T.C.

FIRAT ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

SODYUM DODESİL SÜLFAT

POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ

İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ

Yüksek Lisans Semineri

Hazırlayan: Abdullah ASLAN

Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD

JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE)

1. Elektroforezin Temel Prensibi

2. SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi

3. SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Kullanım Amaçları

* Elektroforez, protein ve nükleik asitler gibi yüklü taneciklerin

belirli bir pH’da elektriksel bir alanda ve iyonize ortamda

molekül büyüklüğü veya yük farklarına göre ayrılması ve

saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.

1. ELEKTROFOREZİN TEMEL PRENSİBİ

* Elektroforez, elektriksel alanda yüklü partiküllerin hareketidir.

* Elektroforez sırasında pozitif yüklü partiküller katoda doğru

hareket eder ve bundan dolayı katyon olarak adlandırılırlar,

negatif yüklü partiküller anoda doğru hareket eder ve böylece

anyon olarak adlandırılırlar.

* Bir partikülün göç oranı;

- Elektriksel alan gücüne

- Partikülün net yüküne

- Elektroforez ortamının yoğunluğuna bağlıdır.

* Elektroforez sırasında kullanılan jel matriksi çeşitli büyüklükteki

makromoleküllerin göçünü engelleyen bir moleküler elek özelliği

gösterir. Jel matriksi nispeten hareketsiz olup ayrılacak olan

moleküllerle etkileşmez.

*Jel ortamında biyolojik makromoleküllerin elektroforezi

yapıldığında sürtünme oluşturulur. Sürtünmeden dolayı büyük

moleküller jel matriksi boyunca küçük moleküllerden daha yavaş

göç edeceği için makromoleküllerin ayrılması sağlanır.

* Jel elektroforezi için kullanılan cihazların basit elektrik

devreleri Ohm kanunu ile tanımlanır:

V= I X R (Elektriksel Potansiyel = Akım şiddeti x Direnç)

* Elektroforez cihazında direnç;

-Tamponun iyonik kuvveti

- Jelin kesit alanı

- Jelin uzunluğu ile sağlanır.

* Elektroforez sırasında üretilen güç moleküllerin hareketinde

kullanılır.

* Belirli bir jel elektroforezi sistemi sadece belirli bir ısı

miktarını dağıtabilir.

* Jelde düzensiz ısı dağılımı göçün aynı olmamasına neden

olur.

2. POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ

* Poliakrilamid jel elektroforezi, proteinlerin analizinde birçok

laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu

teknikte proteinler, elektriksel bir alanda ve iyonize bir

ortamda molekül büyüklüğü veya yük farklılığına göre

ayrılmaktadırlar.

2.1. Doğal Jel Elektroforezi

* Doğal jel elektroforezi proteinlerin, denatüre edici maddeler

(örneğin, sodyum dodesil sülfat) kullanılmadan biyolojik ve

enzimatik özelliklerini kaybetmeksizin ayrıldığı bir tekniktir.

2.2. SDS-PAGE (Denatüre Jel Elektroforezi)

* SDS-PAGE, denatüre edici maddeler (örneğin; sodyum

dodesil sülfat, ß-merkaptoetanol) kullanılarak

proteinlerin poliakrilamid jelde ayrılmasını sağlayan bir

tekniktir.

* Bu teknikte proteinler denatürasyona uğrayarak üç

boyutlu yapıdan linear yapıya dönüşerek poliakrilamid

jelde ayrılırlar.

2.2.1. SDS-PAGE Sistemi

Elektroforez tankı

Güç kaynağı

Jeldeki örnek yükleme kuyularını oluşturan taraklar

Jellerin hazırlandığı cam plaklar

Jel kaseti ve Standı

2.2.2. SDS-PAGE’de Kullanılan Jel Matriksi

* SDS-PAGE’de destekleyici madde (matriks) olarak

poliakrilamid yaygın olarak kullanılmaktadır.

* Poliakrilamid jellerin moleküler elek özellikleri akrilamid

konsantrasyonunun artması ile değişir.

* Poliakrilamid jellerin por büyüklüğü nükleik asitlerin

ayrılmasında kullanılan agaroz jellerinkinden daha küçük olduğu

için küçük moleküllerin ayrılmasını daha iyi sağlamaktadır. Bu

yüzden poliakrilamid jeller, genellikle nükleik asitlerden daha

küçük olan proteinlerin ayrılmasında yaygın olarak

kullanılmaktadır.

2.2.3. SDS-PAGE İçin Kullanılan Tampon Çözeltiler

* Tamponlar akımı ileten iyonları taşır ve pH’ı nisbeten sabit

bir değerde tutar.

* SDS-PAGE’de kullanılan tamponlar şunlardır:

• Ayırma jeli tamponu (1.5M Tris-Cl, pH 8.8)

• Yükleme jeli tamponu (0.5M Tris-Cl, pH 6.8)

• Tank (yürütme) tamponu (0.025M Tris, 0.192M Glisin, %0.1

SDS, pH 8.3)

• Örnek uygulama tamponu (0.125M Tris, %4 SDS, %20

Gliserol, %10 β-merkaptoetanol, Bromophenol blue)

2.2.4. Poliakrilamid Jellerin Hazırlanması

2.2.4.1. Ayırma (separating) Jelinin Hazırlanması (%12)

* Jel oluşturmak için uygun bir pozisyonda tutturulan iki cam

arasına yerleştirilmek üzere ayırma jeli solüsyonu hazırlanır.

* Kaset haline getirilen cam plaklar jel kaseti standına yerleştirilir.

Hazırlanan ayırma jeli solüsyonu pastör pipeti, enjektör veya

uygun bir otomatik pipet ile iki cam arasına aktarılır.

2.2.4.2. Yükleme (stacking) Jelinin Hazırlanması (%4)

* Yükleme jeli solüsyonu hazırlandıktan sonra ayırma jeli

üstünde bulunan boşluğa iki camın en üst seviyesine kadar

yükleme jeli pastör pipeti ile dökülür.

* Protein örneklerini yükleme kuyusu oluşturmak için tarak

yerleştirilir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilerek polimerleşme

sağlanır. Daha sonra tarak dikkatli bir şekilde yavaşça çıkartılır.

2.2.5. Protein Örneklerinin Hazırlanması

* Eşit hacimde protein örneği ve örnek uygulama tamponu

(distile su + Tris-HCI + Gliserol + SDS + β-merkaptoetanol

+ Bromophenol mavisi) küçük bir tüpte karıştırılır.

2.2.6. Poliakrilamid Jelde Protein Örneklerinin

Yürütülmesi

* Jeli taşıyan cam plakalar elektroforez iç modülüne yerleştirildikten

sonra elektroforez tankına bırakılır ve tanka yürütme tamponu

konulur.

* Hazırlanan protein örnekleri ve molekül ağırlığı bilinen standart

protein örnekler yükleme jelindeki tarak dişlerinin oluşturduğu

kuyulara yüklenir.

* Tank kapağı kapatılarak güç kaynağına bağlanır ve akım verilir.

2.2.7. Poliakrilamid Jeldeki Protein Bantlarının

Görüntülenmesi

* Protein bantlarının görünür hale gelmesi için jel boya solüsyonuna

alınır. Burada bir saat- bir gece oda sıcaklığında bekletilir.

* Boya solüsyonundan alınan jel, protein bantlarının dışındaki

boyayı giderici solüsyon ortamına (Destaining: %45 Methanol,

%10 asetik asit, %45 distile su) alınır.

(Turgut- Balik et al., 2004)

* Jel üzerindeki protein bantlarının görüntüsünün en geç 1-2

hafta içinde fotoğrafı alınmalıdır. Ancak jellerin bekletilmesi

gerekiyorsa jel saf su ortamına alınır ve buzdolabında

bekletilir veya jel kurutma sistemlerinde kurutularak

saklanabilir.

2.2.8. Proteinlerin Elektroforetik Göçünü Etkileyen

Faktörler

Protein Molekülünün Büyüklüğü

* Yük bakımından aynı özellikte olan fakat molekül ağırlığı farklı

olan iki proteinin hareket hızı jeldeki mevcut pora bağlı olarak

farklı olacaktır.

* Poliakrilamid jel üzerinde büyük moleküllü proteinler göç

sırasında küçük moleküllü proteinlere göre daha fazla polimerde

tutulur. Buna bağlı olarak büyük molekül yapısına sahip

proteinin hızı küçük olana göre daha az olacaktır.

Akrilamid Konsantrasyonu

* Jeldeki porların büyüklüğü polimerizasyona giren akrilamid

konsantrasyonu ile orantılıdır. Konsantrasyon arttıkça porların

çapı daralırken konsantrasyon azaldıkça porların çapı

genişlemektedir.

Uygulanan Akım ve Süre

* Elektroforez sırasında akım düşük tutulursa süre uzayacaktır.

Sürenin uzun tutulması proteinlerin daha iyi ayrılmasını

sağlayabilir; ancak bazen çok uzun süre jelde kalan proteinler

stabilitesini kaybedebilir.

Kullanılan Tamponun İyonik Kuvveti

* Tamponun iyon konsantrasyonu arttıkça iyonik kuvveti de

artar ve böylece protein moleküllerinin mobilitesi artar.

* İyonik kuvvet azaldıkça proteinlerin mobilitesi azalmaktadır.

* Tamponlar, protein moleküllerinin jeldeki hareketini sağlayan

itici gücü oluşturmaktadır.

3. SDS POLİAKRİLAMİD JEL

ELEKTROFOREZİNİN KULLANIM AMAÇLARI

3.1. Molekül Ağırlığı Tayini

(Turgut-Balik et al., 2004)

3.2. Protein Saflığının Kontrolü

* Saf bir protein doğal jel elektroforezinde tek bir bant verir.

Aynı proteinin SDS-PAGE ile analizi sonucunda da tek bir

bant gözleniyorsa, monomerik yapıda olduğu, birden çok bant

gözleniyorsa multimerik yapıda olduğu anlaşılır.

3.3. Proteinlerin Alt Birimlerinin Belirlenmesi

* ß- merkaptoetanol kullanılarak proteinlerin alt birimleri

incelenebilir.

* Merkaptoetanol, S-S köprüleri ile biri diğerine tutunan protein

alt birimlerini ayırır.

3.4. Aminoasit Dizisinin Tespiti

* Elektroforez sonrası poliakrilamid jeldeki protein bantları

nitroselüloz membrana aktarılır ve dizi analizi yapılması

istenen bant kesilerek ilgili merkezlere gönderilip

proteinin aminoasit dizisi belirlenebilir.

3.5. Western Blotlama

* Elektroforezde birbirinden ayrılan protein bantlarından herhangi

birinin diğerlerinden spesifik antikor kullanılarak ayırt edilmesi

tekniğine Western blot veya İmmünoblot adı verilmektedir.

* Western blot tekniği, elektroforez işlemini takip eden dört

adımda gerçekleştirilir. Bunlar; jeldeki proteinlerin nitroselüloz

membrana aktarımı (blotlama), spesifik olmayan reaksiyonları

engellemek için nitroselüloz membranda protein bağlanmamış

bölgelerin ilgisiz proteinlerle kaplanması (bloklama), özgül

antikorlarla tepkime ve en son adımda ise proteinlerin

görüntülenmesi aşamalarıdır.

4. SONUÇ

* Proteinlerin molekül ağırlığının belirlenmesinde,

* Proteinlerin saflığının kontrolünde,

* Bir proteinin alt birimlerinin belirlenmesinde,

* Bir proteinin izoenzimlerinin belirlenmesinde,

* Bir proteinin aminoasit dizisinin tespit edilmesinde,

* Türler arası benzerlik ve farklılıkların belirlenmesinde,

* Genetik hastalıkların teşhisinde kullanılmaktadır.

T.C.

FIRAT ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

SODYUM DODESİL SÜLFAT

POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ

İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ

Yüksek Lisans Semineri

Hazırlayan: Abdullah ASLAN

Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK