grupy karbonylowe, dityrozynę, mostki disiarczkowe, wiązania krzyżowe). IMA z kolei jest definiowana jako zmieniona w warunkach niedotlenienia i następowego stresu oksydacyjnego cząsteczka albuminy, w strukturze której w obszarze jej N-końca, który stanowi sekwencja 4 kolejnych aminokwasów (Asp-Ala-His-Lys), a zaburzenia w jego obrębie skutkuje obniżoną zdolnością do wiązani jonów metali przejściowych (m.in. kobaltu), co zostało wykorzystane do pomiaru jej stężenia. Z kolei stężenie grup SH w warunkach stresu oksydacyjnego ulega obniżeniu ze względu na ich utlenianie. Wymienione związki, są uznawane za parametry OS ale także oksydacyjnych modyfikacji białek. Pacjentów podzielono na grupy ze względu na liczbę i/lub rodzaj zidentyfikowanych czynników ryzyka ZM. W osoczu krwi tych osób dokonano pomiaru stężenia AOPP, IMA i grup SH metodami spektrofotometrycznymi. Stężenia AOPP i IMA było istotnie statystycznie wyższe, zaś grup SH znamiennie niższe u wszystkich chorych w stosunku do grupy kontrolnej - osób nie obciążonych żadnym z wymienionych czynników ryzyka ZM. W analizowanych grupach chorych nie zaobserwowano różnic w stężeniu IMA bez względu na liczbę i charakter zidentyfikowanych czynników ryzyka ZM. Stężenie AOPP było najwyższe w grupie chorych z rozpoznaną cukrzycą, miażdżycą i nadciśnieniem tętniczym - prawie dwukrotnie wyższe niż w grupie kontrolnej. Różniło się w stosunku do pacjentów z innymi czynnikami ryzyka od około 15 do 37%. Najniższe stężenie tego parametru stwierdzono natomiast u chorych z nadciśnieniem i cukrzycą. Z kolei stężenie grup tiolowych różniło w najmniejszym stopniu (o niecałe 10%) między osobami zdrowymi, a pacjentami z nadciśnieniem, zaś największe zmiany, odzwierciedlone najniższym stężeniem grup SH, stwierdzono u chorych z nadciśnieniem i miażdżycą w stosunku do grupy kontrolnej (o ponad 20%). Uzyskane wyniki badań wstępnych wskazują, iż ze względu największe zmiany stężenia w analizowanych

grupach pacjentów z czynnikami ryzyka ZM, najbardziej przydatne dla różnicowania takich pacjentów wydają się być zaawansowane produkty utleniania białek. 46. Badania erytrocytów metodą cytometrii przepływowej. Anna Stachurska

1, Agata Gieleżyńska

1, Katarzyna Gmerek

1, Adrianna Łoniewska-Lwowska

1, Jadwiga

Fabijańska-Mitek1

1 Zakład Immunohematologii, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Polska

Wstęp: Metody cytometrii przepływowej (flow cytometry FC) są szeroko stosowane w badaniach immunologicznych krwinek białych, przede wszystkim w diagnostyce niedoborów odpornościowych oraz w immunofenotypowaniu komórek białaczkowych i chłoniakowych. W ocenie krwinek czerwonych FC jest stosowana stosunkowo rzadko, częściej w diagnostyce hematologicznej (nocna napadowa hemoglobinuria, hemoglobinopatie i talasemie) niż w immunohematologicznej. Podjęto badania nad wdrożeniem lub opracowaniem metod FC dla skutecznej oceny przecieku płodowo-matczynego (feto-maternal haemorrhage FMH), procesu starzenia się krwinek czerwonych w warunkach banku krwi oraz usuwania starych i nieprawidłowych erytrocytów drogą fagocytozy przez monocyty/makrofagi. Metody i materiał: Stosowano cytometr przepływowy FACSCanto II (BD, USA) oraz przeciwciała monoklonalne skierowane do różnych markerów błonowych (antygen D, glikoforyna A, cząsteczki CD) i wewnątrzkomórkowych (hemoglobina płodowa i anhydraza węglanowa): anty-D, -GPA (CD235a) , -CD44, -CD47, -CD55, -CD58, -CD59, -HbF, -CA. Stosowano mieszaniny krwinek osób dorosłych z krwinkami z pępowiny o stężeniach od 0,1% do 2% oraz próbki krwi kobiet po porodzie, próbki koncentratów krwinek czerwonych przechowywanych przez 42 dni („stare”) oraz w 2-3 dniu od pobrania („świeże”) w obecności leukocytów (KKCz) i ubogoleukocytarnych (UKKCz) oraz krwinki RhD dodatnie opłaszczane przeciwciałami anty-D i fagocytowane przez monocyty izolowane z krwi dawców. Wyniki: I. Porównując trzy metody oceny FMH stwierdzono, że najbardziej zbliżone do rzeczywistych wyniki uzyskano stosując podwójne znakowanie erytrocytów (anty-HbF + CA). W przypadku oznaczania wyłącznie HbF odnotowano problem swoistości testu w obecności dużej populacji krwinek dorosłych z przetrwałą hemoglobiną płodową. Przeciwciała anty-D nie dawały fałszywych reakcji u osób ze słabą odmianą antygenu D, które w profilaktyce choroby hemolitycznej płodu/noworodka są kwalifikowane i badane jako RhD ujemne. II. Wszystkie cząsteczki CD uległy istotnym statystycznie zmianom podczas przechowywania krwi do transfuzji i były one silniejsze w KKCz niż w UKKCz. III. Znakowanie GPA erytrocytów oraz CD14 monocytów ułatwiło ocenę erytrofagocytozy; opracowano metodę o porównywalnej czułości z oceną mikroskopową oraz większej swoistości. IV. Wstępne badania ekspresji GPA i CD47 krwinek czerwonych w sferocytozie wrodzonej wykazały różnice w stosunku do krwinek osób zdrowych. Wnioski: Ze względu na coraz większą dostępność znakowanych pierwszorzędowych przeciwciał erytrocytarnych, unika się aglutynacji krwinek czerwonych, co łącznie ze stosowaniem gotowych zestawów ułatwia rutynową ocenę diagnostyczną np. przecieku płodowo-matczynego. Cytometria przepływowa jako czuła, swoista i obiektywna metoda powinna znaleźć większe zastosowanie niż dotychczas w rutynowych i naukowych badaniach immunohematologicznych krwinek czerwonych. Może ułatwić poszukiwanie markerów jakości krwinek czerwonych przeznaczonych do transfuzji, dodatkowych cech niedokrwistości hemolitycznych wrodzonych, głównie membranopatii oraz zrozumieć proces fizjologicznego i patologicznego starzenia się i eliminacji erytrocytów w warunkach in vitro i in vivo. 47. Indeksy hemolizy, bilirubinemii i lipemii – użyteczne narzędzie w poszukiwaniu błędów przedanalitycznych. Patrycja Szybowska

1, Maria Wróbel

1, Krystyna Sztefko

1

1 Zakład Biochemii Klinicznej P-A Instytutu Pediatrii Collegium Medicum UJ, Kraków, Polska

Wstęp: Obecność hemolizy, bilirubinemii i lipemii w próbce krwi pacjenta ma istotny wpływ na wiele oznaczeń laboratoryjnych. Wizualna ocena tych czynników jest subiektywna. W oparciu o pomiar spektrofotometryczny w zakresie długości fali od 400 do 800 nm współczesne automaty biochemiczne oceniają hemolizę, bilirubinemię i lipemię podając stężenie hemoglobiny (indeks hemolizy, HI), bilirubiny (indeks bilirubiny, BI) i triglicerydów (indeks lipemii, LI), a wartości poniżej 15 mg/dl, 2 µmol/l i 20 mmol/l (odpowiednio) są przyjmowane jako nie dające znaczących interferencji. Wartości tych

indeksów pozwalają na szybką identyfikację najczęstszych egzogennych i endogennych czynników interferujących i ocenę przydatności próbki do oznaczania. Cel.: Ocena indeksu hemolizy, bilirubinemii i lipemii w rutynowych próbkach surowic uzyskanych od pacjentów pediatrycznych. Materiał i metody: Analizie poddano indeksy hemolizy, bilirubinemii i lipemii dla 1556 próbek krwi pobranych do badań biochemicznych od pacjentów pediatrycznych. Oznaczenia biochemiczne wykonywane były na aparacie Vitros 5.1 (Ortho Clinical Diagnostics). Wszystkie indeksy analizowano w zależności od wieku pacjenta, pory dnia w której próbki były pobierane i oddziału. Analizę wyników przeprowadzono przy użyciu pakietu Statistica z wykorzystaniem analizy wariancji. Wyniki:Średnia wartość indeksu hemolizy (HI) dla wszystkich próbek wynosiła 34,3 ± 33,3 mg/dl (zakres 15 – 597 mg/dl). Najwyższe średnie wartości HI stwierdzono dla dzieci poniżej pierwszego miesiąca życia (HI = 57,2 ± 65,9 mg/dl) i u pacjentów od drugiego do szóstego miesiąca (HI = 41,7 ± 39,4 mg/dl). Wartości te były statystycznie istotnie wyższe w porównaniu do średnich wartości HI uzyskanych u dzieci starszych (p<0.001). Średnia wartość indeksu bilirubinemii (BI) wynosiła 4,6 ± 3,4 µmol/l (zakres 2- 19 µmol/l) przy najwyższej wartości w grupie pacjentów poniżej pierwszego miesiąca życia (BI =6,5 ± 3,8 µmol/l) i najniższej u pacjentów od szóstego do dwunastego miesiąca życia (BI = 2,2 ± 0,4 µmol/l). Wartość BI uzyskane od pacjentów poniżej pierwszego miesiąca życia były istotnie wyższe w porównaniu do wartości uzyskanych u dzieci powyżej 6 miesiąca życia. Najniższe, chociaż nieznamiennie, wartości indeksu lipemii (LI) uzyskano dla dzieci poniżej pierwszego miesiąca życia. Najwyższe średnie wartości HI stwierdzono w próbkach krwi pobranych między godziną 22 a 6 rano (HI= 43,3 ± 51,5mg/dl), a najniższe w próbkach pobranych pomiędzy godziną 8 a 15 (HI=31,8 ± 25,7 mg/dl). Wartości te różniły się istotnie (p<0,0001). Również średnia wartość HI uzyskana dla próbek pobranych pomiędzy godziną 15 a 22 różniła się istotnie od średnich wartości HI dla próbek pobranych pomiędzy godziną 22 a 6 rano (p<0.0001). Nie stwierdzono istotnych różnic w wartościach BI i LI w zależności od czasu pobrania próbek krwi. Najwyższą średnia wartość HI uzyskano dla próbek pobranych z bloku operacyjnego (HI = 99±72,9 mg/dl). Wartości HI uzyskane dla oddziałów były istotnie statystycznie wyższe w porównaniu do HI dla próbek pobieranych w punkcie pobrań (p<0.0001). Wnioski: Indeks hemolizy pozwala w prosty sposób wskazać miejsce i porę dnia, w których częściej uzyskuje się próbki zhemolizowane. Możliwe jest zatem podjęcie odpowiedniego działania mającego na celu minimalizowane niektórych błędów przeanalitycznych, dzięki czemu ulegnie poprawie bezpieczeństwo pacjenta. 48. Ocena przydatności oznaczeń aktywności dehydrogenazy alkoholowej i jej izoenzymów oraz dehydrogenazy aldehydowej w surowicy pacjentów z rakiem trzustki. Wojciech Jelski

1, Magdalena Łaniewska-Dunaj

1, Karolina Orywal

1, Maciej Szmitkowski

1

1 Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska

Metabolizm alkoholu etylowego w trzustce zachodzi na drodze oksydacyjnej i nieoksydacyjnej (z udziałem syntazy estrów etylowych kwasów tłuszczowych). W metabolizmie oksydacyjnym główna role odgrywa dehydrogenaza alkoholowa (ADH) i dehydrogenaza aldehydowa (ALDH). Aktywność tych enzymów stwierdzono także w komórkach raka trzustki, wykazując jednocześnie znacząco wyższą aktywność całkowita ADH oraz izoenzymu klasy III ADH w tkance nowotworowej w porównaniu ze zdrową parenchyma trzustki. W związku z tym można sądzić, iż w przebiegu raka trzustki dochodzi do zmian aktywności ADH w surowicy w wyniku uwalniania tego enzymu z komórek rakowym. Celem pracy była ocena przydatności oznaczeń aktywności dehydrogenazy alkoholowej i dehydrogenazy aldehydowej w surowicy pacjentów z rakiem trzustki. Badania wykonano w surowicy krwi 86 pacjentów z rakiem trzustki (50 mężczyzn, 36 kobiet, 44 - 75 lat). Aktywnośc całkowita ADH oznaczano metodą kolorynmetryczną z p-nitrozo-N-N-dimetyloaniliną (NDMA) jako substratem. Aktywność ADH I i ADH II oznaczano metodą spektrofluorymetryczną z użyciem fluorogennych, specyficznych substratów (4-metoksy-1-naftaldehyd dla ADH I i 6-metoksy-2-naftaldehyd dla ADH II). W wyniku redukcji tych aldehydów powstają alkohole, których fluorescencję mierzono na fluorymetrze RF-5301 (Shimadzu). Aktywność izoenzymów pozostałych klas oznaczano metodami spektrofluorymetrycznymi z substratami - alkoholem kaprylowym (ADH III) i m-nitrobenzaldehydem (ADH IV). Aktywność całkowitą ALDH oznaczano również metodą spektrofluorymetryczną z 6-metoksy-2-naftaldehydem jako substratem (utlenianie). Stwierdzono, iż spośród izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej jedynie aktywność ADH III w surowicy pacjentów z rakiem trzustki jest znacząco wyższa (13,48 mU/l) w porównaniu do grupy

kontrolnej (11,06 mU/l). Badanie aktywności tego izoenzymu w surowicy chorych wykazuje wysoką czułość diagnostyczną (72%) i swoistość diagnostyczną (77%). Czułośc diagnostyczna całkowitej ADH wynosi 59% a swoistość diagnostyczna 66%. Czułość i swoistość diagnostyczna zaróno ADH III jak i całkowitej ADH wzrasta wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania nowotworu. Wartośc predykcyjna wyników dodatnich izoenzymów klasy III i całkowitej ADH wynosi odpowiednio 80% i 71%, natomiast wartość predykcyjna wyników ujemnych 71% i 68%. Moc diagnostyczna oceniana na podstawie pola pod krzywą ROC wynosi dla ADH III 0,663 a dla całkowitej dehydrogenazy alkoholowej-0,602. Otrzymane wyniki sugerują przydatność diagnostyczną oznaczania aktywności zwłaszcza ADH III w surowicy pacjentów z rakiem trzustki. 50. Ocena średnich stężeń i odsetek ponadnormatywnych chloesterolu całkowitego, ldl-cholesterolu, hdl-cholesterolu oraz trójglicerydów w 5-letniej, ogólnopolskiej, prospektywnej obserwacji grupy pacjentów poz leczonych z powodu dyslipidemii. badanie lipidogram 5 lat. Jacek Jóźwiak

1, Eugenia Bielińska-Bujniewicz

1, Beata Boruta

1, Ahmed Manasar

1, Henryka Gwarda

1,

Agata Gaida1, Kinga Myczkowska

1, Ewelina Syrnik

1, Mirosław Mastej

1, Izabella Ślęzak-Prochazka

2,

Andrzej Ślęzak2, Witold Lukas

3

1 Śląskie Laboratoria Analityczne sp. z o.o., Polska,

2 Katedra Zdrowia Publicznego, Wydział

Zarządzania Politechnika Częstochowska, Polska, 3 Katedra Medycyny Rodzinnej, Śląski Uniwersytet

Medyczny, Polska Wprowadzenie. Zaburzenia lipidowe są najbardziej rozpowszechnionym, modyfikowalnym czynnikiem ryzyka-sercowo naczyniowego. Celem badania LIPIDOGRAM 5 LAT była próba ogólnopolskiej oceny skuteczności leczenia dyslipidemii na poziomie Podstawowej Opieki Zdrowotnej (POZ). Materiał i metody. Badanie zostało przeprowadzone przez 675 lekarzy-badaczy w 444 miastach i miejscowościach w Polsce. W 2004 roku do badania włączono 1842 losowo wybranych, aktywnych pacjentów POZ. Kryteria włączenia: (1) wiek > 30 r. ż. (2) korzystanie z dowolnego powodu medycznego z porad placówki POZ (3) pisemna zgoda na udział w 5-letniej obserwacji połączonej z trzykrotnym pobraniem krwi. U wszystkich badanych (62% kobiet i 38% mężczyzn), leczonych z powodu zaburzeń lipidowych wypełniono ankietę badawczą oraz dokonano pomiarów antropometrycznych. Trzykrotnie - w 2004, 2006 i 2010 roku - oceniono w surowicy krwi pobranej na czczo stężenie cholesterolu całkowitego (TC, metoda CHOD-PAP), trójglicerydów (TG, metoda z GPO), HDL-cholesterolu (HDL, metoda bezpośrednia immunologiczna). LDL-cholesterol (LDL) obliczono wg wzoru Friedewalda. Normy laboratoryjne oparto o wytyczne NCEP-ATP III. Badania laboratoryjne wykonano w jednym ogólnopolskim laboratorium centralnym. Za leczoną uznawano osobę, która z powodu izolowanych zaburzeń lipidowych i/lub ChNS, cukrzycy czy ciężkiej hipercholesterolemii, od co najmniej 30 dni stosowała dietę hipolipemiczną i leczenie farmakologiczne preparatami hipolipemicznymi w zwyczajowych dawkach. Za istotność statystyczną przyjęto wartość p < 0,05.Wyniki. Spośród 1842 osób, które rozpoczęły badanie w 2004 roku, obserwację w roku 2010 ukończyło 1190 pacjentów (65%). Średni wiek badanych w 2004 roku wyniósł 53,1 lat. Leczenie farmakologiczne w 2004 roku stosowało 27,8% badanych, zaś w 2010 odpowiednio 48,2%. Leczenie farmakologiczne częściej podejmowali mężczyźni. W 2004 roku średnie stężenie TC wyniosło 231,8 mg/dl i było wyższe wśród kobiet (238,6 mg/dl). Pomiędzy rokiem 2004 a 2010 średnie stężenie TC w populacji leczonych z powodu dyslipidemii zostało zredukowane o 26,1 mg/dl. Odsetek osób ze stężeniami TC > 200 mg/dl zredukowano z 71,5% do 50,8%. Średnie stężenie LDL w 2004 roku wyniosło 135,6 mg/dl i było wyższe wśród kobiet (140,3 mg/dl). Średnie stężenie LDL zredukowano o 14,7 mg/dl. Odsetek osób ze stężeniami LDL > 130 mg/dl został zredukowany z 51,5% do 36,1%. Średnie stężenie HDL w 2004 roku wyniosło 65,4 mg/dl i było wyższe wśród kobiet (69,8 mg/dl). Średnie stężenie HDL zmniejszyło się o 8,7 mg/dl. Odsetek osób ze stężeniami HDL < 40 mg/dl w 2004 roku wyniósł 2,5% i wzrósł w kolejnych latach badania 2006 i 2010 odpowiednio do wartości 6,0% oraz 6,7%. Średnie stężenie TG w 2004 roku wyniosło 153,6 mg/dl i było wyższe wśród mężczyzn (170,6 mg/dl). Średnie stężenie TG zostało zredukowane o 12,8 mg/dl. Pomiędzy rokiem 2004 a 2010, w całej populacji leczonych z powodu dyslipidemii odsetek osób ze stężeniami TG > 150 mg/dl uległ redukcji z 43,3% do 36,1%. Wnioski. Brak skuteczności redukcji parametrów lipidogramu wśród około 50% aktywnych pacjentów POZ z ponadnormatywnymi stężeniami cholesterolu całkowitego oraz u co trzeciej osoby z podwyższonymi stężeniami LDL-cholesterolu i trójglicerydów, obserwowany nawet w przypadku wzostu preskrypcji leków hipolipemicznych (statyn), zastosowanych działań edukacyjnych oraz powtarzalnych pomiarów lipidogramu krwi, nasuwa wniosek o konieczności

intensyfikacji leczenia dyslipidemii w Polsce. Niekorzystne zmiany parametru HDL, w świetle przedstawionych wyników, powinny stać się przedmiotem dalszych badań.

51. Aktywność dehydrogenazy alkoholowej (ADH) i jej izoenzymów oraz dehydrogenazy aldehydowej (ALDH) w komórkach guza mózgu. Magdalena Łaniewska-Dunaj

1, Wojciech Jelski

1, Karolina Orywal

1, Robert Rutkowski

2, Jan

Kochanowicz2, Maciej Szmitkowski

1

1 Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2 Klinika

Neurochirurgii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska Liczne doniesienia naukowe mówią o nadmiernym spożywaniu alkoholu jako jednym z czynników ryzyka rozwoju nowotworów mózgu. Mechanizm karcinogenezy guzów mózgu może być związany ze zmianami metabolicznymi w wyniku działania produktów metabolizmu etanolu m.in. aldehydu octowego. W mózgu stwierdzono obecność izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej (ADH) i dehydrogenazy aldehydowej (ALDH). ADH bierze udział w metabolizmie etanolu oraz przemianach szeregu ważnych substancji biologicznych takich jak: retinol, serotonina. ALDH odgrywa kluczową rolę w utlenianiu aldehydu octowego powstałego w wyniku oksydacji alkoholu etylowego. Celem pracy było porównanie aktywności ADH i jej czterech klas izoenzymów (I, II, III, IV) oraz aktywności ALDH w komórkach nowotworowych i niezmienionej tkance mózgu. Do badań wykorzystano wycinki tkanki nowotworowej guzów mózgu (glejaki, oponiaki) i histologicznie niezmienionej tkanki mózgu pobranej od 60 pacjentów (36 mężczyzn i 24 kobiet, 35-72 lata) podczas resekcji guzów mózgu. Aktywność całkowitą ADH oznaczano kolorymetrycznie z p-nitrozo-N-N-dimetyloaniliną jako substratem. Aktywność ADH I i ADH II oznaczano metodą spektrofluorymetryczną z uzyciem fluorogennych, specyficznych substratów (4-metoksy-1-naftaldehyd dla ADH I i 6-metoksy-2-naftaldehyd dla ADH II). Aktywność izoenzymów pozostałych klas ADH oznaczano metodami spektrofotometrycznymi z alkoholem kaprylowym (ADH III) i m-nitrobenzaldehydem (ADH IV) jako substratami. Aktywność całkowitą ALDH oznaczano spektrofluorymetrycznie z 6-metoksy-2-naftaldehydem jako substratem. W komórkach nowotworowych guzów mózgu wykazano aktywność zarówno dehydrogenazy alkoholowej jak i dehydrogenazy aldehydowej, przy czym aktywność ADH jest dużo wyższa w stosunku do ALDH. Aktywność całkowita ADH była znacząco wyższa w tkance nowotworowej niż w zdrowej tkance (2,593 nmol/min/mg białka vs 1,746 nmol/min/mg białka). Spośród izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej tylko aktywność ADH I była istotnie statystycznie wyższa w komórkach rakowych (0,445 nmol/min/mg białka vs 0,356 nmol/min/mg białka).Pozostałe izoenzymy ADH oraz ALDH nie wykazywały znaczących różnic aktywności pomiędzy tkanką nowotworową i zdrową. Nie stwierdzono istotnych statystycznie róznic aktywności badanych enzymów i izoenzymów pomiędzy tkanką nowotworową glejaków i oponiaków. Różnice aktywności całkowitej ADH i izoenzymów klasy I między komórkami nowotworowymi a zdrową tkanką mózgu mogą być czynnikiem zwiększającym poziom aldehydu octowego, który nasila proces karcinogenezy. 52. Analiza laboratoryjna białkomoczu jako markera zapalnego bakteryjnego uszkodzenia nerek w modelu doświadczalnym. Beata Skowron

1, Agnieszka Baranowska

1, Kajetan Juszczak

1, Magdalena Strus

2, Grażyna Więcek

2,

Piotr Heczko2, Piotr Thor

1

1 Katedra Patofizjologii UJ CM, Polska,

2 Katedra Mikrobiologii UJ CM, Polska

Wstęp. Odmiedniczkowe zapalenie nerek (OZN) jest zakażeniem obejmującym górny odcinek układu moczowego, najczęściej rozwijającym się w konsekwencji zakażenia wstępującego z dolnego odcinka dróg moczowych. Należy ono do jednej z zasadniczych przyczyn chorób cewkowo - śródmiąższowych nerek. Czynnikiem etiologicznym odpowiadającym za większość pozaszpitalnych przypadków OZN jest bakteria kolonizująca przewód pokarmowy – pałeczka okrężnicy. Cel pracy. Celem pracy była analiza laboratoryjna białkomoczu jako markera zapalnego, bakteryjnego uszkodzenia nerek w doświadczalnym modelu wstępującego OZN wywołanego pałeczką okrężnicy Materiał i metody. W badaniu wykorzystano samice szczurów rasy Wistar (n=10), którym indukowano OZN przez dopęcherzowe (przezcewkowe) podanie zawiesiny bakterii pałeczki

okrężnicy. Szczep bakterii – pałeczki okrężnicy, scharakteryzowany jako szczep o wysokiej wirulencji, został wyizolowany od pacjentki z ostrym odmiedniczkowym zapaleniem nerek. Zwierzęta podzielono w następujący sposób: Grupa 1 – OZN wywołano podaniem zawiesiny bakterii w dawce 10

5 c.f.u./ml.

Grupa 2 – OZN wywołano podaniem zawiesiny bakterii w dawce 107 c.f.u./ml.

Grupę kontrolną - stanowiły wyniki uzyskane z „zerowego” dnia doświadczenia (mocz i krew zgromadzono przed podaniem zawiesiny bakterii zwierzętom obu grup). W 0,7,14 i 21 dniu eksperymentu zwierzętom pobierano krew i mocz do analizy. Charakterystyka białek moczu polegała na ocenie ilości wydalanego białka z moczem w dobowej zbiórce moczu (DZM), rozdziale elektroforetycznym białek moczu i analizie densytometrycznej, oraz określeniu zależności pomiędzy selektywnością białek moczu a stężaniem kwasu moczowego w surowicy. Analiza laboratoryjna próbek moczu i surowicy, wykonana została na analizatorze biochemicznym Olympus AU 600. Charakterystyka białek moczu odbyła się w oparciu o elektroforezę moczu SDS Page i densytometryczną analizę skanów żeli poliakrylamidowych programem DensyGraf. Wyniki. W obu grupach w 21 dniu doświadczenia ilość białka wydalanego z moczem wzrastała proporcjonalnie do stopnia zakażenia i wynosiła odpowiednio (mg/l); grupa 1 - 177±83,02, grupa 2 - 215±34,16; a w kontroli 79,38±31,22 p<0.05. W przeliczeniu na dobową zbiórkę moczu wzrost wydalania białka z moczem (mg/24h) w 21 dniu doświadczenia w grupie 1 wynosił 2,91±0,91 w odniesieniu do grupy kontrolnej 1,41±0,76 p<0.05. W 21 dniu doświadczenia wzrosło również dobowe wydalanie białka z moczem w grupie 2, pozostając na poziomie 2,37±0,85, co wskazuje na tendencję do uzyskania znamienności statystycznej i konieczność wykonania badań na większej grupie zwierząt. W rozdziale elektroforetycznym białek moczu stwierdzono różną ich selektywność, szczególnie w 14 dniu doświadczenia. W grupie 1 rozdział elektroforetyczny był prawidłowy na wszystkich etapach doświadczenia. W grupie 2 u połowy zwierząt wystąpił białkomocz selektywny i u połowy nieselektywny. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w gęstości białka w moczu. Nie wykazano również zależności między selektywnością białek moczu a stężeniem kwasu moczowego we krwi (uznanego markera uszkodzenia nerek). Wnioski. OZN wywołane przezcewkowym podaniem bakterii pałeczki okrężnicy uszkadza cewki moczowe oraz część śródmiąższową nerek, powodując zwiększone wydalania białka z moczem. W badanym modelu stwierdzono prostą zależność między dawką czynnika etiologicznego a selektywnością białek moczu. Niższa dawka bakterii powoduje wystąpienie białkomoczu zapalnego/cewkowego, natomiast wyższa jest przyczyną wystąpienia białkomoczu nieselektywnego, świadczącego o objęciu procesem zapalnym także kłębuszków nerkowych. Wyniki te są spójne z histologicznym obrazem preparatów wykonanych z nerek, pozyskanych w 21 dniu doświadczenia. 53. Ocena równowagi oksydacyjno-antyoksydacyjnej u dzieci z cukrzycą typu 1 i celiakią - badanie pilotażowe. Grażyna Rowicka

1, Ewa Pańkowska

2, Magdalena Chełchowska

3, Jadwiga Ambroszkiewicz

3, Halina

Weker1

1 Zakład Żywienia, Instytut Matki i Dziecka, Polska,

2 Zakład Diabetologii, Instytut Matki i Dziecka,

Polska, 3 Zakład Badań Przesiewowych, Instytut Matki i Dziecka, Polska

Cukrzyca typu 1 to choroba o znaczeniu społecznym między innymi z uwagi na stały wzrost zachorowalności oraz obniżenie wieku jej rozpoznawania. U dzieci z cukrzycą stwierdza się częstsze występowanie innych chorób o autoimmunologicznym uwarunkowaniu między innymi 4-5 krotnie częstsze występowanie celiakii. Obie choroby stwarzają ryzyko rozwoju powikłań narządowych doprowadzających do niepełnosprawności i wykluczenia z życia społecznego.Za rozwój powikłań związanych z tymi chorobami odpowiedzialne są między innymi uszkodzenia wolnorodnikowe. Zgodnie z aktualnym stanem wiedzy brak jest badań dotyczących oceny równowagi oksydacyjno-antyoksydacyjnej u dzieci u których cukrzyca i celiakia współistnieją. Cel badań: ocena nasilenia procesów oksydacyjnych i obrony przeciwutleniającej u dzieci przy współwystępowaniu celiakii i cukrzycy. Metodyka i materiał: Badaniami objętych zostało 27 dzieci w wieku od 6 do 17 roku życia. Grupę I stanowiły dzieci z rozpoznaną cukrzycą typu 1 (T1DM) i celiakią (CD) (n=13), grupę II- dzieci z cukrzycą typu 1- T1DM ( n= 14). Kryteria włączenia do badań: - wyrównana biochemicznie cukrzyca (stężenie hemoglobiny glikowanej - HbA1cw zakresie 4,0 do 5,8%

- prawidłowo leczona celiakia (brak przeciwciała przeciwko transglutaminazie tkankowej i/ lub przeciwciał przeciwko endomyzjum mięśni gładkich) U wszystkich zakwalifikowanych do badań dzieci oznaczono: - stężenie TOC (Total Oxidant Capacity) wyrażające całkowity potencjał oksydacyjny surowicy krwi oraz stężenie TAC (Total Antioxidant Capacity) wyrażające całkowitą aktywność przeciwutleniającą surowicy krwi. Oznaczenia przeprowadzono metodą immunoenzymatyczną ELISA przy wykorzystaniu gotowych zestawów (Immunodiagnostik AG, Niemcy). Wyniki: Średnia wieku dzieci z obu grup nie różniła się istotnie ( średnia wieku dzieci z cukrzycą i celiakią wynosiła 11,4 ± 3 lat, dzieci cukrzycą 12,7 ± 3 lat ). Średni czas leczenia z powodu cukrzycy dzieci z grupy I wynosił 7,4 ± 3,9 lat, natomiast dzieci z grupy II – 7,8 ± 3,6 lat i nie wykazywał istotnych różnic. Średni czas leczenia dzieci z powodu celiakii wynosił 6,1 ± 3,1 lat. Stężenie TOC w grupie dzieci z T1DM i CD wynosiło 0,2 ±0,09 mmol/l, natomiast w grupie dzieci T1DM – 0,17 ± 0,07 mmol/l, p=0,29 Średnie stężenie TAC w grupie dzieci T1DM i CD oraz T1DM wynosiło odpowiednio 1,69 ± 0,49 mmol/l i 1,78 ± 0,51 mmol/l, p =0,62. Obserwowane u obu grup dzieci wartości TOC i TAC mieściły się w zakresie wartości referencyjnych dla wieku. Wnioski: Prawidłowe leczenie zarówno cukrzycy jak i celiakii może być jednym z czynników mających wpływ na utrzymanie równowagi oksydacyjno- antyoksydacyjnej we krwi u dzieci z tymi chorobami. 55. Badania szlaków sygnalizacyjnych w komórce metodą cytometrii przepływowej. Dorota Bryk

1, Wioletta Olejarz

1, Danuta Zapolska-Downar

1, Dariusz Sitkiewicz

1

1 Katedra Biochemii i Chemii Klinicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Polska

Wstęp i cel pracy. Wewnątrzkomórkowe drogi sygnalizacyjne odpowiedzialne są za odpowiedź komórki na bodziec zewnętrzny. Do najlepiej poznanych i najczęściej badanych należą te, w których pośredniczą MAPK (mitogen activated protein kinases). Kinazy MAP do których zaliczmy ERK1/2 (extracellular signaling-regulated kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase) i p 38 MAPK regulują aktywność wielu białek, enzymów i czynników transkrypcyjnych, w tym NF-κB (Nuclear Factor-κB). Zarówno kinazy MAPK jak i NF-κB odgrywają istotną rolę między innymi w patogenezie zapalenia i miażdżycy. Najczęściej stosowaną metodą służącą do oceny aktywacji tych białek sygnalnych jest Western Blot. Metoda ta jest jednak bardzo pracochłonna i wymaga dużej ilości komórek, co podraża jej koszty. Ponadto może być zastosowana jedynie do badania jednorodnej populacji komórek. Celem niniejszej pracy była ocena stopnia aktywacji tych białek sygnalnych metodą cytometrii przepływowej. Metodyka badań. Badania wykonane były na komórkach pochodzących z ludzkiej aorty, które podawane były działaniu TNFα lub kwasów tłuszczowych trans. Następnie komórki odklejono i utrwalano Phofpho Fix Buffer I. Po przepłukaniu komórki poddawano permabilizacji (Phospho Perm Buffer III). Tak przygotowane komórki inkubowano z przeciwciałami przeciwko ufosforylowanej postaci badanych białek (aktywne formy). Po zakończeniu inkubacji komórki analizowano przy pomocy cytometru przepływowego FACS Calibur przy użyciu programu komuterowego CellQuest. Miarą stopnia fosforylacji badanych białek sygnalnych było średnie natężenie fluorescencji (ŚNF). Wyniki. Inkubacja komórek śródbłonka z TNFα prowadzi do szybkiej aktywacji kinaz MAP. W przypadku ERK1/2 zaobserwowano największy wzrost ŚNF w 20 min. z 248 ± 44 do 446 ±21. Podobnie w przypadku JNK stwierdzono największy wzrost ŚNF po 20 min. (z 318 ± 40 do 460 ±36). Natomiast pik aktywności dla p 38 MAPK ( z 77 ±8 do 247 ±21 ŚNF) stwierdzono już w 10 min. Najbardziej optymalne warunki aktywacji NF-κB p65 zaobserwowano w 45 min inkubacji z TNFα i był to wzrost z 78 ± 14 do 123 ±15 ŚNF. Metoda ta została również wykorzystana do oceny wpływu kwasu elaidynowego (EA) i linoelaidynowego (LA) na stopień aktywacji NF-κB p 65. Stwierdzono, że 45 min inkubacja komórek śródbłonka z EA związana była ze wzrostem z 64 ± 6 do 103 ± 14 ŚNF. Inkubacja z LA powodowała wzrost z 64 ± 6 do 118 ± 10 ŚNF. Wnioski. Zastosowana metoda jest prosta w wykonaniu i daje powtarzalne wyniki. W porównaniu do Western Blot może być wykonane na dużo mniejszej liczbie komórek. 56. Nowoczesny algorytm immunodiagnostyki ostrych białaczek z zastosowaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej – rola probówki skriningowej ALOT. Alicja Sonsala

1, Joanna Bulsa

1, Magdalena Twardoch

1, Iwona Malinowska

2, Urszula Małek

3, Joanna

Trelińska4, Ewa Niedzielska

5, Katarzyna Derwich

6, Wanda Badowska

7, Maciej Niedźwiecki

8, Grażyna

Sobol9, Katarzyna Muszyńska-Rosłan

10, Mariusz Wysocki

11, Grażyna Karolczyk

12, Maria Wieczorek

13,

Tomasz Urasiński14

, Jerzy R Kowalczyk15

, Bogdan Mazur16

, Tomasz Szczepański1, Łukasz Sędek

1

1 1. Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu

Medycznego w Katowicach, Polska, 2 2. Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii

Warszawskiego UM, Polska, 3 3. Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej UM w Lublinie, Polska

4 4. Klinika Pediatrii, Onkologii, Hematologii i Diabetologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Polska,

5

5. Klinika Transplantacji Szpiku, Hematologii i Onkologii Dzieci AM, Wrocław, Polska, 6 6. Klinika

Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej UM w Poznaniu, Polska, 7 7. Oddział

Pediatryczny i Hematologiczno-Onkologiczny Wojewódzkiego Specjalistycznego Szpitala, Dziecięcego w Olsztynie, Polska,

8 8. Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii UM w

Gdańsku, Polska, 9 9. Oddział Onkologii, Hematologii i Chemioterapii Kliniki Pediatrii Śląskiego UM,

Katowice, Polska, 10

10. Klinika Onkologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku, Polska,

11 11. Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz,

Polska, 12

12. Oddział Hematologiczno-Onkologiczny Wojewódzkiego Specjalistycznego Szpitala Dziecięcego w Kielcach, Polska,

13 13. Oddział Hematologii i Onkologii Chorzowskiego Centrum

Pediatrii i Onkologii, Polska, 14

14. Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej Pomorskiego UM w Szczecinie, Polska,

15 3. Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej UM w Lublinie, Polska,

16 15.

Katedra Mikrobiologii i Immunologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Polska Wprowadzenie: Kilkuletnie prace konsorcjum Euroflow zrzeszającego grupę ośrodków hematologicznych w Europie doprowadziły do powstania wystandaryzowanego algorytmu immunodiagnostyki ostrych białaczek z zastosowaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej. Pierwszy etap diagnostyki stanowi ośmiokolorowy panel przesiewowy obejmującego kombinację przeciwciał cyCD3, sCD3, CD7, CD19, CD34, CD45, cyCD79a i cyMPO (ALOT- Acute Leukemia Orientation Tube), który umożliwia wstępną identyfikację i scharakteryzowanie populacji blastycznej – tj. ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów B (BCP- ALL) vs. ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów T (T- ALL) vs. ostra białaczka szpikowa (AML). Drugi etap stanowi rozszerzenie rozpoczętej analizy z zastosowaniem szerokiego panelu przeciwciał charakteryzujących poszczególne podtypy białaczek. Cel pracy: Celem pracy była ocena przydatności protokołu ALOT do klasyfikacji ostrych białaczek oraz w jakim stopniu ALOT pozwala na odróżnienie rozrostu białaczkowego od prawidłowego szpiku kostnego. Metody: Próbki szpiku kostnego (n=1000), krwi obwodowej (n=27) oraz płynu z opłucnej (n=3) pochodzące od 1030 pacjentów z podejrzeniem choroby rozrostowej, leczonych w ośrodkach Polskiej Pediatrycznej Grupy ds. Leczenia Białaczek i Chłoniaków, poddano analizie z wykorzystaniem panelu ALOT. Wyniki: Probówka ALOT umożliwiła prawidłową klasyfikację choroby u 993 spośród 1030 pacjentów (96,4%). Stwierdzono 722 przypadki BCP-ALL, 80 przypadków T- ALL i 118 przypadków AML. U 73 pacjentów ALOT potwierdził prawidłowy obrazy szpiku kostnego. U 36 pacjentów udało się wyróżnić nieprawidłową populacje komórek, lecz jej pełna identyfikacja była możliwa po zastosowaniu dodatkowych badań diagnostycznych. W grupie tej postawiono następujące rozpoznania: ostre białaczki biliniowa lub bifenotypowa (n=10), chłoniak Burkitta (n=13), nieziarniczy chłoniak złośliwy (n=5), rhabdomyosarcoma (n=2), neuroblastoma (n=1) oraz zespół mielodysplastyczny (n=5). Wnioski: Zastosowanie protokołu ALOT w diagnostyce ostrych białaczek umożliwia u większości pacjentów rozpoznanie i odpowiednią klasyfikację typu białaczki, ponadto ułatwia proces diagnostyki rzadszych rozrostów hematologicznych. 57. Zastosowanie alergenowo swoistych przeciwciał ige dla alergenów rekombinowanych w diagnostyce alergii zawodowej. Ewa Nowakowska-Świrta

1, Marta Wiszniewska

2, Cezary Pałczyński

1, Jolanta Walusiak-Skorupa

2

1 Klinika Alergologii i Zdrowia Środowiskowego, Instytut Medycyny Pracy im.prof. J Nofera, Łódź,

Polska, 2 Klinika Chorób Zawodowych i Toksykologii, Instytut Medycyny Pracy im.prof. J Nofera, Łódź,

Polska Rutynowa diagnostyka laboratoryjna u osób uczulonych na białka lateksu ogranicza się do wykonania punktowych testów skórnych oraz do oznaczania swoistych przeciwciał IgE zależnych w surowicy pacjenta. Zaletą punktowych testów skórnych jest ich łatwość wykonywania, szybkość oraz niski koszt, jednak ze względu na niebezpieczeństwo wystąpienia reakcji anafilaktycznej podczas tego badania, coraz częściej w diagnostyce wykorzystuje się oznaczanie alergenowo swoistych przeciwciał (asIgE) w surowicy. Wzbogacanie testów diagnostycznych o rekombinowane antygeny podnosi ich

wartość diagnostyczną, zwiększa czułość testów, pozwala na dokładniejsze określenie czynnika uczulającego. Celem pracy była ocena przydatności oznaczanie antygenowo swoistych przeciwciał IgE w surowicy dla rekombinowanych białek lateksu w diagnostyce alergii zawodowej. Materiał i metody: Badaniem objęto 107 pracowników ochrony zdrowia z podejrzeniem zawodowej alergii na lateks oraz 17 osób nienarażonych na alergeny lateksu w miejscu pracy z pozytywnymi wynikami asIgE dla lateksu. U badanych przeprowadzono diagnostykę alergologiczną oraz oznaczono poziom swoistych przeciwciał IgE w surowicy metodą FEIA dla poszczególnych białek lateksu. Wyniki: U 44(41%) pacjentów z grupy badanej wykazano obecność asIgE w surowicy krwi dla alergenu lateksu, w tym u 18(40%) osób poziom swoistych przeciwciał dla lateksu mieścił się w kl.2, u 13(29%) w kl.3, u 11(25%) w kl.1, u 1(2%) w kl.4 i 5. W grupie kontrolnej wykazano obecność asIgE dla lateksu u 12(70%) osób w kl. 2, u 4(24%) w kl. 1 oraz u 1(5%) w kl. 3. W grupie badanej z pozytywnymi wynikami asIgE dla lateksu najczęściej stwierdzano asIgE dla rekombinowanego białka lateksu rHev b 6.01(N=20). Ponadto wykryto asIgE dla rHev b 6.02(N=18), rHev b 5(N=15), rHev b 8(N=6), rHev b 11(N=5), rHev b 3(N=3), rHev b 1(N=2) i rHev b 9(N=1). W grupie kontrolnej najczęściej obserwowano obecność asIgE w surowicy dla rHev b 8(N=7), rHev b 3(N=3), rHev b 6.01(N=1). W grupie badanej u 25(24%) osób stwierdzono dodatnie wyniki punktowych testów skórnych z lateksem, w grupie kontrolnej u 4(24%) osób. Wnioski: Obecność asIgE dla lateksu jest stwierdzana zarówno u osób zawodowo narażonych na lateks, jak i u osób nienarażonych zawodowo. Pracownicy służby zdrowia uczuleni są na różne białka lateksu. Spośród wszystkich oznaczanych alergenowo swoistych przeciwciał IgE dla białek lateksu największe znaczenie dla pracowników służby zdrowia ma oznaczanie przeciwciał dla rHev b 6.01, rHev b 6.02 i rHev b 5. W diagnostyce alergii na lateks istnieje zapotrzebowanie na testy in vitro o większej swoistości, gdyż nie u każdego pacjenta można przeprowadzić test swoistej prowokacji z lateksem. 58. Przydatność oznaczeń VEGF-A i jego rozpuszczalnych receptorów SVEGF-R1 i SVEGF-R2 w pooperacyjnym monitorowaniu chorych na raka jelita grubego Anna Uttecht - Pudełko

1, Robert Partyka

1, Danuta Kokocińska

1

1 Śląski Uniwersytet Medyczny, Polska

WSTĘP. Rak jelita grubego jest jednym z najczęściej występujący nowotworów złośliwych. Pomimo, że w ostatnich latach osiągnięto znaczący postęp w leczeniu chorych na ten nowotwór, odsetek trwałych wyleczeń jest wciąż niezadowalający. Duże znaczenie wiąże się więc z dalszym rozwojem metod diagnozowania chorych, które pozwolą na wczesne wykrycie wznowy procesu nowotworowego oraz doskonaleniem metod leczenia, które wydłużą czas życia pacjentów. Uwagę badaczy zwraca proces angiogenezy, pełniący kluczową rolę w progresji choroby nowotworowej i tworzeniu przerzutów odległych. Jednym z najważniejszych czynników stymulujących rozwój naczyń krwionośnych jest czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF-A, natomiast do czynników hamujących angiogenezę należą min. jego rozpuszczalne receptory (sVEGFR-1 i sVEGFR-2). CEL PRACY. Celem pracy była ocena pooperacyjnych stężeń VEGF-A i jego rozpuszczalnych receptorów w surowicy krwi chorych na raka jelita grubego oraz ocena udziału badanych parametrów w progresji choroby nowotworowej i kwalifikacji chorych do terapii antyangiogennej. PACJENCI I METODYKA OZNACZEŃ. Badania przeprowadzono w surowicy krwi 62 chorych operowanych z powodu raka jelita grubego w stopniu zaawansowania B i C wg Dukes’a oraz 20 zdrowych ochotników stanowiących grupę kontrolną. W trakcie pooperacyjnej obserwacji chorych podzielono na dwie grupy: I bez wznowy i II ze wznową procesu nowotworowego. W próbkach wykonano oznaczenia stężeń VEGF-A, sVEGF-R1 i sVEGF-R2 techniką ELISA oraz wyznaczono ilorazy stężeń sVEGF-R1:VEGF-A (RATIO 1), sVEGF-R2:VEGF-A (RATIO 2) i sVEGF-R1+sVEGF-R2:VEGF-A (RATIO 1+2). Otrzymane wyniki opracowano statystycznie. WYNIKI. W grupie badanej zaobserwowano istotnie wyższe stężenia VEGF-A oraz niższe stężenia sVEGF-R1 i wartości wyznaczonych ilorazów RATIO 1, RATIO 2 i RATIO 1+2 w porównaniu do grupy kontrolnej. Podobnie u chorych ze wznową raka, w porównaniu do grupy chorych bez progresji choroby, stwierdzono znamiennie wyższe średnie stężenia VEGF-A i niższe stężenia sVEGF-R1 oraz ilorazów RATIO 1, RATIO 2 i RATIO 1+2. Ponadto stwierdzono przydatność oznaczeń VEGF-A i wyznaczania ilorazu sVEGF-R1 do VEGF-A (RATIO 1) w wykrywaniu wznowy procesu nowotworowego u chorych na raka jelita grubego, u których ryzyko progresji choroby zwiększa się

wraz ze wzrostem stężenia VEGF-A i spadkiem wartości ilorazu stężeń sVEGF-R1 i VEGF-A (RATIO 1), sVEGF-R2 i VEGF-A (RATIO 2) oraz sVEGF-R1+sVEGF-R2 i VEGF-A (RATIO 1+2) WNIOSKI. 1. U chorych na raka jelita grubego wartość diagnostyczną wykazuje oznaczenie stężenia VEGF-A oraz ilorazu stężeń rozpuszczalnego receptora 1 i VEGF-A. 2. VEGF-A i jego rozpuszczalny receptor 1 są istotnymi czynnikami prognostycznymi, które mogą być przydatne przy kwalifikacji chorych do terapii antyangiogennej. 60. Wpływ III uniwersalnej definicji zawału mięśnia sercowego na zachowania diagnostyczne klinicystów szpitala wojewódzkiego w Poznaniu. Włodzimierz Pawłowski

1, Iwona Radko

1, Ewa Wysocka

2

1 Zakład Diagnostki Laboratoryjnej i Mikrobiologicznej, Szpital Wojewódzki w Poznaniu, Polska

2 Zakład Biochemii Klinicznej i Medycyny Laboratoryjnej Katedry Chemii i Biochemii Klinicznej,

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Polska Wprowadzenie: Opublikowanie III Uniwersalnej Definicji Zawału Mięśnia Sercowego (UDIII) w sierpniu 2012 roku, stworzyło możliwość istotnej zmiany postępowania klinicystów w zakresie diagnostyki laboratoryjnej u pacjentów z podejrzeniem/rozpoznaniem tej choroby. W szczególności – co założyliśmy w hipotezie wyjściowej – mogło to dotyczyć liczby zleceń w kierunku stężenia sercowej troponiny we krwi. Materiał i metody: Przeanalizowano wszystkie kolejne przypadki pacjentów przyjmowanych przez SOR Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu z ostatecznym rozpoznaniem zawału mięśnia sercowego (MI), w okresie kwiecień-maj 2012, przed sformułowaniem UD-III (Pre-UDIII) - 115 pacjentów oraz listopad–grudzień 2012, po sformułowaniu UDIII (Post-UDIII) - 112 pacjentów. Z populacji badanej wyłączono pacjentów hospitalizowanych poniżej 4 dób, np. z powodu zgonu lub przekazania do innego ośrodka. Stężenia sercowej troponiny I (cTnI) oraz izoenzymu MB kinazy kreatynowej (CKMB) we krwi oceniano przy użyciu odczynników i analizatora firmy Johnson-Johnson (Vitros 5600). Analizie poddano ilość zleceń na cTnI i CKMB w grupie Pre-UDIII: n=83, 36 kobiet i 47 mężczyzn, w wieku: 37-95 lat, mediana 71 i zakres międzykwartylowy (IQ) 62-81, oraz w grupie Post-UDIII: n=73, 31 kobiet i 42 mężczyzn, w wieku od 41 do 89, mediana 71 i IQ 61-78. Liczba pacjentów MI z uniesieniem odcinka ST (STEMI) i bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI) wynosiła odpowiednio dla Pre-UDIII 30 i 53, dla Post-UDIII 19 i 54. Do analizy statystycznej wykorzystano program Statistica 10.0. Wyniki: 1. W obydwu okresach mediana i IQ liczby zleceń cTnI wynosiły 3 i 2-4. Rozkład ilości pacjentów z jednym zleceniem (1z), dwoma zleceniami (2z), trzema zleceniami (3z) itd., wynosił: Pre-UDIII: 1z: 6 (7,2%), 2z: 27 (32,5%), 3z: 24 (29,0%), 4z: 12 (14,5%), 5z: 7 (8,4%), >5z: 7 (8,4%), Post-UDIII:1z: 1(1,4%), 2z: 27 (37,0%), 3z: 21 (28,8%), 4z: 15 (20,6%), 5z: 3 (4,1%), >5z: 6 (8,1%); nie wykazano istotnej statystycznie różnicy dla ilości pacjentów ze zleceniami: 2z, 3z i 4z, tj. najbardziej typowymi w codziennej praktyce klinicznej, pomiędzy analizowanymi okresami. 2. Mediana i IQ ilości zleceń cTnI dla rozpoznania NSTEMI/STEMI wynosiły dla Pre-UDIII: 3 i 2-4/2,5 i 2-4, dla Post-UDIII 3 i 2-4/3 i 2-3. Wykazano dodatnią korelację między liczbą zleceń a czasem hospitalizacji u pacjentów STEMI w grupie Pre-UDIII (R=0,43; p=0,018) oraz u pacjentów NSTEMI w grupie Post-UDIII (R=0,41; p=0,002). 3. Jednokrotne oznaczenia CKMB zaobserwowano w badanych grupach: Pre-UDIII - 5 (6,0%) pacjentów, w tym 4 (7,5%) NSTEMI i 1 (3,3%) STEMI oraz Post-UDIII: 2 (2,7%) – obu pacjentów NSTEMI (3,7%). Wnioski: Wprowadzenie kolejnej definicji zawału mięśnia sercowego nie zmieniło postępowania diagnostycznego w zakresie medycyny laboratoryjnej, z wyjątkiem rezygnacji z jednokrotnego zlecania stężenia sercowej troponiny oraz (nieznamiennego statystycznie) zmniejszenia liczby oznaczeń stężenia CKMB. Ewentualny związek pomiędzy ilością zleceń troponiny a okresem hospitalizacji wymaga obserwacji liczniejszej grupy pacjentów.

61. Udział śródbłonka naczyniowego w powstawaniu przerzutów u chorych na raka piersi. Anna Thielemann

1, Zygmunt Kopczyński

1

1 Uniwersytet Medyczny im.Karola Marcinkowskiego, Polska

Wstęp: Powstawanie przerzutów nowotworowych u chorych na raka piersi jest procesem złożonym i wieloetapowym. Uważa się, że zdolność do przerzutowania zależy od stanu czynnościowego śródbłonka naczyniowego, na który ma wpływ wiele mechanizmów komórkowych i pozakomórkowych. Śródbłonek naczyniowy stanowi nie tylko półprzepuszczalną barierę oddzielającą światło naczynia od płynu pozakomórkowego, ale pełni też funkcję gruczołu wydzielania wewnętrznego i zewnętrznego. Stężenia substancji, wydzielanych przez endotelium, mogą być cennym wskaźnikiem jego dysfunkcji inicjującej proces przerzutowania. Cel badań: Celem badań było określenie stężenia wskaźników związanych z funkcjonowaniem endotelium u kobiet chorych na raka piersi: VEGF i jego swoistych białek receptorowych: VEGFR-1 i VEGFR-2, cząstek adhezyjnych śródbłonka naczyniowego: ICAM-1 (cząsteczki adhezji międzykomórkowej) i VCAM-1 (cząstki adhezji komórkowej naczyń), białek układu aktywacji plazminogenu : aktywatora plazminogenu typu urokinazowego (uPA) i tkankowego (tPA) w surowicy kobiet chorych na raka piersi oraz receptorów dla urokinazy (uPAR) i inhibitorów PAI-1 i PAI-2. Oznaczanie stężeń tych substancji odzwierciedlających stan czynnościowy śródbłonka, może ułatwić wyjaśnienie mechanizmu powstawania przerzutów u chorych na raka gruczołu piersiowego. Metodyka badań: Stężenia badanych czynników VEGF, sVEGFR-1 i sVEGFR-2, sVCAM-1 i sICAM-1 oraz uPA i tPA , receptorów uPAR i inhibitorów PAI-1 i PAI-2 oznaczano we krwi kobiet chorych na raka piersi w wieku 29 - 89 lat (średnia wieku 56 lat) przed zabiegiem chirurgicznym, leczonych w Katedrze i Klinice Onkologii UM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Grupę kontrolną stanowiły surowice 40 kobiet zdrowych w wieku 24-75 lat (średnia wieku 47 lat). Stężenie VEGF, sVEGFR-1 i sVEGFR-2, sVCAM-1 i sICAM-1 oraz tPA i uPAR, PAI-1 oceniano metodą immunoenzymatyczną ELISA w oparciu o testy firmy R&D. Aktywność uPA oznaczano metodą ELISA firmy CHEMICON. Badania laboratoryjne wykonano w Katedrze i Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej UM w Poznaniu. Wyniki badań: W badaniach otrzymano istotnie wyższe stężenia VEGF, rozpuszczalnych form receptorów sVEGFR-1 i sVEGFR-2, cząsteczek adhezyjnych sVCAM-1 i sICAM-1oraz uPA, tPA i uPAR u kobiet chorych na raka piersi w porównaniu do wartości w grupie kontrolnej. Im wyższy był stopień zaawansowania klinicznego choroby tym wyższy uzyskano poziom cytokiny VEGF, receptorów sVEGFR-1 i sVEGFR-2, cząsteczek sVCAM-1 i sICAM-1 oraz tPA i uPA. Podobną zależność obserwowano w grupie kobiet chorych na raka piersi z przerzutami do węzłów chłonnych. Dodatnią korelację uzyskano także między średnim stężeniem badanych substancji a wielkością guza pierwotnego. Wnioski: Zmiany ilościowe badanych czynników u kobiet chorych na raka piersi mogą wskazywać na zaburzenie aktywności biologicznej komórek śródbłonka naczyniowego. Dysfunkcja biochemiczna i czynnościowa śródbłonka naczyniowego może z kolei ułatwiać rozwój guza nowotworowego i powstawanie odległych przerzutów. 62. SCC-AG i PROGRP u chorych na raka płuca Ewa Wójcik

1, Jadwiga Tarapacz

1, Zofia Stasik

1, Urszula Rychlik

1, Beata Sas-Korczyńska

1, Jan Kanty

Kulpa1

1 Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie, Polska

Wprowadzenie: Raka płuca cechuje znaczna heterogenność typów histologicznych, a wynikające stąd różnice we własnościach biologicznych mają istotny wpływ na wybór metod leczenia oraz rokowanie chorych. Jakkolwiek podstawą dla ustalenia typu histologicznego nowotworu są mikroskopowe badania materiału komórkowego, to w niektórych przypadkach pomocne mogą być również oznaczenia wybranych markerów nowotworowych. W ocenie European Group on Tumor Markers (EGTM) w diagnostyce różnicowej raka drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego przydatne mogą być wyniki oznaczeń SCC-Ag a także ProGRP. Niektórzy badacze sugerują, że u chorych na drobnokomórkowego raka płuca poziom antygenu SCC nie powinien przekraczać 1,5 ng/ml. Jednak z drugiej strony zwraca się uwagę na wpływ stanu zapalnego na poziom tego markera. Celem podjętych badań była weryfikacja użyteczności oznaczeń SCC-Ag i ProGRP w diagnostyce różnicowej typów histologicznych raka płuca. Materiał i metody: Badania stężenia SCC-Ag, ProGRP oraz białka C-reaktywnego przeprowadzono w grupie 108 chorych na raka płuca (53 na raka drobnokomórkowego - DRP i 55 chorych na raka

niedrobnokomórkowego - NDRP) oraz w grupie referencyjnej 33 zdrowych osób a także w grupie 27 chorych na zapalanie płuc. Wyniki: Istotnie wyższy, w porównaniu do ludzi zdrowych, poziom SCC-Ag stwierdzano u chorych z zapaleniem płuc oraz z NDRP. Brak było istotnych różnic w stężeniu tego markera pomiędzy grupą referencyjną i DRP oraz pomiędzy grupą ze stanem zapalnym i NDRP. U chorych na DRP stężenie SCC-Ag było natomiast istotnie niższe w porównaniu do NDRP jak i chorych z zapaleniem płuc. Stężenie ProGRP u chorych na NDRP było istotnie wyższe aniżeli w grupie referencyjnej osób zdrowych, natomiast nie różniło się istotnie w porównaniu z grupą chorych ze stanem zapalnym. U chorych na DRP stężenie tego markera było istotnie wyższe aniżeli u chorych na NDRP, w grupie z zapaleniem płuc jak i osób zdrowych. Ponadto stężenie ProGRP było wyższe u chorych z zapaleniem płuc aniżeli w grupie referencyjnej. Stężenie SCC-Ag wyższe od 4,9 ng/ml (wartość odcinająca ustalona dla grupy mieszanej osób zdrowych i chorych z zapaleniem płuc) stwierdzono u 5,6% chorych na DRP (wszyscy ci chorzy mieli podwyższony poziom CRP) oraz u 25,5% chorych na NDRP. Istotnie częściej stężenie ProGRP wyższe od 65,9 ng/ml (wartość odcinająca dla grupy mieszanej zdrowych i z zapaleniem płuc) stwierdzano u chorych na DRP aniżeli NDRP (odpowiednio: 70,4 % vs. 9,3% ; p = 0,0000). W grupie z zapaleniem płuc oraz u chorych na NDRP obserwowano istotne zależności pomiędzy stężeniami CRP i SCC-Ag. Brak było takich zależności u chorych na DRP. We wszystkich badanych grupach nie wykazano zależności pomiędzy stężeniem CRP a poziomem ProGRP. Wnioski: Wyniki oznaczeń SCC-Ag w diagnostyce różnicowej nowotworów płuc mają ograniczoną przydatność ze względu na zależność poziomu tego markera od nasilenia stanu zapalnego. Bardziej użytecznym markerem wydaje się być ProGRP, ponieważ nie stwierdza się wpływu stanu zapalnego na jego poziom. 63. Ocena laboratoryjna zaburzeń frakcji lipoproteinowych u chorych na pierwotne nadciśnienie tętnicze Aleksandra Baszczuk

1, Zygmunt Kopczyński

1, Anna Thielemann

1, Danuta Pupek-Musialik

2, Jarosław

Kopczyński2, Maciej Cymerys

2

1 Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny im.Karola Marcinkowskiego,

Polska, 2 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Zaburzeń Metabolicznych i Nadciśnienia

Tętniczego, Uniwersytet Medyczny im.Karola Marcinkowskiego, Polska Wstęp: Nadciśnienie tętnicze należy do najbardziej rozpowszechnionych chorób układu krążenia o wieloczynnikowej etiologii. Współistnienie kilku czynników ryzyka chorób układu krążenia, może promować szereg procesów prowadzących do przyspieszenia rozwoju miażdżycy, a w konsekwencji do ostrych zespołów naczyniowych. Celem pracy było uzyskanie odpowiedzi na następujące pytanie: Jak kształtują się stężenia cholesterolu frakcji HDL i LDL oraz apoprotein apo A1 i apo B w surowicy chorych na pierwotne nadciśnienie tętnicze z hiperhomocysteinemią? Materiał i metody: Badania przeprowadzono u 42 chorych na pierwotne nadciśnienie tętnicze, leczonych w Katedrze i Klinice Chorób Wewnętrznych, Zaburzeń Metabolicznych i Nadciśnienia Tętniczego UM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Grupę kontrolną stanowiło 20 zdrowych osób. Stężenie homocysteiny w surowicy oznaczano metodą immunochemiczną (FPIA). Metodę nefelometryczną zastosowano do oznaczenia stężenia apoproteiny AI i apoproteiny B. Stężenie cholesterolu frakcji HDL i LDL oznaczono rutynowymi metodami. Badania laboratoryjne wykonano w Katedrze i Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej UM w Poznaniu. Uzyskane wyniki badań poddano analizie statystycznej, przy pomocy programu komputerowego STATISTICA v 9.0. Wyniki: Analiza statystyczna wykazała znamiennie niższe stężenia cholesterolu HDL i apoproteiny AI w surowicy chorych na pierwotne nadciśnienie tętnicze z hiperhomocysteinemią w porównaniu ze stężeniami tego parametrów z normohomocysteinemią. Uzyskano wysoką ujemną korelację pomiędzy stężeniem homocysteiny a stężeniem cholesterolu HDL (rs = -0,5381, p = 0,0002) oraz apoAI (rs = -0,5141, p = 0,0051). Stężenie cholesterolu LDL w surowicy chorych na pierwotne nadciśnienie tętnicze z hiperhomocysteinemią było nieznamiennie wyższe od średniego stężenia cholesterolu LDL u chorych z normohomocysteinemią i u osób zdrowych. Nie wykazano także różnic statystycznie znamiennych w krwi chorych z hiperhomocysteinemią i normohomocysteinemią, kiedy oznaczano stężenia apoproteiny B. Wnioski: Uzyskane wyniki własnych badań sugerują, że chorzy na pierwotne nadciśnienie tętnicze z hiperhomocysteinemią mogą być bardziej narażeni na przyśpieszony rozwój miażdżycy niż chorzy z normohomocysteinemią, ze względu na znamienne obniżenie stężenia cholesterolu HDL i apoAI.

64. sVAP-1 w zależności od nasilenia stanu zapalnego u chorych operowanych z powodu raka jelita grubego. Zofia Stasik

1, Wojciech Wysocki

1, Urszula Rychlik

1, Ewa Wójcik

1, Jadwiga Tarapacz

1, Jan Kanty

Kulpa1

1 Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie, Polska

Wprowadzenie: Naczyniowe białko adhezyjne - 1 (vascular adhesion protein – 1, VAP-1) jest jedną z cząsteczek adhezyjnych obecnych w komórkach śródbłonka, posiadającą aktywność oksydazy aminowej, która pośredniczy w procesach wiązania do nich limfocytów. Uważa się, że odgrywa ono istotną rolę w migracji limfocytów do środowiska zapalnego. Pod wpływem działania metaloproteinaz rozpuszczalna forma VAP-1 (sVAP-1) może być uwalniana z błon komórkowych. W nowotworach przewodu pokarmowego (żołądek, jelito grube) wykazano, że niskie stężenia sVAP-1 wiążą się z gorszym rokowaniem chorych. Celem podjętych badań była ocena zależności pomiędzy stężeniem w surowicy sVAP-1 a poziomem wybranych wskaźników stanu zapalnego. Materiał i metody: Oznaczenia sVAP-1, IL-6 oraz białek ostrej fazy tj. białka C-reaktywnego (CRP), alfa-1 kwaśnej glikoproteiny (AAG) oraz haptoglobiny (HAP) wykonano przed leczeniem operacyjnym u 126 chorych na raka jelita grubego a także w grupie referencyjnej 40 osób zdrowych. Wyniki: W porównaniu z grupą referencyjną u chorych na raka jelita grubego obserwowano istotnie niższy poziom sVAP-1 oraz istotnie wyższe stężenia IL-6, CRP, AAG i haptoglobiny. W badanej grupie chorych wykazano istotną zależność pomiędzy IL-6 vs. CRP oraz odwrotną zależność pomiędzy sVAP-1 vs. HAP. Stwierdzono, że chorzy w zaawansowanych stadiach [III+IV], w porównaniu do chorych w wczesnych stadiach zawansowania [I+II] cechowali się istotnie niższym stężeniem sVAP-1 oraz wyraźną tendencją do wyższych stężeń IL-6 i CRP, przy braku istotnych różnic w poziomach AAG i HAP. Pomiędzy grupami wydzielonymi ze względu na wielkość zmiany pierwotnej obserwowano istotnie niższe stężenia sVAP-1 oraz istotnie wyższe IL-6, CRP, AAG, HAP w grupie [T3-4] w porównaniu do grupy [T1-2]. U 64,6% chorych z [T3-4] stwierdzano obniżony poziom sVAP-1. Brak było natomiast istotnych różnic w stężeniu sVAP-1, IL-6, CRP, AAG i HAP pomiędzy grupami wyodrębnionymi ze względu na stan węzłów chłonnych (N0 vs. N1-3). U chorych na raka jelita grubego obserwowano tendencję do spadku poziomu sVAP-1 wraz ze wzrostem stężenia IL-6 (RS= -0,178; p=0,04) oraz stadium zaawansowania (RS = -0,199; p=0,03). Wniosek: U chorych na raka jelita grubego zakwalifikowanych do leczenia chirurgicznego poziom naczyniowego białka adhezyjnego 1 pozostaje w zależności od zaawansowania procesu nowotworowego jak i nasilenia reakcji ostrej fazy. 65. Ocena wpływu neoadjuwantowej radioterapii na wybrane wykładniki progresji u chorych na raka jelita grubego. Wojciech Wysocki

1, Zofia Stasik

1, Ewa Wójcik

1, Jadwiga Tarapacz

1, Urszula Rychlik

1, Jan Kanty

Kulpa1

1 Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie, Polska

Wprowadzenie: Jedną z preferowanych w leczeniu chorych na raka jelita grubego modyfikacji terapii jest prowadzenie przed zabiegiem operacyjnym wstępnej (neoadjuwantowej) radioterapii. Celem prezentowanych badań było określenie w jakim zakresie neodjuwantowa radioterapia może modyfikować poziom wybranych wskaźników biochemicznych u chorych na raka jelita grubego. Materiał i metody: Badania stężenia CEA, CA 19.9, suPAR, MMP-9, TIMP-1, IL-6 oraz VEGFA wykonano przed leczeniem chirurgicznym: w grupie 126 chorych na nowotwory jelita grubego zakwalifikowanych do leczenia operacyjnego bez wcześniejszej radioterapii oraz 58 chorych poddanych przed operacją neoadjuwantowej radioterapii. Ten sam panel badań wykonano w grupie referencyjnej 40 osób zdrowych. Wyniki: U chorych na raka jelita grubego, w porównaniu z grupą referencyjną, stwierdzano istotnie wyższe stężenia CEA, CA 19.9, suPAR, MMP-9, TIMP-1, IL-6, VEGFA oraz istotnie wyższą wartość wyliczanego współczynnika MMP-9/TIMP-1. W badanej grupie chorych obserwowano istotną dodatnią zależność pomiędzy CEA vs. CA 19.9 i TIMP-1 (p=0,001; p=0,038; odpowiednio), MMP-9 vs. TIMP-1, suPAR i VEGFA (p=0,001; p=0,013; p=0,005; odpowiednio), TIMP-1 vs. suPAR, VEGFA i IL-6 (p=0,000; p=0,004; p=0,003; odpowiednio) oraz suPAR vs. IL-6 (p=0,014). Dla całej grupy chorych na

raka jelita grubego brak było istotnych różnic w stężeniach badanych parametrów pomiędzy chorymi po neoadjuwantowej radioterapii w porównaniu do chorych leczonych tylko chirurgicznie. Jednak analiza grupy chorych w stadium zaawansowania [III+IV] wykazała że chorzy po neoadjuwantowej radioterapii cechowali się istotnie niższymi stężenia MMP-9, TIMP-1 oraz IL-6 (p=0,043; p=0,011; p=0,038; odpowiednio) w porównaniu do chorych bez wstępnego leczenia przed zabiegiem chirurgicznym, przy braku istotnych różnic w pozostałych badanych parametrach. W tej grupie chorych stwierdzano również istotnie rzadziej podwyższone stężenia TIMP-1 oraz tendencję do niższego odsetka podwyższonych wyników MMP-9, VEGFA oraz suPAR. W grupie chorych wyodrębnionej ze względu na wielkość guza [T3-4] wykazano, że stężenie MMP-9 było istotnie niższe u chorych po wstępnej radioterapii w porównaniu z tymi bez leczenia neoadjuwantowego (p=0,032), przy braku istotnych różnic dla pozostałych parametrów. U chorych z zajętymi węzłami chłonnymi (N1-3) stwierdzano istotnie niższe poziomy MMP-9 (p=0,042), TIMP-1 (p=0,017) i IL-6 (p=0,042) u tych poddanych radioterapii w porównaniu z grupą chorych leczonych tylko operacyjnie. Wnioski: U chorych na raka jelita grubego w zaawansowanych stadiach i obecnością przerzutów do węzłów chłonnych w następstwie neoadjuwantowej radioterapii dochodzi do spadku stężenia MMP-9, TIMP-1 i IL-6, wskaźników którym przypisywana jest istotna rola w mechanizmach progresji procesu nowotworowego. U chorych we wczesnych stadiach zaawansowania i bez przerzutów brak jest tak wyraźnej reakcji na neodjuwantową radioterapię przed leczeniem chirurgicznym. 66. Stężenie suPAR a inne wykładniki stanu zapalnego u chorych operowanych z powodu raka jelita grubego Jadwiga Tarapacz

1, Zofia Stasik

1, Urszula Rychlik

1, Ewa Wójcik

1, Wojciech Wysocki

1, Jan Kanty

Kulpa1

1 Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie, Polska

Wprowadzenie: Systemowi urokinazowego aktywatora plazminogenu (uPA) przypisywana jest istotna rola zarówno w uzyskiwaniu fenotypu inwazyjnego jak i progresji nowotworu. U chorych na nowotwory złośliwe podwyższone stężenia rozpuszczalnego receptora aktywatora plazminogenu uznawane są za niekorzystny czynnik prognostyczny. Równocześnie podkreśla się zależności pomiędzy poziomem suPAR a nasileniem stanu zapalnego. Jednym z akceptowanych u chorych na nowotwory wykładników obecności stanu zapalnego (systemic inflammatory response – SIR) jest skala punktowa „Glasgow Prognostic Score (GPS)”, oparta na wynikach oznaczeń białka C-reaktywnego i albuminy. Według tej skali chorzy ze stężeniem CRP powyżej 10 mg/l i stężeniem albuminy poniżej 35 g/l zaliczani są do grupy GPS-2 i cechują szczególnie złym rokowaniem, natomiast chorzy z CRP < 10 mg/l i albuminą >35 g/l należą do grupy GPS-0 i wykazują relatywnie lepsze rokowanie. Celem pracy była analiza u chorych na raka jelita grubego zależności pomiędzy stężeniem suPAR a wybranymi wykładnikami stanu zapalnego o ustalonej przydatności w ocenie rokowania chorych. Materiał i metody: Badania CEA, CA 19.9, suPAR, IL-6, białka C-reaktywnego (CRP), alfa-1 kwaśnej glikoproteiny (AAG) oraz albuminy wykonano w grupie 126 chorych na raka jelita grubego zakwalifikowanych do leczenia operacyjnego a także w grupie referencyjnej 52 osób zdrowych. U wszystkich badanych wyliczono wartości zmodyfikowanego Glasgow Prognostic Score (mGPS). Wyniki: U chorych na raka jelita grubego, w porównaniu z grupą referencyjną, obserwowano istotnie wyższe stężenia CEA, CA 19.9, suPAR, CRP i alfa-1 kwaśnej glikoproteiny oraz istotnie niższe stężenia albuminy. W badanej grupie chorych stwierdzano istotną dodatnią korelację pomiędzy suPAR vs. CRP i AAG ( p=0,0002, p=0,0001; odpowiednio) oraz istotną odwrotną zależność pomiędzy suPAR vs. albumina (p= -0,002). W grupach wyodrębnionych ze względu na stadium zaawansowania (I+II vs. III+IV) istotne różnice stwierdzano tylko dla stężenia CEA (p=0,0004). W grupach chorych wyodrębnionych ze względu na wielkość zmiany pierwotnej, u chorych z [T3+4] w porównaniu do pozostałych obserwowano istotnie wyższe stężenia CA 19.9, CRP i AAG oraz istotnie niższe stężenia albuminy przy braku różnic w zakresie CEA i suPAR. W porównaniu do chorych bez zajętych węzłów chłonnych, chorzy ze zmienionymi przerzutowo węzłami chłonnymi cechowali się tylko istotnie wyższym poziomem CEA (p=0,0003). W grupie chorych ze stężeniem CRP wyższym od 10 mg/l stwierdzano istotnie wyższy poziom suPAR (p=0,00007), przy braku istotnych różnic w stężeniach CEA i CA 19.9. Badaną grupę chorych podzielono ze względu na wartość mGPS: mGPS-0, (CRP<10 mg/l, albumina >35 g/l); mGPS-1 (CRP>10 mg/l i albumina > 35 g/l); mGPS-2 (CRP > 10 mg/l i albumina < 35 g/l). W badanej grupie chorych na raka jelita grubego u 26,1% chorych stwierdzano mGPS-[1+2]. U chorych z mGPS-[1+2] w porównaniu do chorych z mGPS-0 istotnie częściej stwierdzano podwyższone stężenia suPAR (p=0,0183).

Wniosek: W raku jelita grubego ocena stężenia suPAR może wnosić dodatkowe, istotne informacje w stosunku do prezentowanych przez mGPS odnośnie rokowania chorych. 67. VEGFA, suPAR, MMP-9, TIMP-1 i u chorych na raka jelita grubego. Zofia Stasik

1, Ewa Wójcik

1, Wojciech Wysocki

1, Jadwiga Tarapacz

1, Urszula Rychlik

1, Jan Kanty

Kulpa1

1 Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie, Polska

Wprowadzenie: System urokinazowego aktywatora plazminogenu – uPA, dwa inhibitory (PAI-1 i PAI-2) oraz związany z błonami komórkowymi receptor (uPAR) - w opinii wielu badaczy odgrywa znaczącą rolę w rozwoju nowotworów, uczestnicząc m.in. w procesach angiogenezy i proteolitycznej destrukcji błony podstawnej. Wzmożona ekspresja uPA i PAI-1 uznawana jest za niekorzystny czynnik prognostyczny u chorych na nowotwory. Obecnie duże zainteresowanie w tym aspekcie budzą wyniki oznaczeń rozpuszczalnego receptora urokinazowego receptora plazminogenu. Celem podjętych badań była ocena zależności pomiędzy stężeniem suPAR a VEGF, MMP-9 i TIMP-1 u chorych na raka jelita grubego. Materiał i metody: Badania suPAR, VEGFA, metaloproteinazy 9 (MMP-9), inhibitora tkankowego 1 (TIMP-1) oraz CEA i CA 19.9 wykonano w grupie 184 chorych na nowotwory jelita grubego zakwalifikowanych do zabiegu chirurgicznego oraz u 52 osób zdrowych. Wyniki: W porównaniu z grupą referencyjną, u chorych na raka jelita grubego, obserwowano istotnie wyższe stężenia suPAR, VEGFA, MMP-9, TIMP-1, CEA i CA 19.9. W badanej grupie chorych stwierdzano istotne zależności pomiędzy stężeniem CEA vs. TIMP-1 i CA 19.9 (p=0,034; p=0,00; odpowiednio), VEGFA vs. MMP-9, TIMP-1, suPAR (p=0,005; p=0,004; p=0,007; odpowiednio), suPAR vs. MMP-9, TIMP-1 (p=0,013; p=0,000; odpowiednio), MMP-9 vs TIMP-1 (p=0,001). W porównaniu do chorych w niższych stadiach zaawansowania [I+II], u tych w stadium zaawansowania [III+IV] stwierdzano istotnie wyższe stężenia CEA i suPAR (p=0,0019; p=0,049; odpowiednio) przy braku istotnych różnic dla pozostałych parametrów. Pomiędzy grupami wyodrębnionymi ze względu na wielkość nowotworu [T1-2] vs. T[3-4] obserwowano istotnie wyższe stężenia CEA, CA 19.9, suPAR i TIMP-1 (p=0,01; p=0,025; p=0,012 p=0,009; odpowiednio) u chorych z [T3-4]. W tej grupie chorych istotnie częściej stwierdzano podwyższone wyniki CEA i TIMP-1 (p=0,001; p=0,003; odpowiednio) oraz wyraźną tendencję do częściej podwyższonych wyników MMP-9, suPAR i VEGFA. U chorych z zajętymi przerzutowo węzłami chłonnymi wykazano istotnie wyższe stężenia CEA (0,002), brak było natomiast istotnych różnic w zakresie VEGFA, MMP-9, TIMP-1 i suPAR. U chorych na raka jelita grubego obserwowano tendencję do wzrostu stężenia TIMP-1 i suPAR wraz z zaawansowaniem (RS=0,181; RS=0,212; p<0,05; odpowiednio). Wnioski: U chorych na raka jelita grubego stwierdza się istotne zależności pomiędzy stężeniem suPAR, MMP-9, TIMP-1, VEGFA oraz CEA a zaawansowaniem procesu nowotworowego. Zależności pomiędzy suPAR i MMP-9 potwierdzają udział systemu urokinazowego aktywatora plazminogenu w aktywacji metaloproteinaz oraz stymulacji procesów angiogenezy. 68. Zmiany parametrów układu krzepnięcia i fibrynolizy u pacjentów z niedoborem C1 inhibitora Maria Kapusta

1, Danuta Fedak

1, Beata Kuśnierz-Cabala

1, Krystyna Słowińska-Solnica

1, Krystyna

Obtułowicz2, Marek Kuźniewski

3, Bogdan Solnica

1

1 Zakład Diagnostyki Katedra Biochemii Klinicznej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum,

Polska, 2 Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum,

Polska, 3 Katedra i Klinika Nefrologii Uniwersytet Jagielloński Colegium Medicum, Polska

Wstęp: Inhibitor dla składnika C1dopełniacza (C1-INH) jest zaliczany do grupy inhibitorów proteaz serynowych – serpin. Jest ważnym czynnikiem utrzymującym homeostazę organizmu, hamuje klasyczną drogę aktywacji dopełniacza a także ma zdolność hamowania elementów układu krzepnięcia, fibrynolizy i kininogenezy. Niedobór C1-INH prowadzi do niefizjologicznej aktywacji tych układów i występowania objawów chorobowych pod postacią obrzęków naczynioruchowych. Pomimo obniżonego stężenia C1-INH u pacjentów z niedoborem, obrzęki występują nieregularnie, zdarzają się także pacjenci bezobjawowi. Wskazuje to na udział innych czynników niż C1-INH, odpowiedzialnych

za występowanie napadów obrzęków naczynioruchowych, których w przyszłości wykorzystanie umożliwiłoby szybkie rozpoznanie i włączenie skutecznego leczenia. Cel: Celem badania była ocena, czy oznaczenie stężenia D-dimerów, fragmentów protrombiny (F1+2) i inhibitora aktywatora plazminogenu typu 1 (PAI-1) może być przydatne w diagnostyce obrzęku naczynioruchowego spowodowanego niedoborem C1-INH. Metody: Do badania włączono 54 pacjentów z niedoborem C1-INH (22 z ostrym atakiem obrzęku naczynioruchowego, 32 w remisji; 29 (54%) mężczyzn i 25 (46%) kobiet, w wieku od 17 do 49 lat oraz 22 zdrowe osoby w wieku od 24 do 52 lat. Stężenie D-dimerów, fragmentów protrombiny F1+2 i PAI-1 w osoczu oznaczono metodą ELISA firmy R&D i American Diagnostica. Dodatkowo oznaczono stężenie białka C1-INH, metodą immunonefelometryczną (Dade Behring Nephelometer BNII, Siemens) oraz aktywność C1-INH, metodą kolorymetryczną z użyciem substratów chromogennych (Dade Behring Coagulation System, Siemens). Wyniki: W grupie pacjentów z ostrym atakiem obrzęku jak i stanie remisji stężenie i aktywność C1-INH były znacznie obniżone (0.08+/-0.03 g/l) i (16.2+/-15.1%); (0.11+/-0.04 g/l) i (18.7+/-15.9%, p<0.0001) w porównaniu z grupą kontrolną (0.29+/-0.07 g/l) i (98.3+/-16.2%, p<0.0001). Stężenie D-dimerów było znacznie wyższe u pacjentów z ostrym atakiem obrzęku naczynioruchowego i wyniosło (1297+/- 483 ng/ml) w porównaniu z grupą kontrolną (257+/-161 ng/ml, p <0,0001), jak i pacjentami w stanie remisji (796+/-279 ng/ml, p<0,0001). Stężenie fragmentów F1+2 było wyższe u pacjentów z ostrym atakiem obrzęku (998+/-171 pmol/l) niż u pacjentów w remisji i grupie kontrolnej (272+/-96 pmol/l) i (159+/-81 pmol/l; p<0,001). Wykazano, że stężenie PAI-1 w osoczu było niższe u pacjentów podczas ataku obrzęku i remisji (0.98+ /-0.46 ng/ml i 1.15+/-0.51 ng/ml), w porównaniu do grupy kontrolnej (4.28+/-1.9 ng/ml, p<0,001). Zaobserwowano istotną statystycznie dodatnią korelację pomiędzy stężeniem fragmentów F1+F2 i D-dimerów u pacjentów z ostrym atakiem obrzęku (R=0.52) i pomiędzy stężeniem i aktywnością C1-INH a stężeniem D-dimerów (R=0.39 i R=0.41) a także ujemną korelację między stężeniem PAI-1 i F1+F2 podczas ataków obrzęków i remisji (R=-0.34 i R=-0. 37). Wnioski: Uzyskane wyniki badania wskazują, że atak obrzęku naczynioruchowego jest silnie związany z aktywacją układu krzepnięcia i fibrynolizy. Tak więc, D-dimery, fragmenty protrombiny F1+F2 i PAI-1 mogą być uznane jako markery rozwoju zaostrzenia obrzęku spowodowanego niedoborem C1-INH. Uzyskane wyniki mogą mieć również implikacje terapeutyczne. 69. Osteopontyna - biomarker w niedrobnokomórkowym raku płuca. Barbara Masłyk

1, Regina Deja

1, Monika Giglok

2, Katarzyna Galwas-Kliber

2, Joanna Gliwińska

1,

Marzena Gawkowska-Suwińska3, Urszula Dworzecka

2, Anna Drosik

4, Dorota Butkiewicz

5, Piotr

Widłak5, Rafał Suwiński

2

1 Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska,

2 II Klinika

Radioterapii i Chemioterapii, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 3 III Klinika

Radioterapii i Chemioterapii, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 4 Klinika Onkologii

Klinicznej i Doświadczalnej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 5 Centrum Badań

Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska Wstęp: Osteopontyna (OPN) jest białkiem 33-75 kDa, którego ekspresję obserwuje się w kościach, nerkach, tkance nabłonkowej, endometrium i mięśniach gładkich. Bierze udział w metabolizmie kości, przeżyciu i migracji komórek oraz regulacji odpowiedzi immunologicznej i stanów zapalnych. Nadekspresję osteopontyny stwierdzono w tkance nowotworowej chorych na nowotwory sutka, gruczołu krokowego, regionu głowy i szyi, jajnika i żołądka. Osteopontyna jest cytokiną związaną z hipoksją oraz angiogenezą. Niedotlenienie występujące w guzie nowotworowym indukuje ekspresję genu kodującego OPN bezpośrednio oraz poprzez aktywację VEGF-R, pobudza angiogenezę promując rozsiew procesu nowotworowego. Hipoksja guza nowotworowego upośledza wrażliwość komórek nowotworowych na cytostatyki i promieniowanie jonizujące powodując wzrost oporności na chemioterapię i radioterapię, a tym samym skrócenie czasu przeżycia chorych. Materiał i Metody: Badaniem objęto grupę 258 chorych leczonych w Centrum Onkologii - Instytucie z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca, w tym raka płaskonabłonkowego 146 (56,8%), gruczołowego 47 (18,3%) chorych. Mediana wieku wynosiła 63 lata, mężczyźni stanowili 73,9% badanej grupy. Stopień zaawansowania klinicznego oceniono zgodnie z klasyfikacją TNM, jako I-II: 36 (14%), III: 180 (69,7%), IV: 42 (16,3%). Wszyscy chorzy zostali poddani radioterapii na obszar guza i regionalnych węzłów chłonnych, u 66,5% chorych zastosowano chemio-radioterapię. Radioterapię radykalną zastosowano u 61,2% chorych, u 38,8% leczenie paliatywne.

Stężenie OPN oznaczono metodą ELISA (R&D Systems), przed rozpoczęciem leczenia. Grupę kontrolną stanowiło 114 osób zdrowych. Wartość odcięcia stężenia OPN (68,4 ng/mL) pomiędzy grupą chorych a grupą kontrolną ustalono z wykorzystaniem krzywych ROC. Wpływ poziomu OPN na przeżycie chorych oceniono z użyciem testu log-rank, jako wartość odcięcia przyjmując medianę stężenia. Wyniki: Stężenie OPN w grupie chorych mieściło się w zakresie 6,5-619,1 ng/mL (mediana 98,1 ng/mL) i było istotnie statystycznie wyższe (p<0,0000) niż w grupie kontrolnej (mediana 47,9 ng/mL, zakres 2,6- 91,2 ng/mL). Jedynie u 34 (13,2%) chorych w badanej grupie stężenie białka nie przekroczyło wyznaczonej wartości odcinającej. Odnotowano znamienną (p<0,02) różnicę w stężeniu OPN u chorych z rozpoznaniem raka płaskonabłonkowego vs gruczołowego. W aktualnym badaniu, obok uznanych niekorzystnych czynników rokowniczych tj. stopień zaawansowania klinicznego (p<0,004), stan sprawności wg. ZUBROD (p<0,06) czy palenie papierosów (p<0,01); wykazano znamienny statystycznie niekorzystny wpływ wysokiego stężenia OPN (p<0,0000) na przeżycie całkowite chorych. Wnioski: W prezentowanym badaniu wykazaliśmy znacząco wyższe (p<0,0000) stężenie osteopontyny u chorych na raka płuca w porównaniu do grupy zdrowych, a także niekorzystną wartość prognostyczną (p<0,0000) wysokiego wyjściowego stężenia OPN na przeżycie całkowite chorych. 3-letnie całkowite przeżycie chorych wynosiło 15%. U chorych, u których przed rozpoczęciem leczenia stężenie OPN było poniżej 98,1 ng/mL, przeżycie chorych po trzech latach obserwacji wynosiło 22%, natomiast przy stężeniu powyżej tej wartości 5%. Wartość stężenia OPN u chorych przed rozpoczęciem leczenia dostarcza dodatkowych, obok klasycznych czynników prognostycznych, wartościowych informacji rokowniczych w niedrobnokomórkowym raku płuca. 70. Ocena stężenia sVCAM-1oraz profilu lipidowego u chorych z zawałem mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST ( NSTEMI ). Elżbieta Siergiejko

1, Anna Lisowska

2, Aleksandra Korniluk

1, Halina Kemona

1, Violetta Dymicka-

Piekarska1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2 Klinika Kardiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska

Główną przyczyną choroby niedokrwiennej serca jest miażdżyca tętnic wieńcowych. Stopień jej zaawansowania jest czynnikiem patogenetycznym powodującym przejście postaci stabilnej w niestabilną z konsekwencją wystąpienia ostrych zespołów wieńcowych (OZW). W zapoczątkowaniu zmian miażdżycowych kluczową rolę odgrywa dysfunkcja śródbłonka naczyniowego wywołana jego lokalnym uszkodzeniem, w wyniku czego na powierzchni komórek endotelium dochodzi do nasilonej ekspresji molekuł adhezyjnych m.in. VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1). Receptory dla VCAM-1 występują w błonie komórkowej limfocytów T oraz monocytów, umożliwia to ich adhezję do śródbłonka, powodując wzrost wydzielania cytokin zapalnych ( TNF-α, IL-6, MCP-1). Te z kolei prowadzą do aktywacji molekuł adhezyjnych, zwiększając tym samym przepuszczalność śródbłonka. W konsekwencji nasilający się proces zapalny powoduje degradację włókien fibryny oraz pęknięcie blaszki miażdżycowej. Zapobieganie miażdżycy naczyń tętniczych od wielu lat koncentruje się na działaniach zmierzających do obniżenia stężenia cholesterolu we krwi. Działania te są poparte licznymi dowodami wskazującymi na obecność cholesterolu w zmianach miażdżycowych, a także na związek wysokich stężeń cholesterolu z ryzykiem naczyniowej choroby serca i mózgowych powikłań miażdżycy. Obecność VCAM-1 świadczy o zmianach śródbłonkowych prowadzących do postępowania miażdżycy oraz wystąpienia niestabilnych blaszek miażdżycowych. Celem pracy była ocena zależności pomiędzy nasileniem procesu zapalnego wyrażonego stężeniem molekuły adhezyjnej sVCAM-1 a profilem lipidowym u chorych z zawałem mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST. Badaniem zostało objętych 33 pacjentów (24 mężczyzn, 10 kobiet; średnia wieku 61,48 ± 11,42) z zawałem mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI). Oceniono stężenie molekuły adhezyjnej sVCAM-1 w pierwszej dobie wystąpienia incydentów sercowych oraz jej korelacje z profilem lipidowym danej grupy badanej. Grupę kontrolną stanowiło 30 osób w wieku i płci zbliżonym do grupy badanej. Stężenie sVCAM-1 było oznaczane metodą immunoenzymatyczną (zestaw firmy R&D Systems, Minneapolis, USA). Badania profilu lipidowego: cholesterol całkowity, LDL, HDL, TG wykonane zostały metodą enzymatyczną z esterazą cholesterolową i oksydazą cholesterolową na analizatorze biochemicznym ARCHITECT ci4100 firmy Abbott. Wyniki badań

zostały poddane analizie statystycznej przy użyciu programu STATISTICA 9.0 PL. Za różnice istotne statystycznie przyjęto p<0,05. U chorych z OZW stwierdzono podwyższone średnie stężenie sVCAM-1 (1190,139 ± 997,06) w porównaniu z grupą kontrolną (465,826 ± 88,68) (p<0,0001). Średnie stężenie profilu lipidowego przedstawia się następująco: cholesterol całkowity (188,367 ± 48,83) przy wartości referencyjnej (WR) 165 ± 35 mg/dl; cholesterol LDL (120,241 ± 41,88) przy WR 125 ± 25 mg/dl; cholesterol HDL: (42,724 ± 12,66) przy WR 50 ± 15 mg/dl; TG (129,517 ± 75,91) przy WR 120 ± 80 mg/dl. W grupie chorych z zawałem NSTEMI stwierdzono ujemną korelację pomiędzy stężeniem molekuły adhezyjnej VCAM-1 a składowymi profilu lipidowego pacjentów i wynosiły one odpowiednio: sVCAM-1 vs. Chol całkowity (r=-0,4827; p<0,06), sVCAM-1 vs. LDL-chol (r=- 0,368; p<0,049), sVCAM-1 vs. HDL-chol (r=-0,631; p<0,000). Nie wykazano natomiast istotnej statystycznie zależności pomiędzy sVCAM-1 vs. TG (r= 0,053; p<0,978). U chorych z zawałem NSTEMI obserwuje się nasiloną odpowiedź zapalną, na co wskazuje ponad dwukrotnie wyższe stężenie sVCAM-1 w porównaniu do zbliżonej pod względem wieku i płci grupy kontrolnej. Wyniki naszego badania wykazały ujemną zależność pomiędzy stężeniem sVCAM-1 a wykładnikami profilu lipidowego u chorych z zawałem mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST. 71. Występowanie szczepów ESBL(+) wśród pałeczek enterobacteriaceae odpowiedzialnych za infekcje dróg oddechowych Anna Mertas

1, Elżbieta Bobela

1, Wojciech Król

1

1 Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Wydzialu Lekarskiego z Oddzialem Lekarsko-

Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Polska

Jednym z najistotniejszych klinicznie i epidemiologicznie mechanizmów lekooporności pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae jest wytwarzanie enzymów hydrolizujących pierścień ß-laktamowy w cząsteczce leku, tzw. ß-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL). Enzymy ESBL mają zdolność hydrolizy wszystkich penicylin, cefalosporyn (oprócz cefamycyny) oraz monobaktamów (aztreonamu). Aktywność większości enzymów ß-laktamowych hamowana jest przez specyficzne dla nich inhibitory (kwas klawulanowy, tazobaktam, sulbaktam), co znajduje wykorzystanie podczas wykrywania ESBL. W Polsce obowiązuje obecnie wykrywanie mechanizmów ESBL równolegle z wykonaniem antybiogramu dla każdego szczepu bakterii z rodziny Enterobacteriaceae wyizolowanego z materiałów pobranych od pacjentów hospitalizowanych. Wykrywanie ESBL polega na stwierdzeniu u badanego szczepu bakterii obniżonej wrażliwości in vitro na którykolwiek z użytych leków wskaźnikowych (cefotaksym, ceftazydym, ceftriakson, cefpodoksym, cefepim, aztreonam) i wykazanie wpływu inhibitora ß-laktamowego (amoksycylina z kwasem klawulanowym) na ten efekt. Celem niniejszej pracy była ocena występowania szczepów wytwarzających ß-laktamazy o poszerzonym spektrum substratowym (ESBL) wśród pałeczek Enterobacteriaceae odpowiedzialnych za infekcje dróg oddechowych. Analizą objęto 254 szczepy Gram(-) pałeczek należących do rodziny Enterobacteriaceae wyizolowanych w latach 2010-2012 z posiewów materiałów pochodzących z dróg oddechowych (wymaz z nosa, wymaz z gardła, plwocina, popłuczyny oskrzelowe). Do identyfikacji gatunkowej badanych szczepów pałeczek Gram(-) wykorzystano ENTEROtest 24 N (Erba-Lachema, Brno, Czechy). Ocenę lekowrażliwości badanych szczepów bakterii przeprowadzono zgodnie z obowiązującymi zaleceniami Krajowego Ośrodka ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD). Zdolność do produkcji ESBL oceniano zalecaną przez KORLD metodą dwóch krążków DDST (ang. double-disc synergy test). Wśród 254 analizowanych szczepów pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae u 57 szczepów (22,4%) wykazano zdolność do produkcji ESBL. Szczepy ESBL(+) należały do następujących rodzajów: Enterobacter spp. (21 szczepów), Klebsiella spp. (19 szczepów), Escherichia spp. (7 szczepów), Citrobacter spp. (5 szczepów), Serratia spp. (4 szczepy) oraz Proteus spp.(1 szczep). Wśród szczepów ESBL(+) najliczniej reprezentowane były następujące gatunki bakterii: Klebsiella pneumoniae (14 szczepów), Enterobacter kobei (12 szczepów) oraz Escherichia coli (7 szczepów). Wyniki przeprowadzonych badań potwierdzają, że w przypadku infekcji dróg oddechowych drobnoustroje wytwarzające ß-laktamazy o poszerzonym spektrum substratowym (ESBL) nadal stanowią poważny problem zarówno terapeutyczny jak i epidemiologiczny. Enzymy ESBL, wytwarzane głównie przez pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae, warunkują ich oporność na zdecydowaną większość antybiotyków ß-laktamowych. Według aktualnie obowiązujących zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST , wykrycie ESBL nie wyklucza zastosowania w terapii cefalosporyn III i IV generacji oraz aztreonamu w przypadku stwierdzenia na

nie wrażliwości in vitro, jednak zawsze istnieje prawdopodobieństwo wystąpienia niepowodzenia terapeutycznego. Natomiast w aspekcie epidemiologicznym drobnoustroje ESBL(+) stanowią istotny problem jako patogeny alarmowe.

72. Monitorowanie stężenia inhibitorów kalcyneuryny we krwi pacjentów po transplantacji serca specyficznĄ technikĄ UPLC-MS/MS – porównanie z immunochemicznĄ metodĄ ACMIA. Paweł K. Kunicki

1, Joanna Waś

1, Aleksandra Boczek

1

1 Pracownia Farmakologii Klinicznej i Terapii Zakładu Biochemii Klinicznej, Instytut Kardiologii, Polska

Celem pracy było porównanie wyników stężenia cyklosporyny (CSA) i takrolimusu (TAC) oznaczonych nowoczesną, specyficzną techniką ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) połączonej z tandemową detekcją masową (MS/MS) i równolegle zmierzonych dotychczas stosowaną metodą immunochemiczną: Antibody Conjugated Magnetic ImmunoAssay (ACMIA) w próbkach krwi pobranych od pacjentów po przeszczepieniu serca. Do badań wykorzystano system UPLC-MS/MS – Acquity Ultra Performance LC (Waters, USA) oraz certyfikowany zestaw analityczny MassTox® dedykowany dla leków immunosupresyjnych (Chromsystems, Niemcy). Opracowana metoda umożliwiająca jednoczesną analizę CSA, TAC oraz ewerolimusu (EWE) i syrolimusu (SYR) została zwalidowana w zakresie dostępnym dla komercyjnych zestawów zawierających wstępnie przygotowane kalibratory, kontrole i standardy wewnętrzne, a uzyskane parametry walidacji spełniły wymagania stawiane metodom bioanalitycznym przez Europejską Agencję Leków (EMA). Metoda jest liniowa i dla inhibitorów kalcyneuryny charakteryzuje się zakresem: 8-1847 ng/ml (CSA) i 0,9-50,0 ng/ml (TAC) przy precyzji (n=6) wewnątrzseryjnej: 0,57-2,38 % (CSA) i 1,40-6,26 % (TAC) oraz międzysesyjnej: 1,54-3,04 % (CSA) i 2,35-3,59 % (TAC), a także dokładności (n=6) wewnątrzseryjnej: 100,91 ± 3,08 % (CSA) i 94,42 ± 1,61 % (TAC) oraz międzysesyjnej: 102,96 ± 4,20 % (CSA) i 95,81 ± 3,90 % (TAC). W metodzie ACMIA umożliwiającej bezpośrednią analizę próbki krwi pełnej zastosowano analizator Dimension® EXL200 oraz odczynniki i kalibratory: CSA Flex® lub TACR Flex® (Siemens, Niemcy). Materiał kliniczny stanowiły próbki krwi pacjentów po transplantacji serca leczonych przewlekle CSA lub TAC pobrane w stanie stacjonarnym (Cmin), które analizowano w dniu pobrania obiema metodami. Zbadano łącznie n=80 próbek uzyskanych od 62 chorych (50 M i 12 K) w wieku 56,99 (21-87) lat dla oceny stężenia CSA, oraz n=79 próbek od 51 pacjentów (41 M i 10 K) w wieku 52,75 (16-75) lat dla oceny stężenia TAC. Uzyskano wyniki stężeń CSA w zakresie 65,50-442,00, średnio: 140,07 ng/ml dla metody ACMIA oraz: 47,93-396,98, średnio: 119,89 ng/ml dla metody UPLC-MS/MS (p<0,0001, test Wilcoxona). Analiza Bland-Altman wykazała bias = +20,18 ng/ml (95 % CI: +17,45; +22,91), który w wymiarze procentowym wyniósł +16,98 % (95 % CI: +14,93; +19,03), potwierdzający istotność różnicy pomiędzy metodami. Analiza regresji Passing-Bablok wykazała zależność y=1,047x+13,44 (95 % CI dla a: 0,984; 1,111 i dla b: +6,34; +19,40) potwierdzającą znamienność uzyskanych różnic. Wyniki charakteryzowały się satysfakcjonującą korelacją (r

2=0,9667, p<0,0001).

Dla TAC uzyskano wyniki stężeń w zakresie 3,56-36,79, średnio: 10,90 ng/ml dla metody ACMIA oraz: 4,23-33,57, średnio: 11,26 ng/ml dla metody UPLC-MS/MS (p=0,0018, test Wilcoxona). Analiza Bland-Altman wykazała bias = -0,36 ng/ml (95 % CI: -0,65; -0,07), który w wymiarze procentowym wyniósł -5,80 % (95 % CI: -8,61; -2,99), potwierdzający istotność różnicy pomiędzy metodami. Analiza regresji Passing-Bablok wykazała zależność y=1,084x-1,37 (95 % CI dla a: 1,019; 1,143 i dla b: -1,91; -0,78) potwierdzającą znamienność uzyskanych różnic. Wyniki charakteryzowały się satysfakcjonującą korelacją (r

2=0,9560, p<0,0001).

Pomimo wysokiej korelacji stwierdzonej pomiędzy obiema metodami dla każdego z leków, wyniki badań wykazały znamienne różnice w pomiarach – metoda ACMIA istotnie zawyża wyniki oznaczeń CSA, oraz istotnie zaniża wyniki oznaczeń TAC w porównaniu z referencyjną techniką UPLC-MS/MS. Stwierdzone różnice powinny być brane pod uwagę podczas prowadzenia terapii monitorowanej stężeniem leku dla inhibitorów kalcyneuryny.

73. Pentraksyna 3 we wczesnym różnicowaniu pomiędzy ciężką i łagodną postacią ostrego zapalenia trzustki. Beata Kuśnierz-Cabala

1, Anna Gurda-Duda

2, Maria Kapusta

1, Paulina Dumnicka

3, Danuta Fedak

1,

Jan Kulig2, Marek Kuźniewski

4, Bogdan Solnica

1

1 Zakład Diagnostyki Katedra Biochemii Klinicznej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum,

Kraków, Polska, 2 I Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Onkologicznej i Gastroenterologicznej UJCM,

Kraków, Polska, 3 Zakład Diagnostyki Medycznej, Wydział Farmacji UJCM, Kraków, Polska

4 Katedra i Klinika Nefrologii UJCM, Kraków, Polska

Wprowadzenie: Ostre zapalenie trzustki (OZT) jest schorzeniem o trudnym do przewidzenia przebiegu, które u blisko 80% chorych ustępuje bez powikłań. Jednak u ok. 20% chorych z OZT dochodzi do rozwoju ciężkiej postaci obarczonej wysoką 20-30% śmiertelnością, a w przypadkach zakażonej martwicy trzustki może sięgać nawet do 50-80%. Uważa się, że jedynym skutecznym sposobem postępowania u chorych z OZT jest wczesne określenie jego przebiegu i podjęcie adekwatnej terapii na oddziale intensywnej opieki medycznej. Celem pracy była analiza pomiarów pentraksyny 3 (PTX3) we wczesnym okresie trwania OZT (pierwszy tydzień) i porównanie jej wartości diagnostycznej z oznaczeniem białka C-reaktywnego (CRP), interleukiny 6 (IL-6), osoczowym białkiem amyloidowym A (SAA) oraz elastazą granulocytów obojętnochłonnych (PMN-elastaza). Materiał do badania stanowiło osocze wersenianowe oraz surowica 40 chorych (16 kobiet i 24 mężczyzn) w wieku średnim 49±15 lat, hospitalizowanych i leczonych w I Klinice Chirurgii z powodu OZT. U 28 chorych schorzenie miało przebieg łagodny, a w 12 przypadkach średnio-ciężki i ciężki. W wyniku powikłań zmarło 6 chorych. Pomiar PTX3, IL-6 i PMN-elastazy przeprowadzono przy użyciu zestawów ELISA firmy R&D Systems oraz BioVendor, natomiast CRP i SAA metodą immunonefelometryczną (Nephelometer BN II, Simens Diagnostic). Znamienność różnic pomiędzy grupami oceniano przy pomocy testu U Manna Whitneya, a do badania korelacji wykorzystywano współczynnik Spearmana (p<0,05). Wyniki: Wzrost stężenia PTX3 odnotowano w chwili rozpoznania OZT (mediana=5,0 ng/ml; wartość maksymalna: 113,8) i miały one tendencję do normalizacji w kolejnych dobach badania. Stężenia PTX3 były wyższe u chorych z ciężką postacią OZT w porównaniu do łagodnego przebiegu w każdym z analizowanych punktów czasowych (mediana 17.2 vs. 4.0 ng/ml w 1-szym dniu, p=0.03; 5.9 vs. 4.4 w 3-cim dniu, p=0.2; 6.1 vs. 2.2 w 5-tym dniu, p=0.04). W 5-tym dniu obserwacji, stężenie PTX3 było znamiennie statystycznie wyższe u wszystkich, którzy zmarli w wyniku powikłań OZT (mediana 28.8 vs. 2.5 ng/ml; p=0.04). Dodatkowo, w każdym dniu badania stwierdzono silną dodatnią korelację pomiędzy PTX3 i SAA (R=0,627; p=0,0007 w 1-szym, R=0,591; p=0,009 w 3-cim i R=0,668; p=0,001 w 5-tym), IL-6 (R=0,699; p=0,001 w 1-szym, R=0,536; p=0,01 w 3-cim i R=0,684; p=0,0008 w 5-tym) oraz PMN-elastazą (R=0,657; p=0,001 w 1-szym, R=0,598; p=0,007 w 3-cim i R=0,507; p=0,02 w 5-tym). Wnioski: Pomiar PTX3 może być użyteczny diagnostycznie we wczesnej ocenie ciężkości przebiegu OZT przypadającej według nowej redefinicji Klasyfikacji Atlanta 2012 na okres pierwszego tygodnia od rozpoznania OZT. Ponadto zauważono, że PTX3 posiada dynamikę zmian zbliżoną do interleukiny 6 (IL-6) i wyprzedza maksymalny wzrost stężenia białka CRP. 74. Kontrola jakości oznaczeń stężenia glukozy uzyskiwanych przy użyciu glukometrów - wytyczne towarzystw diabetologicznych, producentów glukometrów a praktyka kliniczna. Beata Mrózek

1, Przemysław Tomasik

1

1 Zakład Biochemii Klinicznej, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii UJ CM, Polska

Wstęp: Oznaczenia stężenia glukozy przy pomocy glukometru wykorzystywane są przy podejmowaniu decyzji terapeutycznych, zatem muszą być wiarygodne. Zapewnieniem wiarygodności badań in vitro jest prowadzenie wewnętrznej kontroli jakości (QC). Glukometry, wykorzystywane są do oznaczania stężenia glukozy przede wszystkim przez diabetyków oraz, w systemie badań w miejscu opieki nad pacjentem (POCT) przez personel medyczny pracujący na szpitalnych oddziałach endokrynologicznych czy intensywnej terapii. Oczekuje się więc, że w wytycznych towarzystw diabetologicznych powinny być zawarte wskazówki dotyczące prowadzenia QC oznaczeń glukozy w systemie POCT. Cel: Analiza wytycznych towarzystw diabetologicznych oraz producentów glukometrów dotyczących zapewnienia jakości oznaczeń stężenia glukozy oraz ocena stosowania się do nich przez operatorów glukometrów w szpitalach województwa małopolskiego. Materiał i metody: Analizie poddano zalecenia towarzystw diabetologicznych z Wielkiej Brytanii, USA, Kanady, Australii, Niemiec i Polski, a także wytyczne dotyczące prowadzenia QC oznaczeń glukometrycznych zamieszczone w instrukcjach użytkowania 25 glukometrów dostępnych na polskim

rynku (Abott, Arkray, Bayer, BSI, Bionime, Beurer medical, CSL, Diagnosis, Genexo, I-sens, Johnson&Johnson, MedTrust, Pharmbos, PTS, Roche). Sposób prowadzenia QC oznaczeń stężenia glukozy na oddziałach szpitalnych oceniono przy pomocy kwestionariusza. Ankietowano 29 szpitali na terenie województwa małopolskiego. Otrzymano 26 wypełnionych ankiet, co stanowiło 90% rozprowadzonych ankiet. Z ostatecznego zestawienia wykluczono dwa szpitale, w których nie korzystano z glukometrów. Wyniki: Ani zalecenia towarzystw diabetologicznych ani szpitale nie posiadają jednolitego systemu zapewnienia jakości oznaczeń glukometrycznych. Nie ma również powszechnych systemów prowadzenia QC oznaczeń przy użyciu glukometrów. Towarzystwa diabetologiczne wskazują na konieczność ustanowienia systemu kontroli jakości lecz nie precyzują częstości wykonywania QC i sposobu jej prowadzenia. Jedynie Polskie Towarzystwo Diabetologiczne w 2010 roku zalecało kontrolę glukometrów wykorzystywanych w badaniach w miejscu opieki co dwa tygodnie. W kolejnych wytycznych z 2012 roku informacja ta została pominięta. Wszyscy producenci analizowanych glukometrów zalecają wykonywanie QC przy pierwszym użyciu aparatu, przy braku zgodności wyniku ze stanem klinicznym pacjenta lub przy podejrzeniu nieprawidłowego działania aparatu. W instrukcjach pięciu modeli glukometrów (J&J, Genexo, Diagnosis) zawarta jest informacja o konieczności wykonywania QC minimum raz w tygodniu. Większość firm (Arkray, Bayer, Beurer Medical, CSL, Diagnosis, Genexo, I-Sens, J&J, PTS, Roche) zaleca wykonanie QC przy rozpoczęciu nowego opakowania pasków testowych, co przy czterech - pięciu oznaczeniach dziennie wymusza wykonanie QC co dziesięć - dwanaście dni. Wszyscy producenci mają w swojej ofercie płyny kontrolne, jednak w zależności od producenta glukometrów kontrole są dostępne na jednym, dwóch lub trzech poziomach. Wewnętrzna QC – zgodnie z zaleceniami producentów glukometrów użytkowanych w danej jednostce - prowadzona jest w jedynie pięciu (20,8%) ankietowanych szpitalach. Tylko w czterech kontrola jakości wykonywana jest minimum raz w tygodniu, a dwie jednostki oprócz kontroli wewnętrznej prowadzą także kontrolę zewnętrzną. Wnioski: Brak jednoznacznych wytycznych prowadzenia kontroli jakości jest jedną z przyczyn niskiej wiarygodności oznaczeń stężenia glukozy na glukometrach. 75. CA 125, HE4 i wybrane wykładniki stanu zapalnego u chorych na raka trzonu macicy. Urszula Rychlik

1, Jadwiga Tarapacz

1, Jerzy Jakubowicz

1, Ewa Wójcik

1, Zofia Stasik

1, Paweł Blecharz

1,

Jan Kanty Kulpa1

1 Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie,

Wprowadzenie: Rak trzonu macicy należy do najczęstszych nowotworów złośliwych narządu rodnego. Podstawowym markerem wykorzystywanym w diagnostyce tego nowotworu jest CA 125. Częstość podwyższonych stężeń tego markera wykazuje wyraźną zależność od stadium zaawansowania choroby, a swoistość diagnostyczna wyników jego oznaczeń jest relatywnie niska. Próby wykorzystania w diagnostyce tej grupy chorych oznaczeń CEA, czy CA 19.9 nie przyniosły satysfakcjonujących rezultatów. Obecnie duże nadzieje wiązane są z wykorzystaniem oznaczeń antygenu HE4, którego komplementarne do CA 125 oznaczenia przyczyniły się do znacznej poprawy efektywności diagnostyki u chorych na raka jajnika. Jakkolwiek pierwsze informacje dotyczące wykorzystania oznaczeń HE4 łącznie z CA 125 u chorych na raka trzonu macicy są nader obiecujące, to ocena użyteczności obu tych markerów wymaga dalszej wnikliwej analizy. Celem podjętych badań była ocena wpływu stanu zapalnego na kształtowanie się stężenia CA 125 i HE4 w pilotowej grupie chorych na raka trzonu macicy. Materiał i metody:Badania w surowicy CA 125, HE4 i IL-6 przeprowadzono u 39 chorych na raka trzonu macicy przed leczeniem oraz w grupie referencyjnej 48 zdrowych osób. Dla każdej chorej wyliczono surowiczy wskaźnik nowotworowy CSI (Cancer Serum Index) charakteryzujący nasilenie rozwoju choroby nowotworowej. Wyniki: U chorych na raka trzonu macicy w porównaniu do grupy referencyjnej zdrowych kobiet obserwowano istotnie wyższe stężenia CA 125, HE4 oraz IL-6, przy braku istotnych różnic w poziomie alfa-1 kwaśnej glikoproteiny oraz prealbuminy. Stężenia CA 125 wyższe od 35 U/ml stwierdzano u 18%, a HE4 wyższe od 70 pmol/l u 62% chorych. Pola powierzchni pod krzywymi ROC wynosiły 0,729 - dla HE4, 0,677 - dla CA125 i 0,742 - dla HE4+CA125. Obserwowano istotne różnice w częstości podwyższonych wyników obu markerów w zależności od zaawansowania choroby. O ile podwyższone stężenia CA 125 miało 19% a HE4 50% chorych w stadium zaawansowania FIGO [I+II], to odsetki podwyższonych stężeń tych markerów u chorych w stadium FIGO [ III+IV] wynosiły odpowiednio 22% i 88% . Jakkolwiek nie stwierdzano korelacji pomiędzy stężeniem IL-6 a stężeniami obu markerów, to

w grupie chorych ze stężeniem tej cytokiny wyższym od 6 ng/l stężenia CA 125 i HE4 były istotnie wyższe aniżeli u chorych z niższym poziomem od tej wartości dyskryminacyjnej. Podwyższone stężenie HE4 stwierdzano u 92% chorych ze stężeniem IL-6 wyższym od 6,0 ng/l i tylko u 44% chorych z niskim stężeniem tej cytokiny. Stwierdzono istotne różnice wyników CA 125 i HE4 pomiędzy grupami chorych wyodrębnionymi ze względu na stężenie IL-6. Zbliżone różnice w bezwzględnych wartościach jak i odsetkach podwyższonych stężeń obu markerów obserwowano pomiędzy grupami wydzielonymi ze względu na wartości CSI, wyliczanego jako stosunek stężenia AAG do prealbuminy. Wnioski: W raku trzonu macicy komplementarne do CA 125 oznaczenia HE4 pozwalają na poprawę efektywności diagnostyki tej grupy chorych. Obecność stanu zapalnego ma istotny wpływ, szczególnie na stężenie HE4. 76. Profil lipidowy surowicy krwi a markery uszkodzenia śródbłonka u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca. Magdalena Lampka

1, Zofia Grąbczewska

2, Iga Hołyńska-Iwan

1, Maria Krajewska

1, Agnieszka Kopeć

1,

Elżbieta Piskorska1

1 Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej, Collegium Medicum w Bydgoszczy UMK Toruń,

Polska, 2 Katedra i Klinika Kardiologii i Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum w Bydgoszczy

UMK Toruń, Polska Wprowadzenie: Zaburzenia lipidowe odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu procesów aterogenezy związanych z uszkodzeniem śródbłonka. Do biochemicznych markerów uszkodzenia środbłonka, uwalnianych do krwiobiegu należy czynnik von Willebranda (vWF). Morfologicznym markerem uszkodzenia śródbłonka są krążące w krwi obwodowej komórki śródbłonka (CEC). Celem pracy była ocena zależności pomiędzy stężeniem parametrów lipidowych surowicy krwi a wartością biochemicznych i morfologicznych wskaźników uszkodzenia śródbłonka w przebiegu choroby niedokrwiennej serca. Materiał i Metody: Badaniami objęto 40 pacjentów z chorobą niedokrwienna serca (CAD): 20 pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego (AMI) oraz 20 pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową (SA). Grupę kontrolną stanowiło 20 ochotników, u których nie stwierdzono klinicznych objawów choroby niedokrwiennej serca. Stężenie vWF oznaczano w osoczu krwi cytrynianowej metodą ELISA. Liczbę krążących komórek śródbłonka (CEC) oznaczano w pełnej krwi wersenianowej metodą cytometrii przepływowej. W analizach statystycznych uwzględniono stężenia parametrów lipidowych, które zostały oznaczone u badanych pacjentów w momencie przyjęcia do szpitala: cholesterol całkowity (TC), cholesterol LDL (LDL-C), cholesterol HDL (HDL-C), triglicerydy (TG). Na podstawie stężenia parametrów lipidowych wyznaczono wartość wskaźnika aterogennego LDL-C/HDL-C. Wyniki: W badanej grupie pacjentów z chorobą niedokrwienną zmiany aterogenne w profilu lipidowym surowicy krwi wyrażały się obniżonym w stosunku do grupy kontrolnej stężeniem cholesterolu HDL. Stężenia cholesterolu całkowitego i cholesterolu LDL nie różniły się pomiędzy grupą badaną a kontrolną. Wartość wskaźnika aterogennego LDL-C/HDL-C była wyższa w grupie badanej niż kontrolnej. Grupę pacjentów z chorobą niedokrwienną serca charakteryzowało wyższe niż grupę kontrolną stężenie vWF w osoczu (p< 0,05) i wyższa liczba CEC w krwi obwodowej (p < 0,05). Stężenie cholesterolu HDL korelowało ujemnie ze stężeniem vWF (r = - 0,3123, p < 0,05). Wartość wskaźnika aterogennego LDL-C/HDL-C korelowała dodatnio ze stężeniem vWF (r = 0,2689, p<0,05) i liczbą CEC (r = 0,2438, p<0,05). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy stężeniem cholesterolu całkowitego, cholesterolu LDL i triglicerydów a stężeniem vWF i liczbą CEC. Wnioski: 1. Zwiększone stężenie czynnika von Willebranda w osoczu i zwiększona liczba krążących komórek śródbłonka w krwi obwodowej potwierdzają występowanie uszkodzeń śródbłonka w badanej grupie pacjentów z chorobą niedokrwienną serca. 2. Niskie stężenie cholesterolu HDL jest głównym czynnikiem lipidowym wpływającym na wzrost uszkodzeń biochemicznych i morfologicznych śródbłonka w przebiegu choroby niedokrwiennej serca. 77. Stężenie rozpuszczalnego liganda CD40L w osoczu krwi pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym

Magdalena Lampka1, Zofia Grąbczewska

2, Ewa Jendryczka-Maćkiewicz

3, Elżbieta Piskorska

1, Maria

Krajewska1, Marta Bury

1, Iga Hołyńska-Iwan

1

1Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej, Collegium Medicum w Bydgoszczy UMK Toruń,

Polska, 2Katedra i Klinika Kardiologii i Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum w Bydgoszczy

UMK Toruń, Polska, 3Dział Diagnostyki Laboratoryjnej, Wojewódzki Szpital Obserwayjno-Zakaźny w

Bydgoszczy, Polska Wprowadzenie: Rozpuszczalny ligand CD40 (sCD40L), krążący w krwi obwodowej uznawany jest za nowy marker uszkodzenia blaszki miażdżycowej. Uważa się, że sCD40L bierze udział w patogenezie ostrych zespołów wieńcowych, a jego stężenie w surowicy krwi dobrze odzwierciedla mechanizmy pęknięcia blaszki miażdżycowej, progresji zapalenia i zakrzepicy. Celem pracy jest ocena przydatności oznaczania rozpuszczalnej formy liganda CD40 jako markera uszkodzenia blaszki miażdżycowej u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym oraz określenie zależności pomiędzy stężeniem sCD40L a nasileniem martwicy kardiomiocytów i nasileniem procesów zapalnych. Materiał i Metody: Badaniami objęto 45 pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym (ACS): 25 osób z zawałem serca z uniesieniem odcinka ST (STEMI), 10 osób z zawałem serca bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI) oraz 10 osób z niestabilną chorobą wieńcową (UA). Grupę kontrolną stanowiło 28 ochotników, u których nie występowały kliniczne objawy choroby wieńcowej. Stężenie rozpuszczalnego liganda CD40L oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA. W analizach statystycznych uwzględniono parametry laboratoryjne, które oznaczano w momencie przyjęcia pacjentów do szpitala: stężenie troponiny I (TnI) i liczbę leukocytów (WBC). Wyniki :Stężenie sCD40L było istotnie wyższe w osoczu krwi pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym niż osób z grupy kontrolnej (p < 0,01). Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w stężeniu sCD40L pomiędzy grupą STEMI a grupą NSTEMI i UA. W grupie wszystkich pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym wykazano dodatnią korelację pomiędzy stężeniem sCD40L w osoczu a liczbą leukocytów w krwi obwodowej (r= 0,3086, p < 0,05). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy stężeniem sCD40L a stężeniem troponiny I. Wnioski : 1. Podwyższone stężenia rozpuszczalnej formy liganda CD40L w osoczu krwi pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym wskazują na przydatność oznaczania tego parametru jako markera uszkodzenia blaszki miażdżycowej. 2. Wyższe stężenie sCD40L jest związane z nasileniem procesów zapalnych ocenianych poprzez liczbę leukocytów. 3. Stężenie sCD40L w osoczu krwi pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym nie zależy od nasilenia zmian martwiczych kardiomiocytów. 78. Ekspresja mikrocząstek pochodzenia płytkowego (pmp) u chorych na raka jelita grubego Aleksandra Korniluk

1, Violetta Dymicka-Piekarska

1, Mariusz Gryko

2, Elżbieta Siergiejko

1, Halina

Kemona1

1Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2II

Klinika Chirurgii Ogólnej i Gastroenterologicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska Mikrocząstki pochodzenia płytkowego (PMP) to pęcherzyki błonowe o wielkości 0,05-1 µm, uwalniane podczas aktywacji lub apoptozy płytek krwi. PMP posiadają receptory, oraz wydzielają cytokiny i chemokiny pochodzące z komórek macierzystych, dzięki czemu tak jak płytki krwi uczestniczą w hemostazie, proliferacji komórek śródbłonka i mięśni gładkich, w procesach zapalnych, angiogenezie, a także w progresji nowotworowej. PMP stymulują proliferację komórek nowotworowych, ich przyleganie do fibrynogenu i śródbłonka, co może powodować wzrost inwazyjności nowotworu. Wysoki odsetek PMP koreluje ze złośliwością raka i złym rokowaniem. Sugeruje się także, że PMP mogą być lepszym markerem metastazy niż pochodzące m.in. z płytek krwi VEGF, IL-6 czy RANTES. Celem pracy była ocena odsetka PMP u chorych na raka jelita grubego oraz zbadanie hipotezy czy są one zaangażowane w powstawanie przerzutów a tym samym progresję choroby. Badania przeprowadzono u 22 chorych (10 kobiet i 12 mężczyzn w wieku 53-72 lata) na raka jelita grubego (Adenocarcinoma) oraz u 20 zdrowych osób (9 kobiet i 11 mężczyzn w wieku 49-67 lat) stanowiących grupę kontrolną. Pacjenci byli diagnozowani i zakwalifikowani do leczenia chirurgicznego w II Klinice Chirurgii Ogólnej i Gastroenterologicznej USK w Białymstoku. Pacjenci zostali podzieleni na dwie grupy, ze względu na obecność lub brak przerzutów nowotworowych. Grupa A - 11 chorych bez przerzutów (T1-4N0M0), grupa B- 11 chorych z przerzutami do węzłów chłonnych (TxN+M0). Z badań wyłączono osoby z objawami stanu zapalnego i infekcji oraz przyjmujące w ostatnim czasie leki przeciwpłytkowe. Materiał do badań stanowiła krew żylna pobierana w ilości 2,7 ml na antykoagulant EDTA K2, do probówek typu Monovette (Sarstedt).

Odsetek mikrocząstek oceniano na cytometrze przepływowym FACS Calibur (Becton Dickinson) przy pomocy mikrokulek wielkości od 1µm do 15 µm (Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, USA). Do wyznakowania płytek krwi spośród innych elementów morfotycznych używano przeciwciał monoklonalnych anty-CD61/PerCP (DAKO). Mikrocząstki pochodzenia płytkowego ustalono jako odsetek płytek o wielkości ≤1µm wykazujących pozytywną ekspresję CD 61. Jednocześnie oznaczano liczbę płytek krwi na analizatorze hematologicznym ADVIA 2120 (Siemens). Uzyskane wyniki zostały poddane analizie statystycznej przy pomocy programu Statistica 6.0. Różnice pomiędzy grupami chorych oceniano wykorzystując test t-Studenta dla par, zaś zależność pomiędzy PMP a obecnością przerzutów analizowano wykorzystując współczynnik korelacji rang Spearmana. Odsetek PMP w surowicy pacjentów chorych na raka jelita grubego był czterokrotnie wyższy (10,12±2,42%) niż u osób zdrowych (2,46±0,67%) (p<0,001). Ponadto wykazaliśmy istotny statystycznie wyższy odsetka mikropłytek u pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych (12,31±1,26%) w porównaniu do chorych bez przerzutów nowotworowych (8,99±1,44%) (p<0,05). Podobnie liczba płytek krwi w grupie badanej była istotnie statystycznie wyższa (266,21±92 x10

3/µL)

stosunku do grupy kontrolnej (214,40±13,17 x103/µL) (p<0,009). PLT u pacjentów z przerzutami do

węzłów chłonnych była niższa (249,29±89,84 x103/µL) niż u chorych bez przerzutów (289,34±81,12

x103/µL). W grupie chorych z przerzutami do węzłów chłonnych zaobserwowaliśmy dodatnią korelację

pomiędzy odsetkiem PMP a obecnością przerzutów w węzłach chłonnych (r=0,63: p<0,003). U chorych na raka jelita grubego wykazaliśmy znacząco wyższy odsetek mikrocząstek pochodzenia płytkowego w porównaniu do osób zdrowych, co wskazuje na ich uwalnianie z aktywnych płytek krwi. Odsetek PMP wykazywał tendencję wzrostową wraz z progresją nowotworową, co może pośrednio potwierdzać ich udział w powstawaniu przerzutów. 79. Ocena stężenia ENDOTELINY-1 w surowicy krwi pacjentów z chorobą niedokrwienną serca Maria Krajewska

1, Zofia Grąbczewska

2, Magdalena Lampka

1, Elżbieta Piskorska

1, Iga Hołyńska-

Iwan1, Magdalena Ślązak

1, Tomasz Tyrakowski

1

1Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej, Collegium Medicum w Bydgoszczy UMK Toruń,

Polska, 2Katedra i Klinika Kardiologii i Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum w Bydgoszczy

UMK Toruń, Polska Wprowadzenie: Endotelina-1 (ET-1), uważana za jeden z głównych czynników wpływających na skurcz naczyń krwionośnych, może być wskaźnikiem dysfunkcji śródbłonka. Dysfunkcja śródbłonka naczyniowego to utrata integralności funkcjonalnej, charakteryzująca się zaburzeniem równowagi pomiędzy czynnikami naczyniorozszerzającymi a naczynioobkurczającymi. Głównym źródłem ET-1 są komórki śródbłonka naczyniowego. Celem badań jest ocena przydatności oznaczania endoteliny-1 w surowicy krwi jako markera dysfunkcji śródbłonka u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca. Analizowano zależności pomiędzy dysfunkcją sródbłonka a jego aktywnością prozapalną ocenianą na podstawie stężenia naczyniowej molekuły adhezyjnej-1 (sVCAM-1), uszkodzeniem śródbłonka ocenianym poprzez stężenie czynnika von Willebranda (vWF) oraz nasileniem zmian aterogennych w profilu lipidowym surowicy krwi. Materiał i Metody: Badaniami objęto 40 pacjentów z chorobą niedokrwienną serca: 20 pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego (AMI) oraz 20 pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową (SA). Grupę kontrolną (K) stanowiło 20 ochotników, u których nie stwierdzono klinicznych objawów choroby niedokrwiennej serca. Stężenia ET-1 i sVCAM-1 w surowicy krwi oraz stężenie vWF w osoczu cytrynianowym oznaczono metodą ELISA. W analizach statystycznych uwzględniono stężenia parametrów lipidowych, które zostały oznaczone u badanych pacjentów w momencie przyjęcia do szpitala: cholesterol całkowity (TC), cholesterol LDL (LDL-C), cholesterol HDL (HDL-C), triglicerydy (TG). Na podstawie stężenia parametrów lipidowych wyznaczono wartość wskaźnika aterogennego LDL-C/HDL-C. Wyniki: Stężenie ET-1 było istotnie wyższe w surowicy krwi pacjentów z zawałem mięśnia sercowego niż pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową (p < 0,05) i osób z grupy kontrolnej (p < 0,01). W grupie pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową stężenie ET-1 nie różniło się w sposób istotny statystycznie od wyników grupy kontrolnej. Analiza statystyczna przeprowadzona w grupie obejmującej wszystkich badanych pacjentów i osoby z grupy kontrolnej (AMI + SA + K) wykazała dodatnią korelację pomiędzy stężeniem ET-1 w surowicy a stężeniem sVCAM-1 (r= 0,3041, p < 0,05), stężeniem czynnika vWF (r= 0,2644, p < 0,05) i wartością wskaźnika aterogennego LDL-C/HDL-C (r= 0,2391, p < 0,05). Wnioski: 1. Stężenia ET-1 w surowicy krwi odzwierciedlają dysfunkcję śródbłonka w przebiegu ostrych incydentów wieńcowych, lecz nie w stabilnej chorobie wieńcowej.

2. Stopień dysfunkcji śródbłonka koreluje z nasileniem aktywacji prozapalnej i uszkodzeniem śródbłonka oraz z nasileniem zmian aterogennych w profilu lipidowym surowicy krwi. 80. Wpływ matrycy próbki na oznaczanie cholesterolu we frakcji LDL metodą bezpośrednią w populacji pediatrycznej.. Katarzyna Mamica

1, Krystyna Sztefko

1

1 Zakład Biochemii Klinicznej , P-A Instytutu Pediatrii Collegium Medicum UJ, Polska

Wstęp: Oznaczanie stężenia cholesterolu we frakcji LDL (LDL-C) ma istotne znaczenie w diagnostyce hipercholesterolemii, a wartość wyniku decyduje o rozpoczęciu leczenia hipolipemizującego. Dlatego też uzyskanie wiarygodnego stężenia LDL-C jest istotne z klinicznego punku widzenia. W laboratoriach stosowane są dwie metody do oznaczania stężenia LDL-C: metoda pośrednia oraz metoda bezpośrednia. W metodzie pośredniej stężenie LDL-C jest szacowane według wzoru Friedewalda, w oparciu o stężenia cholesterolu całkowitego (TC), triglicerydów (TG) i cholesterolu frakcji HDL (HDL-C). Metody bezpośredniego oznaczanie stężenia LDL-C wykorzystują reakcje enzymatyczne i czynniki protekcyjne dla LDL lub blokujące lipoproteiny nie-LDL. Jednym z głównych problemów metody bezpośredniej są efekty matrycowe, które mają wpływ na wiarygodność oznaczenia stężenia LDL-C. Jest to szczególnie istotne w próbkach krwi uzyskanych w populacji pediatrycznej, a zwłaszcza od noworodków i niemowląt, u których przemiany biochemiczne zachodzą bardzo szybko pociągając za sobą zmiany wielu podstawowych parametrow. Również w okresie wzrostu i dojrzewania płciowego zmiany parametrów biochemicznych mogą mieć istotny wpływ na oznaczanie LDL-C. Wiarygodność oznaczania stężenia LDL-C ma obecnie zasadnicze znaczenie w świetle wzrastającej częstości występowania hipercholesterolemii w populacji pediatrycznej. Cel pracy: Porównanie oznaczania stężenia LDL-C metodą bezpośrednią i pośrednią u małych dzieci w zależności od stężenia wybranych parametrów biochemicznych. Materiał i Metody: Analizie poddano 531 próbek pochodzących od pacjentów od 2 tygodnia do trzeciego roku życia (średnia 19,5 ± 107,75 miesięcy) leczonych ambulatoryjnie lub hospitalizowanych w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Krakowie. We wszystkich próbkach wykonano oznaczenia stężenia TC, TG, HDL-C i LDL-C oraz oszacowano stężenie LDL-C w oparciu o wzór Friedewalda. Do badań włączono próbki, w których zlecone było oznaczenie stężenia kreatyniny, mocznika, kwasu moczowego, glukozy i białka całkowitego. Oznaczenie stężenia wszystkich frakcji lipidowych zostało wykonane za pomocą metod enzymatycznych przy użyciu analizatora Vitros 5.1. Oceniono wpływ mocznika, kwasu moczowego, kreatyniny, glukozy i białka całkowitego na różnicę (bias) w wartości stężeń cholesterolu frakcji LDL oznaczonych metodą pośrednią i bezpośrednią. Za istotną z punktu widzenia klinicznego różnicę pomiędzy stężeniem LDL-C uzyskanym metoda bezpośrednią i pośrednią przyjęto wartość większą bądź równą 0,5 mmol/l. Wyniki: Niezależnie od matrycy, dla większości badanych próbek zaobserwowano znaczne rozbieżności pomiędzy wynikami stężenia LDL-C uzyskanymi obiema metodami. Udział procentowy wyników stężenia LDL-C, dla których bias wynosił powyżej 0,5 mmol/l mieścił się w zakresie od 20% do 63%. Różnica pomiędzy stężeniem LDL-C oznaczonym metodą bezpośrednią i pośrednią (bias) była najbardziej uzależniona od stężenia białka całkowitego i kreatyniny. Dodatnią liniową korelację uzyskano pomiędzy stężeniem białka całkowitego a wartością bias (r=0,85, p<0,05), natomiast pomiędzy stężeniem kreatyniny a bias stwierdzono ujemną korelację (r=-0,94, p<0,05.). Bias nie zależał ani od stężenia kwasu, moczowego ani od stężenia glukozy. Największy udział procentowy wyników, dla których wartość bias wynosiła powyżej 0,5 mmol/l stwierdzono dla próbek, w których stężenie kreatyniny wynosiło poniżej 16,0 umol/l (63%), stężenia białka całkowitego powyżej 60 g/l (55%) oraz stężenie kwasu moczowego poniżej 250 umol/l (57%). Wnioski: Przy interpretacji wyników stężenia LDL-C oznaczonego metodą bezpośrednią należy zwrócić uwagę na stężenie kreatyniny i białka całkowitego w próbce. 81. Badanie wpływu inhibitora układu tioredoksyna / reduktaza tioredoksyny i indukcji stresu oksydacyjnego na przeżycie i różnicowanie komórek ostrej białaczki szpikowej. Dominika Nowis

1, Justyna Chlebowska

1

1 Zakład Immunologii Centrum Biostruktury WUM, Polska

WSTĘP: Komórki wykształciły szereg mechanizmów umożliwiających inaktywację reaktywnych form tlenu. W tym celu wykorzystują zarówno nieenzymatyczne cząsteczki np. karotenoidy, witaminy E i C ale także złożone układy enzymatyczne, do których należą m.in. peroksydazy, katalazy, dysmutazy ponadtlenkowe, układ glutationu oraz układ tioredoksyna - reduktaza tioredoksyny. Tioredoksyna (Trx) i reduktaza tioredoksyny (TrxR) inaktywują reaktywne formy tlenu zarówno w bezpośredniej reakcji, jak i poprzez redukcję utlenionych białek oraz utrzymując w zredukowanej formie inne enzymy. Większość procesów zachodzących w komórkach nowotworowych, takich, jak przekazywanie sygnałów czy aktywacja czynników transkrypcyjnych, zależy od ich stanu oksydoredukcyjnego. Zwiększone wytwarzanie białek układu tioredoksyna / reduktaza tioreodoksyny w porównaniu do niestransformowanych komórek jest częstą cechą komórek nowotworowych człowieka. Układ Trx/TrxR zmniejsza wpływ stresu oksydacyjnego indukowanego przez kancerogeny, działa ochronnie na komórki nowotworowe promując ich wzrost i hamując proces apoptozy. Zahamowanie układu Trx/TrxR może prowadzić do indukcji stresu siateczki śródplazmatycznej, zatrzymania cyklu komórkowego i indukcji apoptozy, przez co białka te wydają się więc być dobrym celem dla nowych terapii przeciwnowotworowych. Ostre białaczki szpikowe (OBSz) to grupa chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, w których zmienione nowotworowo komórki szeregu mielopoezy proliferują w sposób niekontrolowany, tracą zdolność dojrzewania i zaczynają dominować w obrazie krwi obwodowej pacjentów. Mimo znaczącego postępu w terapii wielu nowotworów układu krwiotwórczego, wyniki leczenia OBSz są nadal niezadowalające. Od niedawna pacjentom z podtypem białaczki M3 (wg FAB) podaje się kwas retinowy oraz trójtlenek arsenu (ATO). Związki te mają promować różnicowanie się komórek białaczkowych hamując aktywność produktu genu fuzyjnego PML-RARα. Prawdopodobnie dodatkowym mechanizmem działania przeciwnowotworowego ATO jest indukcja stresu oksydacyjnego w blastach poprzez zahamowanie reduktazy tioredoksyny. Wobec powyższych faktów zasadne jest przypuszczenie, że zahamowanie aktywności układu Trx/TrxR w liniach komórkowych ostrej białaczki szpikowej z wykorzystaniem inhibitora o kryptonimie SK053

1) może nie tylko wywierać

efekt cytostatyczno-cytotoksyczny, ale również prowadzić do różnicowania się blastów w bardziej dojrzałe stadia mielopoezy. CEL: Zbadanie wpływu SK053 – inhibitora układu Trx/TrxR na przeżycie i różnicowanie komórek ostrej białaczki szpikowej METODY: Początkowo oceniono wpływ cytostatyczny/cytotoksyczny 24, 48 i 72-godzinnej inkubacji komórek linii białaczki promielocytowej HL-60 i NB4 oraz pierwotnych komórek pacjentów z OBSz z SK053 w teście redukcji MTT. Następnie, w oparciu o uzyskane wyniki, komórki inkubowano 48h i 120h z 5 i 10uM SK053, nawirowano na szkiełka podstawowe i oceniono ich morfologię w porównaniu do grup kontrolnych (barwienie metodą May-Grünwald-Giemsa). Wykonano również test redukcji błękitu nitrotetrazolowego (NBT) oraz oceniono błonową ekspresję cząsteczki CD11b, stanowiącą antygen różnicowania neutrofilów, metodą cytometrii przepływowej. WYNIKI: Dla użytych stężeń SK053 uzyskano zmiany w morfologii komórek oraz wzrost odsetka komórek redukujących NBT w przypadku obu linii. Wykazano również, że SK053 powoduje zwiększenie ekspresji markera CD11b na powierzchni komórek linii NB4, natomiast dla komórek linii HL-60 wzrost ekspresji nie jest tak wyraźny. WNIOSKI: Związek SK053, będący inhibitorem układu Trx / TrxR, indukuje różnicowanie komórek ostrej białaczki szpikowej. Projekt finansowany w ramach programu "Iuventus Plus" (IP2011 038971)

82. Określenie wzorca receptorów TLR ulegających ekspresji w obrębie makrofagów izolowanych z wysięków opłucnowych w przebiegu niedrobnokomórkowego raka płuc. Agnieszka Masztalerz

1, Mariusz Kaczmarek

1, Magdalena Kozłowska

2, Agata Nowicka

3, Halina Batura-

Gabryel3, Jan Sikora

1

1Zakład Immunologii, Katedra Immunologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Polska,

2Wielkopolskie Centrum Pulmonologii i Torakochirurgii w Poznaniu, Polska,

3Katedra i Klinika

Pulmonologii, Alergologii i Onkologii Pulmonologicznej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Polska Wstęp: W ostatnim czasie wskazano receptory Toll-podobne (TLR, ang. Toll-like Receptors) jako główną grupę receptorów rozpoznających wzorce molekularne (PRR, ang. Pattern Recognition Receptors). Komórki układu odpornościowego uczestniczące we wrodzonych mechanizmach odpowiedzi immunologicznej, m.in. monocyty/makrofagi, wykazują w swoim obrębie konstytutywną ekspresję większości rodzajów TLR. Makrofagi obecne w nowotworowych wysiękach opłucnowych stanowią specyficzną populację makrofagów towarzyszących nowotworom (TAM, ang. Tumor-

associated Macrophages). W środowisku wysięków do opłucnej powstających w przebiegu niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC, ang. Non-small Cell Lung Cancer) makrofagi często stanowią główną składową odpowiedzi immunologicznej. Cel pracy:celem pracy było określenie ekspresji mRNA receptorów TLR w obrębie makrofagów izolowanych z wysięków opłucnowych. Materiał i metody: Źródłem makrofagów były nowotworowe i nienowotworowe wysięki opłucnowe pozyskiwane do badań diagnostycznych na drodze torakocentezy. Grupa badana obejmuje 25 wysięków opłucnowych (w tym 11 nowotworowych i 14 nienowotworowych). Ocenę ekspresji mRNA przeprowadzono w oparciu o technikę RT-PCR Wyniki i wnioski:Badane makrofagi, niezależnie od etiologii wysięku, wykazały ekspresję mRNA wszystkich receptorów TLR 1-10. W pojedynczych przypadkach nie stwierdzono ekspresji receptorów TLR2 i TLR4. Ekspresja szerokiego repertuaru TLR stanowi o wielokierunkowości pobudzenia makrofagów opłucnowych, szczególnie w odpowiedzi na endogenne ligandy. Nadmierna aktywacja makrofagów może prowadzić na drodze prozapalnych mediatorów do powstawania wysięku lub jego przewlekłego utrzymywania się. Może także sprzyjać zasiedlaniu i rozwojowi przerzutowych komórek nowotworowych. 83. Przeciwciała przeciw receptorowi TSH - ocena zgodnoŚci oznaczeń matodĄ radio-receptorową i immunochemicznąu pacjentów ze schorzeniami tarczycy. Regina Deja

1, Barbara Masłyk

1, Zofia Kołosza

2, Kornelia Hasse-Lazar

3, Anna Chorąży

3, Barbara

Jarząb3

1Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice, Polska,

2Zakład Epidemiologii i Śląski Rejestr Nowotworów, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice, Polska

3Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej, Centrum Onkologii-Instytut oddz.

Gliwice, Polska Wstęp. W diagnostyce biochemicznej chorób tarczycy o podłożu autoimmunologicznym istotną pozycję zajmują oznaczenia poziomu przeciwciał przeciwtarczycowych. Ilościowe oznaczenia przeciwciał przeciw receptorowi TSH (TRAb) są pomocne w diagnozowaniu i monitorowaniu leczenia pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. Poziom TRAb w surowicy określa się obecnie wykorzystując testy radio- receptorowe (RIA) lub immunochemiczne drugiej generacji. Metody oznaczeń różnią się rodzajem stosowanych przeciwciał przeciw ludzkiemu receptorowi tyreotropinowemu, typem receptora TSH, rodzajem znacznika wykorzystanego do uwidocznienia reakcji immunologicznej, czasem inkubacji a także czułością i swoistością analityczną. Cel. Ocena zgodności oznaczeń przeciwciał przeciw receptorowi TSH wykonanych metodą immunochemiczną ECLIA (Electrochemiluminescence immunoassay) oraz techniką RIA, jako metodą odniesienia. Metodyka. Oznaczenia TRAb wykonano równolegle dwiema metodami w 78 próbkach surowicy krwi pochodzących od pacjentów leczonych z powodu nadczynności tarczycy w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa. Techniką ECLIA oznaczenia przeciwciał przeciw receptorowi TSH wykonano na analizatorze Cobas e411 przy użyciu zestawów odczynnikowych Anti-TSHR firmy Roche. Techniką izotopową oznaczenia przeprowadzono z wykorzystaniem zestawów odczynnikowych firmy BRAHMS-TRAK HUMAN RIA, od szeregu lat stosowanych w laboratoriach medycznych.Metoda ECLIA wykorzystuje rozpuszczalny receptor TSH pochodzenia wieprzowego oraz monoklonalne (ludzkie) przeciwciało anty-TSHR, znakowane związkami rutenu. Po utworzeniu kompleksu immunologicznego przyłożenie napięcia do elektrody platynowej powoduje emisję sygnału chemiluminescencyjnego, którego poziom jest odwrotnie proporcjonalny do ilości TRAb w badanej próbce. Czas wykonania oznaczenia na analizatorze wynosi 29 min. Metoda BRAHMS TRAK RIA wykorzystuje probówki opłaszczone ludzkim rekombinowanym receptorem TSH oraz znakowane

125I-TSH pochodzenia bydlęcego. Poziom mierzonego sygnału jest

odwrotnie proporcjonalny do ilości TRAb w testowanych próbkach. Czas wykonania oznaczenia wynosi ok. 4 godzin. Analizę statystyczną korelacji wyników TRAb wg Pearsona przeprowadzono dla całego zakresu otrzymanych stężeń oraz odrębnie dla przedziału od 1- 10 IU/L. Do oceny zgodności wyników oznaczeń TRAb między metodami wykorzystano test Mc Nemara. Wyniki. Stężenie TRAb w badanej grupie mieściło się w zakresie: 0,30-149,20 IU/L dla metody ECLIA oraz 0,10-143,0 IU/L dla metody RIA jako metody odniesienia. Mediany wynosiły odpowiednio: 1,18 IU/L i 1,30 IU/L . Wykazano liniową zależność między wynikami otrzymanymi obiema metodami. Uzyskano współczynnik korelacji równy 0,9835 dla całego zakresu pomiarowego oraz 0,9265 dla

zakresu 1,00 IU/L- 10,00 IU/L. Wartość współczynnika nachyleniowego była bliska jedności i wyniosła 1,0383, a współczynnika odcinającego -0,08. Ocenę zależności różnic pomiędzy wynikami oznaczeń TRAb uzyskanymi obu metodami od średnich stężeń tych przeciwciał przeprowadzono metodą Bland i Altman

, . Analiza nie wykazała istotnych różnic między metodami. Po przyjęciu wartości odcinających

podanych przez producentów zestawów tj. 1,75 IU/L dla metody ECLIA oraz 1,5 IU/L dla metody RIA testem Mc Nemara wykazano zgodność wyników otrzymanych porównywanymi metodami w 99% przypadków. Wnioski. W przeprowadzonym badaniu wykazano wysoką zgodność wyników otrzymanych metodą immunochemiczną z wynikami uzyskanymi z wykorzystaniem metody odniesienia RIA. Wykazano, że rodzaj stosowanego w porównywanych metodach receptora TSH, przeciwciał i znacznika oraz rodzaj zastosowanej techniki pomiarowej i metody obliczeniowej wyników z krzywej standardowej nie wpływają istotnie na wartości uzyskiwanych stężeń TRAb. Natomiast automatyzacja oznaczeń immunochemicznych w znacznym stopniu pozwala skrócić czas oczekiwania na wynik badania. 84. Przeciwciała skierowane przeciwko antygenom bakteryjnym w surowicach pacjentów z pierwotną żółciową marskością wątroby. Alicja Bauer

1, Andrzej Habior

2

1 Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Polska,

2 Klinika Gastroenterologii i Hepatologii, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Polska

Pierwotna żółciowa marskość wątroby (PBC) jest postępującą, przewlekłą chorobą o złożonej, autoimmunologicznej patogenezie, przebiegającą z niszczeniem drobnych wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych i następującą cholestazą, odczynem zapalnym, a następnie włóknieniem i marskością. Diagnoza PBC opiera się na klinicznych, histologicznych i immunologicznych kryteriach. Specyficznymi markerami u ok. 90% pacjentów są przeciwciała antymitochondrialne (anty-M2) i u ok. 50% pacjentów także przeciwciała antyjądrowe. Główne autoantygeny jądrowe zlokalizowane są w otoczce jądrowej (glikoproteina –gp210, nukleoporyna p62 i receptor laminy B). Ostatnio jako istotne dla PBC rozpatruje się także białka kompleksu PML (ciałka Kremera) – Sp100 i Sp140. Zgodnie ze współczesnymi doniesieniami wydaje się, że choroby autoimmunizacyjne wątroby mogą być rezultatem interakcji pomiędzy autoantygenami, predyspozycją genetyczną i zaburzeniem mechanizmów apoptozy. Pod dyskusję poddawany jest również wpływ czynników infekcyjnych na patogenezę PBC, jak E.coli, Chlamydia pneumoniae, Yersinia enterolitica, Helicobacter pylori, czy Mycoplasma pneumoniae, związany z mimikrą molekularną. Czynniki infekcyjne mogą odgrywać rolę w utracie tolerancji immunologicznej. Wytworzone przeciwciała niszczą patogen oraz komórki gospodarza mające homologiczne epitopy. Drobnoustroje mogą wnikać do wątroby przez makrofagi tkankowe i rozprzestrzeniać się do przewodów żółciowych lub poprzez bezpośrednią translokację przez enterocyty i migrację ze światła jelita do dróg żółciowych. Mogą działać jako specyficzny inwazyjny patogen odpowiedzialny za wywołanie zmian zapalnych, albo jako źródło antygenów wzbudzających nieprawidłową odpowiedź układu odpornościowego, z uwalnianiem mediatorów zapalenia o działaniu destrukcyjnym, przy zaburzonych mechanizmach regulacyjnych. Celem naszej pracy było zbadanie obecności przeciwciał skierowanych przeciw różnym antygenom bakteryjnym jak Chlamydia pneumonia, Yersinia enterolitica, Helicobacter pylori, Mycoplasma pneumoniae w surowicach pacjentów z PBC oraz z innymi autoimmunizacyjnymi chorobami wątroby. Materiał i Metody: Grupy badane: pacjenci Kliniki Gastroenterologii i Hepatologii CMKP z klinicznymi objawami: PBC –92, PSC (pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych) - 30, AIH (autoimmunologiczne zapalenie wątroby) – 17, zdrowi dawcy - 30. Przeciwciała skierowane przeciw antygenom bakteryjnym oznaczano testem handlowym firmy Euroimmun (Niemcy). Wyniki : Oznaczono poziom przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom bakteryjnym: anty-chlamydia pneumoniae (Cpn), anty-yersinia enterocolitica, anty-helicobacter pylori, anty-Mycoplasma pneumoniae w surowicach pacjentów z PBC oraz w surowicach kontrolnych. Przeciwciała przeciwko Cpn IgG wykryto u 74% pacjentów z PBC. Średni poziom oznaczonych przeciwciał w grupie PBC był znacznie wyższy niż w grupach kontrolnych (90-85 vs 55-50, 40-35 Ru/ml). Wykrywalność Cpn IgG w grupie PBC była również znacznie wyższa niż w grupach kontrolnych PSC, AIH, zdrowi odpowiednio 74%, 40%, 22%, 23% . Wykrywalność anty-yersinia enterocolitica IgG była odpowiednio 40%, 0%, 0%, 10%. Średni poziom oznaczonych przeciwciał w grupie PBC był wyższy niż w grupie zdrowych dawców (75-70 vs 20-15 Ru/ml). Wykrywalność anty- Helicobacter pylori IgG kształtowała się odpowiednio 84%, 40%, 15%, 12%, anty-. Helicobacter pylori CagA IgG: 41%, 10%, 2%, 0%, anty-

Mycoplasma pneumoniae IgG: 39%, 17%, 14%, 5%. Zbadano zależność pomiędzy występowaniem przeciwciał przeciwko antygenom bakteryjnym i przeciwciał charakterystycznych dla PBC, przede wszystkim skierowanych przeciwko antygenowi M-2, a także poziomem parametrów biochemicznych. W grupie pacjentów z dodatnimi przeciwciałami antymitochondrialnymi stwierdzono w 80% występowanie przeciw antygenom bakteryjnym, w grupie pacjentów z ujemnymi przeciwciałami antymitochondrialnymi w ok. 50%. Wnioski : Otrzymane wyniki mogą potwierdzać zależność pomiędzy PBC a infekcjami bakteryjnymi, której podłożem jest mimikra molekularna. 85. Ekspresja genu kodującego odwrotną transkryptazę telomerazy w tkance nowotworowej u pacjentów z rakiem płuca oznaczana metodą Q-RT-PCR w technologii TAQMAN Marzena Zalewska-Ziob

1, Brygida Adamek

1, Gizela Trapp

1, Ewa Romuk

2, Klaudia Plinta

3, Andrzej

Wiczkowski1

1 Katedra i Zakład Ogólnej Biologii Lekarskiej w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach,

Polska, 2 Katedra Biochemii, Zakład Biochemii w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny, w Katowicach,

Polska, 3 Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Zakładzie Ogólnej Biologii Lekarskiej w Zabrzu,

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Polska

Wstęp : Telomeraza, kompleks złożony z RNA i białka katalitycznego o aktywności odwrotnej transkryptazy, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu długości telomerów i integralności chromosomów. Odwrotna transkryptaza telomerazy jest produktem swoistego genu – hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase). Kompleks pozostaje stale aktywny w komórkach macierzystych i komórkach germinalnych, natomiast fizjologicznie nie stwierdza się jego aktywności w zróżnicowanych komórkach somatycznych. Uaktywnienie telomerazy w komórkach transformowanych eliminuje stopniowe skracanie się telomerów po kolejnych podziałach i umożliwia komórkom nieograniczoną proliferację.Aktywność telomerazy stwierdzono w komórkach wielu ludzkich nowotworów, między innymi zlokalizowanych w płucach. Rak płuca jest najczęstszą przyczyną zgonów z powodu choroby nowotworowej w Polsce. Pomimo stałego doskonalenia metod diagnostycznych i leczniczych, odległe wyniki leczenia są wciąż niezadowalające – pięcioletni czas przeżycia osiąga jedynie 10 - 15% chorych. Pogłębienie wiedzy na temat molekularnych uwarunkowań procesu karcynogenezy w tkance płucnej może przyczynić się do lepszej kwalifikacji chorych do skojarzonych metod leczenia oraz stworzyć nowe możliwości terapii, w tym terapii genowej.Cel: Porównanie ekspresji genu kodującego odwrotną transkryptazę telomerazy w tkance nowotworowej i fragmentach prawidłowej tkanki płucnej u pacjentów z rakiem płuca oraz określenie zależności pomiędzy ekspresją badanego genu a typem histologicznym nowotworu.Materiał i metodyka:Grupę badaną stanowiło 41 pacjentów (12 kobiet, 29 mężczyzn) z rozpoznanym w badaniu histopatologicznym rakiem gruczołowym (N=12) lub płaskonabłonkowym (N=29); średnia wieku wynosiła 62±8,03. Do oceny ekspresji genu hTERT oraz genu konstytutywnego GAPDH wykorzystano technikę ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (Q-RT-PCR – Quantitiative Real Time PCR). Z badanych tkanek wyizolowano RNA, które następnie przepisano na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Uzyskane cDNA posłużyło do oceny ekspresji genu badanego oraz konstytutywnego (GAPDH) w technologii TaqMan. Otrzymane wartości ekspresji dla genu hTERT normalizowano względem zastosowanej kontroli wewnętrznej (GAPDH), w wyniku czego uzyskano wartości względne, bezwymiarowe, pozwalające na dokonanie porównań pomiędzy analizowanymi grupami. Wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu programu Statistica 10.0 wersja PL. Porównania pomiędzy grupami dokonano testem t-Studenta. Za istotne statystycznie uznawano wartości przy poziomie istotności p≤0,05.Wyniki:Średnia ekspresja genu hTERT w tkance nowotworowej była znacząco wyższa w porównaniu z aktywnością w tkance prawidłowej (p=0,04). Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w aktywności enzymu w tkance gruczolakoraka w porównaniu z rakiem płaskonabłonkowym (p=0,6).Wnioski: 1.Wysoka ekspresja genu kodującego odwrotną transkryptazę telomerazy w raku płuca sugeruje aktywny udział tego enzymu w proliferacji komórek nowotworowych. 2.Wstępne wyniki sugerują, iż ekspresja genu hTERT w tkance nowotworowej nie jest parametrem różnicującym raka gruczołowego i płaskonabłonkowego.

86. Ocena oddziaływania toksycznego protez serca w długoterminowych doŚwiadczeniach in vivo. Karolina Janiczak

1, Magdalena Kościelniak-Ziemniak

1, Roman Kustosz

1, Małgorzata Gonsior

1, Helena

Zawisza2, Jerzy Nożyński

2, Michał Czingon

3, Piotr Ścigała

4

1 Pracownia Sztucznego Serca, Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii, Polsk,

2 Pracownia Histopatologii,

Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii, Polska, 3 Gabinet Weterynaryjny Michał Godziek, Rybnik, Polska

4 Przychodnia dla Zwierząt, Piekary Śląskie, Polska

WSTĘP:W ramach programu „Polskie Sztuczne Serce” opracowano pozaustrojową, pulsacyjną protezę wspomagania serca Religa Heart EXT. Pompa oraz materiały konstrukcyjne zostały poddane ocenie biozgodności zgodnie z normą PN EN ISO 10993. Ostatnim etapem badań przedklinicznych były długoterminowe eksperymenty in vivo gdzie ocenie podlegały bezpieczeństwo, funkcjonalność i oddziaływanie protezy na krew oraz efekt wspomagania serca. Szczególnej ocenie poddano ryzyko toksycznego oddziaływania protezy na organizm, związane z długoterminowym kontaktem biomateriałów z przepływającą krwią, gdzie w wyniku oddziaływań chemicznych i enzymatycznych może dochodzić do degradacji oraz uwalniania substancji z polimerów. Celem analiz przeprowadzonych w ramach długoterminowych przedklinicznych badań doświadczalnych była ocena wpływu toksycznego protez serca na tkanki oraz narządy wewnętrzne zwierząt doświadczalnych. MATERIAŁY I METODYKA:Średni czas wspomagania lewej komory serca wynosił 33 dni Jako zwierzęta doświadczalne zastosowano samce świni rasy Wielka Polska Biała o masie w granicach 60-80kg (n=3). W trakcie obserwacji zwierzą oceniano oddziaływanie toksyczne na organizm z zastosowaniem panelu badań hematologicznych i biochemicznych krwi oraz oceny histopatologicznej po zakończeniu doświadczenia. Pełen panel badań diagnostycznych przeprowadzano raz dziennie, obejmował on: morfologię, stężenie wolnej hemoglobiny w osoczu, AST, ALT, amylazę, kreatyninę, bilirubinę całkowitą i bezpośrednią. Okresowo wykonywano rozmaz krwi obwodowej barwiony standardowo z zastosowaniem barwników May-Grunwalda i Giemsy. Próbki tkanek i narządów miękkich do oceny histopatologicznej zostały pobrane podczas autopsji zwierząt doświadczalnych. Pobrane wycinki dotyczyły narządów i tkanek: serca, aorty, płuca, śledziony, wątroby, nerek, trzustki. Tkanki bezpośrednio po pobraniu utrwalono w 4% zbuforowanym formaldehydzie o pH 6,9 a następnie przygotowywano materiał do badania histologicznego metodą parafinową. Preparaty barwiono z użyciem hematoksyliny i eozyny oraz trichromu Massona a następnie poddano ocenie w mikroskopii świetlnej. WYNIKI:W badaniach diagnostycznych obserwowano tendencję spadkową elementów morfotycznych związany z utratą krwi do jam ciała. W rozmach krwi obwodowej nie stwierdzono nie typowych elementów morfotycznych. Przez cały okres obserwacji u wszystkich zwierząt doświadczalnych obserwowano stężenia wolnej hemoglobiny w osoczu mieszczące się w granicach normy. Markery biochemiczne AST, ALT, bilirubina, kreatynina, amylaza oscylowały w granicach normy dla zwierząt doświadczalnych.W ocenie histopatologicznej w dwóch pierwszych eksperymentach dominowały zmiany związane z infekcją, obserwowano stany zapalne w płucach oraz śródmiąższowe zapalenie nerek. Stwierdzono również niewielkie zmiany zapalne w aorcie, w miejscu zespolenia naczynia z kaniulą wypływową. Obraz pozostałych narządów był stosowny do stanu pooperacyjnego (odczyny resorpcyjne), Nie stwierdzono zmian o etiologii toksycznej w obrazie histopatologicznym pobranych tkanek . WNIOSKI:Obserwowane obrazy histopatologiczne tkanek i narządów oraz przeprowadzone badania krwi w czasie wspomagania serca potwierdziły brak toksycznego oddziaływania protezy na organizm zwierząt doświadczalnych.. W przeprowadzonym panelu badań krwi obserwowano jedynie tendencją spadkową liczby elementów morfotycznych związaną z utratą krwi do jam ciała. Zmiany zaobserwowane w aorcie powstały w wyniku przeprowadzonego zabiegu operacyjnego i miały charakter typowy dla okresu pooperacyjnego. Zmiany stwierdzone w obrębie płuc i nerek były wynikiem infekcji nabytych przez zwierzęta przed implantacją oraz powikłanych w wyniku osłabienia organizmu zwierząt po zabiegu. Rezultaty badania doświadczalnego potwierdzają biozgodność badanej pozaustrojowej pompy wspomagania serca Religa Heart EXT. 87. Homeostaza kwasowo-zasadowa i wodno-elektrolitowa u zwierząt mechanicznie wspomaganych pompą religa heart EXT w długoterminowych doświadczeniach przedklinicznych. Magdalena Kościelniak-Ziemniak

1, Karolina Janiczak

1, Roman Kustosz

1, Artur Kapis

1, Małgorzata

Gonsior1, Jerzy Pacholewicz

2, Grzegorz Religa

3, Piotr Ścigała

4, Michał Czingon

5

1 Pracownia Sztucznego Serca, Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii, Polska,

2 Oddział Kliniczny

Kardiochirurgii i Transplantologii, Śląskie Centrum Chorób Serca, Polska, 3 II Klinika Kardiochirurgii i

Transplantologii, Instytut Kardiologii, Polska, 4 Przychodnia dla Zwierząt, Piekary Śląskie, Polska

5 Gabinet Weterynaryjny Michał Godziek, Rybnik, Polska

WSTĘP: W ciągu ostatnich lat niewydolność serca stała się dominującym problemem współczesnej kardiologii i kardiochirurgii. W grupie chorych ze skrajną niewydolnością serca nadal „złotym standardem” w leczeniu jest przeszczepienie serca. Możliwości medycyny transplantacyjnej ze względu na dostępność narządów są ograniczone. Badania naukowe mocno koncentrują w kierunku rozwoju alternatywnych metod leczenia skrajnej niewydolności serca, m.in. mechanicznego wspomagania serca. W ramach programu „Polskie Sztuczne Serce” zaprojektowano prototyp pozaustrojowej protezy serca Religa Heart EXT. Ostatecznym etapem weryfikacji przedklinicznej z założonymi właściwościami funkcjonowania prototypu pozaustrojowej pompy RHE stanowiły długoterminowe badania In vivo. Doświadczenia na dużych zwierzętach są jedyną metodę sprawdzenia poprawności działania protezy serca we współpracy z żywym organizmem. Ze względu na analogie anatomiczne serca i fizjologii krwi w doświadczeniach jako model zwierzęcy wykorzystano świnie. Istotnym aspektem doświadczeń było zapewnienie pełnego monitoringu podstawowych badań diagnostycznych zwierzęcia odzwierciedlających stan kliniczny ze szczególnym uwzględnieniem parametrów gospodarki kwasowo-zasadowej i wodno-elektrolitowej. MATERIAŁY I METODY: Zwierzętami eksperymentalnym poddanym procedurom wszczepienia pompy mechanicznego wspomagania serca były 3 samce świni o wadze od 63 do 75 kg. Podczas eksperymentu monitorowano parametry laboratoryjne podstawowych funkcji przyżyciowych zwierząt w tym parametry oceny gospodarki kwasowo-zasadowej i wodno-elektrolitowej. Krew do badań pobierano w systemie zamkniętym, z wkłucia centralnego w tętnicy szyjnej. Równowaga kwasowo-zasadowa wraz z elektrolitami kontrolowane były za pomocą analizatora I-stat® (Abott, USA). Wybrane parametry biochemiczne: kreatyninę, mocznik, magnez i glukozę oznaczano na weterynaryjnym analizatorze RT 1904 Vet (Rayto Electronics Inc, Chiny). Poziom wiarygodności wyników monitorowano. WYNIKI: Wartości pH oceniano na podstawie trendu parametru, za prawidłowe przyjęto zakres od pH ok. 7.48 do 7.57. pH krwi zwierząt przez większość okresu mechanicznego wspomagania serca wahały się w przedziale wyznaczonych wartości referencyjnych. Odnotowano krótkotrwałe kwasice oddechowe jak i zasadowice metaboliczne. Zmienne wartości pH korygowano podając dożylnie wodorowęglan sodu NaHCO3. Analizowane parametry poziomu CO2, HCO3

-,BE

- , O2 wskazywały na

prawidłowe zjawiska kompensacji układu buforowego zwierząt. U świń odnotowano silne tendencje do hipokaliemi, pomimo podawanych preparatów chlorku potasu w dawkach: doustnie 600 mg/24h i we wlewie 323mEq/24h. Średnie wartości stężenia sodu oscylowały w przedziale wartości referencyjnych. Wartości stężeń glukozy kształtowały się na poziomie górnej granicy normy. Bieżącą gospodarkę wodno-elektrolitową odzwierciedlał poziom mocznika w surowicy zwierząt, którego wartości były znacznie poniżej dolnej granicy normy. Stężenia magnezu zwierząt były zmienne z tendencją spadkową. Niedobory magnezu we krwi korygowano zarówno preparatem doustnym ChelaMag B6 (2g/24h) jak i iniekcjami dożylnymi Mg2SO4 (2g/24h). Stężenia kreatyniny w surowicach zwierząt były prawidłowe. WNIOSKI: Gospodarka kwasowo-zasadowa i wodno-elektrolitowa podczas zaprezentowanych eksperymentów była monitorowana w sposób prawidłowy. Zaproponowany panel badań diagnostycznych w pełni odzwierciedlał homeostazę buforów krwi jak i poziomu elektrolitów surowicy, a otrzymane wyniki stanowiły podstawę do zastosowania prawidłowej farmakoterapii. Kwasice oddechowe indukowane były przedoperacyjną intubacją zwierząt. Zasadowice metaboliczne związane były z zaburzonym pasażem jelitowym zwierząt. Przedstawione tendencje zwierząt do hipokaliemii prawdopodobnie korelowały z podwyższonymi wartościami glukozy we krwi co wymuszało nasiloną diurezę osmotyczną, która w konsekwencji prowadziła do utraty płynów i potasu drogą nerkową. Stałe wlewy dożylne płynów NaCl, Ringera i PWE, dodatkowo zwiększały diurezę zwierząt, co manifestowało się niskimi poziomami mocznika we krwi. Funkcja nerek zwierząt podczas eksperymentów była zachowana. 88. Ocena trombogenności powierzchni węgla szklistego dedykowanego dyskom mechanicznych zastawek dla polskich pomp wspomagania serca.. Magdalena Kościelniak-Ziemniak

1, Maciej Gawlikowski

1, Piotr Wilczek

2, Stanisław Duber

3, Agnieszka

Szuber1, Roman Kustosz

1, Małgorzata Gonsior

1, Jacek Moll

4

1Pracownia Sztucznego Serca, Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii, Polska,

2Pracownia Bioinżynierii,

Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii, Polsk, 3Wydział Nauk o Ziemii, Uniwersytet Śląski, Polska

4Katedra Pediatrii, Kardiologii i Kardiochirurgii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska

Wstęp: Choroby serca są jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie jak i w Polsce a z drugiej strony wraz z rozwojem kardiologii i kardiochirurgii zwiększa się liczba pacjentów poddawanych inwazyjnym zabiegom serca. Często przyczyną rozwijającej się skrajnej niewydolności serca może być nasilająca się wada samej zastawki lub całego mięśnia sercowego. Aktualnie chirurgiczny zabieg wymiany chorobowo zmienionej zastawki serca lub wszczepienie mechanicznego systemu wspomagania serca stanowią jedną z głównych metodę leczenia w sytuacji, w której leczenie farmakologiczne zostało wyczerpane. Zastosowanie protez serca wiąże się z poszukiwaniem biozgodnych biomateriałów, które ograniczą maksymalnie ryzyko adhezji i aktywacji płytek krwi pacjenta co przyczyni się bezpośrednio do ograniczenia stosowania leków przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych. Celem przeprowadzonego badania była ocena własności trombogennych węgla szklistego - otrzymanego metodą polimeryzacji i pirolizy alkoholu furfurylowego z katalizatorem - jako materiału konstrukcyjnego dysku zastawki mechanicznej. Materiały i metody: Trombogenność węgla szklistego badano w warunkach dynamicznego kontaktu powierzchni materiału z świeżą krwią, z wykorzystaniem analizatora funkcji płytek krwi – Impact-R (DiaHem, Szwajcaria). Potencjalne trombogenne właściwości badanego materiału określono poprzez ocenę stopnia aktywacji i adhezji trombocytów. Stopień aktywacji płytek krwi po kontakcie z biomateriałem określono i porównano poprzez wyznakowanie receptorów komórkowych CD 62 – trombocytarnego i CD 45 leukocytarnego na cytometrze przepływowym FC500 (Beckan Coulter, Niemcy). Stopień adhezji płytek krwi na powierzchni biomateriałów określono poprzez ocenę liczebności komórek zaadherowanych na powierzchni badanych biomateriałów w mikroskopie fluorescencyjnym po przeprowadzonym doświadczeniu. Obserwacje prowadzono z zastosowaniem mikroskopu badawczego Axio Observerver (Zeiss, Niemcy). Analiz danych dokonano z użyciem programu AxioVision 4.6. Wyniki: Eksperyment przeprowadzono z użyciem świeżej krwi jednego zdrowego dawcy, po wstępnych badaniach kwalifikacyjnych. cenę normalności rozkładu zmiennej losowej przeprowadzono z wykorzystaniem testu Kołmogorowa-Smirnova. Do zbadania homogeniczności wariancji w badanych grupach zastosowano test Levene'a. Dla wyników o rozkładzie normalnym stosowano test t- Studenta, a w przeciwnym wydarzeniu testem U Manna-Whitneya. Analizę statystyczną wyników przeprowadzono nieparametrycznym testem U Manna-Whitneya na poziomie istotności p=0.05. Wykazano, że liczba zaktywowanych komórek we krwi wolnostojącej oznaczana przed i po eksperymencie jest zbliżona. Nie wykazano znamiennie istotnych statystycznie różnic w aktywacji krwi kontaktowanej z badanym materiałem. Wyniki analiz aktywacji agregatów leukocytarno-płytkowych krwi po kontakcie z badaną powierzchnią węgla szklistego i powierzchnią polistyrenową nie miały rozkładu normalnego, do analizy wyników zastosowano test U Manna-Whitney. Otrzymane wyniki nie wykazały statystycznie różnic w wartościach średnich zmiennych losowych w grupie badanego biomateriału do referencyjnego materiału. Poziom aktywacji agregatów L+P (leukocytarno-płytkowych) badanej powierzchni był na porównywalnym poziomie jak aktywności agregatów L+P powierzchni polistyrenowej. Wyniki badań dotyczące adhezji agregatów L+P badanego materiału węgla szklistego i referencyjnego po testach Impact-R analizowano testem U Manna-Whitney. Analiza statystyczna jednoznacznie wskazała brak znamiennie statystycznych różnic median liczby zadherowanych elementów L+P w grupach badanych. Potencjał atrombogenny badanego materiału węgla szklistego był zbliżony do materiału polistyrenowego. Wnioski: Poziom aktywacji agregatów leukocytarno-płytkowych badanego biomateriału wykonanego z węgla szklistego był porównywalny do poziomu aktywacji materiał referencyjnego stosowanego w testach Imapct-R. Poziom adhezji agregatów leukocytarno-płytkowych na powierzchni badanego materiału był zbliżony do poziomu adhezji agregatów L+P na powierzchni polistyrenu. Omawiany charakter zjawisk należy dodatkowo odnieść do struktury powierzchni badanego biomateriału. 89. Ocena przydatności mikrorna krążących w osoczu krwi obwodowej, jako biomarkerów nowotworowych w niedrobnokomórkowym raku płuca. Maria Sromek

1, Maciej Głogowski

1, Mariusz Kulińczak

1, Magdalena Chechlińska

1, Dariusz Wąsowski

1,

Robert Włodarczyk1, Łukasz Talarek

1, Mariusz Żmijewski

1, Krzysztof Piech

1, Maciej Turski

1, Klara

Zakrzewska1, Justyna Owczarek

1, Piotr Wiśniewski

1, Jan Konrad Siwicki

1

1 Warszawa, Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Polska

Wstęp: Zaburzenia ekspresji mikroRNA mają istotny udział w powstawaniu i rozwoju nowotworów. Niektóre mikroRNA są potencjalnymi biomarkerami diagnostycznymi, predykcyjnymi i prognostycznymi. Niewiele jednak wiadomo na temat użyteczności krążących mikroRNA, w diagnostyce i monitorowaniu leczenia chorób nowotworowych. Duża śmiertelność wśród chorych na niedrobnokomórkowego raka płuc jest jednym z powodów, dla których wciąż szuka się dobrych markerów prognostycznych i predykcyjnych dla tego nowotworu. Wprowadzone dotąd nowe terapie i strategie leczenia nie przynoszą bowiem oczekiwanych efektów. Celem planowanych badań było: 1/ opracowanie procedury pomiaru poziomu ekspresji mikroRNA w próbkach osocza krwi obwodowej, 2/ ocena poziomu ekspresji wybranych mikroRNA, w tym mikroRNA-205, w próbkach osocza pochodzących od osób zdrowych oraz od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przed oraz po zabiegu usunięcia guza w celu sprawdzenia przydatności tych mikroRNA, jako krążących biomarkerów w diagnostyce i monitorowaniu leczenia tego nowotworu. Materiał i metody: Materiał kliniczny stanowiły próbki krwi obwodowej 25. pacjentów (9 kobiet i 16. mężczyzn) Kliniki Nowotworów Płuca i Klatki Piersiowej Centrum Onkologii-Instytutu w Warszawie, chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca, pobierane 1 dzień przed zabiegiem usunięcia guza oraz 1 miesiąc po zabiegu. Materiał kontrolny stanowiło 20 próbek krwi pobranej od zdrowych, dorosłych dawców (10 kobiet i 10. mężczyzn). RNA izolowano przy użyciu komercyjnego zestawu GeneMATRIX Universal RNA/miRNA Purification Kit (EURX). Ekspresję mikroRNA oznaczano techniką RT-qPCR z zastosowaniem komercyjnych zestawów „TaqMan MicroRNA” i wykorzystaniem m.in. mikroRNA-24, jako mikroRNA referencyjnego. Wyniki i wnioski: 1/ Sprawdziliśmy szereg parametrów procedury izolacji RNA z pilotowej serii próbek osocza krwi obwodowej pod kątem wydajności oraz czystości uzyskiwanych preparatów z użyciem dwóch zestawów do izolacji RNA (mirVana/Applied Biosysytems oraz GeneMATRIX Universal RNA/miRNA Purification Kit/EURX). Wybraliśmy zestaw firmy EURX, ze względu na porównywalną skuteczność izolacji RNA oraz bardzo dobrą wydajność. 2/ Dokonaliśmy weryfikacji przydatności mikroRNA-24, jako mikroRNA referencyjnego poprzez stwierdzenie, że poziomu jego ekspresji jest stabilny w wybranych próbkach osocza krwi obwodowej od zdrowych dawców oraz od pacjentów chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca.3/ Stwierdziliśmy, że w większości zanalizowanych przypadków poziom ekspresji mikroRNA-205 w osoczu krwi obwodowej pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca jest wyższy w porównaniu z osobami zdrowymi, natomiast poziom ekspresji tego mikroRNA ulega wyraźnemu spadkowi po usunięciu guza. Nasze wstępne wyniki sugerują przydatność wybranych mikroRNA, w tym mikroRNA-205, jako krążących biomarkerów w diagnostyce i monitorowaniu leczenia tego nowotworu. 90. Prognostyczne znaczenie liczby płytek krwi u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. Barbara Masłyk

1, Regina Deja

1, Monika Giglok

2, Katarzyna Galwas-Kliber

2, Joanna Gliwińska

1, Marzena

Gawkowska-Suwińska3, Anna Drosik

4, Urszula Dworzecka

2, Zofia Kołosza

5, Rafał Suwiński

2

1 Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska,

2 II Klinika

Radioterapii i Chemioterapii, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 3 III Klinika

Radioterapii i Chemioterapii, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 4 Klinika Onkologii

Klinicznej i Doświadczalnej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 5 Zakład Epidemiologii i

Śląski Rejestr Nowotworów, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska Wstęp: Oznaczenie liczby płytek krwi jest jednym z podstawowych badań hematologicznych zlecanych u chorych na nowotwory. Płytki krwi odgrywają istotną rolę w procesie zapalnym, a także w przebiegu procesu nowotworowego, w tym angiogenezie i przerzutowaniu. Płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) jest jednym ze stymulatorów angiogenezy, wydzielanym zarówno przez aktywowane płytki krwi, jak i przez komórki śródbłonka naczyń i komórki guza nowotworowego. Cel: Celem pracy była ocena wartości liczby płytek krwi i stężenia płytkopochodnego czynnika wzrostu jako czynników prognostycznych u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca Materiał/Metody: Badaniem objęto grupę 462 chorych leczonych w Centrum Onkologii - Instytucie z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca, w tym raka płaskonabłonkowego 271 (58,8%), gruczołowego 90 (19,5%) chorych. Stopień zaawansowania klinicznego oceniono zgodnie z klasyfikacją TNM, jako I-II: 60 (13%), III: 304 (65,8%), IV: 92 (19,9%). Wszyscy chorzy zostali poddani

radioterapii na obszar guza i regionalnych węzłów chłonnych, u 67% chorych zastosowano chemio-radioterapię. Radioterapię radykalną zastosowano u 57,6% chorych, u 42,4% leczenie paliatywne. Wszystkie analizowane parametry laboratoryjne oznaczono przed rozpoczęciem leczenia; liczbę płytek krwi z wykorzystaniem analizatora hematologicznego (Sysmex XE-2100), natomiast stężenie PDGF-BB metodą ELISA (RayBiotech, Inc.). Wpływ poziomu badanych zmiennych na przeżycie chorych oceniono z użyciem testu log-rank, jako wartość odcięcia przyjmując medianę stężeń. Analizę wieloczynnikową przeprowadzono za pomocą modelu regresji proporcjonalnego hazardu Coxa. Wyniki: W badanej grupie chorych liczba płytek krwi mieściła się w zakresie 51-832 x10

3/µl (mediana

271 x103/µl), wartość płytkokrytu 0,1-0,76% (mediana 0,26%), stężenie PDGF-BB 6-400 pg/mL

(mediana 243 pg/mL). W przeprowadzonym badaniu, obok uznanych niekorzystnych czynników rokowniczych tj. wiek (p<0,0002), stopień zaawansowania klinicznego (p<0,0005) i stan sprawności wg. ZUBROD (p<0,0008); w analizie jednoczynnikowej wykazano znamienny statystycznie niekorzystny wpływ wysokiej wyjściowo liczby płytek krwi (p<0,0000), płytkokrytu (p<0,0006) i PDGF-BB (p<0,02) na przeżycie całkowite chorych. Wykazano niekorzystny wpływ wysokiej liczby płytek krwi przed leczeniem na przeżycie wolne od wznowy miejscowej (p<0,006) i przeżycie wolne od przerzutów odległych (p<0,01). Analiza wieloczynnikowa wykazała, że spośród analizowanych parametrów hematologicznych i biochemicznych tylko liczba płytek krwi jest niezależnym czynnikiem rokowniczym (p<0,0000) u chorych na niedrobnokomórkowego raka pluca. Wnioski: W prezentowanym badaniu wykazaliśmy niekorzystną wartość prognostyczną wysokiego stężenia PDGF-BB, wysokiej liczby płytek krwi oraz płytkokrytu na przeżycie wolne od wznowy miejscowej, przeżycie wolne od przerzutów odległych i całkowite przeżycie chorych. Przeprowadzona analiza wieloczynnikowa wykazała, że wysoka przed leczeniem liczba płytek krwi jest niezależnym czynnikiem rokowniczym u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. 91. Oznaczenie poziomu n-acetylo-l-asparaginianu w cholinergicznych komórkach SN56 neuroblastoma. Marlena Zyśk

1, Anna Wolska

1, Anna Ronowska

1, Andrzej Szutowicz

1, Hanna Bielarczyk

1

1 Zakład Medycyny Laboratoryjnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera czy Parkinsona znajdują się obecnie na samym szczycie piramidy chorób najczęściej występujących u osób starszych. Z badań klinicznych wynika, że neurodegeneracji w pierwszej kolejności ulegają neurony cholinergiczne przegrody mózgu, podczas gdy neurony wewnętrzne prążkowia pozostają nieuszkodzone. Postępującemu uszkodzeniu neuronów cholinergicznych, obserwowanemu w chorobach neurodegeneracyjnych, towarzyszy spadek poziomu acetylo-CoA, który stanowi koło zamachowe cyklu kwasów trójkarboksylowych, produkujacych energię niezbędną do przeżycia komórek neuronalnych. Ponadto w neuronach cholinergicznych metabolit ten jest wykorzystywany do syntezy N-acetylo-D-asparaginianu (NAA) oraz acetylocholiny (Ach). W związku z tym, celem projektu było zbadanie przeklekłej ekspozycji komórek cholinergicznych na cytotoksyczne stężenia Zn, jako uznanego czynnika neurodegeneracyjnego. Model komórkowy stanowiły komórki linni SN56, które powstały w wyniku fuzji neuronów przegrody mózgu 21- dniowej myszy z komórkami neuroblastoma. Doświadczenia prowadzono na komórkach cholinergicznych niezróżnicowanych (KN) i zróżnicowanych (KR) w środowisku DMEM z 10% płodową surowicą wołową przez 72 godziny. Różnicowanie fenotypowe komórek cholinergicznych wykonano dodając egzogennie 1 mM dwumaślanem-cAMP i 0,001 mM kwasem all-trans-retinowym na 48 godzin. Na ostatnie 24 godziny hodowli komórki zostały poddane ekspozycji na cynk. W komórkach zróżnicowanych i niezróżnicowanych oznaczono poziom całkowitego acetylo-CoA i NAA oraz aktywność acetylotransferazy cholinowej (ChAT). Parametrem definiujacym cytotoksyczny wpływ cynku było oznaczenie śmiertelności komórek wyrażone jako procent uwalnianej przez komórki dehydrogenazy mleczonowej. Aktywność ChAT w komórkach SN56 KN wyniosła 0,106 nmol/min/mg białka, w SN56 KR zaś 0,232 nmol/min/mg białka, co świadczy o wzroście ekspresji fenotypu cholinergicznego pod wpływem zastosowanych czynników różnicujących. W komórkach kontrolnych oznaczone poziomy NAA w KN i KR SN56 wyniosły odpowiednio 70 i 55 nmol/mg białka, przy jednoczesnym poziomie acetylo-CoA 29,3 i 23,8 pmol/mg białka. Cytotoksyczne działanie cynku na wyżej wymienione parametry zaobserwowano przy stężeniu 0,175 mM Zn. Przewlekła ekspozycja (24h) SN56 KN i KR na 0,175 mM Zn spowodowała odpowiednio 27% i 36% śmiertelność komórek. W tych samych warunkach zaobserwowano spadek komórkowego NAA o 64% w SN56 KN i 51% w SN56 KR, przy jednoczesnym spadku acetylo-CoA o 68% (SN56 KN) i 45% (SN56 KR). Uzyskane wyniki wskazują na liniową korelację pomiędzy poziomami acetylo-CoA i NAA zaróno w KN, jak i KR

SN56. Dane te potwierdzają jedną z hipotez, wskazujących na to, że zaburzenia metabolizmu acetylo-CoA mogą być jednym z czynników odpowiedzialnych za rozwój chorób neurodegeneracyjnych. Praca finansowana z Badań Statutowych ST-57.

92. Stężenie i przydatność diagnostyczna metaloproteinazy-9 (MMP-9) u pacjentek z rakiem jajnika. Sławomir Ławicki

1, Ewa Będkowska

1, Ewa Gacuta-Szumarska

2, Maciej Szmitkowski

1

1 Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2 Klinika

Perinatologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska Metaloproteinazy są enzymami wydzielanymi przez komórki różnych nowotworów, odgrywającymi istotną rolę w patogenezie procesu nowotworowego i degradacji matrix międzykomórkowego. W inwazji komórek nowotworowych raka jajnika szczególną rolę odgrywa MMP-9 (żelatynaza B), charakteryzująca się zdolnością do degradacji kolagenu typu IV, co jest istotne w mechanizmie uszkadzania błony podstawnej naczyń i tworzenia przerzutów. Dlatego też celem badań była ocena stężeń oraz przydatności diagnostycznej MMP-9 u pacjentek z rakiem jajnika oraz ich porównanie z markerem rutynowo oznaczanym w diagnostyce tego nowotworu, tj. z CA 125. Badaniami objęto 60 pacjentek z rakiem nabłonkowym jajnika (carcinoma epitheliale ovarii). Grupę kontrolną stanowiło 30 zdrowych kobiet. Materiałem do badań było osocze ubogopłytkowe. Oznaczenia MMP-9 wykonano metodą ELISA, CA 125 - metodą CMIA. Określono przydatność diagnostyczną MMP-9 i CA 125 poprzez wyliczenie czułości i swoistości diagnostycznej, wartości predykcyjnych wyniku dodatniego i ujemnego oraz mocy diagnostycznej badań - pole pod krzywą ROC (AUC). Wykazano znamiennie wyższe stężenie MMP-9 oraz markera porównawczego u chorych na raka jajnika. MMP-9, podobnie jak CA 125, wykazał wysokie wartości swoistości diagnostycznej (94% i 92%). Czułość diagnostyczna MMP-9 (52%), wartość predykcyjna wyniku dodatniego (93%) i ujemnego (50%) oraz pole pod krzywą ROC (AUC) (0,6515) były niższe w porównaniu do CA 125 (odpowiednio 67%, 94% i 58%, 0,7490). Czułość diagnostyczna, wartość predykcyjna wyniku ujemnego oraz moc diagnostyczna badań (AUC) wyraźnie wzrastały przy jednoczesnej analizie badanych parametrów (82%, 67%, 0,8425). Uzyskane wyniki sugerują możliwość wykorzystania MMP-9 w diagnostyce i monitorowaniu raka jajnika, ale tylko w połączeniu z CA 125. 93. Stężenie i przydatność diagnostyczna czynnika stymulującego kolonie makrofagowe (M-CSF) oraz markera HE-4 u pacjentek z rakiem jajnika. Marcin Gościcki

1, Sławomir Ławicki

1, Ewa Będkowska

1, Ewa Gacuta-Szumarska

2, Maciej

Szmitkowski1

1 Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2 Klinika

Perinatologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska Cytokina M-CSF wydzielana jest przez komórki różnych nowotworów i odgrywa istotną rolę w patogenezie procesu nowotworowego, zwłaszcza w tworzenia przerzutów. Stwarza to możliwość jej wykorzystania w diagnostyce wielu nowotworów, w tym w raku jajnika. Dlatego też celem badań była ocena stężeń oraz przydatności diagnostycznej M–CSF u pacjentek z rakiem jajnika oraz ich porównanie z markerem rutynowo oznaczanym w diagnostyce tego nowotworu, tj. z HE-4. Badaniami objęto 60 pacjentek z rakiem nabłonkowym jajnika (carcinoma epitheliale ovarii). Grupy kontrolne stanowiło 30 pacjentek ze zmianami łagodnymi jajnika (torbiele) oraz 30 zdrowych kobiet. Materiałem do badań było osocze ubogopłytkowe. Oznaczenia M-CSF wykonano metodą ELISA, HE-4 - metodą CMIA. Określono przydatność diagnostyczną M-CSF i HE-4 poprzez wyliczenie czułości i swoistości diagnostycznej, wartości predykcyjnych wyniku dodatniego i ujemnego oraz mocy diagnostycznej badań - pole pod krzywą ROC (AUC). Wykazano znamiennie wyższe stężenie M-CSF oraz markera porównawczego u chorych na raka jajnika w porównaniu do zmian łagodnych i osób zdrowych. W zmianach łagodnych stężenia badanych parametrów również były znamiennie wyższe aniżeli u osób zdrowych. M-CSF, podobnie jak HE-4, wykazał wysokie wartości swoistości diagnostycznej (po 94%). Czułość diagnostyczna M-CSF (70%), wartość predykcyjna wyniku dodatniego (95%) i ujemnego (61%) oraz pole pod krzywą ROC (AUC) (0,8562) były wyższe w porównaniu do HE-4 (odpowiednio 55%, 94%, 51%, 0,8321). Czułość diagnostyczna, wartość predykcyjna wyniku ujemnego oraz moc diagnostyczna badań (AUC) wyraźnie wzrastały przy jednoczesnej analizie badanych parametrów (84%, 73%, 0,9257).

Uzyskane wyniki sugerują możliwość wykorzystania M-CSF w diagnostyce i monitorowaniu raka jajnika, zwłaszcza w połączeniu z HE-4. Obydwa markery nie nadają się do różnicowania zmian łagodnych z rakiem jajnika. 94. Stężenie i przydatność diagnostyczna VEGF u pacjentek z rakiem jajnika. Maciej Szmitkowski

1, Sławomir Ławicki

1, Ewa Gacuta-Szumarska

2, Ewa Będkowska

1

1Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2Klinika

Perinatologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska Cytokina VEGF wydzielana jest przez komórki różnych nowotworów i odgrywa istotną rolę w patogenezie procesu nowotworowego, zwłaszcza w procesie neowascularyzacji guza i tym samym tworzenia przerzutów. Dlatego też celem badań była ocena stężeń oraz przydatności diagnostycznej VEGF u pacjentek z rakiem jajnika oraz ich porównanie z markerem rutynowo oznaczanym w diagnostyce tego nowotworu, tj. z CA 125. Badaniami objęto 60 pacjentek z rakiem nabłonkowym jajnika (carcinoma epitheliale ovarii). Grupę kontrolną stanowiło 30 zdrowych kobiet. Materiałem do badań było osocze ubogopłytkowe. Oznaczenia VEGF wykonano metodą ELISA, CA 125 - metodą CMIA. Określono przydatność diagnostyczną VEGF i CA 125 poprzez wyliczenie czułości i swoistości diagnostycznej, wartości predykcyjnych wyniku dodatniego i ujemnego oraz mocy diagnostycznej badań - pole pod krzywą ROC (AUC). Wykazano znamiennie wyższe stężenie VEGF oraz markera porównawczego u chorych na raka jajnika. VEGF, podobnie jak CA 125, wykazał wysokie wartości swoistości diagnostycznej (94% i 92%). Czułość diagnostyczna VEGF (54%), wartość predykcyjna wyniku dodatniego (94%) i ujemnego (51%) oraz pole pod krzywą ROC (AUC) (0,7844) były niższe w porównaniu do CA 125 (odpowiednio 68%, 94% i 58%, 0,8276). Czułość diagnostyczna, wartość predykcyjna wyniku ujemnego oraz moc diagnostyczna badań (AUC) wyraźnie wzrastały przy jednoczesnej analizie badanych parametrów (83%, 72%, 0,9124). Uzyskane wyniki sugerują możliwość wykorzystania VEGF w diagnostyce i monitorowaniu raka jajnika, zwłaszcza w połączeniu z CA 125. 95. Nieinwazyjna diagnostyka prenatalna grup krwi. Agnieszka Orzińska

1, Katarzyna Guz

1, Ewa Brojer

1

1 Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii,

Polska Wstęp: Niezgodność między matką a płodem w zakresie antygenów krwinki czerwonej z układów Rh i Kell lub krwinki płytkowej z układu HPA-1 może prowadzić do alloimmunizacji kobiety ciężarnej i choroby płodu/noworodka. Nieinwazyjna diagnostyka prenatalna (NIDP) grup krwi jest obecnie najlepszą techniką służącą wykrywaniu lub wykluczaniu możliwości wystąpienia konfliktu serologicznego w trakcie ciąży. Od 12 lat w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii (IHiT) w Warszawie prowadzone są badania z wykorzystaniem wolnokrążącego DNA płodu (cff-DNA) w krwioobiegu kobiet ciężarnych do oznaczenia genotypu dziecka. Cel: Podsumowanie 12 lat nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej grup krwi w IHiT. Materiał i metody: Badano 621 kobiet ciężarnych (502 RhD ujemnych, 24 Rhc ujemne, 26 RhE ujemnych, 32 K ujemnych, 37 HPA-1a ujemnych). DNA z osocza izolowano metodą automatyczną ekstraktorem easyMag (Biomerieux). Genotyp płodu określano metodą RQ-PCR na aparacie ABI Prism 7700 przy użyciu starterów i sond specyficznych dla genów: RHD (intron 4, eksony 7 i 10), RHCE*c, RHCE*E, KEL*1 (startery zawierające LNA) i HPA*1a (zastosowano przedamplifikacyjne trawienie allelu HPA*1b enzymem restrykcyjnym). Dla potwierdzenia obecności DNA całkowitego i cff-DNA analizowano obecność genów: CCR5, SRY lub polimorfizmów typu insercja/delecja dziedziczonych od ojca, a nieobecnych u matki. Wyniki: W 7/502 przypadkach u RhD ujemnej matki wykryto wariant RHD w jej genomie, co uniemożliwiło wykonanie badań płodu. U 372 kobiet prawidłowo przewidziano RhD płodu: RHD wykryto w 280 przypadkach, a brak RHD stwierdzono w 92 przypadkach. Badanie 24 ciężarnych Rhc ujemnych i 26 ciężarnych RhE ujemnych wykazało pełną zgodność wyników genotypu płodu z fenotypem noworodka (17 RHCE*c dodatnie, 7 RHCE*c ujemne and 15 RHCE*E dodatnie, 11 RHCE*E ujemne). U 31/32 ciężarnych K ujemnych prawidłowo

oznaczono genotyp KEL*1 dziecka (19 KEL*1 dodatnie, 12 KEL*1 ujemne), zaś w jednym przypadku uzyskano wynik fałszywie dodatni. U 37 ciężarnych HPA-1a ujemnych badanie HPA*1a poprzedzone trawieniem allelu HPA*1b matki pozwoliło jednoznacznie określić genotyp płodu (28 HPA-1a dodatnie, 9 HPA-1a ujemne). We wszystkich przypadkach, w których uzyskano wynik ujemny płodu i był dostępny materiał, obecność cff-DNA potwierdzono poprzez wykrycie w osoczu matki cechy odziedziczonej po ojcu. Wnioski: Opracowane protokoły NIDP dla badanych antygenów grup krwi pozwalają prawidłowo przewidzieć fenotyp płodu i zaplanować optymalny sposób prowadzenia ciąży w zależności od określonego w NIPD genotypu płodu. Wynik NIPD świadczący o zgodności genotypu płodu i matki (25% przebadanych przypadków) może być podstawą zaniechania procedur inwazyjnych dla monitowania stanu klinicznego płodu u kobiet zimmunizowanych. 96. Czy sole wanadu mogą modyfikować tworzenie skrzepu i funkcje płytek krwi u osób zdrowych i z cukrzycą? Anna Michno

1, Katarzyna Grużewska

1, Mariusz Siemiński

2, Agnieszka Stefańska

1, Joanna Begiedza

1,

Andrzej Szutowicz1, Hanna Bielarczyk

1

1Zakład Medycyny Laboratoryjnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska,

2Zakład Neurologii

Dorosłych, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska Przewlekła hiperglikemii w cukrzycy jest związana z rozwojem zakrzepicy, powikłań naczyniowych i neuropatii nawet u 60% pacjentów. W związku z tym wymaga odpowiedniej strategii leczenia w celu zapobiegania niepełnosprawności i przedwczesnej śmierci w tej grupie pacjentów. Zwiększona aktywność płytek krwi w cukrzycy stanowi zasadniczy element powikłań naczyniowych. Dodatkowo płytki krwi wykazują zmienioną zdolność do aktywacji i agregacji w cukrzycy powikłanej neuropatią, w porównaniu z cukrzycą niepowikłaną. Sole wanadu stosowane u pacjentów z cukrzycą i zwierząt doświadczalnych wykazują właściwości insulino-tropowe bez efektu hipoglikemii występującego po przedawkowaniu insuliny wskazują również korzystny wpływ wanadu na ograniczenie powstawania powikłań cukrzycowych i poprawę metabolizmu komórkowego w cukrzycy. Jednakże, brak danych odnoszące się do wpływu wanadu na funkcję i metabolizm komórek insulino-niezależnych takich jak płytki krwi. Celem pracy była ocena wpływu chlorku wanadu na tworzenie skrzepu i funkcję płytek krwi u osób zdrowych i pacjentów z cukrzycą w różnym stopniu zaawansowania choroby. Przebadano 6 pacjentów z cukrzycą typu 2 oraz 4 zdrowych ochotników. Doświadczenia były prowadzone na krwi pełnej i izolowanych płytkach krwi w warunkach spoczynkowych oraz po ich aktywacji. Analizowano zdolność do tworzenia skrzepu i agregatów komórkowych w warunkach przepływu in vitro w mikroskopie fluoroscencyjnym. Krew była inkubowana z 500µM chlorkiem wanadu, znakowana fluorescencyjnie (10µM DiOC6) i poddana przepływowi przez mikrokapilary opłaszczone kolagenem (50µg/ml) i fibrynogenem (500µg/ml). Analiza wykonywana była w warunkach symulujących przepływ kapilarny (1000/s) w naczyniach krwionośnych. Dokonano również analizy zdolności płytek krwi do agregacji metodą turbidymetryczną, syntezy reaktywnych związków reagujących kwasem tiobarbiturowym (TBARS) przy użyciu metody spektrofotometrycznej. W warunkach przepływu kapilarnego, na powierzchni kolagenu i fibrynogenu utworzony skrzep stanowił 6.20±1.8% oraz 14.6±1.1% powierzchni mikrokapilary odpowiednio u osób zdrowych i pacjentów z cukrzycą (P<0.05). Chlorek wanadu (500uM) spowodował redukcję powierzchni skrzepu do odpowiednio 1.04±0.32 u osób zdrowych (p<0.05). Jednocześnie redukcja skrzepu była znamienna u osób z cukrzycą i stanowiła 6.86±1.0% (p<0.05). Agregacja płytek krwi po trombinie u osób zdrowych stanowiła średnio 72±2.45% , a w płytkach osób z cukrzycą 69.4±7.8%. Chlorek wanadu zahamował agregację do 30±8.2% u osób zdrowych (p<0.05), natomiast u pacjentów z cukrzycą nie obserwowano zmian w agregacji (70.0±6.7%). Produkcja TBARS w krwinkach płytkowych osób zdrowych po aktywacji trombiną stanowiła 2.18±0.07 nmoli/12min/mg białka u osób zdrowych i 2.87±0.08 nmoli/12min/mg białka u pacjentów z cukrzycą. Chlorek wanadu spowodował ponad pięciokrotny wzrost akumulacji TBARS u osób zdrowych (11.1±3.1). Natomiast u osób z cukrzycą obserwowano spadek akumulacji TBARS o 40% po zastosowaniu chlorku wanadu (p<0.05). Stan funkcjonalny płytek krwi może różnić się u osób zdrowych i pacjentów z cukrzyca oraz zmieniać się u pacjentów w zależności od stopnia zaawansowania cukrzycy. Z tego powodu takie same stężenia soli wanadu mogą wykazywać efekt cytoprotekcyjny lub cytotoksyczny na funkcję płytek krwi. Dlatego użycie dużej grupy pacjentów zarówno z cukrzycą niepowikłaną, jak i powikłaną zmianami naczyniowymi i neuropatią umożliwi wyodrębnienie grupy pacjentów, u których stosowanie

wanadu może być potencjalnie korzystne i bezpieczne, od grupy, u której związki wanadu mogą działać cytotoksycznie na płytki krwi. Projekt finansowany z ST57 i MN7. 97. Izolacja frakcji PRE-BETA-HDL z mieszaniny HDL i liposomów lecytynowych Anna Wolska

1, Urszula Walkusz

2, Barbara Kortas-Stempak

2, Małgorzata Wróblewska

2

1Zakład Medycyny Laboratoryjnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska,

2Zakład Chemii Klinicznej,

Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska Powrotny transport cholesterolu prowadzony jest przez ubogie w lipidy prekursorowe lipoproteiny wysokiej gęstości (pre-beta HDL). W warunkach in vitro strukturalna modyfikacja dojrzałych cząstek lipoprotein wysokiej gęstości (alfa-HDL), zachodząca podczas akceptacji przez nie fosfolipidów liposomalnych, powoduje tworzenie nowej frakcji lipoproteinowej, poruszającej się w żelu agarozowym z ruchliwością pre-beta. Celem badań było opracowanie warunków rozdziału produktów reakcji HDL z egzogennymi fosfolipidami, umożlwiających izolację pre-beta HDL od frakcji alfa-HDL i liposomów. HDL otrzymywano z ludzkiej surowicy pochodzącej od osób zdrowych metodą ultrawirowania w gęstości surowicy d=1,21 g/mL, pozbawionej metodą wytrąceniową pozostałych lipoprotein. Wyizolowane ultrawirówkowo HDL i liposomy mieszano ze sobą tak, żeby stosunek wagowy fosfolipidów liposomalnych do fosfolipidów HDL wynosił 5:1. Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano 1 godz. w temp. 37

oC z delikatnym mieszaniem. Następnie mieszaninę doprowadzano do gęstości 1,042 g/mL

poprzez dodanie stałego bromku potasu i wirowano przy 100.000 obr./min. w temp. 4oC przez 5 godz.

Po zakończeniu ultrawirowania oddzielano flotującą frakcję liposomów od infranatantu zawierającego alfa-HDL i pre-beta HDL. Za pomocą heparyny i chlorku wapnia wytrącano frakcję pre-beta HDL i oddzielano od pozostającej w supernatancie frakcji alfa-HDL. W wyniku oddziaływania HDL z liposomami lecytynowymi dochodzi do powstawania nowej frakcji pre-beta HDL, którą można wyizolować metodą dwustopniową tj. w I etapie, metodą ultrawirówkową oddzielając liposomy, a w II etapie, metodą wytrąceniową oddzielając osad precypitujących pre-beta HDL od niewytrącanej w przyjętych warunkach frakcji alfa-HDL. 98. Chłoniak burkitta, chłoniak burkitta bez translokacji MYC z częściową trisomią chromosomu 11 oraz chłoniaki inter DLBCL/ BL ujawniają niski poziom MIR-155 i MIR-21 w porównaniu z chłoniakami rozlanymi z dużych komórek. Michalina Zajdel

1, Grzegorz Rymkiewicz

2, Magdalena Chechlińska

3, Barbara Pieńkowska-Grela

4,

Katarzyna Błachnio2, Paweł Swoboda

1, Krzysztof Goryca

5, Jan Konrad Siwicki

1

1Pracownia Immunologii Komórkowej, Zakład Immunologii, Centrum Onkologii-Instytut im. M.

Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska, 2Pracownia Cytometrii Przepływowej, Zakład Patologii,

Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska, 3 Zakład Immunologii,

Centrum Onkologii-Instytut Warszawa, Polska, 4 Pracownia Genetyki Nowotworów, Zakład Patologii,

Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska, 5Zakład Genetyki,

Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska Wstęp: Szybka i precyzyjna diagnostyka różnicowa agresywnych chłoniaków nie-Hodgkina (NHL) ma kluczowe znaczenie dla uzyskania sukcesu terapeutycznego. Niektóre z tych chłoniaków są nieprawidłowo rozpoznawane z powodu dużego podobieństwa części przypadków chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) do chłoniaka Burkitta (BL) oraz do podtypu chłoniaka Burkitta bez translokacji MYC z częściową trisomią chromosomu 11 [dalej oznaczanego BL MYC

- dup(11)] lub

chłoniaków o cechach pośrednich pomiędzy chłoniakiem rozlanym z dużych komórek B a chłoniakiem Burkitta (Inter DLBCL/ BL). Warunkiem skuteczności leczenia chorych na BL, BL MYC

- dup(11) lub

Inter DLBCL/BL jest niezwłoczne wdrożenie intensywnej chemioterapii. Szereg doniesień literaturowych wskazuje na możliwość zastosowania mikroRNA w diagnostyce agresywnych chłoniaków z komórek B. mikroRNA, to krótkie niekodujące cząsteczki RNA regulujące ekspresję genów i pełniące istotne funkcje w wielu procesach fizjologicznych, także w powstawaniu i rozwoju nowotworów. Profile ekspresji mikroRNA niosą więcej informacji niż profile ekspresji mRNA i lepiej wskazują na pochodzenie komórki, z której rozwinęła się populacja komórek zmienionych nowotworowo. Do analizy ekspresji mikroRNA potrzeba bardzo mało materiału (ng całkowitego RNA), a ze względu na swoją niewielką długość mikroRNA są bardziej stabilne i bardziej oporne na Rnazy niż mRNA.

Cel badań: Ocena przydatności wybranych mikroRNA, w tym: miR-155 oraz miR-21 w różnicowej diagnostyce agresywnych chłoniaków z komórek B, ze szczególnym uwzględnieniem wyodrębnionego przez nas ostatnio chłoniaka BL MYC

- dup(11).

Materiał: Biopsje cienkoigłowe guzów węzłowych i pozawęzłowych uzyskane od ponad 100 pacjentów Kliniki Nowotworów Układu Chłonnego Centrum Onkologii-Instytutu w Warszawie z podejrzeniem BL, BL MYC-, DLBCL lub Inter DLBCL/BL. Do badań włączono materiał charakteryzujący się co najmniej 70% zawartością patologicznych limfocytów B, potwierdzoną analizą w cytometrze przepływowym. Wykonano również badania histopatologiczno - immunohistochemiczne oraz cytogenetyczne. Metoda: RT-qPCR, przy wykorzystaniu pętlowych starterów do reakcji odwrotnej transkrypcji oraz sond TaqMan do qPCR (Life Technologies). Poziom ekspresji mikroRNA przedstawiono na podstawie obliczeń %u2206%u2206CT, a kalibrator stanowiły jednojądrzaste komórki spoczynkowe krwi obwodowej osoby zdrowej. Wyniki i wnioski: 1. Poziom ekspresji miR-155 jest istotnie niższy w: BL (mediana=0,34; n=35), BL MYC

- dup(11) (mediana=0,76; n=10) oraz Inter DLBCL/ BL (mediana=1,0; n=5),

w porównaniu do DLBCL (mediana=7,96; n=45). 2. Poziom ekspresji miR-21 jest istotnie niższy w: BL (mediana=0,19; n=23), BL MYC

-dup(11) (mediana=0,31; n=10) w porównaniu do DLBCL (mediana=0,91; n=23).

3.. Wykonanie klasyfikatora dla miR-155 oraz miR-21 jednocześnie, pozwala z 86% czułością i 75% specyficznością odróżnić BL, BL MYC

- dup(11) oraz Inter DLBCL/ BL od DLBCL. miR-155 oraz miR-

21 mogą być markerami uzupełniającymi algorytm diagnostyki różnicowej BL i DLBCL, także z uwzględnieniem wyodrębnionej przez nas ostatnio podgrupy chłoniaków BL bez translokacji MYC, z częściową trisomią chromosomu 11. 99. Mikrorna w płynie mózgowo-rdzeniowym, jako potencjalne biomarkery w diagnostyce chłoniaków w ośrodkowym układzie nerwowym. Michalina Zajdel

1, Grzegorz Rymkiewicz

2, Magdalena Chechlińska

3, Agnieszka Druzd-Sitek

4,

Katarzyna Błachnio2, Maria Cieślikowska

1, Maria Sromek

1, Krzysztof Goryca

5, Jan Konrad Siwicki

1

1Pracownia Immunologii Komórkowej, Zakład Immunologii, Centrum Onkologii-Instytut im. M.

Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska, 2Pracownia Cytometrii Przepływowej, Zakład Patologii,

Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska, 3Zakład Immunologii,

Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polsk, 4Klinika Nowotworów

Układu Chłonnego, Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska, 5Zakład Genetyki, Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie, Polska

Wstęp: Diagnostyka różnicowa pierwotnych chłoniaków w ośrodkowym układzie nerwowym (ang. primary central nervous system lymphoma, PCNSL) z chorobami neurologicznymi wciąż stanowi wyzwanie diagnostyczne pomimo zastosowania technik obrazowych, oceny cytologicznej i cytometrycznej płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR). O ostatecznym rozpoznaniu decyduje ocena histopatologiczna materiału pobranego drogą biopsji stereotaktycznej, która naraża pacjentów na powikłania neurologiczne.Szybka diagnostyka wtórnego zajęcia OUN w przebiegu chłoniaka decyduje o długości przeżycia pacjentów. Badania Baraniskin i wsp. sugerują, że oznaczenie poziomu ekspresji mikroRNA w PMR może różnicować z wysoką specyficznością oraz czułością przypadki PCNSL z innymi chorobami neurologicznymi, w szczególności o podłożu zapalnym. Cel badań: Ocena przydatności wybranych mikroRNA, w tym: miR-21, miR-19b-1 oraz miR-92a-2 dla: 1/ różnicowej diagnostyki PCNSL, 2/ wczesnej diagnostyki wtórnego zajęcia OUN w przebiegu chłoniaków. Materiał: Próbki PMR pobrane od pacjentów leczonych lub konsultowanych w Klinice Nowotworów Układu Chłonnego Centrum Onkologii-Instytutu w Warszawie pozostałe po rutynowej diagnostyce: 1/ pierwotnego oraz wtórnego zajęcia OUN, 2/ nienowotworowych chorób neurologicznych. Metody: RT-qPCR, przy wykorzystaniu pętlowych starterów do reakcji odwrotnej transkrypcji oraz sond TaqMan do qPCR (Life Technologies) dla m.in.: miR-21, miR-19b-1 oraz miR-92a-2. Poziom ekspresji mikroRNA przedstawiono na podstawie obliczeń deltaCT. Wyniki i wnioski: 1/ Opracowano ujednolicony schemat zbierania, zabezpieczania próbek PMR oraz izolacji RNA i reakcji RT-qPCR dla oznaczeń poziomu ekspresji mikroRNA w PMR. 2/ W większości analizowanych przypadków chłoniaków w OUN poziom ekspresji wybranych mikroRNA w PMR (w tym: miR-21, miR-19b-1 oraz miR-92a-2) był wyższy w porównaniu z grupą kontrolną.

3/ Nasze wstępne dane pokazują, że ocena poziomu ekspresji mikroRNA w PMR może być użyteczna w diagnostyce pierwotnych i wtórnych chłoniaków OUN. 100. Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do terapeutycznego monitorowania stężenia enancjomerów fluoksetyny i norfluoksetyny. Błażej Grodner

1, Magdalena Skrobańska

1, Dariusz Sitkiewicz

1

1 Katedra Biochemii i Chemii Klinicznej, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska

Wstęp i cel pracy. Fluoksetyna - [±-N-metylo-3-fenylo-3-[(α, α, (-trifluoro-p-tolilo) oksy]-propylamina)] – należąca do grupy selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny (selective serotonin reuptake inhibitor – SSRI) dzięki czemu serotonina dłużej przebywa w przestrzeni międzysynaptycznej i wydłuża czas pobudzania neuronów postsynaptycznych. Wychwyt zwrotny serotoniny odbywa się poprzez transporter serotoniny (ang. SERT – Serotonin transporter) do neuronu presynaptycznego, gdzie jest ona degradowana lub przechowywana do dalszego użycia. Fluoksetyna jest szeroko stosowana w leczeniu depresji i innych chorób z zaburzeniami poziomu serotoniny. Zarówno fluoksetyna jak i jej metabolit – norfluoksetyna - występują w postaci enancjomerów (S) i (R) czyli związków optycznie czynnych różniących się kształtem cząsteczki z zachowaniem stałej struktury wewnętrznej związku. Ogólnoświatową tendencją firm farmaceutycznych jest dążenie do wyeliminowania leków występujących w postaci mieszanin racemicznych (mieszanin enancjomerów), gdyż w wielu przypadkach oba izomery wykazują odmienne działania farmakologiczne oraz mogą różnić się znacząco farmakokinetyką. Różnice te przekładają się w ogromnym stopniu na działanie biologiczne leku i jego metabolitu. Celem badań enancjomerów fluoksetyny i norfluoksetyny w surowicy krwi pacjentów jest wykorzystanie opracowanej metody w pracach dotyczących terapii monitorowanej oraz badanie procesów farmakodynamicznych i farmakokinetycznych danych substancji. Materiał i metodyka. Do oznaczania enancjomerów fluoksetyny i norfluoksetyny zastosowano metodę wysokosprawnej elektroforezy kapilarnej z zastosowaniem wysokosulfonowanych cyklodekstryn jako selektorów chiralnych. Badania przeprowadzono z zastosowaniem aparatu do elektroforezy kapilarnej P/ACE MDQ firmy Beckman Coulter wyposażonego w detektor UV, autosampler oraz oprogramowanie Karat 32 służące do analizy i interpretacji pomiarów. Wyniki. Wstępnie przeprowadzone pilotażowe badania na surowicy pochodzącej od kilku pacjentów wykazują duże różnice w poziomie poszczególnych form enancjomerów (S)fluoksetyny od 11,32 ng/ml po 2 tygodniach podawania do 51,44 ng/ml po 4 tygodniach oraz (R) fluoksetyny od 18,68 ng/ml po 2 tygodniach do 54,87 ng/ml po 4 tygodniach podawania i (S) norfluoksetyny od 2,48 ng/ml po 2 tygodniach do 6,84 ng/ml po 4 tygodniach podawania oraz (R) norfluoksetyny od 10,89 ng/ml po 2 tygodniach do 18,10 ng/ml po 4 tygodniach podawania doustnego racemicznego preparatu fluoksetyny, co może być związane z indywidualnymi różnicami w aktywności CYP2D6, który jest głownym układem cytochromowym odpowiedzialnym za kierunek przemian fluoksetyny i norfluoksetyny w organizmie człowieka. Wnioski. Opracowana metoda oznaczania enancjomerów fluoksetyny i norfluoksetyny w surowicy krwi pacjentów charakteryzuje się bardzo dobrymi parametrami powtarzalności i odtwarzalności w zakresie od 2,5 ng/ml do 250 ng/ml ze współczynnikami korelacji r

2=0,998 dla (S) fluoksetyny i 0,997

dla (R) fluoksetyny oraz r2=0,998 dla (S) norfluoksetyny i 0,998 dla (R) norfluoksetyny. Metoda

charakteryzuje się wysoką specyficznością i bardzo wysoką czułością – LOD na poziomie 2,5 ng/ml dla każdego z enancjomerów, co umożliwia jej zastosowanie do badań klinicznych. 101. Czy fruktozamina ma szansę zająć miejsce hemoglobiny glikowanej jako markera w kwalifikacji do zabiegu kardiochirurgicznego chorych na cukrzycę ? ELŻBIETA GAŁĄZKA-HERCZAKOWSKA

1, ANDRZEJ SZAFRANEK

1, HANNA CZARNECKA

1,

KRZYSZTOF STROJEK1, MARIAN ZEMBALA

1

1 ŚLĄSKIE CENTRUM CHORÓB SERCA w Zabrzu, Polska

Wstęp: Glikacja białek jest procesem nieodwracalnym. Glikacji ulega hemoglobina, której okres trwania we krwi wynosi 2,5-3 miesięcy i świadczy o średniej glikemii w tym czasie i inne białka

osocza, których miarą glikacji jest fruktozamina odzwierciedlająca stan glikemii w ciągu ostatnich 2 tygodni (okres półtrwania albumin). Dynamika zmian fruktozaminy sprawia, że jest ona szybciej reagującym markerem oceniającym stan glikemii u pacjenta a jednocześnie dającym lepszą ocenę stopnia przygotowania pacjenta z cukrzycą do zabiegu operacyjnego niż obarczona dużą stałą czasową zmienna HbA1c. Cel pracy: Celem pracy było znalezienie takiej wartości stężenia ftuktozaminy, która byłaby punktem odcięcia przy kwalifikacji pacjenta chorego na cukrzycę do zabiegu kardiochirurgicznego odpowiadającego HbA1c ≤ 7,5%. Wiąże się to ze znalezieniem modelu matematycznego (równania matematycznego) pozwalającego powiązać wartość HbA1c z odpowiadającą jej czasowo wartością fruktozaminy. Metodyka: W tym celu zgromadzono próbkę danych, pochodzących od 270 pacjentów hospitalizowanych w Śląskim Centrum Chorób Serca na różnych oddziałach. Pytanie, na które należało odpowiedzieć można zapisać w postaci: - jaka wartość fruktozaminy (lub przedział wartości) odpowiada „odcinającej wartości” HbA1c ? Przenosząc pytanie na grunt statystyczny można sformułować dwie hipotezy: H0 : nie ma istotnej statystycznie korelacji pomiędzy wartościami fruktozaminy oraz HbA1c, H1: występuje istotna statystycznie korelacja pomiędzy wartościami w/w wskaźników a jeśli tak, to definiując postać matematyczną równania, będziemy potrafili określić „wartość odcinającą” dla fruktozaminy. Wyniki: Wśród 270 analizowanych próbek HbA1c w przedziale dobrego wyrównania (6-7.5 %) stwierdzono 135 przypadków, w przedziale poniżej: 6 % 66 przypadków, powyżej 7.5 % 69 przypadków. Na podstawie wykresu zależności: fruktozamina = f (HbA1c) można stwierdzić dodatnią korelację pomiędzy zmiennymi. Do oceny zależności użyto współczynnika korelacji Pearsona. Przyjęty poziom istotności α = 0,05. Przeprowadzone na podstawie wspomnianej próbki danych obliczenia wykazały, że wartość korelacji pomiędzy fruktozaminą i HbA1c jest równa 0.77 i jest istotna statystycznie na przyjętym poziomie istotności. Jednocześnie, jak to wynika z powyższego, matematyczną postać szukanego, liniowego modelu matematycznego wiążącego obie zmienne można zapisać w postaci równania: fruktozamina = 34,47 + HbA1c x 32,67 .............................(1) Można zauważyć, że współczynniki równania (zarówno stojący przy zmiennej jak i wyraz wolny) są istotne statystycznie, a błąd standardowy estymacji wynosi 36.71. Wnioski: Otrzymany, istotny statystycznie (p<0.05) współczynnik korelacji pomiędzy stężeniem fruktozaminy a wartością HbA1c oraz w konsekwencji wyprowadzone równanie regresji wiążące obie zmienne, stanowi podstawę do określenia granicznej wartości stężenia fruktozaminy (punkt odcięcia) dla kwalifikacji pacjentów do zabiegu operacyjnego. Wydaje się oczywiste, że rozpoczęte badania należy kontynuować, a wykorzystanie do analizy regresji większej ilości danych pozwoli doprecyzować współczynniki równania, łącznie z badaniem wpływu podwyższania stopnia wielomianu funkcji regresji na dokładność otrzymanych wyników. W efekcie będzie można określić wartość graniczną stężenia fruktozaminy odpowiadającą wartości granicznej HbA1c. Analizę należy wzbogacić o wektor parametrów pozwalających na ocenę powodzenia zabiegu operacyjnego. Z powyższego wynika, że wykorzystanie jako markera wartości stężenia fruktozaminy u pacjentów z cukrzycą da możliwość znacznego skrócenia czasu oczekiwania pacjenta na wykonanie zabiegu operacyjnego, oraz co nie jest bez znaczenia, pozwoli na obniżenie kosztów badania. 102. Tkankowy inhibitor metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 2 (TIMP-2) w raku żołądka. Barbara Mroczko

1, Marta Łukaszewicz-Zając

2, Mariusz Gryko

3, Bogusław Kędra

3, Maciej

Szmitkowski 1Zakład Diagnostyki Biochemicznej; Zakład Diagnostyki Chorób Neurozwyrodnieniowych, Uniwersytet

Medyczny w Białymstoku, Polska, 2Zakład Diagnostyki Biochemicznej,, Uniwersytet Medyczny w

Białymstoku, Polska, 3II Klinika Chirurgii Ogólnej i Gastroenterologicznej, Uniwersytet Medyczny w

Białymstoku, Polska WSTĘP. Rak żołądka stanowi drugą co do częstości przyczynę zgonów z powodu nowotworów złośliwych. Jednym z najistotniejszych etapów rozwoju i przerzutowania nowotworu jest degradacja białek przestrzeni pozakomórkowej (ECM) i błony podstawnej naczyń. Metaloproteinazy macierzy

zewnątrzkomórkowej (MMPs) należą do enzymów zdolnych do trawienia kolagenu typu IV. Czynnikami hamującymi proteolityczną aktywność tych enzymów są tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMPs). W związku z tym celem pracy była ocena przydatności oznaczeń stężeń TIMP-2 w diagnostyce chorych na raka żołądka. Określono zależności stężeń tego enzymu od parametrów kliniczno-patologicznych guza, tj.: stadium zaawansowania nowotworu, wielkości guza, występowania lub braku przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych oraz przerzutów odległych. Oceniono także wskaźniki diagnostyczne, tj. czułość diagnostyczną TIMP-2 oraz klasycznych markerów nowotworowych raka żołądka – antygenu karcino-embrionalnego (CEA) i antygenu nowotworowego 19-9 (CA 19-9). MATERIAŁY I METODY. Grupę badaną stanowiło 191 osób, w tym 100 chorych na raka żołądka oraz 91 osób zdrowych. Stężenia TIMP-2 oznaczano w surowicy metodą immunoenzymatyczną ELISA, zaś do oznaczenia stężeń CA 19-9 i CEA wykorzystano metodę immunoenzymatyczną MEIA. WYNIKI. Stężenia TIMP-2 były znacząco niższe (79 ng/ml), zaś klasycznych markerów nowotworowych (CEA – 1,4 ng/ml; CA 19-9 – 6,9 U/ml) istotnie wyższe u chorych na raka żołądka w porównaniu do grupy kontrolnej osób zdrowych (TIMP-2 – 94 ng/ml; CEA – 0,8 ng/ml; CA 19-9 – 0,8 U/ml). Stwierdzono istotnie statystyczną zależność między stężeniami TIMP-2 a wielkością guza (cecha T) (p=0,002). Podobne wyniki uzyskano w przypadku klasycznych markerów nowotworowych. Czułość diagnostyczna oznaczeń TIMP-2 (61%) była znacznie wyższa niż klasycznych markerów nowotworowych (CEA – 21% i CA 19-9 – 31%) i wzrastała przy łącznym oznaczaniu stężeń TIMP-2 z CA 19-9 do 71%. WNIOSKI. Uzyskane wyniki badań sugerują możliwość zastosowania oznaczania stężeń TIMP-2 w diagnostyce chorych na raka żołądka. 103. Metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej 2 (MMP-2) w raku żołądka. Marta Łukaszewicz-Zając

1, Barbara Mroczko

1, Mariusz Gryko

2, Bogusław Kędra

2, Maciej

Szmitkowski1

1Zakład Diagnostyki Biochemicznej,, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2II Klinika Chirurgii

Ogólnej i Gastroenterologicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska WSTĘP. Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs) odgrywają znaczącą rolę w rozwoju nowotworów. MMPs mają zdolność degradacji błony podstawnej naczyń i macierzy zewnątrzkomórkowej. Wykazano, że metaloproteina 2 (MMP-2) jest zdolna do degradacji kolagenu typu IV, ułatwiając migrację i inwazję komórek nowotworowych. Rak żołądka jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu guzów złośliwych na świecie i charakteryzuje się złym rokowaniem i krótkim czasem przeżycia pacjentów. W związku z tym celem pracy była ocena przydatności diagnostycznej oznaczeń stężeń MMP-2 w diagnostyce chorych na raka żołądka. Określono zależności stężeń tego enzymu od cech kliniczno-patologicznych guza, tj. stopnia zaawansowania nowotworu, wielkości guza oraz obecności przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych. Wyznaczono ponadto wskaźniki diagnostyczne, tj. czułość diagnostyczną MMP-2 oraz klasycznych markerów nowotworowych raka żołądka – antygenu karcino-embrionalnego (CEA) i antygenu nowotworowego 19-9 (CA 19-9) MATERIAŁY I METODY. Grupę badaną stanowiło 100 chorych na raka żołądka, zaś grupę kontrolną – 91 osób zdrowych. Stężenia MMP-2 oraz klasycznych markerów nowotworowych (CEA i CA 19-9) oznaczano w surowicy przy użyciu metody immunoenzymatycznej. WYNIKI. Stężenia MMP-2 były znacząco niższe (184 ng/ml), zaś markerów nowotworowych – istotnie wyższe (CEA – 1,4 ng/ml; CA 19-9 – 6,9 U/ml) u chorych na raka żołądka w porównaniu do grupy kontrolnej osób zdrowych (MMP-2 – 205 ng/ml; CEA – 0,8 ng/ml; CA 19-9 – 0,8 U/ml). Ponadto wykazano podwyższone stężenia MMP-2 u chorych w bardziej zaawansowanym stadium nowotworu oraz pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych niż u chorych z niskim stopniem zaawansowania guza oraz bez przerzutów do węzłów chłonnych. Podobne wyniki uzyskano w przypadku stężeń klasycznych markerów nowotworowych (CEA i CA 19-9). Czułość diagnostyczna MMP-2 (54%) była wyższa w porównaniu do CEA (21%) i CA 19-9 (31%). Największą czułość diagnostyczną wykazano dla łącznej analizy stężeń MMP-2 z CA 19-9 (68%). WNIOSKI. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość wykorzystania oznaczania stężeń MMP-2 jako potencjalnego markera nowotworowego raka żołądka, zwłaszcza przy łącznym oznaczaniu z CA 19-9.

104. Związek pomiędzy statusem witaminyu D a markerami stanu zapalnego u chorych z przewlekłą chorobą nerek leczonych powtarzanymi hemodializami Danuta Fedak

1, Marek Kużniewski

2, Maria Kapusta

1, Beata Kuśnierz-Cabala

1, Paulina Dumnicka

3,

Dorota Pawlica-Gosiewska1, Bogdan Solnica

1, Władysław Sułowicz

2

1Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Zakład Diagnostyki Katedra Biochemii Klinicznej,

Polska, 2Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Katedra i Klinika Nefrologii, Polska,

3Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Zakład Diagnostyki Medycznej, Polska

Wprowadzenie: Wpływ witaminy D (25OHD) na organizm ma charakter plejotropowy. Oprócz działania klasycznego związanego z gospodarką wapniowo-fosforanową i metabolizmem kostnym witamina D wykazuje działanie immunomodulacyjne, przeciwzapalne, kardioprotekcyjne, nefroprotekcyjne i antyproliferacyjne. Pacjenci z przewlekłą chorobą nerek (PChN), a w szczególności pacjenci przewlekle hemodializowani (HD) znajdują się w grupie wysokiego ryzyka niedoborów witaminy D, a badania ostatnich lat wykazały dodatkowo, że niedobory tej witaminy stanowią czynnik wzrostu ryzyka śmiertelności w tej grupie chorych. Wśród pacjentów hemodializowanych umieralność z powodu chorób sercowo-naczyniowych przekracza 30-krotnie umieralność osób z prawidłowa funkcją nerek. Przewlekły stan zapalny zarówno w populacji ogólnej jak i w populacji chorych dializowanych jest ważnym czynnikiem ryzyka występowania chorób sercowo-naczyniowych. Celem badania była ocena związku statusu witaminy D z wybranymi parametrami zapalnymi: białkiem C-reaktywnym (CRP), IL-6, IL-8, albuminą oraz całkowitą liczbą leukocytów (WBC), stężeniem hemoglobiny (HGB) oraz wartością hematokrytu (HCT) krwi obwodowej. Materiał i metody: Badaniami objęto 215 chorych z PChN leczonych powtarzanymi hemodializami (90 kobiet i 125 mężczyzn), w wieku 60,3±12.3 lat, dializowanych średnio przez okres: 80±50 miesięcy. Stężenie 25OHD oznaczano na analizatorze Elecsys firmy Roche, CRP (hs CRP) oznaczano nefelometrycznie, IL-6, IL-8 oznaczano metodą ELISA, natomiast stężenie albuminy oraz morfologię krwi obwodowej oznaczano metodami rutynowymi. Wyniki: W badaniu potwierdzono występowanie powszechnych niedoborów 25OHD w grupie badanych chorych. Średnia wartość stężenia witaminy D wynosiła 19,11 ± 11,19 ng/ml (20% wyników mieściło się w zakresie <10 ng/ml; 56% w zakresie <20 ng/ml, a tylko 15% w zakresie >30 ng/ml). Wartości stężeń parametrów zapalnych oraz wskaźników morfologii krwi obwodowej wynosiły kolejno (wartości średnie dla rozkładów normalnych i mediany oraz dolny i górny kwartyl dla rozkładów wartości różnych od normalnego): CRP 4,2 (1,69-6,43) mg/l; albumina 38,31±4,03 g/l; IL-6 3,54 (1,72-6,43) pg/ml; IL-8 28,95 (20,02-43,31) pg/ml; HGB 10,98±2,83 g/dl; HCT 33,28±4,18 %; WBC

6,52±2,17 x 103/l. Wykazano związek pomiędzy stężeniem 25OHD a wiekiem (r=-0,27; p=0,0000);

czasem dializowania (r=0,18; p<0,02); stężeniem IL-6 (r=-0,17; p<0,02) oraz IL-8 (r=-0,17; p<0,01); stężeniem albuminy (r=0,32; p=0,0000); liczbą WBC (r=-0,16; p/,0,02); HGB (r=-0,18; p<0,009); HCT (r=0,17;<0,01). Nie wykazano korelacji pomiędzy stężeniem 25OHD a stężeniem CRP. Wnioski: Pomimo, że nie potwierdzono zależności pomiędzy stężeniem 25OHD a stężeniem CRP, wykazano statystycznie znamienne ujemne korelacje z cytokinami prozapalnymi oraz leukocytozą, jak również dodatnią korelację pomiędzy 25OHD a albuminą będącą ujemnym białkiem ostrej fazy. Przedstawione wyniki wskazują na związek niskiego statusu witaminy D z nasileniem stanu zapalnego u chorych hemodializowanych. 105. Metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej 2 (MMP-2) w chorobie Alzheimera. Ilona Zaręba

1, Barbara Mroczko

2, Marzena Zboch

3, Marta Łukaszewicz-Zając

4, Magdalena

Groblewska4, Olga Martyna Koper

5, Agnieszka Kulczyńska

5, Maciej Szmitkowski

4, Piotr Lewczuk

6

1 Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Diagnostyki Chorób Neurozwyrodnieniowych, Uniwersytet

Medyczny w Białymstoku, Polska, 2 Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Zakład Diagnostyki Chorób

Neurozwyrodnieniowych, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska, 3 Ośrodek Badawczo-

Naukowo-Dydaktyczny Chorób Otępiennych Akademii Medycznej we Wrocławiu, Samodzielny Publiczny Zakład Opieki Zdrowotnej w Ścinawie, Polska,

4 Zakład Diagnostyki Biochemicznej,

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska, 5 Zakład Diagnostyki Chorób Neurozwyrodnieniowych,

Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska, 6 Lab. for Clinical Neurochemistry and Neurochemical

Dementia Diagnostics, Universitätsklinikum Erlangen , Germany WSTĘP. Choroba Alzheimera (AD) jako najczęstsza przyczyna otępienia należy do najistotniejszych problemów medycznych i socjo-ekonomicznych. Długoletni przebieg AD bez objawów klinicznych

utrudnia rozpoznanie tej choroby, przy czym daje nadzieję na znalezienie profilaktyki i leczenia, które mogłyby być wdrożone we wczesnym stadium zanim pojawią się nieodwracalne zmiany w mózgu. W związku z tym poszukuje się nowych markerów biochemicznych, których oznaczanie we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym umożliwiłoby wczesną diagnostykę chorych na AD. Wykazano wpływ metaloproteinazy 2 (MMP-2) na tworzenie się blaszek amyloidowych u chorych na AD. MATERIAŁY I METODY. Grupę badaną stanowiło 40 osób, w tym 20 chorych na AD oraz 20 osób zdrowych. Stężenia MMP-2 oraz uznanych markerów biochemicznych tej choroby (białka tau i jego fosforylowanej formy Ptau181) oznaczano w płynie mózgowo-rdzeniowym metodą immunoenzymatyczną ELISA. WYNIKI. Stężenia MMP-2 (31,55 ng/ml), tau (933,91 pg/ml) i Ptau181 (85,95 pg/ml) były wyższe u chorych na AD w porównaniu do grupy kontrolnej osób zdrowych, przy czym różnice te były istotne statystycznie jedynie dla uznanych biomarkerów AD. Czułość diagnostyczna oznaczeń MMP-2 była niższa niż tau i Ptau181, zaś swoistość diagnostyczna utrzymywała się na tym samym poziomie dla wszystkich analizowanych białek. WNIOSKI. Wstępne wyniki badań potwierdzają przydatność oznaczeń tau i Ptau181 w diagnostyce chorych na AD i wskazują na konieczność prowadzenia dalszych badań nad zastosowaniem metaloproteinaz jako biomarkerów AD. 106. Leczenie krwią i jej składnikami w wieloprofilowym szpitalu klinicznym ze szczególnym uwzględnieniem oddziałów hematologicznych. Maria Kozłowska-Skrzypczak

1, Bogusław Grabowski

2, Natalia Czyż

1, Mieczysław Komarnicki

1

1Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Ukłądu Krwiotwórczego Uniwersytetu

Medycznego w Poznaniu, Polsk, 2Szpital Kliniczny Przemienienia Pańskiego Uniwersytetu

Medycznego w Poznaniu, Polska WSTĘP: W niniejszej pracy dokonano oceny gospodarki krwi i jej składników u pacjentów leczonych w Szpitalu Klinicznym Przemienienia Pańskiego UM w Poznaniu ze szczególnym uwzględnieniem chorych poddanych przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych. Miała ona na celu nie tylko aspekt medyczny, ale także wymiar ekonomiczny. Dokonanie oceny statystycznej było możliwe na podstawie systematycznie przeprowadzanego rozliczania ilości i wartości zużytej krwi i jej składników w poszczególnych oddziałach Szpitala. Analizę przeprowadzono na podstawie zgody wydanej przez Dyrekcję Szpitala. MATERIAŁ I METODY: Przedstawiona analiza jest retrospektywna. Badaniami objęto lata od 2008 do 2011. W analizowanym okresie hospitalizowano w Szpitalu 12 518 pacjentów wymagających leczenia krwią i jej składnikami. Ze względu na zapotrzebowanie na krew i jej składniki szczegółowej analizie poddano dane dotyczące chorych leczonych na oddziale hematologicznym, a zwłaszcza transplantacyjnym. Liczba chorych hospitalizowana na oddziale transplantacyjnym wynosiła 478, w tym 184 kobiet i 294 mężczyzn w wieku średnio 56 (17-73) lat. W trakcie leczenia chorym przetaczano następujące składniki krwi: koncentrat krwinek czerwonych, koncentrat krwinek płytkowych oraz świeżo mrożone osocze. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu Statistica 6.0. OMÓWIENIE I WNIOSKI: Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że w Szpitalu jednostką o największym zapotrzebowaniu na krew i jej składniki był oddział hematologiczny z pododdziałem transplantacyjnym oraz oddział kardiochirurgiczny. Oddziały o najmniejszym zużyciu krwi i preparatów krwiopochodnych to oddziały okulistyczny i onkologicznej opieki paliatywnej. Oddział hematologiczny oraz transplantacyjny to 59,4% całkowitego wykorzystania krwi i jej składników w Szpitalu. W analizowanym okresie czasu w strukturze zużycia jednostek krwi i jej składników, związanych z leczeniem pacjentów po transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych, najwyższą pozycję zajmują koncentraty krwinek płytkowych. W dalszej kolejności były to koncentraty krwinek czerwonych i preparaty świeżo mrożonego osocza. Najwyższe koszty tego leczenia odnotowano na oddziale transplantacyjnym. Związane one były przede wszystkim z wydatkami poniesionymi na koncentraty płytek krwi, a następnie na preparaty krwinek czerwonych oraz świeżo mrożone osocze. 107. Analiza i korelacja wybranych wolnokrążących markerów nowotworowych oznaczanych u chorych na raka żołądka Małgorzata Kraszkiewicz

1, Andrzej Tukiendorf

2, Barbara Masłyk

3, Aleksandra Chmura

3, Rafał

Kawczyński1, Jerzy Wydmański

1

1Zakład Radioterapii, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska,

2Zakład Epidemiologii,

Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice, Polska, 3Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum

Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska Cel: Celem pracy było zbadanie współzależności wolnokrążących markerów nowotworowych (antygenów) Ca 19-9 oraz CEA, oznaczanych u chorych na raka żołądka przed leczeniem, z wybranymi parametrami morfologii krwi obwodowej i parametrami biochemicznymi. Materiał i metoda: Do analizy włączono szczegółowe charakterystyki 142 pacjentów przed rozpoczęciem leczenia, przyjętych w latach 2006-2013 do CO-I w Gliwicach, obejmujące ich wiek (średnia = 57,5, mediana = 59, zakres = 33-73) płeć (M = 70,1 %, K = 29,9 %), lokalizację nowotworu (32,2 % wpust, 67,8 % reszta żołądka), a także szeroki zakres wskaźników biochemicznych i morfologicznych (łącznie 28 parametrów). Wyniki: Podwyższone stężenie Ca 19-9 i CEA stwierdzono odpowiednio u 22,8% (32 pacjentów) i 19% (27 chorych). Ze względu na stwierdzenie odstępności rozkładów markerów od własności normalnych, korelacje pomiędzy badanymi zmiennymi określono przy pomocy testów nieparametrycznych Spearmana (dla zmiennych ciągłych) i testu Wilcoxona (dla płci i lokalizacji). Stwierdzono tylko pojedyncze zależności statystycznie istotne- wprost proporcjonalną zależność stężeń CA19-9 z poziomem eozynofilów i odwrotnie proporcjonalną ze stężeniem kreatyniny; poziomy CEA i limfocytów są zaś skorelowane dodatnio. Dodatkowo, stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy badanymi markerami CA19-9 oraz CEA (współczynnik r =0,253 p=0,0028.) Wyniki testów Wilcoxona nie potwierdziły zależności statystycznie istotnej dla lokalizacji guza (wpustu vs reszta żołądka) i płci badanych pacjentów, a stężeniem markerów. Wnioski: Poziom wolnokrążących markerów nowotworowych był podwyższony u co piątego chorego. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy znanymi czynnikami klinicznymi i wartością stężenia wolnokrążących markerów nowotworowych. Stwierdzono korelację pomiędzy stężeniem wolnych markerów nowotworowych i wybranymi parametrami morfologii i biochemii krwi obwodowej, jednak znaczenie pozostaje niejasne. 108. Wpływ nosicielstwa GBS u kobiet ciężarnych na zdolność antyoksydacyjną organizmu. Anna Blacha

1, Mariusz Machczyński

2, Maria Pioruńska- Stolzmann

1, Lech Torliński

1, Kalina

Maćkowiak1

1Wydział Lekarski II, Uniwersytet Medyczny im.Karola Marcinkowskiego, Polska,

2Poradnia Położniczo

Ginekologiczna w Poznaniu, Polska Biocenoza pochwy to układ stabilny, jednak podlegający ciągłym, chociaż najczęściej niewielkim zmianom ilościowym. Zmiany te dotyczą liczby pałeczek kwasu mlekowego, a także ilości bakterii pochodzących z przewodu pokarmowego lub kolonizujących ujście cewki moczowej. Szczególnego znaczenia nabiera ten fakt u kobiet ciężarnych u których obecność Streptococcus agalactiae, może być przyczyną wystąpienia wczesnej posocznicy u noworodków. Do transmisji wertykalnej dochodzi przede wszystkim po rozpoczęciu porodu lub pęknięciu błon płodowych. Streptococcus agalactiae to paciorkowiec β- hemolizujący zaliczany do grupy serologicznej B (GBS-Group B Streptococcus), który jako tzw. bakteria komensala, może kolonizować dolny odcinek przewodu pokarmowego, odbytu i środowisko pochwy. Kolonizacja może mieć charakter przejściowy, przewlekły lub przerywany. Badanie na obecność GBS w 35-37 tygodniu ciąży jest objęte najnowszymi zaleceniami Ministerstwa Zdrowia. Celem badania była ocena stężenia wybranego parametru peroksydacji lipidów i zdolności antyoksydacyjnej w surowicy krwi kobiet ciężarnych, które były nosicielkami GBS oraz u kobiet ciężarnych nie będących nosicielkami GBS Materiał do badań uzyskano podczas rutynowych badań kontrolnych pacjentek Przychodni Położniczo-Ginekologicznej w Poznaniu. Grupę badaną (GI; wiek 30,5±5,5 lat) stanowiło 17 kobiet w 35-37 tygodniu ciąży, które były nosicielkami Streptococcus agalactiae (GBS+). Grupę porównawczą (GII; wiek 29,0 ±4,6) stanowiło 20 kobiety w 35-37 tygodniu ciąży, które nie były nosicielkami Streptococcus agalactiae (GBS-). U wszystkich kobiet oznaczono stężenie dialdehydu malonowego (MDA), stężenie wolnych grup -SH oraz całkowitą zdolność antyoksydacyjną organizmu wyrażoną jako FRAP (ferric reducing/antioxidant power). Wyniki: W grupie kobiet z GBS+ (GI) stężenie dialdehydu malonowego (MDA) wyniosło 15,52 ±0,016 µmol/L, stężenie wolnych grup-SH 0,274 ±0,041 mmol, a całkowita zdolność antyoksydacyjna organizmu 691,07 ±64,50 µmola (wyrażona w postaci equivalentu Troloxu).

Natomiast w grupie porównawczej (GII) wartości te wynosiły odpowiednio; dla dialdehydu malonowego 14,57 ±0,15 µmol/L, wolnych grup –SH 0,299 ±0,052 mmol, a całkowita zdolność antyoksydacyjna organizmu była równa 533,21 ±139,44 µmol. W przypadku stężeń MDA i wolnych grup-SH nie obserwowano różnic istotnych statystycznie między badanymi grupami (GI vs GII). Wykazano natomiast różnicę istotną statystycznie dla zdolności antyoksydacyjnej wyrażonej jako FRAP (p=0,0001) między grupą kobiet będących nosicielkami GBS oraz kobiet ciężarnych nie będących nosicielkami GBS. Wnioski: Zaobserwowane wyższe stężenie FRAP w grupie kobiet, które były nosicielkami Streptococcus agalactiae (GBS+) może wskazywać na obronę organizmu przed niebezpieczeństwem związanym z zakażeniem paciorkowcem β-hemolizującym. 109. Obrona antyoksydacyjna u kobiet w ciąży. Urszula Grudzień

1, Katarzyna Gawlik

2, Dorota Pawlica

2, Bogdan Solnica

1

1 Zakład Diagnostyki Katedra Biochemii Klinicznej UJCM, Polska,

2 Zakład Diagnostyki Katedra

Biochemii Klinicznej UJCM, Polska Wstęp: Stres oksydacyjny jest definiowany jako brak równowagi między produkcją reaktywnych form tlenowych (ROS) a aktywnością antyoksydacyjną. Ciąża to stan zwiększonego stresu oksydacyjnego, wynikającego z aktywności mitochondrialnej łożyska. Cel pracy: Celem pracy było oszacowanie różnic w poziomie aktywności antyoksydantów u zdrowych ciężarnych w porównaniu do zdrowych kobiet nie będących w ciąży. Materiały i metody: Badaniem objęto 29 zdrowe ciężarne (ZC ). Grupę odniesienia stanowiły 22 zdrowe kobiety nie będące w ciąży ( ZNC ). U wszystkich kobiet dokonano pomiaru aktywności reduktazy glutationowej ( GR ) w osoczu, aktywności peroksydazy glutationowej ( GPx) w osoczu oraz całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza, mierzonej za pomocą parametru FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma ). Oznaczono również stężenie CRP oraz kwasu moczowego w surowicy. Wyniki: Wykazano nie znamienny statystycznie spadek aktywności peroksydazy glutationowej oraz wzrost stężenia FRAP w grupie kobiet ciężarnych w porównaniu z kobietami bez ciąży ( odpowiednio dla GPx: 560,69 U/L u ZC oraz 651,12 U/L u ZNC; p=0,62 oraz dla FRAP: 1,115 mmol/l u ZC oraz 1,067 mmol/l dla ZNC, p=0,36 ). Nie zaobserwowano różnic w aktywności reduktazy glutationowej oraz w stężeniu kwasu moczowego między grupami (58,04 U/l dla ZC oraz 59,44 U/l dla ZNC; 2,02 μmol/l u ZC oraz 2,07 μmol/l u ZNC ). Zaobserwowano znamienny wzrost stężenia CRP u kobiet w ciąży w porównaniu z grupą kontrolną (1,78 mg/L dla ZC, 0,44 mg/L dla ZNC, p< 0,01). Wykazano korelację między aktywnością peroksydazy glutationowej oraz stężeniem kwasu moczowego w obu grupach (p=0,026 r= 0,33) jak również między FRAP oraz CRP w grupie kobiet w ciąży (r=0,4340, p=0,039). Podsumowanie: W badaniach nie wykazano znamiennych różnić w obronie antyoksydacyjnej mierzonej za pomocą GR, GPx, FRAP oraz kwasu moczowego u ciężarnych w porównaniu do kobiet nie będących w ciąży. Wykazano, iż kwas moczowy pełni funkcję drobnocząsteczkowego antyoksydanta. Badania sugerują iż stres oksydacyjny w ciąży może wynikach z nadmiernej produkcji ROS, niewyrównanej przez pozostającą bez zmian obronę antyoksydacyjną. Wzrost stężenia CRP w grupie kobiet w ciąży wskazuje na stan średniej odpowiedzi immunologicznej w tej grupie. 110. Ocena stężeń CA 125, IL-8 i STNF RI u chorych na mięsaki macicy. Beata Kotowicz

1, Małgorzata Fuksiewicz

1, Maria Kowalska

1, Anna Dańska-Bidzińska

2, Mariusz

Bidziński3, Janina Kamińska

1

1 Zakład Markerów Nowotworowych, Centrum Onkologii-Instytut Warszawa, Polska,

2 II Klinika

Położnictwa i Ginekologii, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska, 3 Dział Kliniczny

Ginekologii, Świętokrzyskie Centrum Onkologii, Polska Cel pracy: Mięsaki macicy są niejednorodną grupą nowotworów pochodzenia mezenchymalnego. Stanowią zaledwie ok. 1% wszystkich nowotworów ginekologicznych, jednakże stwarzają istotny problem terapeutyczny. Celem pracy było wstępne określenie przydatności oznaczania standardowego markera nowotworowego CA 125, interleukiny 8 oraz rozpuszczalnego receptora TNF – sTNF RI w surowicy krwi chorych na mięsaki macicy.

Materiał i Metody: Badaniami objęto 52 chore, przed leczeniem, w wieku 23-80 lat (mediana 56 lat). W surowicy krwi badanych chorych oznaczono stężenia CA 125 oraz IL-8 i sTNF RI. Stężenia CA 125 oznaczano metodą chemiluminescencji w systemie Architect i2000sr, zestawami firmy Abbott Diagnostics, IL-8 i sTNF RI metodą immunoenzymatyczną ELISA zestawami firmy R&D Systems. Normy dla IL-8 i sTNF RI ustalono w oparciu o oznaczenia tych parametrów w grupie kontrolnej, którą stanowiło 40 zdrowych kobiet, w wieku od 28 do 63 (mediana 48 lat), przyjmując jako punkt odcięcia 95 percentyl. Wyniki: W badanej grupie u największego odsetka chorych, podwyższone były stężenia sTNF RI (94%), podczas gdy stężenia standardowego markera CA 125 tylko u 23% badanych. Stężenia interleukiny 8 podwyższone były u 56% chorych. Wykazano znamiennie wyższe stężenia wszystkich badanych parametrów: sTNF RI (p<0,0001), CA 125 (p< 0,0001) i IL-8 (p< 0,0029) w surowicy krwi chorych, w porównaniu z grupą kontrolną zdrowych kobiet. W oparciu o analizę krzywych ROC u chorych na mięsaki macicy, najwyższą czułość diagnostyczną wykazano dla sTNF RI (AUC=0,998) a dla IL-8 AUC=0,812, podczas gdy czułość diagnostyczna dla CA 125 wynosiła AUC=0,748. Podsumowanie: U chorych na mięsaki macicy stwierdzono, że czułość diagnostyczna oznaczanych cytokin, potwierdzona analizą krzywych ROC, była znacznie wyższa niż czułość markera nowotworowego CA 125. Wydaje się, że oznaczanie stężeń IL-8 oraz sTNF RI łącznie z CA 125 może mieć istotne znaczenie u chorych na mięsaki macicy. 111. Monitorowanie terapii antyagregacyjnej z zastosowaniem analizatora multiplate® - ustalenie optymalnych warunków wykonania oznaczenia. Paweł K. Kunicki

1, Karolina Woźniak

1, Joanna Waś

1

1Pracownia Farmakologii Klinicznej i Terapii Zakładu Biochemii Klinicznej, Instytut Kardiologii, Polska

Skojarzona terapia antyagregacyjna pochodnymi kwasu acetylosalicylowego i klopidogrelem jest standardowym postępowaniem u chorych po przebytym ostrym zespole wieńcowym oraz leczonych przezskórną interwencją wieńcową. Jedną z możliwości optymalizacji terapii antyagregacyjnej jest analiza agregacji płytek krwi oznaczana pomiarem oporności impedancyjnej. Celem naszych badań było wyznaczenie optymalnych warunków dla wykonania oznaczenia uwzględniających wpływ czasu i temperatury na pobraną próbkę krwi. Badania zdolności płytek krwi do agregacji wykonano z wykorzystaniem analizatora Multiplate® oraz odczynników ASPI test (do oceny działania kwasu acetylosalicylowego) oraz ADP test (do oceny wpływu klopidogrelu) (Roche). Materiał biologiczny uzyskano od zdrowych ochotników nie leczonych antyagregacyjnie w ciągu poprzedzających 7 dni. Test ASPI wykonano w grupie 7 osób (4 M, 3 K) w wieku 27-44 lat, natomiast test ADP wykonano w grupie 8 osób (2 M, 6 K) w wieku 26-49 lat. Oznaczenia wykonano zgodnie z procedurą analityczną producenta. Oceniono wpływ czasu upływającego od pobrania próbki krwi na uzyskany wynik agregacji wykonując oznaczenia po: 1; 2; 4; 6; 10 i 24 h; jednocześnie zbadano wpływ temperatury przechowywania pobranej próbki krwi wykonując równoległe analizy dla próbek przechowywanych w lodówce (4

oC, TL) i w temp. pokojowej (24

oC, TP).

Zaobserwowano duże zróżnicowanie międzyosobnicze zarówno w wartościach agregacji, jak i w przebiegu zdolności do agregacji podczas przechowywania próbki dla obu ocenianych testów. Uśrednione (n=7) wyniki uzyskane dla testu ASPI wyrażone w wartości pola pod krzywą AUC [AU*min] wynosiły odpowiednio: 393 ± 186 (TL) i 429 ± 223 (TP) po 1 h (NS), 453 ± 148 (TL) i 474 ± 178 (TP) po 2 h (NS), 450 ± 142 (TL) i 289 ± 100 (TP) po 4 h (p=0,0469), 347 ± 112 (TL) i 195 ± 88 (TP) po 6 h (p=0,0156), 332 ± 152 (TL) i 116 ± 48 (TP) po 10 h (p=0,0156) oraz 100 ± 71 (TL) i 93 ± 50 (TP) po 24 h od pobrania (NS). Uśrednione (n=8) wyniki uzyskane dla testu ADP wyrażone w wartości pola pod krzywą AUC [AU*min] wynosiły odpowiednio: 704 ± 271 (TL) i 698 ± 310 (TP) po 1 h (NS), 694 ± 299 (TL) i 551 ± 360 (TP) po 2 h (NS), 577 ± 233 (TL) i 247 ± 85 (TP) po 4 h (p=0,0078), 480 ± 208 (TL) i 194 ± 68 (TP) po 6 h (p=0,0078), 334 ± 151 (TL) i 155 ± 28 (TP) po 10 h (p=0,0078) oraz 96 ± 85 (TL) i 152 ± 38 (TP) po 24 h od pobrania (NS). Reaktywność płytek przechowywanych w TP szybko ulega obniżeniu (różnice znamienne od czasu 4 h) w porównaniu z próbkami krwi przechowywanymi w TL dla obu ocenianych testów. Badanie powinno być wykonane najpóźniej w ciągu 4 h (ASPI test) i 2 h (ADP test) od pobrania przy przechowywaniu próbki w TL, i nie później niż w ciągu 2 h (ASPI test) i 1 h (ADP test) od pobrania przy braku możliwości chłodzenia próbki. W związku z zaobserwowaną niestabilnością pomiaru w

czasie przechowywania próbki, dla omawianej metodyki należy wdrożyć wewnątrzlaboratoryjną procedurę analityczną standaryzującą warunki wykonywania pomiarów. 112. Postępowanie diagnostyczne u dzieci z deficytem mcad wykrytym w badaniu przesiewowym noworodków. Tomasz Poławski

1, Ewa Głąb-Jabłońska

1, Mariusz Ołtarzewski

1

1 Zakład Badań Przesiewowych, Instytut Matki i Dziecka, Polska

Deficyt dehydrogenazy średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych (MCAD) katalizującej reakcję utlenienia atomu węgla w pozycji β należy do jednych z najczęściej występujących bloków metabolicznych β-oksydacji kwasów tłuszczowych. Niezdiagnozowany deficyt MCAD może powodować hipoglikemię hipoketotyczną, zespół Reye'o-podobny, a w przypadku ostrej dekompensacji metabolicznej może prowadzić do nagłej śmierci bądź nieodwracalnych uszkodzeń układu nerwowego. Wczesne wykrycie deficytu MCAD w badaniu przesiewowym noworodków, polegającym na oznaczeniu profilu acylokarnityn w suchej kropli krwi z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas (LC/MS/MS), jest istotne dla dalszego postępowania klinicznego. Populacja objęta badaniem składała się z trzech grup pacjentów: osób z niedoborem aktywności MCAD (n = 15) wytypowanych na podstawie pozytywnych wyników badania profilu kwasów organicznych w moczu metodą GC/MS oraz profilu acylokarnityn w suchej kropli krwi metodą LC/MS/MS, rodziców dzieci z deficytem MCAD (prawdopodobni nosiciele; n = 8) oraz z grupy kontrolnej (zdrowe dzieci; n = 30). W celu potwierdzenia lub wykluczenia deficytu MCAD wykonano ilościowe oznaczenie aktywności dehydrogenazy acylo-CoA w izolowanych na ficolu limfocytach, polegające na badaniu utlenienia oktanoilo-CoA (C8-CoA) i redukcji heksafluorofosforanu ferrocenu (FcPF6). Ilość powstałego 2-oktenoilo-CoA (C8:1-CoA) oznaczono metodą HPLC z detektorem UV-VIS. Uzyskane aktywności MCAD porównano z profilem acylokarnityn, które oznaczono metodą LC/MS/MS dla n-butylowanych pochodnych w suchej kropli krwi pobranej na bibułę Whatman 903. Zakres aktywności u zdrowych osób wyniósł od 42,8 do 105,1 pmol C8:1-CoA min

-1 10

6 komórek

-1. Natomiast u osób z deficytem

MCAD aktywność wahała się w zakresie 0,3 – 18,8 pmol C8:1-CoA min-1

106 k

-1 (0,3 % – 25 %

średniej aktywności grupy kontrolnej). U rodziców dzieci z deficytem (przypuszczalnych nosicieli) aktywność wynosiła 22,1 – 45,4 pmol C8:1-CoA min

-1 10

6 k

-1 (30 % - 61 % grupy kontrolnej). W

materiale pobranym od chorych z deficytem MCAD profil acylokarnityn wykazywał stale podwyższony poziom oktanoilokarnityny. Natomiast nie zaobserwowano korelacji pomiędzy stopniem obniżenia aktywności dehydrogenazy acylo-CoA a podwyższeniem acylokarnityn C6, C8, C10, których poziom jest zależny od aktualnego stanu metabolicznego pacjenta. U 26% chorych z deficytem MCAD aktywność utrzymywała się w zakresie 17,5% - 26,5% średniej aktywności grupy kontrolnej, co może świadczyć o braku homogeniczności genetycznej populacji osób z niedoborem aktywności tego enzymu. Przypadki te ze względu na częściowy deficyt aktywności mogą przedstawiać łagodniejszy obraz kliniczny. 113. Encefalopatia manganowa – znaczenie oznaczeń manganu w materiale biologicznym Michał Ordak

1, Halina Matsumoto

1, Małgorzata Abramowska

1, Tadeusz Nasierowski

1, Marcin Wojnar

1

1 I Wydział Lekarski, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska

W ostatnich latach w Polsce wprowadzono oraz wyegzekwowano prawo mówiące m.in. o konfiskacie dopalaczy. Jednym z nieoczekiwanych efektów tego wydarzenia było zwiększenie nielegalnej produkcji efedronu (metkatynonu) z popularnych leków zawierających pseudoefedrynę takich jak: Sudafed, Gripex. Do produkcji efedronu używa się nadmanganianu potasu, który nie jest usuwany z uzyskanego preparatu. Przewlekłe stosowanie metylokatynonu może doprowadzić do tzw. encefalopatii efedronowej, związanej z nagromadzeniem manganu w OUN, charakteryzującej się zespołem nieodwracalnym objawów neurologicznych. Istnieje niewielka liczba badań dotyczących skali tego zjawiska w Polsce oraz opisu metod analitycznych stosowanych do oznaczeń manganu w materiale biologicznym: we krwi oraz w moczu. Terapia monitorowana stężeniem manganu mogłaby w znaczący sposób zwiększyć skuteczność terapii w zatruciu tym mikroelementem.

114. Diagnostyka boreliozy i chorób odkleszczowych. Małgorzata Zielińska-Przyjemska

1, Piotr Bociąg

1, Karolina Lisiak-Teodorczyk

1, Jacek Wojciechowicz

1

1 Centrum Badań DNA Sp. z o.o., Polska

Borelioza z Lyme najczęściej występująca choroba odkleszczowa - stanowi przedmiot intensywnych badań naukowych, które zaowocowały poznaniem wielu mechanizmów patogenetycznych i reakcji immunologicznych w zakażonym organizmie, jak również znacznym postępem w zakresie nowoczesnej diagnostyki schorzenia. Obecnie uważa się, że borelioza może stanowić zespół infekcji odkleszczowych, ponieważ kleszcze mogą być zakażone, oprócz Borrelia burdorferi, innymi patogenami, takimi jak bakterie, pierwotniaki czy wirusy (np. Babesia microti, Anaplasma phagocytophilum, Bartonella henselae/quintana, Mycoplasma pneumoniae, wirus odkleszczowego zapalenia opon mózgowych). Koinfekcje, głównie Anaplasma phagocytophilum i/lub Babesia microti, zmieniają obraz kliniczny boreliozy (atypowa borelioza), utrudniając diagnostykę i leczenie. Celem pracy była analiza statystyczna stosowanych przez CBDNA testów do identyfikacji najczęstszych patogenów: Borrelia burgdorferi, Babesia microti, Bartonella henselae/quintana, Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma pneumoniae, Yersinia enterocolitica, Chlamydia pneumoniae i Toxoplasma gondii w surowicach pacjentów z podejrzeniem boreliozy. Zastosowano test przesiewowy ELISA, test potwierdzający Western-blot oraz badanie techniką immunofluorescencji pośredniej (IFA) w celu oznaczenia obecności przeciwciał w klasach IgG i IgM. Przeanalizowano również testy diagnostyczne wykonywane techniką Real Time PCR na nosicielstwo patogenów wywołujących groźne dla człowieka choroby (borelioza, babeszjoza, bartonelloza, mycoplsama) w organizmie kleszczy wyjętych ze skóry pacjentów. Autorzy mają nadzieję, że opracowane przez nich dane pozwolą na uzyskanie informacji niezbędnych dla celów rutynowej diagnostyki. 115. mIRNA-208 jako wczesny marker zawału mięśnia sercowego. Sławomir Białek

1, Dariusz Górko

2, Marcin Grabowski

2, Błażej Grodner

1, Grzegorz Opolski

2, Dariusz

Sitkiewicz1

1 Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Medycznej, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY,

Polska, 2 I Katedra i Klinika Kardiologii, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska

Cząsteczki miRNA to grupa małych, 21-23 nukleotydowych, niekodujących cząsteczek RNA, które na etapie po transkrypcyjnym regulują ekspresję genów poprzez blokowanie translacji i/lub wpływając na stabilność mRNA. W ludzkim genomie odkryto dotychczas około 1000 różnych miRNA (z czego szczegółowo opisanych zostało 721), odgrywających istotną rolę w wielu procesach m.in. różnicowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego, embriogenezie, apoptozie, stanach zapalnych. Analiza piśmiennictwa z ostatnich kilku lat wskazuje, iż markerami użytecznymi diagnostycznie mogą być również cząsteczki mikroRNA. W wielu pracach dowiedziono, że miRNAs cechuje je specyficzność tkankowa i komórkowa. Na przykład dla komórek mięśnia sercowego najbardziej specyficzne są miRNA-208a, miRNA-499 oraz miRNA-1. Natomiast dla mięśni gładkich tętnic wieńcowych miRNA-1, miRNA-133a/b, miRNA-126-3p, miRNA-30c, miRNA-26a oraz let-7. Celem pracy była próba oceny użyteczności diagnostycznej miRNA-208a jako wczesnego markera zawału mięśnia sercowego. Cel ten został zrealizowany poprzez: - Ocenę ilościową miRNA-208a u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego (STEMI) i u pacjentów z grupy kontrolnej; - Analizę dynamiki zmian poziomów krążących miRNA-208a u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego (STEMI). - Ocenę korelacji ilości cząsteczek krążących miRNA-208a ze stężeniami cTnI. Przebadano 19 pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST oraz 10 pacjentów z koronarograficznie potwierdzonym brakiem zmian miażdżycowych w naczyniach wieńcowych jako grupą kontrolną. Grupa badana obejmowała 4 kobiety i 15 mężczyzn w wieku 45-80 lat. Wszyscy pacjenci poddani zostali pierwotnej angioplastyce wieńcowej w czasie do 3 godzin od wystąpienia objawów bólowych. Krew do badań pobierano w momencie przyjęcia pacjenta do szpitala (czas 0) oraz po 3, 6, 12, 24 i 48 godzinach. Poziom miRNA-208a oznaczano w osoczu metodą rt-PCR. Poziom krążącego miRNA-208a odnoszono do stężenia cTnI w surowicy krwi. W osoczu pacjentów ze STEMI, już w momencie przyjęcia do szpitala stwierdzano obecność miRNA-208a. U pacjentów z grupy kontrolnej nie obserwowano obecności cząsteczek miRNA-208a w osoczu (poziom nieoznaczalny). Poziom krążącego miRNA-208a wzrastał w czasie, osiągając maksimum w

3-ciej godzinie (wzrost 54-krotny, p<0,001). W tym czasie stężenia cTnI były znacząco niższe niż miRNA-208a. Istotny wzrost stężenia cTnI następował dopiero w 6-tej godzinie po reperfuzji. Poziom miRNA-208a stopniowo się obniżał nie osiągając jednak poziomu wyjściowego w czasie do 48 godzin. miRNA-208a wydaje się być wczesnym i swoistym markerem uszkodzenia kardiomiocytów w następstwie zawału mięśnia sercowego. 116. Ocena przydatności peptydowego antygenu OspC-7 borrelia burgdorferi w diagnostyce serologicznej boreliozy z Lyme. Tomasz Wielkoszyński

1

1 NZOZ Zakład Pulmonologii w Tarnowskich Górach i Indywidualna Specjalistyczna Praktyka

Lekarska, Polska Borelioza z Lyme jest najczęściej występującym w Polsce zakażeniem odkleszczowym. Pomimo dysponowania szerokim wachlarzem metod bakteriologicznych, serologicznych czy molekularnych, diagnostyka boreliozy wciąż nastręcza licznych trudności i może prowadzić do uzyskiwania wyników zarówno fałszywie ujemnych, jak i fałszywie dodatnich. Złożony cykl życiowy krętka Borrelia burgdorferi s.l. oraz nabyte w toku ewolucji strategie przeżycia mikroorganizmu powodują, że diagnostyka boreliozy z Lyme jest trudna i wymaga często indywidualizacji postępowania diagnostycznego. Tradycyjnie w diagnostyce serologicznej boreliozy stosowana jest strategia dwuetapowa, polegająca na wykonaniu w I etapie testu ELISA, a w razie uzyskania dodatniego wyniku w badaniu przesiewowym – potwierdzenie testem typu immunoblot. Ponieważ nawet około 50% wyników testu ELISA może być obarczonych ryzykiem uzyskania wyniku fałszywie ujemnego (w zależności od czułości testu i stosowanych antygenów oraz wartości cut-off), sensowne wydaje się równoczesne wykonywanie obu etapów diagnostycznych jednocześnie lub wykonywanie jedynie testu immunoblot we wszystkich badanych materiałach. Pewną możliwością wydaje się również wykorzystanie do konstrukcji testów ELISA antygenów rekombinowanych lub syntetycznych antygenów peptydowych reprezentujących immunodominujące epitopy natywnych antygenów krętkowych. Jednym z takich antygenów jest heptapeptyd prezentujący epitopy zewnętrznego białka powierzchniowego C krętka B. burgdorferi (OspC) o sekwencji AESPKKP. Powszechnie uważa się, że odpowiedź immunologiczna w klasie IgM skierowana przeciw antygenowi OspC jest najważniejszym markerem serologicznym aktywnego zakażenia. Celem pracy była ocena przydatności wyników oznaczania przeciwciał przeciw antygenowi peptydowemu białka OspC (peptyd OspC-7) w diagnostyce serologicznej boreliozy oraz porównanie uzyskanych wyników z wynikami testu immunoblot dla przeciwciał w klasie IgM. Badanie wykonano w 160 próbkach surowic rutynowo badanych w kierunku obecności przeciwciał przeciw B. burgdorferii z wykorzystaniem metody immunoblot w klasie IgM (test RecomLine Borrelia firmy Mikrogen, Niemcy). Ocenę obecności przeciwciał przeciw peptydowemu antygenowi OspC-7 wykonano w klasie IgM techniką ELISA stosując płytki opłaszczone streptawidyną i biotynylowanym peptydem oraz kolejno inkubując badane surowice, konjugat anty-IgM-HRP i substrat (TMB). Do kalibracji metody wykorzystano zbiorczą surowicę IgM-pozytywną, wyrażając wyniki badanych próbek jako wartość S/Co. Wśród badanych surowic 64 (40%) było IgM-pozytywnych w teście immunoblot. Dominującą reakcją była reakcja z antygenami OspC (98% pozytywnych wyników). Dla surowic IgM-pozytywnych w teście immunoblot średnia wartość S/Co w teście ELISA z antygenem OspC-7 wynosiła 3,02 (± 0,96), zaś dla surowic IgM-negatywnych – 0,89 ± 0,66 (p<0,01). Czułość diagnostyczna testu wynosiła 91%, zaś swoistość diagnostyczna – 90% (przy założonej wartości odcięcia 1,35 S/Co). Dodatnia wartość predykcyjna testu wynosiła 78%, zaś ujemna wartość predykcyjna – 96%. Precyzja oznaczeń w serii jednoczesnej dla próbki o stężeniu decyzyjnym wynosiła 5,9%. Podsumowując można stwierdzić, że test wykorzystujący peptydowy antygen OspC-7 charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością w diagnostyce aktywnego zakażenia krętkiem B. burgdorferi (charakteryzującego się obecnością przeciwciał w klasie IgM) i może stanowić cenne uzupełnienie rutynowo stosowanych metod diagnostyki serologicznej boreliozy z Lyme. 117. Ocena porównywalności wyników oznaczania przeciwciał przeciw borrelia burgdorferi s.l. uzyskanych z wykorzystaniem testów ELISA różnych producentów. Tomasz Wielkoszyński

1, Joanna Strzelczyk

2, Gizela Trapp

2, Krzysztof Solarz

3, Andrzej Wiczkowski

2

1 NZOZ Zakład Pulmonologii w Tarnowskich Górach i Indywidualna Specjalistyczna Praktyka

Lekarska, Polska, 2 Katedra i Zakład Ogólnej Biologii Lekarskiej, Śląski Uniwersytet Medyczny w

Katowicach, Polska, 3 Zakład Parazytologii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Polska

Borelioza z Lyme jest najczęściej występującym w Polsce zakażeniem odkleszczowym, a jej diagnostyka nastręcza nadal wielu trudności metodycznych i interpretacyjnych. Rutynowa diagnostyka tego zakażenia obejmuje wykonanie w pierwszym etapie badania przesiewowego z wykorzystaniem techniki ELISA, a następnie, w przypadku uzyskania dodatniego wyniku, wykonanie testu typu immunoblot. Ze względu na ryzyko uzyskania fałszywie ujemnego wyniku testu ELISA za wysoce zasadne wydaje się jednak równoczesne wykonywanie obu etapów diagnostycznych jednocześnie lub rutynowe wykonywanie jedynie testu immunoblot. Problem niskiej swoistości analitycznej i niewielkiej czułości diagnostycznej testów ELISA stosowanych w diagnostyce choroby z Lyme wynika często z faktu stosowania jako antygenów nieoczyszczonych białek krętkowych (natywne antygeny) oraz nieodpowiednio dobranych wartości odcięcia. Problemu nie rozwiązuje również zastosowanie jako antygenów wybranych, pojedynczych antygenów rekombinowanych. Dlatego tez poważnym i niestety niedocenianym w praktyce problemem jest brak porównywalności wyników uzyskiwanych przy użyciu testów ELISA różnych producentów. Celem pracy była ocena porównywalności wyników oznaczeń przeciwciał przeciw B. burgdorferi s.l. w klasach IgG i IgM uzyskanych z wykorzystaniem testów ELISA trzech producentów. Badaniami objęto 70 próbek surowic badanych w kierunku zakażenia krętkiem B. burgdorferi s.l. Oznaczenia wykonano z wykorzystaniem testów firm: Euroimmun - EI (IgG: antygeny natywne 3 genogatunków krętka + antygen VlsE; IgM – antygeny natywne 3 genogatunków), Aescu Diagnostics - AD (IgM: natywne OspC + r-p41i; IgG: natywne antygeny + rVlsE) oraz Virotech - VT (IgG: natywne antygeny B. afzelii + rVlsE; IgM: natywne antygeny B. afzelii) zgodnie z instrukcjami producentów. W klasie IgG odpowiednio dla 40% (EI), 36% (AD) i 36% (VT) próbek uzyskano wynik dodatni, dla 23% (EI), 11% (AD) i 17% (VT) – wynik graniczny oraz dla 37% (EI), 53% (AD) i 47% (VT) – wynik ujemny. Korelacja wyników pomiędzy testami wynosiła odpowiednio: 0,57 (EI vs AD), 0,87 (EI vs VT) i 0,63 (AD vs VT). Zgodność wyników dla wszystkich testów wynosiła 22,9% (wyniki dodatnie), 27,1% (wyniki graniczne) i 50% (wyniki ujemne). W klasie IgM odpowiednio dla 23% (EI), 18,5% (AD) i 33% (VT) próbek uzyskano wynik pozytywny, dla 21% (EI), 8,5% (AD) i 14% (VT) – wynik graniczny oraz dla 46% (EI), 73% (AD) i 53% (VT) – wynik ujemny. Korelacja wyników pomiędzy testami wynosiła odpowiednio: 0,92 (EI vs AD), 0,55 (EI vs VT) i 0,62 (AD vs VT). Zgodność wyników dla wszystkich testów wynosiła 7,1% dla wyników pozytywnych, 34,3% dla wyników granicznych oraz 41,4% dla wyników negatywnych. W świetle uzyskanych wyników bardzo istotne wydaje się zwrócenie uwagi na jakość testów ELISA stosowanych w diagnostyce boreliozy i wybór testów wykorzystujących antygeny pochodzące z genogatunków (serotypów) krętków występujących na danym obszarze geograficznym. Porównywanie wyników uzyskanych testami różnych producentów wydaje się bardzo utrudnione, a często praktycznie niemożliwe. 118. Ocena glikowanej hemoglobiny HbA1c u osób diagnozowanych przy użyciu testu doustnego obciążenia glukozą. Ewa Wysocka

1, Włodzimierz Pawłowski

2, Marcin Nowicki

1, Maciej Cymerys

3, Waldemar Myszka

1

1 Zakład Biochemii Klinicznej i Medycyny Laboratoryjnej Katedry Chemii i Biochemii Klinicznej,

Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Polska, 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Mikrobiologicznej,

Szpital Wojewódzki w Poznaniu, Polsk, 3 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Zaburzeń

Metabolicznych i Nadciśnienia Tętniczego, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Polska Amerykańskie Towarzystwo Diabetologiczne (ADA) od 2010r. rekomenduje glikowaną hemoglobinę HbA1c w diagnostyce dysglikemii, dla cukrzycy (DM) ≥6.5% oraz dla stanów przedcukrzycowych (PreDM) 5.7-6.4%, oznaczoną metodami certyfikowanymi przez National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP). Polskie Towarzystwo Diabetologiczne nie zaleca takiego postępowania, z powodu braku wystarczającej kontroli jakości metod laboratoryjnych w Polsce oraz nieustaloną wartość diagnostyczną HbA1c w rozpoznawaniu cukrzycy dla polskiej populacji (Diabetologia Kliniczna,2013,t.2,supl.A). Celem pracy była ocena HbA1c u osób z podejrzeniem dysglikemii, w zależności od wyników testu doustnego obciążenia glukozą (OGTT).

Materiał i metody: Do badania kwalifikowano pacjentów Poradni Zaburzeń Metabolicznych z podejrzeniem zespołu metabolicznego, w ramach pierwotnej profilaktyki chorób sercowo-naczyniowych. U 120 osób, 52 mężczyzn (M) i 68 kobiet (K), w wieku 22-79 lat, wykonano badanie przedmiotowe, m.in. pomiary antropometryczne i ciśnienia tętniczego krwi (BP), badania laboratoryjne, m.in. cholesterol całkowity (T-C), cholesterol frakcji HDL (HDL-C), triacyloglicerole (TAG), cholesterol frakcji LDL (LDL-C), HbA1c i przeprowadzono 75-g OGTT wg zaleceń WHO. Stężenie glukozy (G) w trakcie OGTT (G-0 i G-120) oraz profil lipidowy, na czczo, w osoczu oceniano metodami enzymatycznymi (Dimension Xpand Plus Systems, Siemens Healthcare Diagnostics). HbA1c mierzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC, D-10 Bio-Rad), certyfikowaną przez NGSP. Na podstawie wyników OGTT ustalono: prawidłową tolerancję glukozy, NGT (G-0<5.6mmol/l, G-120<7.8mmol/l), nieprawidłową glikemię na czczo, IFG (G-0 5.6-6.95mmol/l, G-120<7.8mmol/l), upośledzoną tolerancję glukozy, IGT (G-0<7.0mmol/l, G-120 7.8-11.05mmol/l) i cukrzycę, T2DM (G-0<7.0mmol/l, G-120≥11.1mmol/l). Analizie statystycznej (programy STATISTICA10.0 i MedCalc12.5.0) poddano wyniki pacjentów grup: NGT n=50 (19M/31K), IFG n=22 (9M/13K), IGT n=26 (11M/15K), PreDM=IFG+IGT n=48 (20M/28K) i T2DM n=22 (13M/9K). Wyniki: 1.W populacji n=120, mężczyźni i kobiety prezentowali podobny wiek, BP, BMI, G-0, G-120, HbA1c i parametry lipidowe z wyjątkiem wyższego HDL-C i niższych TAG u kobiet. Zaobserwowano dodatnie korelacje HbA1c z:G-0 (R=0.58;p<0.0001), G-120 (R=0.61;p<0.0001), wiekiem (R=0.25;p=0.0055), obwodem talii (R=0.23;p=0.0181), ciśnieniem skurczowym (R=0.35;p=0.0001). 2.HbA1c<5.7% zaobserwowano u 66.0% osób NGT, 31.8% osób IFG, 26.9% osób IGT, 4.5% osób T2DM; HbA1c 5.7-6.4%: u 34% osób NGT, 50.0% osób IFG, 65.4% osób IGT, 13.7% osób T2DM; HbA1c≥6.5%: brak w grupie NGT, u 18.2% osób IFG, 7.7% osób IGT, 81.8% osób T2DM. 3. Analiza krzywych ROC wskazała wartość HbA1c 5.8% różnicującą NGT i PreDM z 56.2% czułością i 84.0% swoistością (AUC 0.773), wartość HbA1c 6.4% różnicującą PreDM i T2DM z 81.8% czułością i 87.5% swoistością (AUC 0.877) oraz HbA1c 6.4% różnicującą IGT i T2DM z 81.8% czułością i 92.3% swoistością (AUC 0.874). Wnioski: Wstępna ocena użyteczności HbA1c (pojedynczych oznaczeń zamiast zalecanych przez ADA – dwóch) w rozpoznawaniu stanów przedcukrzycowych i cukrzycy u bezobjawowych Wielkopolan – w odniesieniu do wyników OGTT, potwierdza znaczenie diagnostyczne parametru oraz sugeruje przyjęcie dla populacji polskiej rekomendowanych przez ADA wartości odcięcia, zwłaszcza przy rozpoznawaniu cukrzycy. 119. Wpływ palenia tytoniu na wybrane parametry gospodarki lipidowej i węglowodanowej u młodych mężczyzn. Kalina Maćkowiak

1, Alicja Brożek

1, Marcin Nowicki

2, Anna Blacha

2, Ewa Wysocka

1, Lech Torliński

1

1 Uniwersytet Medyczny im.Karola Marcinkowskiego, Polska,

2 Wydział Lekarski II, Uniwersytet

Medyczny im.Karola Marcinkowskiego, Polska W 2010r. Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (AHA) zaproponowało koncepcję zdrowia sercowo-naczyniowego, które definiowane jest równolegle z obecnością czterech zachowań prozdrowotnych oraz trzema czynnikami kliniczno-laboratoryjnymi. Wśród zachowań prozdrowotnych szczególne znaczenie mają: prawidłowy wskaźnik masy ciała (BMI), aktywność fizyczna i rekomendowana dieta oraz abstynencja nikotynowa. Prawidłowe stężenie cholesterolu całkowitego (T-C), ciśnienie krwi oraz stężenie glukozy to kliniczno-laboratoryjne czynniki mające wpływ na zmniejszenie ryzyka zapadalności na choroby sercowo-naczyniowe w przyszłości. Współczesne wytyczne Światowej Organizacji Zdrowia zalecają ocenę czynników ryzyka u młodych dorosłych po ukończeniu 20 roku życia. Jest to okres, w którym młode zdrowe osoby wkraczają w życie zawodowe, a jednocześnie jest to czas na najbardziej skuteczną modyfikację stylu życia. Celem badania była ocena wybranych parametrów gospodarki lipidowej i węglowodanowej oraz pomiar ciśnienia krwi, jak również pomiar parametrów antropometrycznych u młodych zdrowych ochotników płci męskiej z uwzględnieniem nałogu palenia. W pracy dokonano analizy wyników badań przesiewowych w grupie zdrowych ochotników – studentów Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Grupę palących (MP) stanowiło 58 mężczyzn w wieku 22±3 lata i grupę niepalących (MN) stanowiło 82 mężczyzn w wieku 22±2 lata. U wszystkich mężczyzn na czczo wykonano profil lipidowy i oznaczono stężenie glukozy. Ponadto wykonano pomiary antropometryczne i pomiary ciśnienia krwi. We krwi włośniczkowej oceniano: stężenie glukozy (GLU), cholesterolu całkowitego (T-C), cholesterolu frakcji HDL (HDL-C), triacylogliceroli (TAG) na analizatorze biochemicznym Reflotron

Plus (Roche Diagnostics, USA). Stężenie cholesterolu frakcji LDL (LDL-C) wyliczono ze wzoru Friedewalda, obliczono wartość nie HDL-C i wskaźnik T-C/HDL-C. W grupie MP średnie stężenia w mg/dL wynosiły: GLU-69,7±5,9, T-C -150,4 ±26,6, TAG 89,2 ±33,5, HDL-C 59,4 ±14,9 , LDL-C 76,8 ±26,6. Średnie stężenia w mg/dL w grupie MN wynosiły: GLU-71,9 ±7,0, T-C -152,4 ±24,5, TAG 76,8 ±23,9, HDL-C 74,9 ±10,9 , LDL-C 62,7 ±21,9. Wykazano istotne statystycznie różnice pomiędzy grupami badanymi (MP vs MN) dla TAG i HDL-C, LDL-C oraz wskaźnika C-T/HDL-C. Palenie tytoniu wpływa niekorzystnie na profil lipidowy i jako niezależny czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych zwiększa możliwość wystąpienia tych chorób w przyszłości u młodych mężczyzn. 120. Badania przesiewowe w kierunku zakażenia mycobacterium tuberculosis u osadzonych w śląskich zakładach penitencjarnych. Wanda Maksymowicz-Mazur

1, Joanna Pendzich

1, Jerzy Kozielski

2

1Pracownia Bakteriologii Gruźlicy, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 3 Śląskiego

Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Polska, 2Katedra i Klinika Chorób Płuc i Gruźlicy,

Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 3 Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Polska WPROWADZENIE I CEL PRACY. Gruźlica w więzieniach stanowi alarmujący problem zdrowia publicznego w większości krajów, nie tylko w krajach rozwijających się. Z prowadzonych na całym świecie badań wynika, że częstość występowania gruźlicy jest znacznie wyższa wśród osób osadzonych w zakładach penitencjarnych, niż w populacji ogólnej. W 2003 roku w Polsce częstość występowania gruźlicy wynosiła w ogólnej populacji 26.5/100000, a wśród więźniów 238.7/100000, natomiast w USA-6.7/100000 w ogólnej populacji oraz 29.4/100000 wśród więźniów. Wiadomo, że status socjoekonomiczny, bezdomność, narkomania, niedożywienie, stres fizyczny i psychiczny mogą pogarszać stan zdrowia, zwiększyć wrażliwość na infekcje lub zwiększyć ryzyko aktywacji latentnej formy gruźlicy. Zatłoczenie, niewystarczająca wentylacja pomieszczeń, częsta rotacja osadzonych w obrębie jednostki penitencjarnej i między jednostkami stwarzają sprzyjające warunki dla transmisji gruźlicy. Wg danych amerykańskich pobyt w więzieniu przez rok zwiększa 2.2-krotnie zagrożenie infekcją prątkiem gruźlicy. System więziennictwa stanowi więc potencjalny rezerwuar M. tuberculosis, w tym szczepów lekoopornych. W trakcie przebywania w miejscu odosobnienia osadzeni mają kontakt z wieloma pracownikami i odwiedzającymi. Większość osadzonych wraca na wolność i kontaktuje się z populacją ogólną. Celem pracy było przeprowadzenie profilatycznych badań w kierunku zakażenia prątkiem gruźlicy w jednej z grup najwyższego ryzyka-wśród aresztantów i więźniów, z wykorzystaniem nowoczesnych metod diagnostycznych. MATERIAŁ I METODY. Próby plwociny pobrano od 234 osadzonych: 84 w śląskim zakładzie karnym i 150 w śląskim areszcie śledczym. Plwocinę poddawano dekontaminacji metodą NALC/NaOH. Ze zdekontaminowanego materiału klinicznego /1/ wykonywano preparaty mikroskopowe, które barwiono w kierunku obecności bakterii kwasoopornych, /2/ posiewano próby na podłoża płynne BACTEC MGIT (szybka metoda hodowlana), /3/ izolowano RNA w celu wykrycia konkretnych gatunków z rodzaju Mycobacterium. Metoda BACTEC MGIT została również wykorzystana do określenia lekooporności prątków. Zestaw AST SIRE KIT użyto do oceny lekooporności prątków na streptomycynę, izoniazyd, rifampicynę i etambutol, natomiast zestaw AST PZA KIT posłużył do oceny lekooporności prątków na pirazynamid. Zastosowano też metodę molekularną GenoType Mycobacteria Direct umożliwiającą bezpośrednią diagnostykę w materiałach klinicznych pięciu gatunków/grup mykobakterii (M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. malmoense i M tuberculosis complex). WYNIKI. Prątki gruźlicy wykryto w plwocinie jednego mężczyzny ze 150 osadzonych w areszcie śledczym oraz dwóch mężczyzn na 84 osadzonych w zakładzie karnym Obecność prątków zdiagnozowano metodą BACTEC MGIT i potwierdzono zestawem MGIT TBc Identification Test. Jeden z trzech wyizolowanych szczepów prątków gruźlicy był oporny na etambutol, a wrażliwy na pozostałe trzy leki pierwszej linii oraz na pirazynamid. Drugi szczep był oporny na streptomycynę i pirazynamid, a wrażliwy na izoniazyd, rifampicynę i etambutol. Szczep trzeci okazał się wrażliwy tylko na rifampicynę, natomiast oporny na pozostałe testowane leki. WNIOSKI: Profilaktyczne badania w kierunku zakażenia prątkami gruźlicy osadzonych w zakładach penitencjarnych są niezbędne i pozwalają na wykrycie przypadków aktywnej gruźlicy w jednej z grup najwyższego ryzyka. Stwierdzenie zakażenia prątkami gruźlicy umożliwia szybkie rozpoczęcie oceny

lekopornpości wyizolowanych szczepów bakterii i podjęcie celowanej chemioterapii. Zastosowanie nowoczesnych metod laboratoryjnych takich, jak szybka metoda hodowlana czy metoda molekularna w znacznym stopniu przyspiesza i usprawnia proces diagnostyczny. Wykrycie zakażenia prątkami gruźlicy u osób z grup najwyższego ryzyka wydatnie przyczynia się do obniżenia zapadalności na gruźlicę zarówno w tych grupach, jak i w ogólnej populacji. 121. Niedobory tiaminy jako czynnik rozwoju encefalopatii cholinergicznych. Agnieszka Jankowska-Kulawy

1, Hanna Bielarczyk

1, Anna Ronowska

1, Dorota Bizon-Zygmańska

1,

Andrzej Szutowicz1

1Zakład Medycyny Laboratoryjnej Katedra Biochemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny,

Polska Tiamina (witamina B1) a szczególnie jej biologicznie aktywna forma pirofosforan tiaminy odgrywa bardzo ważną rolę w organizmie człowieka. Większość puli pirofosforanu tiaminy jest transportowana do mitochondriów, gdzie jest on wbudowywany w centra aktywne enzymów od niego zależnych. Obecnie znanych jest ponad dwadzieścia różnych enzymów zależnych od pirofosforanu tiaminy. Do dobrze poznanych enzymów należą: kompleksy dehydrogenazy pirogronianowej i α-ketoglutaranowej oraz dehydrogenaza 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach. Enzymy te pełnią ważna rolę w procesach bioenergetycznych komórek regulując dopływ acetylo-CoA do cyklu Krebsa a ostatni z wymienionych enzymów jest ogniwem ograniczającym katabolizm aminokwasów, takich jak: walina , leucyna i izoleucyna. Niedobór tiaminy, jako kofaktora powoduje upośledzenie metabolizmu energetycznego mózgu poprzez zahamowanie aktywności kompleksów dehydrogenazy pirogronianowej i α-ketoglutaranowej. Jest to bezpośrednią przyczyną rozwoju zarówno obwodowych neuropatii, jak i centralnej, cholinergicznej encefalopatii. Niedobory tiaminy związane ze skrajną hipowitaminozą są dość rzadkie ze względu na urozmaicone pożywienie i dużą dostępność suplementów diety. Stosunkowo często, nawet w krajach wysoko rozwiniętych występuje subkliniczny niedobór tiaminy, który związany jest z rozwojem choroby Alzheimera i Parkinsona. Przypadki różnie nasilonych zespołów związanych z niedoborem tiaminy dotyczą określonych grup ryzyka między innymi pacjentów w podeszłym wieku, dializowanych, z rozległymi oparzeniami, z ciężkimi infekcjami bakteryjnymi, z niewydolnością serca, chorych na cukrzycę, z enter opatiami. Do grupy ryzyka zalicza się również kobiety w ciąży i w okresie laktacji oraz osoby pozostające na dietach selektywnych. Problemem współczesnego świata jest emigracja w celach zarobkowych i związana z tym oszczędność finansowa, która odbija się na zdrowiu i w wielu wypadkach na życiu ludzi. Celem przedstawionych badań było zbadanie zmian w stężeniu i dystrybucji acetylo-CoA oraz zmian w metabolizmie acetylocholiny w mózgu, w stanie niedoboru tiaminy. Modelem do badań były hodowle komórek cholinergicznych neuroblastoma SN56, w których zwiększono ekspresję fenotypu cholinergicznego. W modelu zwierzęcym wykorzystywano synaptosomy zakończeń nerwowych i komórki całego mózgu. Eksperymentalnie niedobory tiaminy w modelu komórkowym wywoływano przez dodanie do hodowli amprolium, natomiast w drugim modelu zwierzętom doświadczalnym podawano drogą wstrzyknięć podskórnych pirytiaminę. Wywołany amprolium niedobór tiaminy w hodowlach mysich komórek cholinergicznych SN56 powodował zahamowanie metabolicznego przepływu pirogronianu przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej oraz spadek poziomu acetylo-CoA w przedziale cytoplazmatycznym. Neurony o niskiej ekspresji fenotypu cholinergicznego były bardziej odporne na niedobory tiaminy niż neurony wysoko zróżnicowane. Śmiertelność tych ostatnich była dwukrotnie większa niż komórek niezróżnicowanych przy tym samym deficycie tiaminy. W komórkach zróżnicowanych stwierdzono znamienną korelacje pomiędzy poziomem acetylo-CoA, przeżywalnością i funkcją neurotransmisji. Takiej zależności nie stwierdzono w komórkach niezróżnicowanych fenotypowo. Wywołany pirytiaminą niedobór tiaminy u zwierząt doświadczalnych powodował spadek aktywności kompleksów dehydrogenazy pirogronianowej i α-ketoglutaranowej w zakończeniach nerwowych, któremu towarzyszył spadek poziomu acetylo-CoA w przedziale mitochondrialnym i cytoplazmatycznym. Zaburzenia te korelowały z zahamowaniem transportu tego metabolitu drogą liazy ATP-cytrynianowej i były bezpośrednią przyczyną upośledzenia syntezy i wydzielania acetylocholiny. Przedstawione dane wskazują, że niedobór tiaminy może być jedynym bądź komplementarnym czynnikiem powodującym rozwój encefalopatii cholinergicznych poprzez mechanizm inhibicji aktywności kluczowych enzymów warunkujących syntezę acetylo-CoA. W następstwie tego dochodzi

do zahamowania cyklu kwasów trójkarboksylowych i obniżenia zasobów energetycznych mózgu, co bezpośrednio wiedzie do rozwoju zmian neurodegeneracyjnych. Grant MNiSW projekt NN401 1029937, praca statutowa ST57, projekt rządowy IP2011 046071. 122. Aktywność oksydazowa ceruloplazminy i stężenie wybranych białek osocza u osób z obturacyjnym bezdechem śródsennym Marcin Nowicki

1, Szczepan Cofta

2, Ewa Wysocka

1, Włodzimierz Pawłowski

3, Alicja Brożek

1, Maria

Iskra4

1 Zakład Biochemii Klinicznej i Medycyny Laboratoryjnej Katedry Chemii i Biochemii Klinicznej,

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Polska, 2 Katedra i Klinika

Pulmonologii, Alergologii i Onkologii Pulmonologicznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Polska,

3 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Mikrobiologicznej, Szpital

Wojewódzki w Poznaniu, Polska, 4 Zakład Chemii Ogólnej Katedry Chemii i Biochemii Klinicznej,

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Polska Zespół obturacyjnego bezdechu śródsennego (obstructive sleep apnea, OSA), rozpoznawany u 2-4% osób dorosłych, charakteryzuje się nawracającymi epizodami obturacji górnych dróg oddechowych podczas snu z towarzyszącym zmniejszeniem utlenowania krwi i następczą sennością dzienną. Nawracająca hipoksemia oraz przebudzenia powodują m.in. zwiększoną aktywność układu współczulnego, dysfunkcję śródbłonka oraz stres oksydacyjny - zjawisko łączące patobiochemię OSA i chorób sercowo-naczyniowych. Szczególne miejsce zajmują białka osocza - kompleksują jony metali i czynią je niedostępnymi do produkcji rodnika hydroksylowego. Ceruloplazmina jest główną oksydazą osocza, wiąże jony miedzi oraz posiada zdolność utleniania m.in. amin biogennych - jej fizjologicznymi substratami w organizmie są kwas askorbinowy, adrenalina i noradrenalina. Celem pracy była analiza aktywności oksydazowej ceruloplazminy oraz stężenia ceruloplazminy, transeferyny i albuminy w surowicy osób z różnym stopniem nasilenia obturacyjnego bezdechu śródsennego. Metody: Osoby z podejrzeniem obturacyjnego bezdechu śródsennego (obstructive sleep apnea, OBS), z wykluczeniem pacjentów ze schorzeniami ostrymi i przewlekłymi, zostały poddane badaniu podmiotowemu i przedmiotowemu, m.in. pomiar wskaźnika masy ciała (BMI) i ciśnienia tętniczego krwi skurczowego (SBP), rozkurczowego (DBP), oraz badaniu polisomnograficznemu (EMBLA S4000 Remlogic, EMBLA Co) i analizom biochemicznym krwi. Do populacji badanej zakwalifikowano 55 osób, 16 kobiet i 39 mężczyzn, w wieku 35-69 lat: mediana 55, zakres międzykwartylowy 51-58 lat. Na podstawie wskaźnika bezdechów/spłyconego oddychania (apnea/hypopnea index, AHI) stworzono cztery grupy badanych osób: grupa N (n=12) z prawidłowym AHI<5, grupa OSA1 (n=15) z AHI 5-15, grupa OBS2 (n=13) z AHI 16-30, grupa OBS3 (n=15) z ODI≥31. Oceniono morfologię krwi obwodowej (Cell-Dyn Ruby, Abbott Laboratories), szybkość opadania krwinek czerwonych, OB (Sarstedt) oraz stężenie glukozy (G) i parametrów profilu lipidowego na czczo (T-C, HDL-C, TG, LDL-C) – metodami enzymatycznymi (odczynniki BioMerieux, Hitachi U-2900). U wszystkich badanych w osoczu pobranym rano, na czczo zmierzono: stężenie albuminy (ALB), ceruloplazminy (CP-c) i transferyny (TRF) - metodą nefelometrii (odczynniki Dade Behring, Behring Nephelometer II) oraz aktywność oksydazową ceruloplazminy (CP-oa) -spektrofotometrycznie metodą Schosinsky’ego (odczynniki Sigma-Aldrich, Hitachi U-2900). Do analizy statystycznej wykorzystano program Statistica 10.0. Wyniki: 1.Badane grupy pacjentów nie różniły się pod względem wieku, BMI, SBP, DBP, liczby leukocytów krwi obwodowej i OB. 2.Nie obserwowano istotnej statystycznie różnicy stężeń ALB, TRF i CP-c pomiędzy badanymi grupami. W grupach OSA1 i OSA2 w porównaniu z grupą N stwierdzono

narastające wartości CP-oa (odpowiednio:123,533,3 i 131,636,9 vs 82,420,6 jednostek Schosinsky’ego; p<0,01). Wnioski: Wyniki badania sugerują mobilizację aktywności ceruloplazminy u osób z łagodną i umiarkowaną postacią obturacyjnego bezdechu śródsennego. Może to świadczyć o próbie metabolicznego wyrównania wzmożonej aktywność układu współczulnego u pacjentów OSA, jedynie w mniej zaawansowanych stadiach 123. Badanie wpływu zmienności wartości stężenia darunawiru w osoczu na efektywność leczenia podczas długotrwałej terapii antyretrowirusowej Beata Gralak-Dąbrowska

1, Tomasz Pawiński

1, Piotr Pulik

2, Andrzej Horban

2

1Zakład Chemii Leków, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Pols,

2Centrum Diagnostyki i

Terapii AIDS, Wojewódzki Szpital Zakażny w Warszawie, Polska Terapeutyczne monitorowanie stężeniem inhibitorów proteazy jest czynnością, która ułatwia dobór schematu optymalnego dawkowania leków antyretrowirusowych w terapii AIDS. Darunavir (DRV) jest inhibitorem proteazy drugiej generacji, cechującym się stosunkowo niewielką ilością działań niepożądanych i wysoką skutecznością. Celem przeprowadzonego badania było opracowanie metody oznaczania i walidacja metody HPLC oznaczania DRV w osoczu krwi pacjentów poddanych monoterapii i następnie określenie przedziału stężenia terapeutycznego, ktore ograniczyłoby do minimum występowanie działań niepożądanych oraz poprawiło skuteczność leczenia antyretrowirusowego. Izolację DRV z osocza przeprowadzono metodą ekstrakcji ciecz-ciecz. Do osocza pobranego od pacjentów oraz osocza standaryzowanego użytego do przygotowania krzywej wzorcowej metodą standardu wewnetrznego dodano eteru metylo-tert-butylowego. Krzywa wzorcowa o liniowości w zakresie 0,1 - 20 µg/ml została przygotowana z zastosowaniem roztworu podstawowego i roztworów roboczych substancji wzorcowej DRV (Cilag AG-QC Chemicals) oraz Midazolamu (Mid) zastosowanego jako standard wewnętrzny. Odzysk DRV z osocza wyniósł 92,4 % ± 4,5 %. Po wytrząśnięciu i odwirowaniu, warstwę organiczną przenoszono do szklanej probówki i odparowano do sucha w temp. 56°C w atmosferze azotu. Do suchej pozostałości dodano fazy ruchomej w obj. 0,2 ml i po rozpuszczeniu nanoszono w obj. 20 µl na kolumnę chromatograficzną Waters Nova Pak C18, przez którą przepływała faza ruchoma z prędkością 1 ml/min. Fazę ruchomą stanowiła mieszanina buforu fosforanowego (pH 5,9) - metanol - acetonitryl (39:22:39; o/o/o). Analiza prowadzona była przy użyciu chromatografu cieczowego Shimadzu pracującego w systemie izokratycznym z detekcją spektrofotometryczną przy długości fali 266 nm. Czas analizy wynosił 5 minut, a czasy retencji dla DRV i Mid odpowiednio 2,1 min i 3,3 min. Granica oznaczalności dla DRV wyniosła 0,05 µg/ml. Powtarzalność wewnątrzseryjna (n=6) dla stężeń 0,25 , 5 i 20 µg/ml wynosiła odpowiednio 4,2 , 4,7 i 0,9 % (Wz) obrazując precyzję oraz -4, -2,4 i -6,3 % obrazując dokladność. Powtarzalność międzyseryjna (n=30) dla tych samych stężeń wynosiła odpowiednio 7,4 , 3,1 i 5,2 % (Wz) oraz 8, 2,4 i 4,2 %. W grupie 300 pacjentów lek podawany był w dawce 800 mg raz na dobę. Średnia wartość stężenia DRV w osoczu pacjentów była równa 2,85 ± 1,94 µg/ml, a stężenia terapeutyczne w przedziale dawkowania 24 godzinnym zawarte było w zakresie 0,1 - 12,1 µg/ml. Cmax wynosiło 4,2 ± 2,43 µg/ml przy Tmax 4 ± 1,2 godz. W przedstawionym powyżej przedziale terapeutycznych stężeń obserwowano korzystny efekt leczniczy w postaci obniżenia poziomu wiremii i ograniczonych do minimum działań niepożądanych (zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego, wysypki skorne). Przedstawiona zwalidowana metoda HPLC spełnia kryteria stawiane metodom analitycznym stosowanym w terapeutycznym monitorowaniu stężeniem leku w płynach ustrojowych. 124. Ocena stężenia glukozy w próbkach krwi pełnej, osoczu i surowicy w czasie 2 pierwszych godzin po pobraniu. Hanna Zborowska

1, Dagna Bobilewicz

1, Sandra Major

1

1 warszawski, WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Polska

Ze względu na kluczowe znaczenie stężenia glukozy wśród kryteriów rozpoznawania cukrzycy, bardzo ściśle określono wymagania analityczne /nieprecyzja ≤ 3,3%, bias ≤ 2,5%, błąd całkowity ≤ 7,9%/. Materiałem zalecanym jest osocze uzyskane z krwi pobranej na fluorek sodowy. Antykoagulant ten wybrano ze względu na hamowanie glikolizy beztlenowej, zachodzącej wewnątrz krwinek także po pobraniu próbki. Wpływ rozpoczyna się jednak dopiero po około 2 godzinach od pobrania. W praktyce stężenie glukozy oznaczane jest nie tylko na potrzeby diagnostyki cukrzycy i często przeprowadzane jest w surowicy /pozostawionej na krwinkach/ lub krwi pełnej. Czas w jakim wykonywane są oznaczenia od momentu pobrania są często różne. Krew pełna jest typowym materiałem, wykorzystywanym w analizatorach parametrów krytycznych. Badanie może być wykonywane w laboratorium ale także bezpośrednio przy pacjencie. Wtedy przesunięcie czasowe pomiędzy pobraniem a wykonaniem oznaczenia praktycznie nie istnieje. Celem pracy była ocena zmian zachodzących w stężeniu glukozy w czasie pierwszych dwóch godzin od momentu pobrania próbek. Materiałem do badań były: - próbki krwi żylnej, pochodzące od pacjentów Izby Przyjęć SP CSK, przysłane do laboratorium celem wykonania rutynowych badań, pobrane na:

heparynę /strzykawki Pico, Radiometr/

cytrynian sodowy /probówki, Medlab/

„skrzep” /probówki Medlab/ - próbki krwi od zdrowych ochotników, u których dodatkowo pobierano próbkę krwi na:

fluorek sodowy /probówki Beckton Dickinson/. We krwi pełnej oznaczenia wykonywano w analizatorze ABL 835 /metoda amperometryczna/, w czasie < 5 minut od pobrania a następnie po 30, 60, 90 i 120 minutach przechowywania w temperaturze pokojowej. Z próbek „na skrzep”, po odwirowaniu część surowicy odlewano a część na nim pozostawiano. W próbkach z antykoagulantami materiałem było osocze pozostawione na krwinkach. Glukozę oznaczano metodą heksokinazową w analizatorze Cobas Integra firmy Roche po 30, 60, 90 i 120 minutach od pobrania. Wyniki:Średnie stężenie glukozy we krwi pełnej heparynizowanej uzyskane w próbkach natychmiast po pobraniu /czas 0/ wynosiło 156 mg/dl i nie różniło się istotnie statystycznie od stężenia glukozy oznaczonego w 30 minucie w próbkach odseparowanej surowicy /śr. = 156 mg/dl/ i surowicy przechowywanej „na skrzepie” /śr. = 157 mg/dl/. Stężenie glukozy zmierzone w 30 minucie we krwi pełnej było nieistotnie niższe i wynosiło 152 mg/dl. W pozostałych próbkach z antykoagulantami średnie stężenie było zbliżone i oscylowało w granicach 152 mg/dl. W próbkach odseparowanej surowicy stężenie glukozy nie zmieniało się w czasie. We wszystkich pozostałych materiałach obserwowano stały spadek stężenia glukozy. Był on najmniejszy w próbkach surowicy przechowywanych „na skrzepie” i wynosił w 120 minucie 4,9 %. Różnica była istotna statystycznie w stosunku do wartości w 30 minucie. Największy ubytek obserwowano w przypadku krwi pełnej heparynizowanej. W 120 minucie wynosił on 11,2 %. W osoczu fluorkowym przechowywanym na krwinkach stężenie spadło w 120 minucie o 8,4 % a w osoczu cytrynianowym o 7,3 %. Wnioski: Jedynie szybkie odseparowanie surowicy od krwinek zapewnia niezmienność stężenia glukozy w czasie 2 pierwszych godzin od pobrania. W próbkach materiału mających kontakt z krwinkami zawsze należy liczyć się z ubytkiem stężenia glukozy, przy czym spadek ten jest najmniejszy w przypadku surowicy. 125. Soluble urokinase plasminogen activator receptor in assesment of risk stratification in patients after first myocardial infarction - pilot study. Rafał Nikodem Wlazeł

1, Iwona Szadkowska

2, Lucjan Pawlicki

3, Marzenna Zielińska

4, Marek

Paradowski1

1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska,

2

Zakład Chorób Wewnętrznych i Rechabilitacji Kardiologicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska, 3 Klinika Chorób Wewnętrznych i Rechabilitacji Kardiologicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polsk,

4 Klinika Intensywnej Terapii Kardiologicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska

Background: The aim of the study was to assess the risk connected with cardiovascular events in patients with first myocardial infarction (MI) treated with PCI procedure. Soluble urokinase plasminogen activator receptor (suPAR) serum level was assessed as a risk biomarker in comparison to inflammatory biomarkers (CRP). Methods: We enrolled 50 patients with first MI, confirmed clinically and in laboratory tests, with negative history of heart failure, and 30 patients of generally healthy population. In all patients following parameters’ serum levels were measured: suPAR (Suparnostic Flexi, ELISA, Virogates); hsCRP (ITA, Beckmann Coulter). In patients with MI PCI procedure was applied as a treatment and the parameters in question were measured before discharge. As cardiovascular events we defined non-fatal MI, stroke, elective coronary revascularization, hospitalization of heart failure and death. Results: The ROC analysis for serum suPAR indicated 85% sensitivity for predicting cardiovascular events in 6 moths time (cutoff 3.36 ng/mL, AUC 0.65, p=0,019) with 85,5% specificity for a cutoff value declared by a producer as a high-risk-assossiated (5,54 ng/mL). suPAR level showed a poor but still statistically relevant correlatation with hsCRP (p<0.005). There was a difference in suPAR levels between patients with MI and control group (4.77 ng/mL and 2.87 ng/mL, p<0.0001). Conclusion: The results indicate that suPAR may be a useful marker in cardiovascular events prediction after first MI. Further studies are needed.

126. Wartość diagnostyczna paneli (multipleks) złożonych z cytokin prozapalnych jako markerów raka jelita grubego. Małgorzata Krzystek-Korpacka

1, Dorota Diakowska

2, Bartosz Kapturkiewicz

3, Iwona Bednarz-Misa

1,

Agnieszka Bronowicka-Szydełko1, Andrzej Gamian

1

1 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,

Polska, 2 Katedra i Klinika Chirurgii Gastroenterologicznej i Ogólnej , Uniwersytet Medyczny im.

Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska, 3 I Oddział Chirurgii Onkologicznej, Dolnośląskie Centrum

Onkologii we Wrocławiu, Polska Rak jelita grubego (RJG) jest jednym z najczęściej występujących nowotworów, lecz choć wczesna diagnoza decyduje o dobrym rokowaniu, w około 70% przypadków rozpoznawany jest w III lub IV stadium zaawansowania. Poszukiwane są skuteczne i małoinwazyjne metody wczesnej diagnostyki, ponieważ obecnie wykorzystywane są kosztowne, inwazyjne i niosą ze sobą ryzyko powikłań (kolonoskopia) lub dają wysokie odsetki wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych (test na krew utajoną w kale). Antygen karcynoembrionalny (CEA) jest jedynym serologicznym markerem RJG szeroko stosowanym w praktyce klinicznej, jednak nieprzydatnym do celów przesiewowych. Biorąc pod uwagę ścisły związek między stanem zapalnym a nowotworzeniem, przebadaliśmy, z użyciem systemu do multipleksowej analizy cząsteczek w technologii zawiesiny macierzy (Luminex), stężenie 11 prozapalnych cytokin i czynników wzrostowych u pacjentów z RJG (n=78) i zdrowych kontroli (honorowi krwiodawcy oraz osoby z polipami jelita grubego; n=36), porównując je ze stężeniem CEA (oznaczonego techniką ELISA), wykorzystując analizę dyskryminacyjną jako narzędzie selekcji potencjalnych markerów. Panel oznaczanych cytokin obejmował: IL-1β, IL-6, IL-8, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, MIP-1α, TNF-α, VEGF-A i PDGF-BB. Stężenie wszystkich badanych analitów było znamiennie wyższe w RJG niż w grupie kontrolnej, przy czym CEA, VEGF-A i PDGF-BB rosły stopniowo wraz ze zwiększającym się stopniem zaawansowania nowotworu, podczas gdy stężenie pozostałych cytokin zmieniało się skokowo z przyrostami w I lub II stadium zaawansowania oraz ponownie między III i IV stadium. Analiza dyskryminacyjna wykazała, że stężenia MIP-1α, IL-6, G-CSF, TNF-α i PDGF-BB najbardziej różnicują obie badane grupy. Panel złożony z tych cytokin charakteryzowała 94% dokładność i 72% specyficzność przy 95% czułości w różnicowaniu RJG od kontroli gdy analizowano wszystkie przypadki RJG oraz 90% dokładność i 58% specyficzność przy 95% czułości, gdy analizę ograniczono do nowotworów w stadium I i II zaawansowania. Dla porównania, IL-6, najlepsza indywidualna cytokina, miała 91% dokładność i 61% specyficzność w całej grupie a G-CSF, najlepsza cytokina przy ocenie wczesnych nowotworów, odpowiednio 89% dokładność i 36% specyficzność. Panel złożony z cytokin, których stężenie było znamiennie wyższe już we wczesnych stadiach raka, IL-6, G-CSF, TNF-α, MCP-1, GM-CSF, FGF-2 i VEGF-A, charakteryzowała 89% dokładność i 72% specificzność przy 95% czułości w różnicowaniu od kontroli lokalnie niezaawansowanych guzów (T1/T2). Z kolei CEA, VEGF-A, PDGF-BB i IL-1β różniły się znamiennie między nowotworami rozsianymi i nierozsianymi, ale panel złożony z tych analitów cechowała umiarkowana dokładność (75%) i słaba specyficzność (26%) przy 95% czułości. Uzyskane wyniki wskazują na potencjał cytokin prozapalnych i czynników wzrostowych jako potencjalnych narzędzi we wczesnej diagnostyce RJG oraz na możliwość poprawy wartości diagnostycznej, szczególnie specyficzności, dzięki multipleksowaniu wielu, starannie dobranych, analitów. 127. Porównanie relacji między homocysteiną, paraoksonazą (PON)-1 a malonodialdehydem – MDA-markerem peroksydacji lipidów – w otępieniu naczyniopochodnym i alzheimerowskim. Małgorzata Krzystek-Korpacka

1, Iwona Bednarz-Misa

1, Izabela Berdowska

1, Bogdan Zieliński

1, Sylwia

Płaczkowska2, Marzena Zboch

3, Andrzej Gamian

1

1 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,

Polska, 2 Zakład Praktycznej Nauki Zawodu Analityka, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we

Wrocławiu, Polska, 3 Ośrodek Badawczo-Naukowo-Dydaktyczny Chorób Otępiennych, SP ZOZ w

Ścinawie, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska Hiperhomocysteinemia jest wspólnym czynnikiem ryzyka rozwoju otępienia naczyniopochodnego i alzheimerowskiego. Jej cytotoksyczność wynika m.in. ze zdolności do indukcji peroksydacji lipidów oraz N-homocysteinylacji białek przez tiolakton homocysteiny. Paraoksonaza (PON)-1 jest enzymem antyoksydacyjnym chroniącym przed peroksydacją lipidów który, dzięki zdolności do hydrolizy tiolaktonu homocysteiny do homocysteiny, zapobiega również N-homocysteinylacji białek. W modelach eksperymentalnych stres oksydacyjny poprzedza pojawienie się zmian patologicznych

charakterystycznych dla choroby Alzheimera i wraz z procesami zapalnymi leży u podstaw uszkodzenia bariery naczyniowo-mózgowej. Celem niniejszej pracy była ocena stężenia/aktywności oraz wzajemnych relacji homocysteiny, PON1 i malonodialdehydu jako markera peroksydacji lipidów w surowicy pacjentów z różnymi formami otępienia. Badaniem objęto 199 osób: 63 z chorobą Alzheimera (AD), 40 z demencją naczyniopochodną (VaD), 33 z demencją mieszaną (MD) oraz 63 kontrole (pacjenci z bólami głowy lub łagodnymi zaburzeniami funkcji poznawczych). W surowicy krwi oznaczono stężenie malonodialdehydu (MDA/TBARS) metodą spektrofotometryczną z kwasem tiobarbiturowym w obecności BHT oraz stężenie homocysteiny przy zastosowaniu wzmacnianej cząsteczkowo immunonefelometrii. Zmierzono również aktywność PON1 wobec dwóch substratów: octanu fenylu (aktywność arylesterazowa, niewrażliwa na polimorfizm Q192R) i paraoksonu (aktywność paraoksonazowa, wrażliwa) i wyodrębniono trzy fenotypy enzymu: PON1-AA (homozygoty z glutaminą w pozycji 192), AB (heterozygoty) i BB (homozygoty z argininą 192). Wyniki odniesiono do stopnia zaburzeń funkcji poznawczych ocenianych według Krótkiej Skali Oceny Aktywności Poznawczej (MMSE) oraz wskaźnika niedokrwiennego Hachinskiego (HIS). Porównanie poszczególnych grup wykazało znamienne różnice w stężeniu MDA/TBARS: 1.01, 1.07, 1.19 i 1.20 nmol/mL odpowiednio w grupie kontrolnej, AD, MD i VaD (1-way ANOVA: p=0.001) i homocysteiny 12.7, 14.6, 13.9 i 14.8 µmol/L (AD vs. kontrole, p=0.026 i VaD vs. kontrole, p=0.048). Na aktywność arylesterazową nie wpływał ani fenotyp enzymu ani przynależność do grupy, podczas gdy aktywność paraoksonazowa PON1 różniła się znamiennie zarówno między fenotypami jak i badanymi grupami (2-way ANOVA: p<0.001 dla fenotypu i p=0.017 dla grupy). Pacjenci z AD mieli znamiennie niższe aktywności PON1-AB niż kontrole (150.7 vs. 182 nmol/ml/min, p=0.043). MDA/TBARS korelowały dodatnio ze stopniem otępienia-MMSE, ale wyłącznie w grupie VaD (ρ=0.43, p=0.006). Aktywność arylesterazowa PON1 korelowała ujemnie z HIS w grupie VaD (ρ=-0.46, p=0.003) i wykazywała podobną tendencję w MD (ρ=-0.34, p=0.061). Natomiast homocysteina wykazywała dodatnią korelację z HIS wyłącznie u pacjentów z AD (ρ=0.43, p=0.002) a z MMSE u pacjentów z MD (ρ=0.35, p=0.047). PON1 korelowała dodatnio z homocysteiną w MD (ρ=0.66, p<0.001) a ujemnie z MDA/TBARS w grupie kontrolnej (r=0.28, p=0.03). Nie zaobserwowano zależności między homocysteiną a MDA/TBARS w żadnej z badanych grup. Reasumując, uzyskane wyniki wskazują na odmienne zachowanie badanych parametrów w zależności od rodzaju otępienia: nasilenie peroksydacji lipidów w otępieniu z komponentą naczyniową, spadek aktywności PON1 w chorobie Alzheimera, a wzrost stężenia homocysteiny zarówno w otępieniu alzheimerowskim, jak i naczyniopochodnym. 128. Potencjał diagnostyczny midkiny, wielofunkcyjnej cytokiny, w diagnostyce raka jelita grubego. Małgorzata Krzystek-Korpacka

1, Iwona Bednarz-Misa

1, Dorota Diakowska

2, Robert Olewiński

3,

Katarzyna Neubauer4, Andrzej Gamian

1

1 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,

Polska, 2 Katedra i Klinika Chirurgii Przewodu Pokarmowego i Chirurgii Ogólnej , Uniwersytet

Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska, 3 I Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej,

Gastroenterologicznej i Endokrynologicznej , Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska,

4 Katedra i Klinika Gastroenterologii i Hepatologii , Uniwersytet Medyczny im.

Piastów Śląskich we Wrocławiu, Polska Midkina jest wielofunkcyjną cytokiną ekspresjonowaną głównie w okresie płodowym. Jej eskpresja w dorosłym organizmie pozostaje na niskim poziomie i jest ograniczona do zaledwie kilku narządów, m.in. jelit. Jednakże, ekspresja midkiny ulega wznowieniu w procesie transformacji nowotworowej. Midkina może uczestniczyć w wielu etapach nowotworzenia, od inicjacji, poprzez progresję do przerzutowania. Dotychczasowe badania nad midkiną w chorobie nowotworowej wskazują na jej związki z rozwojem wielu typów nowotworów, m.in. raka jelita grubego (RJG). Jednakże, mimo wielu publikacji dokumentujących potencjał midkiny jako biomarkera nowotworowego, brak jest danych dotyczących możliwości wykorzystania oznaczeń midkiny w diagnostyce RJG. W niniejszej pracy oznaczono metodami immunoenzymatycznymi stężenie midkiny w surowicy 105 pacjentów z RJG i porównano ze stężeniem cytokiny u 86 osób z grupy zwiększonego ryzyka rozwoju RJG, tj. pacjentów z polipami i nieswoistymi zapaleniami jelit, oraz u 70 osób zdrowych (honorowi krwiodawcy i zdrowi ochotnicy). Wartość diagnostyczną midkiny porównano z antygenem karcynoembrionalnym (CEA), jedynym biochemicznym markerem wykorzystywanym w diagnostyce RJG. Stężenie midkiny u pacjentów z RJG wynosiło 807 ng/L i było znamiennie wyższe niż u pacjentów z nieswoistymi

zapaleniami jelit, zarówno w remisji (335 ng/L), jak i zaostrzeniu (633 ng/L) choroby, pacjentów z polipami (418 ng/L) czy u osób zdrowych (245 ng/L). Zaobserwowaliśmy wyższe niż u kontroli stężenia midkiny u pacjentów z RJG już w pierwszym stadium zaawansowania raka oraz dalszy wzrost jej stężenia w kolejnych stadiach choroby. Stężenie cytokiny korespondowało ze złośliwością guza, będąc znamiennie wyższym u pacjentów z nowotworami o niskim (G3) stopniu zróżnicowania histopatologicznego niż u tych, których guzy zawierały mniejszy odsetek komórek odróżnicowanych (G1 i G2). Stężenie midkiny u pacjentów z RJG pozytywnie korelowało z wykładnikami stanu zapalnego oraz mediatorami hematopoezy i angiogenezy: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, MIP-1α, G-CSF, GM-CSF, VEGF-A i PDGF-BB. Wyniki regresji wieloczynnikowej wskazują na IL-1β i PDGF-BB jako czynniki warunkujące zmiany stężenia midkiny w surowicy pacjentów z RJG (R

2=0.4). Midkina

jako wskaźnik obecności RJG okazała się lepszym markerem niż CEA, różnicując pacjentów z RJG od osób zdrowych z 80% dokładnością, 83% czułością i 68% specyficznością wobec 60% dokładności, 37% czułości i 88% specyficzności CEA. Podobnie, midkina lepiej różnicowała pacjentów z RJG i nieswoistymi zapaleniami jelit wykazując 77% dokładność, 81% czułość i 68% specyficzność wobec 70% dokładności, 45% czułości przy 100% specyficzności CEA. Uzyskane przez nas wyniki wskazują na możliwość wykorzystania oznaczeń midkiny w diagnostyce RJG. 129. Analiza porównawcza wartości referencyjnych wykorzystywanych w polskich medycznych laboratoriach diagnostycznych dla wybranych parametrów biochemicznych Barbara Przybył-Hac

1, Andrzej Brzeziński

1, Marek Paradowski

2

1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Laboratoryjnej, Polska,

2 Zakład Diagnostyki

Laboratoryjnej i Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska Wstęp. Wieloletnie własne obserwacje wskazywały, że w polskich medycznych laboratoriach diagnostycznych (MLD) występuje duże zróżnicowanie stosowanych wartości referencyjnych (RV) dla ilościowo oznaczanych parametrów laboratoryjnych. Zróżnicowanie to może w sposób istotny utrudniać interpretację wyniku badania, a tym samym ograniczać użyteczność kliniczną samego badania laboratoryjnego, nawet mimo prawidłowo przeprowadzonych w laboratorium procedur analitycznych. Z jednej strony podważa to zaufanie do laboratorium, a z drugiej badanie laboratoryjne staje się mniej wiarygodne diagnostycznie. Cel pracy. Celem pracy było dokonanie szczegółowej analizy porównawczej wartości referencyjnych (RV) stosowanych przez polskie MLD dla stężeń w surowicy lub osoczu osób dorosłych wybranych biochemicznych parametrów laboratoryjnych (potasu, wapnia, kreatyniny i glukozy) w zestawieniu z RV podawanymi przez firmy diagnostyczne - producentów materiałów do diagnostyki in vitro (FDiagn). Materiały. Źródłem danych były informacje z Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Laboratoryjnej uzyskane z MLD uczestniczących w programach sprawdzianów międzylaboratoryjnych. Podjęto analizę RV dla 4 podstawowych parametrów biochemicznych oznaczanych u osób dorosłych w surowicy: dla potasu, wapnia i kreatyniny oraz w osoczu dla glukozy na czczo, biorąc za podstawę dane otrzymane z blisko 1500 laboratoriów. Analiza porównawcza obejmowała 2 elementy: RV stosowane przez laboratoria i RV zebrane od FDiagn. Wyniki. Badania potwierdziły duże zróżnicowanie wykorzystywanych RV przez MLD oraz stosowanie w laboratoriach różnych jednostek pomiarowych stężeń (SI - tylko 15% laboratoriów i wagowo-objętościowych 85% placówek). Wyniki szczegółowe: 1). Potas (1092 laboratoria): dolna granica RV (dgRV) waha się od 3,1 do 4,1 mmol/l, górna granica RV (ggRV) od 4,7 do 5,8 mmol/l. Przedziały RV w granicach 3,5-5,5 mmol/l podaje 74,5% MLD oraz 11 FDiagn. 2). Wapń (n=1057): dgRV od 2,0 do 2,28 mmol/l (8,0-9,1 mg/dl), ggRV od 2,48 do 2,75 mmol/l (9,9-11,0 mg/dl). 78,5% MLD stosuje różne RV w przedziale 2,025-2,65 mmol/l (8,1-10,6 mg/dl). 3). Kreatynina (RV dla mężczyzn i kobiet odpowiednio z 1373 i 1386 laboratoriów). RV u mężczyzn zawarte są w przedziale 0,60-1,40 mg/dl (77,8% laboratoriów), u kobiet w przedziale 0,40-1,30 mg/dl (71,8% laboratoriów). 4). Glukoza (n=1418): dgRV wahają się od 3,0 do 4,22 mmol/l (55-76 mg/dl), ggRV od 5,5 do 6,6 mmol/l (99-118 mg/dl). 82,2% MLD stosuje 12 przedziałów RV, zawartych w granicach 3,3-6,4 mmol/l (60-116 mg/dl). Tylko 20,5% MLD wykorzystuje RV zgodnie z aktualnymi zaleceniami Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego z 2012r (prawidłowa glikemia na czczo w próbce krwi żylnej pobranej 8-14 godzin od ostatniego posiłku oznaczona w osoczu krwi żylnej wynosi 3,3-5,5 mmol/l (60-99 mg/dl). Wnioski. Wykazane duże zróżnicowanie RV utrudnia interpretację wyniku badania laboratoryjnego przez lekarza, wykorzystującego badania z różnych MLD, szczególnie w sytuacji stosowania przez laboratoria wartości stężeń wyrażanych w różnych jednostkach pomiarowych. Rozwiązaniem analizowanego problemu może być ogólnokrajowy system, który pozwoli na opracowanie i

wprowadzenie do stosowania ujednoliconych wartości referencyjnych we wszystkich MLD w Polsce. Niezależnie od potrzeby stworzenia takiego systemu istnieje pilna potrzeba ściślejszej współpracy na linii zakład opieki zdrowotnej - laboratorium i lekarz - diagnosta laboratoryjny. 130. Evaluation of the clinical utility of soluble urokinase plasminogen activator receptor in intensive care unit patients with complications after acute coronary syndrome. Rafał Nikodem Wlazeł

1, Monika Terlecka

2, Waldemar Machała

3, Anna Urbaniak

2, Beata Mamełka

2,

Marek Paradowski1

1 Zkaład Diagnostyki Laboratoryjnej i Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska,

2

Zakład Diagnostyki Lboratoryjnej i Biochemii Klinicznej, Uniwersytecki Szpital Kliniczny im.WAM-CSW, Polska,

3 Klinika Anestezjologii i Intensywnej Terapii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska

Background:The aim of this study was to evaluate the clinical usefulness of soluble urokinase plasminogen receptor (suPAR) in monitoring the disease course and prognosis of patients treated in the Intensive Care Unit (ICU) due to complications after acute coronary syndrome (ACS) treatment. Material and methods The study involved 6 patients previously hospitalized in Clinical Military Hospital – Medical University of Lodz. Patients state was severe, treated in the ICU, transferred from Cardiology Unit of the hospital because of complications associated with ACS. 3 of those patients died. In case of patients in the course of intensive treatment (4 - 8 time points, depending on the clinical case) plasma levels of suPAR (ELISA, suPARnostic, Virogates) was determined. The dynamics of concentrations of suPAR, C-reactive protein (CRP), procalcitonin (PCT), the number of white blood cells (WBC) and the scale of Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II (APACHE II) were compared.Results: In patients who died, suPAR concentrations were higher comparing to patients who survived. Maximum concentrations of suPAR were within a range: 8.21 - 14.49µg/L and 7.10 - 29.34µg/L respectively. Maximum concentrations of suPAR were found in the last 2-3 days before death. Dynamics of suPAR was characterized by increased concentrations in the event of deterioration and death of the patient and decreased concentrations for effective therapy. That dependency was not visible for other tested parameters.Conclusions: Preliminary results indicate that the evaluation of plasma levels seems to be a useful prognostic parameter of clinical course of disease in patients with complications after ACS. Research needs to deepen, especially to answer the question whether the value of suPAR levels after ACS episode can be a prognostic biomarker for adverse cardiac events.

131. Ocena polimorfizmów w pozycjach c1236t, g2677/a, c3435t genu ABCB1 w przypadkach raków żołądka. Marta Żebrowska

1, Aleksandra Sałagacka

1, Agnieszka Jeleń

1, Marek Mirowski

2, Ewa Balcerczak

1

1Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska,

2Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska

Wstęp: Glikoproteina P, kodowana przez gen ABCB1 jest ATP-zależną pompą błonową, która trasportuje substraty z komórek do środowiska pozakomórkowego. Do tej pory zidentyfikowano ponad 50 polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP ang. single nucleotide polymorphism) badanego w pracy genu. Najczęstszym polimorfizmem tego genu jest SNP w pozycji 2677 prowadzący do zamiany allelu G (typ dziki) na allel T lub A, co wiąże się z substytucją alaniny (Ala) na serynę (Ser) bądź treoninę (Thr). Drugim najczęstszym polimorfizmem genu ABCB1 jest SNP w pozycji 3435, w wyniku którego dochodzi do zamiany allelu C (typ dziki) na allel T. Kolejnym SNP jest polimorfizm w pozycji 1236, który prowadzi do zamiany allelu C (typ dziki) na allel T. Badane w pracy polimorfizmy bardzo często występują w sprzężeniu ze sobą. Udowodnino związek badanych SNPs ze zmianą poziomu/funkcji glikoproteiny P, co może mieć wpływ na ryzyko rozwoju chorób. Cel: Celem pracy jest genotypowanie w pozycjach 1236, 2677, 3435 w rakach żoładka w polskiej populacji oraz porównanie rozkładu częstości uzyskanych genotypów z grupą kontrolną. Materiał: Materiał do badania stanowiły mrożone skrawki tkankowe żołądka pobarane śródoperacyjnie z rakiem żołądka (grupa badana) oraz próbek krwi obwodowej pochodzące od krwiodawców (grupa kontrolna) Metody: Do genotypowania w pozycji 3435 wykorzystano technikę PCR-RFLP. Natomisat do analizy SNPs w pozycjach 1236 i 2677 wykorzystano technikę sekwencjonowania automatycznego metodą

Sangera. Ze względu na liczebność grupy badanej w analizie statystycznej wykorzystano test Chi^2 NW (Najwyższej Wiarygodności). Za istotne statystycznie przyjmowano wyniki gdzie p<0,05. Wyniki: We wstępnych badaniach nie zaobserwowano istotnej statystycznie różnicy w częstości występowania poszczególnych genotypów dla SNP 3435 między grupą badaną a grupą kontrolną (p=0,1723). Natomiast homozygota zmutowana TT dla SNP 3435 wykazuję tendencję do częstszego występowania w połączonej (na potrzeby statystyczne) grupie pacjentów z rakiem in situ lub rakiem w I stadium zaawansowania (p=0,0761) Wnioski: Nie wykaznao związku pomiędzy polimorfizmem 3435 genu ABCB1 a predyspozycją do rozwoju raka żołądka. 132. Ocena polimorfizmów w pozycjach 1236c>t, 2677g>t/a i 3435c>t genu abcb1 u osób chorych na depresję Agnieszka Jeleń

1, Marta Żebrowska

1, Aleksandra Sałagacka

1, Marek Mirowski

2, Ewa Balcerczak

1

1Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polsk,

2Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska

Wstęp: Gen ABCB1 (ang. ATP-binding cassette subfamily B transporter 1), nazywany również MDR1, koduję glikoproteinę P, której kluczową rolą jest usuwanie ksenobiotyków z komórki do środowiska pozakomórkowego. Może być więc odpowiedzialna zarówno za podatność na rozwój niektórych chorób jak i za efekt leczenia preparatami stanowiącymi substrat dla tego transportera. Glikoproteina P fizjologicznie występuję m. in. w obrębie bariery krew-mózg, co oznacza, że białko to reguluje dystrybucję leków, których miejscem działania jest ośrodkowy układ nerwowy. Wiele preparatów stosowanych w terapii depresji stanowi substrat dla glikoproteiny P. Istnieje kilka polimorfizmów SNPs (ang. single nucleotide polymorphisms) badanego genu. Do polimorfizmów, które mają wpływ na zmianę ekspresji genu i funkcji glikoproteiny należą badane w pracy SNPs w pozycjach 1236, 2677 i 3435. Mogą one wiązać się z predyspozycją do rozwoju różnych chorób, w tym depresji, ze względu na nagromadzenie ksenobiotyków, a także wpływać na przebieg leczenia oraz jego skuteczność poprzez rozwój zjawiska oporności wielolekowej. Problem depresji dotyka coraz większej liczby osób, a według danych WHO, ta jednostka chorobowa w najbliższych latach może stać się drugim problemem zdrowotnym w rankingu światowym. W związku z tym poznanie mechanizmów prowadzących do jej rozwoju oraz wpływających na efektywność terapii jest niezwykle istotne. Cel pracy: Poszukiwanie różnic pomiędzy częstością występowania poszczególnych alleli oraz genotypów w badanych miejscach polimorficznych genu ABCB1 u pacjentów z depresją, w porównaniu z grupą kontrolną. Materiał i metody: Materiał do badań stanowiło DNA wyizolowane z krwi pobranej od pacjentów z depresją. Badane fragmenty genu ABCB1 namnażano z użyciem trzech różnych par starterów w reakcji PCR. Produkty tej reakcji oceniano metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Dla polimorfizmu w pozycji 3435, fragment DNA powielony metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej, poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym (PCR-RFLP). Dla polimorfizmów w pozycjach 1236 i 2677 wykonano automatyczne sekwencjonowanie. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej. Wyniki: W przypadku polimorfizmu w pozycji 3435 zarówno homozygota zmutowana TT jak i zmutowany allel T występowały częściej w grupie osób z depresją (odpowiednio 36,3% i 59,9%) niż wśród osó zdrowych (odpowiednio 21,9% i 46,9%). Dla polimorfizmu w pozycji 2677 częstość poszczególych genotypów i alleli była zbliżona w porównywanych grupach . Wnioski: Wstępne badania wykazują istnienie zależności pomiędzy obecnością polimorfizmu w pozycji 3435 genu ABCB1 a występowaniem depresji . 133. Alternatywna metoda oznaczania albuminurii: materiał do badań druga ranna porcja moczu w miejsce dobowej zbiórki. Iga Barska

1, Melania Mikołajczyk

2, Marek Paradowski

1

1Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska,

2Klinika Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Farmakologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi,

Polska

Wydalanie albumin z moczem jest uznanym czynnikiem ryzyka wystąpienia niewydolności nerek oraz incydentów sercowo-naczyniowych. Oznaczanie wydalania albumin wykonuje się powszechnie z dobowej zbiórki moczu i stanowi to „złoty standard” w szacowaniu albuminurii. 24-godzinna zbiórka moczu jest kłopotliwą procedurą, generującą a priori wiele błędów. Stąd poszukuje się innych metod eliminujących błędy przedanalityczne. W piśmiennictwie naukowym ukazało się kilka prac, w których wykazano, że stężenie albumin w pojedynczej pierwszej rannej porcji moczu dobrze koreluje z albuminurią szacowaną ze zbiórki dobowej. W pracach tych jednak nie udokumentowano w sposób właściwy, szczegółowych warunków uzyskiwania pierwszej rannej porcji moczu (np.: czas zalegania moczu w pęcherzu). Biorąc powyższe spostrzeżenia za podstawę, postawiono za cel pracy badanie porównawcze albuminurii i ilorazu stężeń albumina/kreatynina w moczu (UACR, ang. Urine Albumin-to-Creatinine Ratio), wyznaczonych z dobowej zbiórki i z drugiej rannej porcji moczu, próbek zebranych w ściśle określonych warunkach. Wykonanie badań porównawczych w dobrze kontrolowanych warunkach szpitalnych pozwoli na określenie przydatności klinicznej określania albuminurii z użyciem, alternatywnej wobec dobowej zbiórki, metody wyliczania UCAR z drugiej rannej porcji moczu. Do badań włączono grupę 32 pacjentów w wieku od 19 do 85 lat, hospitalizowanych w Klinice Nefrologii, Nadciśnienia Tętniczego i Medycyny Rodzinnej Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego im. Wojskowej Akademii Medycznej – Centralny Szpital Weteranów w Łodzi. Od pacjentów pobrano dobową zbiórkę oraz tego samego dnia drugą ranną próbkę moczu. W celu zebrania drugiej rannej próbki moczu pacjent gromadził mocz w pęcherzu przez około 2-3 godziny między godziną 7:00 a 9:00-10:00. W pobranych próbkach moczu oznaczano stężenie albuminy i kreatyniny oraz wyliczano UACR. Uzyskano bardzo dobrą korelację UACR wyznaczonymi z dobowej zbiórki moczu i z drugiej rannej porcji w szerokim zakresie wartości stężeń albumin w moczu (r = 0,9825). Najlepszą korelację między tymi samymi cechami stwierdzono w moczu pacjentów z normoalbuminurią, gdy UACR nie przekraczał 30 mg/g kreatyniny (r = 0,9771). W moczu z mikro- i makroalbuminurią korelacja była również wysoka i wynosiła odpowiednio: 0,9249 i 0,9332. Wyniki badań wykazały, iż druga ranna próbka moczu z wyznaczeniem wskaźnika UACR jest dobrą alternatywą dla wyznaczania albuminurii z próbek moczu uzyskanych z dobowej zbiórki. Pozwoli to na uniknięcie błędów przedlaboratoryjnych związanych z gromadzeniem porcji dobowej. 136. Wybitnie nasilona chemiluminescencja granulocytów obojętnochłonnych u pacjenta z podejrzeniem autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt. Analiza przypadku. Olga Ciepiela

1, Iwona Kotuła

1, Urszula Demkow

1.

1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski

Unwersytet Medyczny, Polska Wstęp. Autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt (AIN) jest coraz częściej rozpoznawaną jednostką chorobową u dzieci, przebiegającą z łagodnymi stanami zapalnymi, najczęściej dotyczącymi tkanki przyzębia, oraz ropniami skórnymi. Sugeruje się, że rozwój AIN może być zależny od przebytych infekcji wirusowych. Niewielka symptomatologia schorzenia powoduje, że obniżenie liczby granulocytów obojętochłonnych we krwi obwodowej wykrywane jest przypadkowo, podczas wykonywania rutynowych badań morfologii krwi obwodowej. AIN może przebiegać bezobjawowo, ustępuje najczęściej samoistnie po 36 miesiącu życia. U większości chorych neutrofilia krwi obwodowej wraca do wartości referencyjnych do 6 roku życia. Materiał i metody. U dwuletniej dziewczynki ze stanem zapalnym tkanki przyzębia, bez nawracających infekcji, przechodzącej szczepienia obowiązkowe i zalecane bez nasilonych skutków ubocznych, wykonano badanie morfologii krwi obwodowej i oceniono manualny rozmaz krwi. W morfologii zaobserwowano neutropenię poniżej 0,5 G/L oraz nieznaczną monocytozę. Rozkład leukocytów potwierdzono w rozmazie ręcznym, gdzie zaobserwowano 9% granulocytów z jądrem podzielonym, 2% neutrofili z jądrem pałeczkowym, 15% monocytów i 68% imfocytów. Pacjent został skierowany na konsultację immunologiczną, przed którą powtórzono badanie morfologii krwi i wykonano test chemiluminescencji granulocytów we krwi pobranej do probówki zawierającej heparynę. Wyniki. W morfologii krwi obwodowej potwierdzono neutropenię (0,4 G/L). Oceniając funkcję granulocytów metodą chemiluminescencji uzyskano następujące wyniki: w układzie fMLP/luminol - 41 fMLP/kom, co stanowi ponad dwukrotne przekroczenie wartości referencyjnych, w układzie zymosan/luminol - 256 zymosan/kom, co stanowi ponad jedenastokrotne przekroczenie wartości referencyjnych, w układzie PMA/luminol - 780,8 PMA/kom, co stanowi ponad trzydziestopięciokrotne przekroczenie wartości referencyjnych.

Wnioski. Po konsultacji immunologicznej postawiono rozpoznanie prawdopodobnej autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt. Rozpoznanie oparto jedynie na wywiadzie i dwukrotnych wynikach badania morfologii krwi obwodowej, ponieważ badania obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych nie było dostępne. Pomimo znacznej neutropeni, u dziecka nie obserwowano zwiększonej podatności na infekcje. Za skąpoobjawowy AIN może odpowiadać wybitnie podwyższona zdolność granulocytów do wybuchu tlenowego wywoływanego drogą receptorową i pozareceptorową. 137. Nadzór nad etapem przedanalitycznym – stabilność parametrów biochemicznych, badania własne. Krzysztof Łangowski

1, Joanna Naumowicz

1, Paweł Pisarek

1, Cecylia Nowicka

1

1Medyczne Laboratorium Diagnostyczne Gdynia, Laboratoria Medyczne Bruss grupa ALAB sp. z o.o.,

Polska Cel: Ocena stabilności parametrów biochemicznych we krwi w warunkach rutynowej pracy laboratorium Metody: Krew od 19 ochotników kobiet i mężczyzn pobierano do sześciu probówek systemem próżniowym (Greiner Bio-One) i przechowywano w temperaturze pokojowej. Surowicę do wykonania badań oddzielano przez odwirowanie w 1, 3, 5, 8, 12 i 24 godzinie od czasu pobrania i niezwłocznie poddawano badaniu. Badano następujące parametry biochemiczne: Na, K, Cl, Ca, Fosforany, Mg, Fe, Mocznik, Kreatynina, Kwas Moczowy, Bilirubina Całkowita, Cholesterol, HDL, LDL, Triglicerydy, Białko, Albumina, AST, ALT, Amylaza, GGT, CK, LDH, Lipaza, IGA, IGG, IGM, CRP, ASO, Transferyna i RF. Badania wykonano zestawami firmy Roche na analizatorze Modular P 800. Temperaturę pomieszczenia monitorowano termometrem sprawdzonym w odniesieniu do wzorcowanego termohigrometru. Wartością odniesienia dla każdego parametru były wyniki uzyskiwane w próbce odwirowanej i poddanej badaniu w 1 godzinie od czasu pobrania. Wyniki: W ocenie wyników badań wzięto pod uwagę uzyskiwane w laboratorium wartości niepewności (k=2 przy p=95%), która mieściła się w zakresie od 2 do 9% w zależności od ocenianego parametru. Wyznaczono różnicę bezwzględną i względną dla każdego z w/w parametrów wobec wartości odniesienia oraz średnie arytmetyczne różnic. Uzyskane wyniki wykazały różnice statystycznie istotne P < 0.05 dla następujących parametrów: Potas, w 8h różnica -7,3%; Fosforany, w 12h różnica 12,6%; Magnez, w 24h różnica 8,3% i Kreatynina, w 24h 11,3%. Tak więc zgodnie z protokołem badania stwierdzono najkrótszy czas stabilności w godzinach: 5, 8, 12 i 12 odpowiednio dla potasu, fosforanów, magnezu i kreatyniny. Dla pozostałych parametrów nie wykazano wystąpienia różnic statystycznie istotnych w czasie 24h od momentu pobrania, co wskazuje na co najmniej 24 godzinną stabilność tych parametrów. Wnioski: Stosowanie do pobierania krwi zestawów próżniowych i nadzór nad temperaturą transportu i przechowywania (temperatura pokojowa) skutkuje efektem zapewnienia stabilności większości parametrów biochemicznych, w czasie wystarczającym na transport próbek do laboratorium z zewnętrznych punktów pobrań. Uzyskany najkrótszy czas stabilności wynoszący 5 godzin jest bezpiecznym okresem czasu, w którym można dostarczyć próbki do laboratorium bez obawy o ich jakość. Wśród 33 badanych parametrów tylko 4 wykazały się mniejszym czasem stabilności, niż założony w protokole badania maksymalny 24 godzinny czas od pobrania próbki, bez oddzielenia surowicy od skrzepu. Dla niektórych parametrów czas stabilności był dłuższy niż podawany w piśmiennictwie (np. potas, fosforany, żelazo), dla niektórych krótszy (np. magnez, kreatynina). 138. Nadzór nad etapem przedanalitycznym – stabilność parametrów immunochemicznych, badania własne. Krzysztof Łangowski

1, Joanna Naumowicz

1, Paweł Pisarek

1, Cecylia Nowicka

1

1Medyczne Laboratorium Diagnostyczne Gdynia, Laboratoria Medyczne Bruss grupa ALAB sp. z o.o.,

Ocena stabilności parametrów immunochemicznych we krwi w warunkach rutynowej pracy laboratorium Metody: Krew od 19 ochotników, kobiet i mężczyzn pobierano do sześciu probówek systemem próżniowym (Greiner Bio-One) i przechowywano w temperaturze pokojowej. Surowicę do wykonania badań oddzielano przez odwirowanie w 1, 3, 5, 8, 12 i 24 godzinie od czasu pobrania i niezwłocznie

poddano badaniu. Badano następujące parametry immunochemiczne: DHEA-S, PSA, PSA wolny, AFP, LH, FSH, Estradiol, Prolaktyna, Progesteron, Testosteron kobiety, Testosteron mężczyźni, CA125, CEA, B12, IGE, Insulina, T3, FT3, T4, FT4, TSH, Kortyzol i Ferrytyna. Badania wykonano metodą ECLIA przy użyciu odczynników firmy Roche, na analizatorze Modular E170. Temperaturę pomieszczenia monitorowano termometrem sprawdzonym w odniesieniu do wzorcowanego termo- higrometru. Wartością odniesienia dla każdego parametru były wyniki uzyskiwane w próbce odwirowanej i poddanej badaniu w 1 godzinie od czasu pobrania. Wyniki: W ocenie wyników badań wzięto pod uwagę biologiczną zmienność wewnątrzosobniczą dla ocenianych parametrów i przyjęte w laboratorium wartości niepewności (k=2 przy p=95%), która mieściła się w zakresie od 4 do 10% w zależności od ocenianego parametru. Wyznaczono różnicę bezwzględną i względną dla każdego z w/w parametrów wobec wartości odniesienia oraz średnie arytmetyczne różnic. Uzyskane wyniki wykazały różnice statystycznie istotne p < 0.05 dla następujących parametrów: Insulina - w 8h różnica -13,3%, Testosteron w niskich wartościach (kobiety) - w 8h różnica 9,9%. Tak więc zgodnie z protokołem badania stwierdzono najkrótszy czas stabilności 5 godzin dla insuliny i testosteronu u kobiet. Dla pozostałych parametrów nie wykazano różnic statystycznie istotnych w czasie 24h od momentu pobrania, co wskazuje na co najmniej 24 godzinną stabilność tych parametrów. Wnioski: Stosowanie do pobierania krwi zestawów próżniowych i nadzór nad temperaturą transportu oraz przechowywania (temperatura pokojowa) skutkuje co najmniej 24 godzinną stabilnością 21 z 23 badanych parametrów immunochemicznych (hormony, markery nowotworowe, witaminy i białka specyficzne). Wykazany czas stabilności jest wystarczający na transport próbek do laboratorium z zewnętrznych punktów pobrań. oraz wykonanie badania. Jednocześnie 24 godzinna stabilność umożliwia wykonanie powtórnego badania, w przypadku zgłoszonej przez lekarza niespójności wyniku z obserwowanym stanem klinicznym pacjenta. Tylko dwa parametry, insulina i testosteron u kobiet wymagają oddzielenia surowicy od skrzepu w czasie do 5 godzin od pobrania. 139. Nadzór nad etapem przedanalitycznym – stabilność materiału dla badania ogólnego moczu, badania własne. Krzysztof Łangowski

1, Joanna Drzycimska

1, Cecylia Nowicka

1

1Medyczne Laboratorium Diagnostyczne Gdynia, Laboratoria Medyczne Bruss grupa ALAB sp. z o.o.,

Polska Cel: Weryfikacja stabilności składowych badania ogólnego moczu w okresie do 12 godzin od pobrania Metody: Pierwotne próbki moczu rozdzielono na równe części po 10 ml każda do zamkniętych probówek, przechowywano w temperaturze pokojowej i badano w czasie 1, 2, 4, 6 , 8, 10 i 12 godzin po pobraniu. Temperaturę pomieszczenia monitorowano termometrem sprawdzonym w odniesieniu do wzorcowanego termohigrometru. Badania wstępne moczu wykonywano testem paskowym (Combur, Roche) z odczytem reflektometrycznym (Urisys 1800 Roche). Elementy morfotyczne były liczone z zastosowaniem cytometru przepływowego (UF 1000i, Sysmex). Osad po odwirowaniu moczu oceniano w mikroskopie optycznym. Badane próbki podzielono na dwie grupy – kryterium były wyniki testu paskowego (wyniki prawidłowe, n=19 i wyniki nieprawidłowe, n=16). Wyniki: W grupie wyników prawidłowych badaniem cytometrycznym w pięciu próbkach stwierdzono obecność bakterii. W dwóch z pięciu próbek zaobserwowano istotny diagnostycznie wzrost bakterii po 8 godzinie od pobrania. I tak: ilość bakterii w czasie 1, 8, 10 i 12h dla próbki 01/2012 to odpowiednio 249, 429, 421, 513 kom/ul; dla próbki 05/2012 to odpowiednio 848, 1175, 1952, 6118 kom/ul. Poza tym, w żadnej z próbek moczu prawidłowego, badanych do 12 godzin po pobraniu testem paskowym, cytometrem przepływowym i mikroskopowo, nie zaobserwowano istotnych zmian w wynikach badań erytrocytów, leukocytów i bakterii. W grupie wyników nieprawidłowych badano mocze, których wyniki uzyskane testem paskowym były dodatnie dla co najmniej jednego z trzech parametrów: erytrocytów (13 próbek), leukocytów (10 próbek), bakterii (4 próbki). Analizowano również wyniki próbek moczu, dla których uzyskano w pierwszej godzinie badania cytometrem przepływowym, patologiczny wynik bakterii (10 próbek). W dwóch z 17 badanych próbek zaobserwowano spadek leukocytów. W jednej próbce z 17 badanych zaobserwowano wzrost, w jednej spadek bakterii. Dla większości patologicznych próbek moczu, badanych trzema technikami pomiarowymi do 12 godzin po pobraniu, nie zaobserwowano istotnych zmian w wynikach badań erytrocytów, leukocytów i bakterii, w odniesieniu do wyników uzyskanych w pierwszej godzinie od pobrania.

Obserwowano również w czasie 12 godzin wyniki pH moczu, ciężaru właściwego, parametrów biochemicznych oraz pozostałych elementów morfotycznych (nabłonki, wałeczki, kryształy, drożdże i śluz). Zarówno w grupie próbek moczu prawidłowego jak i patologicznego nie obserwowano zmian na tyle istotnych, aby były one podstawą zmiany kwalifikacji badanych próbek moczu pod względem diagnostycznym. Wnioski: W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano, że stabilność elementów morfotycznych w moczu, przechowywanym w zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej, była znacznie dłuższa niż stabilność podawana w piśmiennictwie (np. dla erytrocytów 1-2 godziny) i wynosiła dla większości badanych próbek przynajmniej 12 godzin. Wyniki przeprowadzonych badań mogą znacznie zliberalizować warunki kwalifikacji materiału do badania w laboratorium medycznym. Wymaga to jednak dalszych badań . Zaobserwowane nieliczne zmiany w stabilności elementów morfotycznych są podstawą zachowania przyjętej zasady, że badanie moczu powinno być wykonane w możliwie najkrótszym czasie. 140. Czy można zastąpić wskažnik aldosteron / aktywność reninowa osocza (ARR), wskažnikiem aldosteron / renina (ADRR) w diagnostyce pierwotnego hiperaldosteronizmu? Piotr Glinicki

1, Wojciech Jeske

1, Lucyna Bednarek-Papierska

1, Aleksandra Kruszyńska

1, Elżbieta

Rosłonowska1, Jadwiga Słowińska-Srzednicka

1, Anna Kasperlik-Załuska

1, Małgorzata Gietka-

Czernel1, Wojciech Zgliczyński

1

1Klinika Endokrynologii, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Polska

Wstęp: Pierwotny hiperaldosteronizm (PA) jest jedną z przyczyn nadciśnienia tętniczego i uważa się, iż może dotyczyć 5-12% pacjentów z nadciśnieniem. Diagnostyka biochemiczna PA opiera się na oznaczeniu stężenia aldosteronu oraz aktywności reninowej osocza (ARO) oraz wyliczeniu wskaźnika aldosteron / ARO (ARR). Oznaczenie bezpośredniego stężenia reniny (DRC) i wyliczenie wskaźnika aldosteron / DRC (ADRR) może być pomocne w diagnostyce PA. Celem pracy było zbadanie czy można zastąpić oznaczenie aktywności reninowej osocza, oznaczeniem bezpośredniego stężenia reniny? Materiał i metody: 118 pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i guzkiem nadnercza. U każdego z nich wykonano oznaczenie stężenia aldosteronu, ARO oraz bezpośredniego stężenia reniny, w spoczynku (0’) oraz po pionizacji (2h). Wskaźnik ARR wyrażono w ng/dl / ng/ml/h, wskaźnik ADRR w pg/ml / pg/ml. Stężenie aldosteronu, reniny oraz ARO oznaczono przy pomocy metod izotopowych (RIA/IRMA). Wyniki: Przy wskaźniku ARR < 20 (n=75), mediana ARR (0’) 11 vs. (2h) 8; AADR (0’) 12 vs. (2h) 14.Przy wskaźniku ARR > 21 (n=43), mediana ARR (0’) 57 vs. (2h) 46; ADRR (0’) 39 vs. (2h) 57.W 9 potwierdzonych przypadkach PA ( 4 hiperplazja / 5 aldosteronoma) mediana wskaźników ARR (0’) 191 vs. (2h) 343, ADRR (0’) 170 vs. (2h) 202. Wnioski: Wskaźnikowi AAR < 20 odpowiadał podobnie niski wskaźnik ADRR. Natomiast w pozostałych badanych przypadkach mediany obu wskaźników były podobnie mniej lub bardziej podwyższone. U pacjentów z PA oba wskaźniki były wyraźnie podwyższone i u większości wynosiły > 100. Wyznaczenie wskaźnika aldosteron / ARO lub aldosteron / renina jest tylko testem przesiewowym i zwykle istnieje potrzeba wykonania dalszych badań (np. rekomendowanych testów potwierdzających). 141. Ocena stężenia siarczanu heparanu u pacjentów z ChNS. Iwona Kaznowska-Bystryk

1, Bartosz Zięba

2, Janusz Solski

3

1Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Polska,

2Oddział Kardiologii,

Szpital Wojewódzki im. Kardynała S. Wyszyńskiego w Lublinie, Polska, 3 akład Diagnostyki

Laboratoryjne, Uniwersytet Medyczny w Lubline, Polska Wprowadzenie: Choroba niedokrwienna serca (ChNS) stanowi w populacji osób dorosłych jedną z głównych przyczyn wysokiej śmiertelności. Z tego powodu, obok dobrze poznanych markerów ChNS, nadal poszukuje się kolejnych czynników ryzyka, które pozwoliłyby na pełniejsze wyjaśnienie patomechanizmu miażdżycy oraz ocenę ryzyka zapadalności na choroby serca. Zainteresowanie siarczanem heparanu (HS) wiązane jest z udziałem tego glikozaminoglikanu (GAG) w patomechanizmie miażdżycy. HS występuje w przestrzeniach: pozakomórkowej,

wewnątrzkomórkowej, jak również na powierzchni komórek, gdzie pełnią rolę receptorów dla chemokin, czynników wzrostowych, enzymów i innych składników ECM modulując ich koncentrację, dystrybucję a przez to biologiczną aktywność. Oddziaływanie HS z lipoproteinami (LP) jest istotne w komórkowym wychwycie LP, w szczególności w ułatwieniu dostępu LP do receptorów i lipazy. HS, jako składnik perlekanu, uczestniczy w budowie ściany naczyń i definiowany jest jako silny inhibitor proliferacji komórek mięśni gładkich. Ponadto, luminalna powierzchnia ściany naczyń pokryta jest warstwą glikokaliksu, którego głównym składnikiem są GAG, wśród nich ponad 50% przypada na HS. Wykazuje on działanie antyadhezyjne, jednocześnie stanowi barierę dla wody, jonów i innych rozpuszczalnych substancji, a także zabezpiecza przed siłami ścierania. Celem niniejszej pracy było zbadanie, czy istnieje zależność pomiędzy stężeniem HS w surowicy krwi a rozwojem ChNS oraz czy przebieg kliniczny ChNS ma wpływ na stężenie HS. Materiał i metody: Materiałem badań była surowica 42 pacjentów (19 kobiet i 23 mężczyzn) z rozpoznaną ChNS. Pacjenci zostali podzieleni w zależności od przebiegu klinicznego choroby na grupę bez przebytych incydentów sercowo-naczyniowych w wywiadzie – 13 chorych oraz grupę 29 chorych z OZW w wywiadzie, która obejmowała pacjentów z zawałem z uniesieniem odcinka ST (STEMI) i bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI). Grupę kontrolną stanowiło 40 zdrowych osób (22 kobiety i 18 mężczyzn). Oznaczenie stężenia HS przeprowadzono zestawem Heparan Sulfate Elisa Kit firmy Seikagaku. Oznaczenie profilu lipidowego (TChol, LDL-Ch, HDL-Ch, TG) przeprowadzono stosując komercyjnie dostępne testy. Analizę statystyczną przeprowadzono przy pomocy pakietu Statistica ver.10 (Stat Soft, Polska). Różnice i zależności zaliczano do statystycznie istotnych przy p<0.05. Wyniki: Stężenie HS w surowicy pacjentów z ChNS było znamiennie wyższe w porównaniu do grupy kontrolnej osób zdrowych (p=0,0112). Porównując uzyskane wyniki stężenia HS w surowicy pacjentów ze względu na przebieg kliniczny ChNS, tj. grupę bez przebytych incydentów sercowo-naczyniowych w wywiadzie i grupę z OZW, zarówno pod postacią STEMI jak i NSTEMI, otrzymano wartości zbliżone w poszczególnych grupach, które nie wykazywały istotnych statystycznie różnic. Wnioski: Wyższe stężenie HS w surowicy oznaczone u osób z chorobą niedokrwienną serca w porównaniu do osób zdrowych może świadczyć o nieprawidłowym metabolizmie HS w ChNS. W przebadanej grupie chorych, przebieg kliniczny ChNS nie miał wpływu na stężenie HS w surowicy. 142. Ocena aktywności enzymów antyoksydacyjnych u pacjentów z rakiem płuc. Ewa Romuk

1, Marzena Zalewska-Ziob

2, Ewa Birkner

1

1 Wydział Lekarski z Oddz. Lekarsko-Dentystycznym, Katedra Biochemii Zakład Biochemii Ogólnej

Ślaski Uniwersytet Medyczny, Polska, 2 Wydział Lekarski z Oddz. Lekarsko-Dentystycznym, Katedra

Biologii Ślaski Uniwersytet Medyczny, Polska Mimo, że występowanie stresu oksydacyjnego w komórkach nowotworowych potwierdzono w badaniach in vitro i in vivo, to mechanizmy odpowiedzialne za jego indukcję nie są do końca poznane i wyjaśnione. W świetle aktualnego stanu wiedzy do potencjalnych mechanizmów odpowiedzialnych za zwiększone powstawanie RFT w komórkach nowotworowych należą: stany zapalne i działanie cytokin, zaburzenia w przekazywaniu sygnałów onkogennych, aktywny metabolizm związany z ciągłą proliferacją, mutacje w mitochondrialnym DNA (mtDNA) i związane z tym dysfunkcje. Pierwszą linię obrony stanowią enzymy antyoksydacyjne oraz endo- i egzogenne niskocząsteczkowe antyoksydanty. W skład enzymatycznego systemu antyoksydacyjnego wchodzą: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) oraz jej izoenzymy (CuZn-SOD i Mn-SOD), katalaza (CAT), peroksydaza glutationowa (GPX)), transferaza glutationowa(GST) oraz reduktaza glutationowa (GR). Liczne obserwacje wskazują, że czynniki onkogenne w komórkach nowotworowych mogą prowadzić do stymulowania wytwarzania zwiększonych ilości anionorodnika ponadtlenkowego. Cel: Ocena aktywności enzymów antyoksydacyjnych dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT), peroksydazy glutationowej (GPX)), transferazy glutationowej (GST) i reduktazy glutationowej (GR) w tkance nowotworowej i odpowiadającej jej tkance zdroweju pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Materiał i metodyka Grupę badaną stanowiło 40 pacjentów (12 kobiet, 28 mężczyzn) z rozpoznanym niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Średnia wieku wynosiła 62±6,1. Aktywność SOD oraz jej izoenzymy oznaczano metodą spektrofotometryczną wg Oyanagui, aktywność GPX oznaczano metodą spektrofotometryczną wg Paglia, aktywność GST oznaczano metodą spektrofotometryczną wg Habiga, aktywność GR oznaczano metodą spektrofotometryczną wg Richtericha, aktywność

katalazy oznaczano metodą spektrofotometryczną wg Aebi. Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu programu Statistica wersja 10, wykorzystując test nieparametryczny U Manna-Whitneya dla porównania aktywności enzymów antyoksydacyjnych w tkance nowotworowej i odpowiadającej jej tkance zdrowej. Wyniki: Zaobserwowano tendencję wzrostową aktywności całkowitej SOD oraz istotny statystycznie wzrost aktywności izoenzymu MnSOD (p<0,00005) oraz CuZnSOD (p<0,0008) w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki zdrowej. Aktywność GST oraz GR była także istotnie statystycznie wyższa w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki zdrowej (p<0,0001). Aktywność GPX była istotnie statystycznie wyższa w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki zdrowej (p<0,05). Aktywność katalazy była istotnie statystycznie niższa w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki zdrowej (p<0,05). Wnioski: Wysokie aktywności enzymów antyoksydacyjnych w tkance nowotworowej w porównaniu z tkanką zdrową świadczą o uruchomieniu mechanizmów obronnych organizmu, które w warunkach stresu oksydacyjnego mają za zadanie unieczynnić wytwarzane wolne rodniki tlenowe. Następstwem zwiększonych ilości RFT w komórkach nowotworowych oraz rosnącego stresu oksydacyjnego jest stymulacja podziałów komórkowych, powstawanie mutacji, prowadzące do niestabilności genomu czy zmiany we wrażliwości komórkowej na leki przeciwnowotworowe. 143. HDL – aktualny stan wiedzy, znaczenie diagnostyczne Magdalena Hałabiś

1, Marcin Dziedzic

1, Janusz Solski

1

1 Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Uniwersytet Medyczny w Lublinie , Polska

Choroba sercowo-naczyniowa (ChSN) i jej powikłania stanowią obecnie jedną z głównych przyczyn zgonów w rozwiniętych cywilizacjach. Jednym z podstawowych badań wykorzystywanych w ocenie ryzyka ChSN jest profil lipidowy w skład którego wchodzi oznaczenie: cholesterolu całkowitego (TC), triglicerydów (TG), cholesterolu LDL (LDL-C) i HDL (HDL-C). Spośród tych parametrów tylko wyższe stężenia cholesterolu HDL (HDL-C) oraz jego głównej apolipoproteiny apoAI (apoAI) są uważane za parametry odwrotnie korelujące z ryzykiem sercowo-naczyniowym. Niezaprzeczalnie mechanizmem antyaterogennego oddziaływania HDL jest jego udział w zwrotnym transporcie cholesterolu (RCT). Proces ten budzi duże zainteresowanie, zwłaszcza zaś jego molekularna regulacja oraz fakt iż tempo RCT nie zawsze koreluje z osoczowym stężeniem HDL-C i apoAI wskazując, że ocena RCT i jego komponentów może stanowić istotną informację kliniczną poza danymi uzyskanymi z pomiaru apoAI i HDL-C. Porażka leku zwiększającego stężenie HDL-C będącego inhibitorem CETP, zwróciła uwagę na fakt wysokiej heterogenności i wielopotencjalnego wpływu HDL, którego wyznacznikiem nie koniecznie jest stężenie cholesterolu w tej frakcji. Znane są zaburzenia w których niskiemu stężeniu HDL-C i apoAI nie towarzyszą incydenty sercowo-naczyniowe. Pomiar parametru stałego jakim jest stężenie HDL-C z epidemiologicznego punktu widzenia umożliwia przewidzenie ewentualnych incydentów sercowo-naczyniowych w dużej populacji to jednak jest niewystarczający aby uchwycić różnorodność funkcjonalną cząstek HDL i ryzyko ChSN związane z tą lipoproteiną. HDL to heterogenna grupa cząstek, które w zależności od gęstości, rozmiaru, ładunku i budowy oraz użytej metody rozdziału można podzielić na podklasy. Choć wyniki badań nad rozdziałem cząstek HDL są często kontrowersyjne to jednak większość badaczy uważa iż HDL2 i HDL1 wydają się być bardziej antyaterogennymi cząstkami zaś HDL3 i duża obecność preB1HDL wskazuje na wzrost ryzyka ChSN. Oznaczanie jakości jak i funkcji HDL stanowi nowy wyłaniający się rejon badań, w których będą mogły być określane fizjologiczne mechanizmy obronne HDL przeciwko oksydacji i stanowi zapalnemu. Wymagane jest oznaczenie lipidów i lipoprotein cząstki HDL gdyż te elementy wpływają na jej jakość i funkcje oraz zidentyfikowanie podklas HDL aby następnie zbudować panel badań określający heterogenność cząstki, który po zaadaptowaniu metodyki dla dużych grup pacjentów byłby bardzo przydatny w globalnej ocenie ryzyka ChSN. Oznaczenie specyficznych frakcji HDL i apoA-I wydaje się być znacznie lepszym wykładnikiem składu i rozkładu cząstek HDL oraz oceny ryzyka sercowego niż samo oznaczenie HDL-C. Na dzień dzisiejszy koniecznym wydaje się być wprowadzenie oznaczeń apoA-I do profilu lipidowego, które w dużej mierze może pomóc w ocenie jakości cząstki HDL oraz uzupełni informację jaką daje rutynowe oznaczenie stężenia HDL-C.

144. Wartość prognostyczna ekspresji Il-1, Il-6 i Il-10 w myocardium u chorych z kardiomiopatią rozstrzeniową zapalną. Dorota Domal-Kwiatkowska

1, Ewa Nowalany-Kozielska

2, Sławomir Smolik

1, Ludmiła Węglarz

1

1Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, Katedra i Zakład

Biochemii, Polska, 2 Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym SUM, Zabrze, II Katedra

i Oddział Kliniczny Kardiologii, Polska Wstęp: Zapalenie mięśnia sercowego (ZMS) może obejmować komórki mięśnia sercowego, tkankę śródmiąższową oraz naczynia. Wyróżnia się 3 fazy - infekcję wirusową, fazę odpowiedzi immunologicznej i kardiomiopatii rozstrzeniowej. Znaczącą rolę w przebiegu odpowiedzi immunologicznej ZMS odgrywają interleukiny pro - i antyzapalne. Cel: Wykazanie, że badana aktywność transkrypcyjna IL-1β, IL-6 oraz IL-10 w myocardium może zostać wykorzystana w ocenie działania określonej interleukiny w patogenezie ZMS jako marker odpowiedzi immunologicznej u chorych z kardiomiopatią rozstrzeniową zapalną. Materiały i metody: RNA całkowity wyizolowano z bioptatów mięśnia sercowego i przeprowadzono reakcję QRT-PCR dla analizowanych interleukin. Do badania wytypowano 30 chorych z kardiomiopatią rozstrzeniową zapalną (skala NYHA I-II), u których rozpoznanie ZMS ustalono na podstawie stopnia wzmożonej ekspresji białek głównego układu zgodności tkankowej (HLA) i stopnia nacieku zapalnego oraz oceniono aktywność transkrypcyjną receptorów aktywowanych proteazami PAR1 i PAR2. Wyniki: Aktywność transkrypcyjną interleukin oceniono u chorych, u których ekspresja PAR2 była podwyższona w stosunku do PAR1 oraz badanie potwierdziło cechy pobudzenia immunologicznego. Wykazano, że aktywność IL-10 była wyższa w stosunku do IL-1β w bioptatach mięśnia sercowego u badanych chorych. Nie stwierdzono natomiast różnicy w aktywnościach IL-1β i IL-6. Wniosek: Wzrost ekspresji IL-10, w stosunku do IL-1β sugeruje tłumienie procesu zapalnego w myocardium, wynikające ze zdolności IL-10 do hamowania produkcji cytokin prozapalnych. Prozapalne działanie IL-6 prawdopodobnie jest znoszone przez IL-10. 145. Analiza wybranych polimorfizmów genów u pacjentów z zespołem zależności alkoholowej Anna Grzywacz

1, Iwona Małecka

1, Andrzej Jasiewicz

1, Aleksandra Suchanecka

1, Jerzy Samochowiec

1

1 Katedra i Klinika Psychiatrii, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Polska

Wstęp: Od wielu lat prowadzone są badania mające na celu identyfikację czynników ryzyka zespołu uzależnienia od alkoholu (ZZA), a tym samym grup ryzyka, które powinny zostać objęte programami profilaktycznymi. Cele: Analiza wpływu zmienności w obrębie genów DRD2, DRD4, ANKK1, 5HTT, 5HT2A i BDNF na ryzyko wystąpienia alkoholizmu oraz charakterystyki kliniczne przebiegu tego schorzenia. Przeprowadzenie badań z asocjacji genotypów i alleli. Analiza transmisji alleli w rodzinach nuklearnych. Materiał i metody: Badaniem objęto 365 mężczyzn rasy kaukaskiej, w tym 193 pacjentów z ADS oraz 172 osoby z grupy kontrolnej. Grupy te, a także homogenne podgrupy fenotypowe pacjentów z ZZA, porównywano pod kątem częstości występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmów: genu DRD2 w regionie promotora (rs1799732) oraz w Ex 8 (rs12364283), genu ANKK1 Taq1A (rs1800497), genu DRD4 w Ex 3 (2–11 VNTR), genu 5HTT (VNTR SLC6A4 ins/del 44 pz), genu 5HT2A (T102C, rs6313) i genu BDNF (rs6265). Ponadto przeprowadzono test nierównowagi transmisji badanych polimorfizmów. Wyniki: Nie potwierdzono statystycznie znamiennej zależności pomiędzy występowaniem ZZA a nosicielstwem poszczególnych genotypów i alleli badanych polimorfizmów. U pacjentów z rodzinnym obciążeniem ZZA znamiennie częściej niż w grupie przypadków sporadycznych oraz w grupie kontrolnej występował allel T polimorfizmu genu 5HT2A (T102C, rs6313). Natomiast u mężczyzn, u których w przebiegu ADS występowały drgawki, znamiennie częściej niż w pozostałych grupach stwierdzano obecność genotypu A/G, a także rzadsze występowanie allelu G polimorfizmu genu BDNF (rs6265). W teście nierównowagi transmisji wykazano, że jedynym allelem przekazywanym preferencyjnie pacjentom z ADS przez ich rodziców był allel G polimorfizmu Val66Met (G/A) genu BDNF.

Wnioski: Analiza rodzin nuklearnych wskazuje na nierównowagę transmisji i preferencyjne dziedziczenie niektórych alleli analizowanych polimorfizmów. W niniejszym badaniu takim preferencyjnie dziedziczonym allelem okazał się allel G genu BDNF. Badania finansowano z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr NN 402466540 146. Aktywność izoenzymów dehydrogenazy alkoholowej (ADH) oraz dehydrogenazy aldehydowej (ALDH) w komórkach raka jajnika. Karolina Orywal

1, Wojciech Jelski

1, Michał Zdrodowski

2, Maciej Szmitkowski

1

1Zakład Diagnostyki Biochemicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska,

2Klinika

Ginekologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska Wprowadzenie : Nowotwory złośliwe są jedną z głównych przyczyn zgonów kobiet na całym świecie, stanowiąc istotny problem nie tylko w starszych grupach wiekowych. Narząd rodny wykazuje ekspresję mRNA dla dehydrogenazy alkoholowej (ADH), katalizującej pierwszy etap metabolizmu alkoholu etylowego do aldehydu octowego, ulegającego oksydacji z udziałem dehydrogenazy aldehydowej (ALDH). W tkankach nowotworowych wielu narządów dochodzi do zaburzeń aktywności ADH i ALDH, co może mieć udział w procesie karcinogenezy. Zmiany w aktywności ADH i ALDH mogą odgrywać także rolę w patogenezie rozwoju raka jajnika. Celem pracy było porównanie aktywności ADH i jej czterech klas izoenzymów (I, II, III, IV) oraz aktywności ALDH w komórkach nowotworowych jajnika, torbieli jajnika i niezmienionej tkance tego narządu. Materiał i metody: Do badań wykorzystano wycinki tkanki nowotworowej jajnika pobrane od 38 kobiet (wiek 41-75 lat) oraz 40 torbieli jajnika (wiek kobiet 27-72 lat). Grupę kontrolną stanowiły 34 histologicznie niezmienione tkanki jajnika, pobrane od kobiet z mutacją w genie BRCA1(wiek 36-61 lat), pobrane podczas profilaktycznej operacji usunięcia jajnika. Aktywność całkowitą ADH oznaczano metodą kolorymetryczną z p-nitrozo-N-N-dimetyloaniliną (NDMA) jako substratem. Aktywność ADH I i ADH II oznaczano metodą spektrofluorymetryczną z użyciem fluorogennych, specyficznych substratów (4-metoksy-1-naftaldehyd dla ADH I i 6-metoksy-2-naftaldehyd dla ADH II). Aktywność izoenzymów pozostałych klas oznaczano metodami spektrofotometryczni z substratami - alkoholem kaprylowym (ADH III) i m-nitrobenzaldehydem (ADH IV). Aktywność całkowitą ALDH oznaczano również metodą spektrofluorymetryczną z 6-metoksy-2-naftaldehydem jako substratem. Wyniki : Wykazano, że komórki nowotworowe jajnika, torbieli jajnika oraz zdrowa tkanka tego narządu wykazują aktywność ADH i ALDH, jednak aktywność dehydrogenazy alkoholowej jest znacznie wyższa w porównaniu z dehydrogenazą aldehydową we wszystkich badanych tkankach. Aktywność wszystkich klas ADH w tkance nowotworowej jest wyższa w porównaniu do aktywności w komórkach torbieli oraz zdrowego jajnika, jednak różnice istotne statystycznie (p<0.05) stwierdza się jedynie w przypadku klasy I ADH. Jej aktywność w komórkach raka jajnika wynosi 0.147 nmol/min/mg białka i jest znamiennie wyższa w porównaniu do tkanki torbieli (0.115 nmol/min/mg białka) oraz zdrowego jajnika (0.109 nmol/min/mg białka). Nie wykazano istotnych różnic aktywności w profilu izoenzymów ADH pomiędzy zmianami łagodnymi jajnika a jego zdrową tkanką. Całkowita aktywność ADH jest wyższa u kobiet z nowotworem jajnika (0.703 nmol/min/mg białka) w porównaniu do tkanki zdrowego jajnika (0.674 nmol/min/mg białka) oraz do torbieli jajnika (0.681 nmol/min/mg białka) a różnice te były znamienne statystycznie. Analiza aktywności całkowitej ADH nie wykazała istotnych różnic pomiędzy grupami kontrolnymi. Wnioski: Różnice aktywności całkowitej ADH i izoenzymu klasy I sugerują, że komórki nowotworowe mają zwiększoną zdolność produkcji aldehydu octowego, co może nasilać proces karcinogenezy oraz być przyczyną zaburzeń metabolicznych w niskozróżnicowanych komórkach rakowych. 147. Charakterystyka zakażenia parvowirusem B19V u chorych z chorobami hematologicznymi – wnioski dla właściwego postępowania diagnostycznego wśród osób z obniżoną odpornością. Aleksandra Kalińska

1, Ewa Sulkowska

1, Anna Ejduk

1, Lech Konopka

1, Sydonia Gołębiowska-

Staroszczyk2, Michał Matysiak

2, Piotr Grabarczyk

1

1Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, Polska,

2Samodzielny Publiczny Dziecięcy Szpital

Kliniczny w Warszawie, Polska Wstęp Zakażenie parvowirusem B19 (B19V) nie wywołuje zwykle objawów istotnych klinicznie. U osób z obniżoną odpornością (np. immunosupresja, chemioterapia) w wyniku infekcji de novo bądź

reaktywacji przebytego zakażenia, B19V może prowadzić do poważnych powikłań klinicznych (m.in. anemia, aplazja czerwonokrwinkowa). Celem pracy jest charakterystyka zakażenia B19V u chorych z chorobami hematologicznymi, a szczególnie wśród osób z obniżoną odpornością oraz sformułowanie wskazań dla właściwego postępowania diagnostycznego. Materiał i metody Przeanalizowano 85 pacjentów z klinik hematologiczno-onkologicznych z wykrytym zakażeniem B19V: 22 chorych z osłabioną odpornością, 63 pacjentów z prawidłową odpornością. DNA B19V badano metodą real-time PCR (Candotti i in. 2004, czułość 100 IU/ml), anty-B19V metodą ELISA (Mikrogen/Euroimmun). Polimorfizm B19V analizując temperaturę topnienia produktu amplifikacji (Schalasta i in. 2004). Wyniki U 17,1% chorych DNA B19V był jedynym markerem zakażenie. Analizując obie grupy stwierdzono, iż największy odsetek pacjentów (31,8%) bez markerów serologicznych obserwowano w grupie z obniżoną odpornością (średnia DNA-emia - 1,46x10

10 IU/ml). Przeciwciała IgM i IgG wykryto

u 18,2% (średnie stężenie DNA B19V - 2,69x1010

IU/ml), u 13,6% wykryto tylko IgM przy średnim stężeniu DNA B19V – 1,73x10

9 IU/ml. Najniższą średnią DNA-emię B19V - 7,72x10

3 IU/ml

stwierdzono u pacjentów z IgG(+). U chorych z prawidłową odpornością rozkład częstości markerów zakażenia B19V był odmienny -największy odsetek (51,9%) stanowili chorzy z wykrywanymi markerami serologicznymi IgM i IgG (średnia wiremia – 1,2x10

6 IU/ml), natomiast jedynie u 11,1%

chorych tylko marker molekularny diagnozował zakażenie B19V (średnia wiremia – 1,20x106

IU/ml). Wykazano występowanie genotypu 2 B19V u 3 pacjentów z obniżoną odpornością, u pozostałych chorych zidentyfikowano genotyp 1 B19V. Wnioski Diagnostyka B19V u chorych z obniżoną odpornością, powinna być oparta przede wszystkim na badaniu DNA B19V. Ilościowe badanie DNA B19V może być przydatne również do monitorowania zakażenia i oceny skuteczności postępowania przeciwwirusowego. Zdiagnozowane przypadki genotypu 2 wskazują na konieczność stosowania testów diagnostycznych wykrywających różne formy polimorficzne (przynajmniej genotyp 1 i 2). 148. Zależność oznaczeń wzoru odsetkowego krwinek białych przy użyciu metody automatycznej (5 diff) i manualnej. Joanna Gliwińska

1, Barbara Masłyk

1, Katarzyna Kostecka

1

1 Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska

Cel pracy: Celem pracy było określenie zależności wyników wzoru odsetkowego krwinek białych uzyskanych metodą automatyczną, w odniesieniu do referencyjnej manualnej metody mikroskopowej. Materiał/metody: Analizą objęto 300 próbek krwi pacjentów leczonych w Centrum Onkologii – Instytucie, Oddział w Gliwicach, u których wykonywano rutynowe badanie morfologii krwi obwodowej. Materiał do badań stanowiły reprezentatywne próbki krwi pełnej, pobranej w systemie próżniowego pobierania krwi (Beckton Dickinson) do probówek o objętości 2ml, zawierających K2EDTA jako antykoagulant. Oznaczenia wykonano z zachowaniem czasu badania, do 2h od pobrania krwi, zgodnie z obowiązującymi rekomendacjami. Do badania włączono próbki krwi oznaczone za pomocą aparatu hematologicznego (5diff), spełniające kryteria wykonania oceny mikroskopowej leukogramu. Weryfikacja wyników wzoru odsetkowego krwinek białych przeprowadzona została zgodnie z wytycznymi ISLH. Metodą automatyczną oznaczenia wykonano na analizatorze Sysmex XE 2100, który z wykorzystaniem metody fluorescencyjnej cytometrii przepływowej, różnicuje krwinki białe na pięć głównych populacji: neutrofile (NEUT), limfocyty (LYMPH), monocyty (MONO), eozynofile (EO), bazofile (BASO) oraz dodatkowy parametr badawczy: niedojrzałe granulocyty (IG) obejmujący: metamielocyty, mielocyty i promielocyty. Metodę odniesienia (metoda referencyjna) stanowiła manualna mikroskopowa ocena wzoru odsetkowego krwinek białych, przy użyciu mikroskopu świetlnego Olympus BX43. Wynik leukogramu obejmował ocenę 100 kolejno napotkanych komórek układu białokrwinkowego, wybarwionych metodą Rapid Stain, przy użyciu cytowirówki barwiącej Aerospray Pro, z zastosowaniem barwników tiazyny i eozyny. Do oceny zależności wyników uzyskanych metodą automatyczną oraz referencyjną metodą manualną użyto analizy korelacji i regresji prostoliniowej. Wyniki: Weryfikacji mikroskopowej podlegały procentowe wartości populacji krwinek białych oznaczonych u chorych na nowotwory, w następujących zakresach: NEUT 12,3-95,7%; LYMPH 1,7-74,7%; MONO 0,6-39,8%; EO 0-45,3%; BASO 0-4,1%; IG 0-28,9%. Współczynniki korelacji dla procentowej zawartości populacji limfocytów, granulocytów obojętnochłonnych oraz granulocytów kwasochłonnych wyniosły odpowiednio 0,95; 0,96; 0,96. Dla populacji monocytów i niedojrzałych granulocytów 0,9; 0,32 dla granulocytów zasadochłonnych.

Wnioski: W badaniu stwierdzono wysoką, bliską jedności, współzależność procentowej zawartości populacji limfocytów oraz granulocytów obojętno- i kwasochłonnych. Natomiast uzyskane wartości współczynników korelacji dla populacji monocytów, a w szczególności granulocytów zasadochłonnych potwierdzają konieczność weryfikacji wyników otrzymanych przy użyciu analizatora hematologicznego. Z uwagi na ogromną wartość diagnostyczną wyników wzoru odsetkowego krwinek białych, w szczególności w odniesieniu do chorych na nowotwory podanych chemioterapii, patologiczne wyniki automatycznego różnicowania leukocytów otrzymywane podczas rutynowych badań hematologicznych wymagają weryfikacji w procesie diagnostycznym. 149. Genotypowanie parvowirusa B19V metodą analizy temperatury topnienia (TM) produktu amplifikacji przy pomocy sond typu Hybprobes (lightcycler probes).. Aleksandra Kalińska

1, Sydonia Gołębiowska-Staroszczyk

2, Michał Matysiak

2, Dorota Nowakowska

3, E.

Sulkowska1, A. Ejduk

1, L. Konopka

1, Piotr Grabarczyk

1

1 Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, Polska,

2 Samodzielny Publiczny Dziecięcy

Szpital Kliniczny w Warszawie, Polska, 3 Instytut "Centrum Zdrowia Matki Polki" w Łodzi, Polska

Wstęp Zakażenie parowirusem B19 (B19V) występuje powszechnie. U osób immunokompetentnych przebiega bezobjawowo lub z objawami grypopodobnymi, bólami stawowymi. Infekcja B19V ma szczególne znaczenie kliniczne u osób z osłabioną odpornością , np. u chorych otrzymujących leki immunosupresyjne, chemioterapię oraz u pacjentów ze wzmożoną erytropoezą. U kobiet ciężarnych zakażenie B19V może skutkować poronieniem, nieimmunologicznym obrzękiem płodu, wrodzoną anemią u dziecka. Badania DNA B19V wykonywane są u dawców osocza do produkcji immunoglobuliny anty-D oraz anty-HBs. Dotychczas poznano trzy genotypy wirusa. Nie wszystkie testy oparte na metodzie real-time PCR wykrywają DNA genotypów 2 oraz 3, niektóre zaniżają ilość tych form polimorficznych. Celem pracy była analiza genotypów B19V u zakażonych pacjentów przy pomocy analizy temperatury topnienia (Tm) w trakcie real-time PCR z wykorzystaniem sondy typu HybProbes (ang. melting temperature analysis-MTA). Materiał i metody Genotypy B19V badano metodą wg Schalasta G. et al., 2004 na aparacie LightCycler (LC-480). Przeanalizowano próbki, w których wcześniej wykryto DNA B19V metodą real-time PCR wg Candotti et al., 2004. Spośród 41 próbek: 30 pochodziło od pacjentów z klinik hematologicznych i onkologicznych, 8 z klinik ginekologiczno-położniczych, zaś 3 od zakażonych dawców krwi. Grupę kontrolną stanowiły próbki, w których wcześniej określono polimorfizm B19V na drodze sekwencjonowania (dwie zakażone genotypem 1 i jedna genotypem 2). Wyniki Badania genotypów w próbkach kontrolnych metodą MTA były zgodne z wynikami analizy metodą sekwencjonowania. Temperatura topnienia wynosiła 66

oC i 56

oC, odpowiednio dla genotypu 1

i 2. Spośród 41 pacjentów, w jednym przypadku stwierdzono genotyp 2 (2,5%), a u pozostałych (97,5%) genotyp 1. Próbka zakażona genotypem 2 pochodziła od pacjentki z małopłytkowością, u której obserwowano przewlekłe zakażenie, utrzymujące się przynajmniej przez 7 miesięcy (stężenie DNA B19 w surowicy 92-4x10

4 IU/ml).

Wnioski Metoda MTA z użyciem sond typu HybProbes umożliwia przeprowadzenie badań epidemiologicznych polimorfizmu B19V. Zidentyfikowano przypadek zakażenia genotypem 2, co wskazuje na krążenie tej formy polimorficznej w populacji polskiej. 151. Użyteczność oznaczeń poziomu żelaza u chorych na czerniaka. Ewa Leporowska

1, Honorata Tatka

1, Aldona Karczewska-Dzionk

2, Andrzej Mackiewicz

3

1 Pracownia Diagnostyki Laboratoryjnej, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Polska,

2 Oddział

Radioterapii Onkologicznej I, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Polska, 3 Zakład Immunologii

Nowotworów, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Polska Wprowadzenie. Żelazo należy do pierwiastków niezbędnych do wzrostu każdej komórki. Jest ono kofaktorem kluczowych enzymów uczestniczących w procesach związanych z cyklem komórkowym. Fe w krążeniu występuje w postaci związanej z transferyną. Zarówno komórki prawidłowe, jak i nowotworowe wychwytują żelazo na drodze endocytozy za pośrednictwem receptorów dla transferyny. Niektóre komórki posiadają zdolność wychwytu żelaza na drodze adsorpcyjnej pinocytozy, aczkolwiek proces ten jest znacznie mniej wydajny. Taką właściwość posiadają między

innymi komórki czerniaka. Na komórkach czerniaka występuje antygen p97, określany jako melanotransferyna (MTf). Wykazuje ona znaczną homologię z transferyną i laktoferyną. Przypuszcza się, że melanotransferyna może być odpowiedzialna za dodatkowy mechanizm wychwytu żelaza przez komórki czerniaka. Dlatego też celem badania była ocena stężeń żelaza oraz przydatności diagnostycznej tego parametru u chorych z czerniakiem poddanych immunoterapii. Materiały i metody. Badaniem objęto 77 chorych na czerniaka z mierzalnymi przerzutami, w III i IV stopniu zaawansowania wg AJCC, poddanych immunoterapii genetycznie modyfikowaną szczepionką czerniakową. Stężenie żelaza w surowicy oznaczano przed rozpoczęciem immunoterapii, w momencie uzyskania odpowiedzi na leczenie oraz w czasie stwierdzenia kolejnej progresji choroby. Dokonano porównania poziomu Fe u chorych, u których uzyskano odpowiedź na leczenie z grupą, u której nie uzyskano odpowiedzi na stosowaną formę terapii. Wyniki. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między stężeniem Fe przed rozpoczęciem immunoterapii i w momencie uzyskania odpowiedzi na leczenie. Natomiast wystąpienie progresji choroby powodowało istotny spadek poziomu Fe. W grupie chorych, u których obserwowano odpowiedź kliniczną (CR+PR+SD) na stosowaną immunoterapię stwierdzono istotnie wyższe stężenie Fe. Analiza krzywych ROC pozwoliła na wyodrębnienie tej grupy chorych z mocą diagnostyczną testu AUC=0,632. W analizie czasu przeżycia OS nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupą chorych, u których poziom Fe przed leczeniem znajdował się w zakresie wartości referencyjnych w porównaniu z grupą chorych, u której wartości znajdowały się poniżej tego zakresu. Wnioski. Obserwacja zmian poziomu Fe u chorych na czerniaka w trakcie immunoterapii umożliwiła stwierdzenie, że progresja choroby wywołuje istotny spadek stężenia żelaza nasilający się do czasu zakończenia obserwacji. Oceniany w niniejszej pracy parametr laboratoryjny może być przydatny do stratyfikacji chorych do immunoterapii, monitorowania oraz przewidywania skuteczności stosowanego leczenia. Udział żelaza w progresji czerniaka nie jest całkowicie wyjaśniony i wymaga dalszych badań, nie mniej poczynione obserwacje wnoszą dodatkowe informacje na temat potencjalnych mechanizmów zaangażowanych w rozwój tego nowotworu. 152. Wpływ Tgf-Β na czynność endokrynną tkanki tłuszczowej u chorych na sklerodermię. KATARZYNA WINSZ-SZCZOTKA

1, KORNELIA KUŹNIK-TROCHA

1, KATARZYNA KOMOSIŃSKA-

VASSEV1, EUGENIUSZ KUCHARZ

2, ANNA KOTULSKA

2, KRYSTYNA OLCZYK

1

1 Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej , Wydział Farmaceutyczny

zOddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Polska,2 Katedra i

Klinka Chorób Wewnętrznych i Reumatologii, Szpital Kliniczny nr 7, Górnośląskie Centrum Medyczne Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach , Polska Wprowadzenie i cel pracy: Skleroderma (SSc) jest chorobą wielonarządową, o przewlekłym i postępującym charakterze. Istotą wymienionego schorzenia jest postępujące włóknienie skóry i narządów wewnętrznych, zapoczątkowane stanem zapalnym toczącym się w obrębie naczyń krwionośnych. W patogenezie wymienionych zaburzeń znaczącą rolę odgrywa – uwalniany z komórek nacieku zapalnego – transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β). Źródłem wymienionego czynnika jest także tkanka tłuszczowa, uważana obecnie za jeden z największych gruczołów endokrynnych. Czynność endokrynna tkanki tłuszczowej wiąże się z biosyntezą i wydzielaniem do krwi adipokin, w tym także obok TGF-β – adiponektyny, leptyny, rezystyny, wisfatyny czy białka wiążącego retinol. Liczne funkcje tych ostatnich cząsteczek w organizmie skutkują powiązaniami między tkanką tłuszczową a zaburzeniami metabolicznymi i zapalnymi chorobami autoimmunologicznymi. Dowiedziono bowiem, że adipokiny wywierając wpływ na przemiany biochemiczne ustroju uczestniczą w etiopatogenezie nadciśnienia tętniczego, choroby niedokrwiennej serca, insulinooporności czy też cukrzycy typu 2. Pomimo, że rola adipokin w etiopatogenezie SSc nie jest w pełni jasna, to uważa się że cząsteczki te, jako modulatory zapalenia, mogą stanowić ogniwo łańcucha patogenetycznych zmian prowadzących do ujawnienia się omawianej patologii. Choć opisano ilościowe zmiany ad ipokin u chorych z SSc to dane te są niejednoznaczne i często odmienne. Stąd też, za cel niniejszej pracy przyjęto ocenę ewentualnych zależności pomiędzy stężeniem TGF-β a stężeniami najliczniej reprezentowanych we krwi adipokin, tj. adiponektyny i leptyny we krwi osób chorych na sklerodermię. Materiały i metody: Ilościowej oceny stężenia TGF-β, adiponektyny oraz leptyny w osoczu krwi osób z rozpoznaną – w oparciu o kryteria Amerykańskiego Towarzystwa Reumatologicznego – sklerodermą oraz osób zdrowych, dokonano metodami immunoenzymatycznymi (ELISA), komercyjnie dostępnymi testami firmy R&D Systems, zgodnie z instrukcjami podanymi przez producenta testów.

Wyniki: W przebiegu sklerodermy dochodzi do znamiennego wzrostu stężenia TGF-β (p<0,001) oraz obniżenia stężenia zarówno adiponektyny (p<0,001) jak i leptyny (p<0,001) w osoczu krwi osób chorych, w porównaniu do stężeń stwierdzonych we krwi osób zdrowych. Ponadto, wykazano istnienie u chorych przeciętnej korelacji pomiędzy stężeniem TGF-β a leptynemią (r=-0.39, p=0.047) oraz brak zależności wymienionego czynnika wzrostu z adiponektynemią (r=0.09, p=0.629). Nie ujawniono związków korelacyjnych pomiędzy stężeniami analizowanych adipokin a stężeniem CRP, wartością OB oraz wartością współczynnika Rodnana, odzwierciedlającego rozległość i stopień zaawansowania zmian skórnych u osób chorych. Wnioski: Uzyskane wyniki wydają się wskazywać na odmienny wpływ TGF-β na przemiany metaboliczne poszczególnych adipokin. Wykazane zaś zaburzenia metabolizmu tkanki tłuszczowej u osób chorych na sklerodermę, znajdujące swój wyraz w zmianach ilościowych ocenianych adipokin osocza krwi, mogą stanowić jedną z przyczyn ogólnoustrojowych zmian charakterystycznych dla SSc. 154. Liczba oznaczeń hbsag i anty hcv w laboratorium szpitala powiatowego i klinicznego. Nina Kozioł-Rudnicka

1, Ewa Szulc-Mysińska

2, Dagna Bobilewicz

2, Anna Mańko

1, Karol Ratomski

3.

1 Pracownia Diagnostyki Laboratoryjnej SP ZOZ w Sokołowie Podlaskim, Polska,

2 Laboratorium

Centralne SP CSK w Warszawie, Polska, 3 Centrum Położniczo-Ginekologiczne „BOCIAN” w

Białymstoku, Polska Zapalenie wątroby typu B i C są chorobami zakaźnymi o etiologii wirusowej. Według WHO w Polsce jest około 2% ludności przewlekle zakażonych wirusem B, a 15-20% przebyło to zakażenie w przeszłości. Według danych Polskiej Grupy Ekspertów HCV szacuje się, że zakażenie to obejmuje około 1,5% populacji. Badania laboratoryjne pierwszego rzutu (badania przesiewowe) w kierunku obu zakażeń są ogólnie dostępne i wykonywane rutynowo w medycznych laboratoriach diagnostycznych, z tym że oznaczenie anty HCV zostało wprowadzone później niż HBsAg i w przeciwieństwie do tego ostatniego bezpośredni test potwierdzenia laboratoryjnego nie jest praktycznie dostępny. Wprowadzenie szczepień przeciwko zakażeniu typu B, przy jednoczesnym zwiększeniu możliwości zakażenia wirusem typu C (zabiegi operacyjne i diagnostyczne) sprawiło, że z końcem lat 90 przy malejącej liczbie oznaczeń HBsAg wzrastała liczba testów anty HCV. Celem pracy było porównanie całkowitej liczby wyników obu testów w tym wyników reaktywnych w szpitalu powiatowym i klinicznym w latach 2011/2012. Rozpatrywano wyniki uzyskane u pacjentów badanych w:

laboratorium szpitala powiatowego – 2558 HBsAg, 2120 anty HCV – testy f-my Abbott

laboratorium szpitala klinicznego – 18 010 HBsAg, 19 177 anty HCV – testy f-my Roche Wyniki: W szpitalu powiatowym 1% wyników HBsAg stanowiły wyniki reaktywne (dodatnie) natomiast 1,4% wyników anty HCV było reaktywnych. W sumie zleceń na oznaczenia anty HCV było 12% mniej niż HBsAg. W szpitalu klinicznym 1,3% wyników HBsAg było dodatnich i 3,5% reaktywnych anty HCV, co jest zrozumiałe, ze względu na leczenie chorób wątroby. Liczba zleceń na testy w kierunku HCV była o 10% większa niż HBsAg. Można stwierdzić, że % wyników dodatnich HBsAg w przeciwieństwie do anty HCV jest niezależny od badanej populacji. Pozostaje natomiast pytanie czy różnice w liczbie zlecanych oznaczeń HBsAg versus anty HCV są wynikiem rzeczywistej potrzeby klinicznej czy tez brakiem określonych procedur. 155. Ocena aktywności procesów wolnorodnikowych i wpływu oksydacyjnej modyfikacji cząsteczek białkowych na przemiany proteoglikanów tkankowych w przebiegu fizjologicznego starzenia się ustroju. Katarzyna Komosińska-Vassev

1, Paweł Olczyk

2, Katarzyna Winsz-Szczotka

1, Kornelia Kuźnik-

Trocha1, Agnieszka Jura-Półtorak

1, Katarzyna Klimek

3, Krystyna Olczyk

1

1Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej, Wydział Farmaceutyczny z

Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec, Polska,

2Zakład Farmacji Aptecznej Katedry Farmacji Stosowanej, Wydział

Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Kasztanowa 3, 41-200 Sosnowiec, Polska,

3Zakład Statystyki, Wydział Farmaceutyczny z

Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiec, Polska

Wprowadzenie: Analiza procesów starzenia na poziomie molekularnym wykazała, iż nieodłącznym elementem fizjologicznego starzenia się ustroju są strukturalno-czynnościowe zmiany, zachodzące w macierzy pozakomórkowej tkanki łącznej. Komponentami macierzy, które w największym stopniu podlegają zmianom towarzyszącym starzeniu, są dwa strukturalne białka – kolagen i elastyna. Zachodząca z wiekiem przebudowa składników macierzy obejmuje także i inne jej makrocząsteczki – w tym proteoglikany (PGs) i ich składniki cukrowe – glikozoaminoglikany (GAGs). Mechanizm jakościowej przebudowy składników macierzy pozakomórkowej wiąże się zarówno z modyfikacją biosyntezy wspomnianych komponentów, jak również – z postsyntetyczną ich modyfikacją. Zmiany potranslacyjne, jakim podlegają składniki ECM wraz z wiekiem zależą od stanu prooksydacyjno-antyoksydacyjnego ustroju. Materiały i metody: Celem niniejszej pracy była ocena aktywności procesów wolnorodnikowych w – towarzyszącej procesowi fizjologicznego starzenia się ustroju – przebudowie składników macierzy pozakomórkowej. Analizy tej dokonano w oparciu o pomiar stężenia reaktywnych związków karbonylowych (PCO) osocza, będących wykładnikiem obecności stresu oksydacyjnego, a zarazem wskaźnikiem oksydacyjnej modyfikacji białek, w tym białek rdzeniowych PGs. Oceny biochemicznych zmian składników ECM dokonano w oparciu o ilościową analizę całkowitej puli GAGs osocza krwi. Materiał do badań stanowiły próbki krwi osób zdrowych, obojga płci, podzielonych na grupy wiekowe odpowiadające kolejnym dekadom życia. GAGs wyizolowano z osocza krwi stosując wieloetapową ekstrak -eliminację oraz sprzęganie z chlorkiem cetylpirydyniowym. Miarą wyizolowanych GAGs było stężenie kwasów heksuronowych. Zawartość związków karbonylowych osocza w pozyskanych próbkach oznaczono metodą ELISA. Wyniki: W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono sukcesywne obniżenie się stężenia siarczanowanych GAGs osocza w przebiegu fizjologicznego starzenia się ustroju. Spadek ten był przy tym jednakowo silnie zaznaczony w grupie kobiet jak i mężczyzn. Podjęte badania wskazały ponadto na związane z wiekiem zaburzenia równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej ustroju w kierunku nasilenia reakcji utleniania. Laboratoryjnym wykładnikiem obecności stresu oksydacyjnego, prowadzącego w konsekwencji do oksydacyjnej modyfikacji cząsteczek białkowych – w tym białek rdzeniowych PGs, był silny wzrost stężenia PCO na przestrzeni kolejnych dekad życia, wykazujący przy tym zależność od płci badanych osób. U mężczyzn rosnąca tendencja zawartości PCO w osoczu obejmowała dwa – o różnej intensywności przyrostu etapy. Punkt nieciągłości dla stężenia grup karbonylowych osocza, wyznaczony metodą quasi-Newtona, określono na 55 rok życia. Do tego czasu, wzrost stężenia PCO w grupie mężczyzn następował powoli, po czym gwałtownie wzrastał w kolejnych latach życia. U kobiet stężenie grup karbonylowych osocza wzrastało z dość znaczną, choć jednostajną w trakcie starzenia szybkością. Dwuczynnikowa analiza wariancji ujawniła ponadto, iż wspólne oddziaływanie płci i wieku było istotnym czynnikiem, oddziałującym na stężenie PCO w przebiegu procesu starzenia. Nadmierne wytwarzanie reaktywnych form tlenu w warunkach stresu oksydacyjnego przyczynić się może do peroksydacji białek rdzeniowych PGs, jak również do częściowego rozpadu łańcuchów glikozoaminoglikanowych, uczestnicząc tym samym w przebudowie składników macierzy pozakomórkowej w przebiegu procesu starzenia. Tezę tę poparły wyniki badań wskazujące na ścisłą korelację pomiędzy wskaźnikami oksydacyjnej modyfikacji cząsteczek białkowych (PCO), a siarczanowanymi glikozoaminoglikanami krwi osób w różnym wieku. Wnioski: Fizjologiczne starzenie się związane jest z występowaniem stresu oksydacyjnego i nasilonym powstawaniem oksydacyjnie zmodyfikowanych białek. Ponadto, pojawiający się – w przebiegu procesu starzenia – stres oksydacyjny moduluje przemiany proteoglikanów tkankowych, które znajdują swoje odzwierciedlenie w profilu GAGs osocza. 156. Ocena wartości prognostycznej liczby krwinek białych wraz z wzorem odsetkowym u chorych na nowotwory regionu głowy i szyi. Barbara Masłyk

1, Tomasz Rutkowski

2, Joanna Gliwińska

1, Jolanta Mrochem-Kwarciak

1, Agata

Hajduk2, Andrzej Wygoda

2, Marcin Hutnik

2, Beata Lukaszczyk-Wideł

2, Piotr Widłak

3, Krzysztof

Składowski2

1 Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska,

2 I Klinika

Radioterapii i Chemioterapii, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska, 3 Centrum Badań

Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów, Centrum Onkologii-Instytut oddz. Gliwice , Polska

Wstęp: Oznaczenie liczby krwinek białych wraz z różnicowaniem na subpopulacje to podstawowe badanie hematologiczne u chorych na nowotwory. Stanowi kluczowy punkt decyzji klinicznych dotyczących postępowania u indywidualnych chorych. Celem pracy była ocena wartości liczby krwinek białych wraz z wzorem odsetkowym jako czynników prognostycznych u chorych na nowotwory regionu głowy i szyi. Materiał/Metody: Badaniem objęto grupę 114 chorych leczonych w Centrum Onkologii - Instytucie z powodu płaskonabłonkowego raka regionu głowy i szyi. 79,8% badanej grupy stanowili mężczyźni. Mediana wieku wynosiła 59 lat. Stopień zaawansowania klinicznego oceniono jako I-II: 56 (49,2%), III: 33 (28,9%), IV: 25 (21,9%). U 56 (49,1%) chorych zastosowano radioterapię, u 58 (50,9%) chemio-radioterapię. Analizowane parametry hematologiczne oznaczono przed rozpoczęciem leczenia; z wykorzystaniem analizatora hematologicznego (Sysmex XE-2100). Dodatkowo, w grupie 39 chorych oceniono stężenie sFlt-1 (rozpuszczalna forma receptora VEGF-R1), metodą elektrochemiluminescencji (Cobas e411, Roche Diagnostics).Wpływ poziomu badanych zmiennych na czas przeżycia chorych oceniono z użyciem testu log-rank, jako wartość odcięcia przyjmując medianę stężeń. Analizę wieloczynnikową przeprowadzono za pomocą modelu regresji proporcjonalnego hazardu Coxa. Wyniki: W badanej grupie chorych wartości oznaczanych parametrów mieściły się w następujących zakresach: liczba krwinek białych 3,43-17,42 x10

3/µl (mediana 7,43x10

3/µl), granulocyty

obojętnochłonne (Neut) 0,83-14,2 x103/µl (mediana 4,2 x10

3/µl), limfocyty (Limf) 0,63-9,08 x10

3/µl

(mediana 2,2 x103/µl), monocyty 0,09-1,54 x10

3/µl (mediana 0,67 x10

3/µl), eozynofile 0-0,73 x10

3/µl

(mediana 0,19 x103/µl), bazofile 0-0,13 x10

3/µl (mediana 0,03 x10

3/µl). Równocześnie wyliczono

wskaźnik Neut/Limf, którego wartość wynosiła 0,3-10,3. Stężenie sFlt-1 mieściło się w zakresie 59,7-112,4 pg/ml (mediana 75,3 pg/ml). Analiza jednoczynnikowa wykazała znamienny statystycznie niekorzystny wpływ wysokiej wyjściowo liczby krwinek białych (p<0,0002) oraz granulocytów obojętnochłonnych (p<0,05) na przeżycie chorych. W przypadku sFlt-1 zaobserwowano tendencję do znamienności statystycznej (p<0,09). W przeprowadzonej analizie wieloczynnikowej wykazano, że spośród analizowanych parametrów wyłącznie liczba krwinek białych jest niezależnym czynnikiem rokowniczym (p<0,004) u chorych na płaskonabłonkowego raka regionu głowy i szyi. Wnioski: W aktualnym badaniu wykazaliśmy niekorzystną wartość prognostyczną wysokiej wyjściowo liczby leukocytów (p<0,0002) oraz granulocytów obojętnochłonnych (p<0,05) na przeżycie całkowite chorych. Spośród ocenianych zmiennych tylko liczba krwinek białych liczba krwinek białych jest niezależnym czynnikiem rokowniczym u chorych na nowotwory regionu głowy i szyi.

Skorowidz autorów streszczeń

Abramowska. Małgorzata 113

Adamek. Brygida 85

Ambroszkiewicz. Jadwiga 24, 27, 29, 53

Badowska. Wanda 56

Baer-Dubowska. Wanda 4

Balcerczak Ewa 131, 132

Balwierz Walentyna 10

Baran Jarosław W s.XIII,

Baranowska. Agnieszka 52

Barska Iga 133

Bartosiewicz Zbigniew W s.I, W s.XI

Basta. Lidia 23

Baszczuk Aleksandra 63

Batura-Gabryel. Halina 82

Bauer Alicja 84

Bednarek. Marta 11

Bednarek-Papierska. Lucyna 140

Bednarczuk Tomasz W s.XI,

Bednarz-Misa Iwona 126, 127, 128

Begiedza Joanna 96

Bembnista Ewa 13

Berdowska Izabela 127

Bergmann Katarzyna 9

Berska Joanna 30, 31

Będkowska Ewa 92, 93, 94

Białek Sławomir W s.XIV, 115

Bicka Joanna 3

Bidziński Mariusz 110

Bielarczyk Hanna 91, 96, 121

Bielińska-Bujniewicz Eugenia 50

Birkner Ewa 142

Bizon-Zygmańska Dorota 121

Blacha Anna 108, 119

Blecharz Paweł 75

Błachnio Katarzyna 98, 99

Bobela Elżbieta 71

Bobilewicz Dagna W s.III, 124, 154

Bobruk Marta 36

Bociąg Piotr 114

Boczek Aleksandra 72

Boruta Beata 50

Brojer Ewa W s.XVI, 33, 40, 41, 95

Bronowicka-Szydełko Agnieszka 126

Brożek Alicja 119, 122

Bryk Dorota 55

Brzeziński Andrzej 129

Brzosko Marek 14, 15, 17

Brzosko Iwona 14, 15, 17

Bugajska Jolanta 30, 31

Bulsa Joanna 56

Bury Marta 77

Butkiewicz Dorota 69

Chechlińska Magdalena 89, 98, 99

Cedzyński Maciej 39

Chełchowska Magdalena 24, 27, 29, 53

Chlebowska Justyna 81

Chlipalska Olga 7

Chmura Aleksandra 107

Chorąży Anna 83

Ciepiela Olga 136

Cieślik Joanna 10

Cieślikowska Maria 99

Cofta Szczepan 122

Cymerys Maciej 63, 108

Czarnecka Hanna 101

Czingon Michał 86,87

Czupryniak Leszek W s.VIII,

Czyż Natalia 106

Ćwiklińska Agnieszka 16,18

Dańska-Bidzińska Anna 110

Dąbrowska Milena W s.IX,

Deja Regina 69, 83, 90

Demkow Urszula W s.XIII, W s.XIV, 37, 136

Derwich Katarzyna 56

Diakowska Dorota 126, 128

Dłużniewski Mirosław 35

Domal-Kwiatkowska Dorota 144

Domański Dominik W I,

Dorożyńska Iwona 5, 8

Drosik Anna 69, 90

Drozdowski Marek 3

Druzd-Sitek Agnieszka 99

Drybańska Bożena 23

Drzycimska Joanna 139

Duber Stanisław 88

Dumnicka Paulina 73, 104

Dworzecka Urszula 69,9

Dyląg Stanisław 23

Dymicka-Piekarska Violetta 70,78

Dziedzic Marcin 143

Ejduk Anna 147, 149

Fabijańska-Mitek Jadwiga 46

Fedak Danuta 68, 73, 104

Fijałkowska Aleksandra 16

Fischer Katarzyna 14, 15, 17

Fliciński Jacek 14,15

Fuksiewicz Małgorzata 110

Gaciong Zbigniew W s.III,

Gacuta-Szumarska Ewa 92, 93, 94

Gaida Agata 50

Gajewska Joanna 24, 27, 29

Galwas-Kliber Katarzyna 69,9

Gałązka-Herczakowska Elżbieta 101

Gamian Andrzej 126, 127, 128

Gaszyński Wojciech W s.II,

Gawkowska-Suwińska Marzena 69, 90

Gawlik Katarzyna 109

Gawlikowski Maciej 88

Gieleżyńska Agata 46

Gietka-Czernel Małgorzata 140

Giglok Monika 69,9

Glinicki Piotr W s.XI, 140

Gliwińska Anna 18

Gliwińska Joanna 69, 90, 148, 156

Głąb-Jabłońska Ewa 112

Głogowski Maciej 89

Gmerek Katarzyna 46

Golański Jacek W s.IX,

Gołębiowska-Staroszczyk Sydonia 147, 149

Gonsior Małgorzata 86, 87, 88

Goryca Krzysztof 98, 99

Gościcki Marcin 93

Góralska Marta 8

Górko Dariusz 115

Grabarczyk Piotr W s.XVI, 147, 149

Grabowski Marcin 115

Grabowski Bogusław W s.XV, 106

Gralak-Dąbrowska Beata W s.VII, 123

Grąbczewska Zofia 76, 77, 79

Groblewska Magdalena 105

Grodner Błażej 100, 115

Grodzicki Tomasz W s.VI,

Gruchacz Jolanta 3

Grudzień Urszula 109

Grużewska Katarzyna 96

Gryko Mariusz 78, 102, 103

Grzebyk Ewa 45

Grzywacz Anna 145

Gurda-Duda Anna 73

Guz Katarzyna 95

Gwarda Henryka 50

Habior Andrzej 84

Hajduk Agata 156

Hałabiś Magdalena 143

Hasse-Lazar Kornelia 823

Heczko Piotr 52

Hołyńska-Iwan Iga 76, 77, 79

Horban Andrzej 123

Hutnik Marcin 156

Iskra Maria 122

Iwanowska Marzena W s.III,

Jakubowicz Jerzy 75

Janiczak Karolina 86, 87

Jankowska-Kulawy Agnieszka 121

Jarząb Barbara 83

Jasiewicz Andrzej 145

Jeleń Agnieszka 131, 132

Jeleńska Magdalena W s.IX,

Jelski Wojciech 48, 51, 146

Jendryczka-Maćkiewicz Ewa 77

Jeske Wojciech 140

Jędrzejczak Wiesław WP II,

Jóźwiak Jacek 50

Jura-Półtorak Agnieszka 155

Jurkowski Marek 3

Juszczak Kajetan 52

Kaczmarek Mariusz 82

Kalińska Aleksandra 147, 149

Kamińska Janina 110

Kamińska Joanna 25, 34, 42

Kamiński Jarosław 20

Kapis Artur 87

Kapturkiewicz Bartosz 126

Kapusta Maria 68, 73, 104

Karczewska-Dzionk Aldona 151

Karczmarewicz Elżbieta W s.IV

Kasperlik-Załuska Anna Anna 140

Kawczyński Rafał 107

Kaznowska-Bystryk Iwona 141

Kemona Halina 25, 34, 42, 70, 78

Kędra Bogusław 102,103

Kieć-Wilk Beata W s.XII,

Kitowska Agnieszka 3

Klemarczyk Witold 27

Klepacka Teresa 24,27

Klimek Katarzyna 155

Kmin Ewelina W s.V,

Kochanowicz Jan 51

Kokocińska Danuta 58

Kołosza Zofia 83, 90

Komarnicki Mieczysław 106

Komosińska-Vassev Katarzyna 152,155

Kondracka Agnieszka W s.XI,

Konopka Anna W s.XV

Konopka Lech 147,149

Kopczyński Zygmunt W s.X, 61, 63

Kopczyński Jarosław 63

Kopeć Agnieszka 76

Kopeć Izabella 41

Koper Olga 25, 34, 105

Korniluk Aleksandra 70,78

Korohoda Przemysław 30

Kortas-Stempak Barbara 18,97

Kostecka Katarzyna 148

Kościelniak-Ziemniak Magdalena 86, 87, 88

Kotowicz Beata 110

Kotulska Anna 152

Kotuła Iwona 136

Kowalczyk Iwona 3

Kowalska Maria 110

Kozielski Jerzy 120

Kozioł-Rudnicka Nina 154

Kozłowska Magdalena 82, 106

Kozłowska-Skrzypczak Maria 13

Krajewska Maria 76, 77, 79

Kraszkiewicz Małgorzata 107

Kretowicz Marek 9

Król Wojciech 71

Kruszyńska Aleksandra 140

Krzystek-Korpacka Małgorzata 126, 127, 128

Kubiak Agnieszka 13

Kucharska Anna 37

Kucharz Eugeniusz 152

Kuchta Agnieszka 18

Kulczyńska Agnieszka 105

Kulig Jan 73

Kulińczak Mariusz 89

Kulpa Jan W II, W s.X, 62, 64, 65, 66, 67, 75

Kuna Piotr W s.XIV,

Kunicki Paweł W s.VII, 72, 111

Kustosz Roman 86, 87, 88

Kuśnierz-Cabala Beata 68,73

Kuźniewski Marek 68, 73, 104

Kuźnik-Trocha Kornelia 152, 155

Lampka Magdalena 76, 77, 79

Laskowska-Klita Teresa 24, 27, 29

Leporowska Ewa 151

Lewczuk Piotr 105

Lipartowska Karina 26

Lisiak-Teodorczyk Karolina 114

Lisowska Anna 70

Lorenc Roman W s.IV

Litwin Anna 31

Lukas Witold 50

Lukaszczyk-Wideł Beata 156

Łabęcka-Modzelewska Hanna 26

Łangowski Krzysztof 137, 138, 139

Łaniewska-Dunaj Magdalena 48,51

Ławicki Sławomir 92, 93, 94

Łoniewska-Lwowska Adrianna 46

Łopacz Patrycja 33

Łukasiewicz Jolanta 39

Łukaszewicz-Zając Marta 102, 103, 105

Machała Waldemar 130

Machczyński Mariusz 108

Maciejewska Anna 39

Maciejewski Tomasz 29

Mackiewicz Andrzej 151

Maćkowiak Kalina 108, 119

Majewska-Szczepanik Monika 5,8

Major Sandra 124

Maksymowicz-Mazur Wanda 120

Malinowska Iwona 56

Małecka Iwona 145

Małecki Maciej W s.VIII, W s.XII

Małek Urszula 56

Małyszko Jolanta W s.III,

Mamełka Beata 130

Mamica Katarzyna 28, 80

Manasar Ahmed 50

Manitius Jacek 9

Mańko Anna 152

Mańkowska-Cyl Aneta W s.IV, 9

Marcińska Katarzyna 8

Marszałek Andrzej 22

Marzec Iwona 26

Masłyk Barbara 69, 83, 90, 107, 148, 156

Mastej Mirosław 50

Masztalerz Agnieszka 82

Maślanka Krystyna 33

Matowicka-Karna Joanna 34, 42

Matsumoto Halina W s.VII, 113

Matuszak Paula 13

Matysiak Michał 147, 149

Mertas Anna 71

Miazga Jolanta 19

Michno Anna 96

Michur Halina 33 Miklaszewska-Sokolewicz Małgorzata W s.XVI

Mikołajczyk Melania 133

Mirowski Marek WP I, 131, 132

Moczulski Dariusz W s.VIII,

Moll Jacek 88

Morris Howard W s.IV

Mrochem-Kwarciak Jolanta 156

Mroczko Barbara W s.X, 102, 103, 105

Mrózek Beata 74

Muszyńska-Rosłan Katarzyna 56

Myczkowska Kinga 50

Myszka Waldemar 118

Nasierowski Tadeusz 113

Naumowicz Joanna 137,138

Neubauer Katarzyna 128

Niedzielska Ewa 56

Niedźwiecki Maciej 56

Niemir Zofia 39

Nowaczek-Migas Maria 41

Nowakowska Dorota 149

Nowakowska Monika 10

Nowakowska-Świrta Ewa 57

Nowalany-Kozielska Ewa 144

Nowicka Agata 82

Nowicka Cecylia 137, 138, 139

Nowicki Marcin 118, 119, 122

Nowis Dominika 81

Nożyński Jerzy 86

Obtułowicz Krystyna 68

Odrowąż-Sypniewska Grażyna 9

Olczyk Krystyna 152, 155

Olczyk Paweł 155

Olejarz Wioletta 53

Olender Kamil 9

Olewiński Robert 128

Ołtarzewski Mariusz 112

Opolski Grzegorz 35, 36, 115

Ordak Michał 113

Orywal Karolina 48, 51, 146

Orzińska Agnieszka 95

Osińska Iwona 37

Ostanek Lidia 14, 15

Ostas Alina 33

Owczarek Justyna 89

Pabin Agata 19

Pacanis Anastasis 18

Pacholewicz Jerzy 87

Pałczyński Cezary 57

Pańkowska Ewa 53

Paradowski Marek W s.XV, 125, 129, 130, 133

Partyka Robert 58

Pawiński Tomasz W s.VII, 123

Pawlak Maciej 35, 36

Pawlica Dorota 109

Pawlica-Gosiewska Dorota 104

Pawlicki Lucjan 125

Pawlik-Sobecka Lilla 45

Pawłowska Joanna 11

Pawłowski Włodzimierz 60, 118, 122

Pączek Leszek W s.I,

Pendzich Joanna 120

Pera Łukasz 35

Piech Krzysztof 89

Pieńko Karolina 40

Pieńkowska-Grela Barbara 98

Pietruczuk Mirosława W s.V,

Piniewska Joanna 35

Pioruńska-Stolzmann Maria 108

Pisarek Paweł 137, 138

Piskorska Elżbieta 76, 77, 79

Piwowar Agnieszka 45

Plinta Klaudia 85

Płaczkowska Sylwia 45, 127

Polcyn-Adamczak Magdalena 39

Polińska Beata 34, 42

Poławski Tomasz 112

Popko Katarzyna W s.XIII, 37

Pruszczyk Piotr W s.XV,

Przedlacki Jerzy W s.III

Przepiera-Będzak Hanna 14

Przybył-Hac Barbara 129

Przybyszewska-Kazulak Elżbieta 38

Pulik Piotr 123

Pupek-Musialik Danuta 63

Pyl Hanna 40

Radko Iwona 60

Raszeja-Specht Anna W s.IX,

Ratomski Karol 154

Religa Grzegorz 87

Rogatko Iwona 7

Rogowska Elżbieta 24

Romuk Ewa 85, 142

Ronowska Anna 91, 121

Rosłonowska Elżbieta 140

Rowicka Grażyna 53

Roztoczyńska Dorota 31

Rutkowski Robert 51

Rutkowski Tomasz 156

Rybczyńska Maria 12

Rychlik Urszula 62, 64, 65, 66, 67, 75

Rymkiewicz Grzegorz 98, 99

Sałagacka Aleksandra 131, 132

Samochowiec Jerzy 145

Smoliński Bolesław W s.XIV,

Sas-Korczyńska Beata 62

Sawicka Paulina 12

Sawicki Marcin 14, 15, 17, 22

Serafińska Barbara 21

Siedlak Maciej W s.XIII,

Siedlecki Janusz W s.X,

Siemiński Mariusz 96

Siergiejko Elżbieta 70.78

Sikora Jan 82

Sitkiewicz Dariusz W s.XV, 35, 36, 55, 100, 115

Siwicki Jan Konrad 89, 98, 99

Skalska Urszula 3

Skibicka Joanna 16

Składowski Krzysztof 156

Skowron Beata 52

Skrobańska Magdalena 100

Słowik Agnieszka W s.XII,

Słowińska-Solnica Krystyna 68

Słowińska-Srzednicka Jadwiga 140

Smolik Sławomir 144

Solarz Krzysztof 117

Solnica Bogdan W s.II, W s.VIII, 68, 73, 104, 109

Solski Janusz 141,143

Sonsala Alicja 56

Sontag Oswald W s.V,

Spychalska Justyna 40, 41

Sromek Maria 89, 99

Stachurska Anna 46

Staniszewska Krystyna 19

Stasik Zofia 62, 64, 65, 66, 67, 75

Stefańska Agnieszka 96

Stelmaszczyk-Emmel 37

Stępińska Janina W s.XV,

Strojek Krzysztof 101

Strus Magdalena 52

Strzelczyk Joanna 117

Strzelecki Adrian 16

Strzępa Anna 5, 8

Suchanecka Aleksandra 145

Sulkowska Ewa 147, 149

Sułowicz Władysław 104

Suwiński Rafał 69,9

Swoboda Paweł 98

Sygitowicz Grażyna 22, 35, 36

Syrnik Ewelina 50

Szadkowska Iwona 125

Szafranek Andrzej 101

Szamotulska Katarzyna 27

Szczepanik Marian 5,8

Szmitkowski Maciej 48, 51, 92, 93, 94, 102, 103, 105, 146

Sztefko Krystyna

W III, W s.VI, 7, 10, 28, 30, 31, 47, 80

Szuber Agnieszka 88

Szulc-Mysińska Ewa 21, 154

Szutowicz Andrzej 10, 91, 96, 121

Wybrański Patrycja 47

Szymańska-Chabowska Anna 45

Ścigała Piotr 86, 87

Ślązak Magdalena 79

Ślęzak Andrzej 50

Ślęzak-Prochazka Izabella 50

Świerzko Anna 39

Talarek Łukasz 89

Tarapacz Jadwiga 62, 64, 65, 66, 67, 75

Tatka Honorata 151

Terlecka Monika 130

Thielemann Anna W. s.X, 61, 63

Thor Piotr 52

Tomasik Przemysław W s.VI, 28, 74

Torliński Lech 108, 119

Totoń Ewa 12

Tracz Marta 35

Trapp Gizela 85, 117

Trelińska Joanna 56

Tukiendorf Andrzej 107

Turowski Paweł 40

Turski Maciej 89

Twardoch Magdalena 56

Tyrakowski Tomasz 79

Uhrynowska Małgorzata 33, 40, 41

Urbaniak Anna 130

Utracka Alicja W s.II

Uttecht –Pudełko Anna 58

Walecka Anna Anna 14, 17

Walińska Ewa 26

Walkusz Urszula 97

Wybrańs-Skorupa Jolanta 57

Waś Joanna 72, 111

Wąsowski Dariusz 89

Weker Halina 27, 53

Węglarz Ludmiła 144

Wiczkowski Andrzej 85, 117

Widłak Piotr 69,156

Wieczorkiewicz Urszula 19

Wielkoszyński Tomasz 116. 117

Więcek Grażyna 52

Wilczek Piotr 88

Winikajtis-Burzyńska Agnieszka 14, 15, 17

Winsz-Szczotka Katarzyna 152, 155

Wiszniewska Marta 57

Wiśniewski Piotr 89

Wiśniewska Agnieszka 21, 38

Wituska Małgorzata 38

Wlazeł Rafał 125, 130

Włodarczyk Robert 89

Wojciechowicz Jacek 114

Wojnar Marcin 113

Wolska Anna 11, 91, 97

Woźniak Karolina 111

Wójcik Ewa W s.X, 62, 64, 65, 66, 67, 75

Wróbel Maria 47

Wróbel Agnieszka 33

Wróblewska Małgorzata 11, 16, 18, 97

Wybrański Iwona W s.XII,

Wydmański Jerzy 107

Wygoda Andrzej 156

Wysocka Ewa 60, 118, 119, 122

Wysocki Wojciech 64, 65, 66, 67

Zachwieja Katarzyna 30

Zajdel Michalina 98,99

Zajkowska Joanna W s.XVI,

Zakrzewska Klara 89

Zalewska-Ziob Marzena 85, 142

Zapolska-Downar Danuta 55

Zaręba Ilona 105

Zawisza Helena 86

Zboch Marzena 105, 127

Zborowska Hanna W s.V, 124

Zembala Marian 101

Zemelka-Wiącek Magdalena 8

Zielińska Marzenna 125

Zielińska-Przyjemska Małgorzata 4, 114

Zieliński Bogdan 127

Zięba Bartosz 141

Zdrodowski Michał 146

Zyśk Marlena 91

Żebrowska Marta 131, 132

Żmijewski Mariusz 89

Żurawska-Płaksej Ewa 45 *WP – wykład plenarny (numeracja w kolejności – liczby rzymskie) *W s. – wykład w sesji (numery sesji - liczby rzymskie) *Numery streszczeń (liczby arabskie)