Regulacja kwitnienia

Rośliny kwiatowe przechodzą fazę wzrostu wegetatywnego (wytwarzanie pędów i liści) i fazę kwitnienia, w trakcie której

wytwarzają organy służące do rozmnażania płciowego

• U roślin jednorocznych faza wegetatywna zaczyna się w momencie kiełkowania nasion. Następująca po niej faza kwitnienia kończy się starzeniem się i śmiercią rośliny.

• U roślin dwuletnich, faza wegetatywna trwa przez pierwszy rok, w drugim roku następuje kwitnienie, które kończy się śmiercią rośliny.

• U roślin wieloletnich, kwitnienie następuje co rok, przez wiele lat.

Wzrost wegetatywny pędu następuje w merystemie wierzchołkowym. Jest to masaniezróżnicowanych komórek na szczycie pędu. Podziały mitotyczne tych komórekwytwarzają komórki, które różnicują w części pędu, liście, wtórne merystemy (zwane też pączkamibocznymi) – dają początek rozgałęzieniom pędu.

Kwitnienie jest regulowane przez wiele czynników

Kwitnienie wymaga przekształcenia merystemu

wierzchołkowego w merystem kwiatowy

Zależy to od:

• Czynników wewnętrznych

• Czynników zewnętrznych

Regulacja przez temperaturę

• Wiele roślin jednorocznych (np. pszenica ozima) i dwuletnich ma opóźniony czas kwitnienia, jeśli nie przejdzie w trakcie zimy okresu zimowego przechłodzenia. Zmiany powodowane przez ten okres zimowego przechłodzenia noszą nazwę wernalizacji.

• U wielu drzewiastych roślin kwiatowych rosnących w klimacie umiarkowanym (jabłonie, bzy), kwitnienie wymaga uprzedniej ekspozycji na niską temperaturę. Drzewa te nie kwitną w klimacie ciepłym, w którym nie ma wyraźnych zim.

Stan uśpienia pąków jest zlokalizowany.

Regulacja przez fotoperiod (stosunek długości dnia do nocy)

• Fotoperiod jest wykrywany w liściach (np. roślina X potrzebuje dnia o długości co najmniej 8,5 godziny, by móc zakwitnąć). Jednak wystarczy, by tylko jeden liść był eksponowany na właściwy fotoperiod, aby kwiaty pojawiały się na całej roślinie.

• Liście produkują sygnał chemiczny - florigen, który jest transportowany do merystemów wierzchołkowych.

• Chemiczna natura florigenu nie jest wyjaśniona, jednym z jego składników może być białko kodowane przez gen FT (Flowering locus T).

Florigen może się przemieszczać poprzez system naczyniowy

Budowa kwiatu

• Merystem kwiatowy różnicuje w cztery koncentryczne okółki (kręgi) komórek, które tworzą następnie cztery części kwiatu.

• Komórki w okółku 1 rozwijają się w działki kielicha, tworzące najniższy poziom. Łącznie działki tworzą tzw. kielich.

• Okółek 2 daje początek umieszczonym nad kielichem płatkom, tworzącym razem koronę kwiatu. Korona kwiatu jest jego najbardziej barwną częścią.

• Okółek 3 rozwija się w pręciki, męskie organy płciowe.

• Okółek 4 (najbardziej wewnętrzny) tworzy słupki, narządy płciowe żeńskie. Często zlewają się w pojedynczą strukturę.

1

2

3

4

Model ABC rozwoju kwiatu

• Wyniki analizy genetycznej mutantów Arabidopsis i Petunii, sugerowały, że istnieje grupa genów kodujących czynniki transkrypcyjne (główne włączniki) niezbędne do włączania genów warunkujących rozwój działek kielicha, płatków korony, pręcików i słupków.

• Te główne włączniki należą do trzech klas: A, B i C.

• Komórki, w których wyrażane są tylko geny klasy A tworzą działki kielicha.

• Komórki, w których wyrażane są zarówno geny klasy A jak i klasy B, tworzą płatki korony.

• Komórki, w których wyrażane są zarówno geny klasy B jak i klasy C, tworzą pręciki.

• Komórki, w których wyrażane są tylko geny klasy C tworzą słupki.

Geny ABC:

Grupa A: Apetala1 (AP1) Apetala2 (AP2)

Grupa B: Apetala3 (AP3) Pistilata (PI)

Grupa C: Agamous (AG)

Efekty mutacji w genach ABC

Relacje między genami ABC

• Geny klasy A i C są w stosunku do siebie represorami. W nieobecności A, C są aktywne w całym kwiecie. W nieobecności C, A są aktywne w całym kwiecie.

Efekty mutacji w AP1

Geny klasy E (SEP) uzupełniają geny modelu ABC

• Geny SEP (SEPALLATA), obok genów ABC, są niezbędne do prawidłowego określania tożsamości organów kwiatowych

Większość genów ABCE koduje czynniki transkrypcyjne z domeną MADS

• Domena MADS występuje na N-końcu białka i warunkuje: wiązanie do DNA, zdolność do dimeryzacji i lokalizację jądrową.

• (tylko białko AP2 nie należy do rodziny białek MADS)• Arabidopsis zawiera ponad 100 genów kodujących różne białka z domeną MADS.

Domena KMADS Domena C

ANIMALS PLANTS

Pattern formation in development Embryo development Flower development Master regulatory genes contain Master regulatory genes homeobox (Hox genes) contain MADS box Dorsal-ventral specification controlled by TGF-related proteins (GURKEN), No relatives of GURKEN receptor tyrosine kinases, Ras No receptor tyrosine kinases activation, transcription factors No Ras proteins of kappa B, Rel, basic HLH families No kappa B or Rel –type TFs

Weak similarity of the bHLH domain

Cell-cell signaling

Critical role of receptor tyrosine kinases, Critical role of serine/threonine Ras activation kinases of the type not found in

animals

Chromatin

Histones, histone modifying proteins, Swi/Snf-type ATPases, Trx proteins, Polycomb proteins, HP1-type proteins.

Enahncer of zeste (Polycomb-type CURLY LEAF (Polycomb type) maintains repression of maintains repression of the MADS the Hox genes (Ultrabithorax) genes (AGAMOUS)

Niezależna ewolucja genetycznych narzędzi kontroli rozwoju u zwierząt i roślin

Meyerowitz, EM. Science (2002)

Centralna rola genu LFY (LEAFY)

• Ortologi LFY występują u wszystkich gatunków roślin (także nie kwiatowych).

• Aktywność LFY jest konieczna i wystarczająca do determinacji merystemu kwiatowego.

• Niezależnie od determinacji typu merystemu, LFY pełni dwie kluczowe funkcje w rozwoju kwiatu:

1. Jest głównym integratorem sygnałów prowadzących do indukcji kwitnienia.

2. Jest głównym aktywatorem genów ABCE.

Cztery fazy rozwoju kwiatu

1. W odpowiedzi na sygnały ze środowiska i sygnały wewnętrzne roślina przestawia się z wzrostu wegetatywnego na wzrost reprodukcyjny – ten proces kontrolują geny regulujące czas kwitnienia (flowering time genes).

2. Sygnały z różnych ścieżek wpływających na czas kwitnienia są integrowane, co prowadzi do aktywacji niewielkiej grupy genów tożsamości merystemu (meristem identity genes), które warunkują powstanie kwiatu (Geny TFL1, LFY, AP1).

3. Geny tożsamości merystemu aktywują geny tożsamości organów kwiatowych (Geny ABCE).

4. Geny tożsamości organów aktywują zależne od nich geny „budujące organy”, które determinują różne typy komórek, z których składają się poszczególne organy kwiatu.

Genetyczna kontrola czasu kwitnienia

Geny kontrolujące czas kwitnienia działają w czterech ścieżkach indukcji:

A. Zależnej od fotoperiodu (rytm dobowy, długi dzień);

B. Zależnej od giberelin (GA);

C. Autonomicznej;

D. Wernalizacyjnej

U Arabidopsis liczba liści w rozecie jest miarą czasu kwitnienia

Analiza czasu kwitnienia w Arabidopsis, efekt mutacji w genach SWI3

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Number of cauline leaves

atswi3c atswi3d wt

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Number of secondary inflorescences

atswi3c atswi3d wt

Leaf number at flowering during long day

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

9 10 11 12 13 14 15 16

atswi3c atswi3d wt

Leaf number at flowering during short day

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 57 60

atswi3c atswi3d wtA B

C D

% %

%%

Sarnowski et al.,Plant Cell 2005

days leaf NoC-24-25 /9-10D-24-25 /11Wt-20-21 /11

days leaf NoC-65-75 /27D-60-75 /34Wt-58-67 /54

C-3-4D-6-7Wt-8

C-3-4D-6-7Wt-8

atswi3c: early flowering in SD, slightly early flowering in LDatswi3d: early flowering in SD

Kontrola czasu kwitnienia – fotoperiod (long day pathway)

• Wiele genów indukujących kwitnienie w długim dniu koduje białka zaangażowane w percepcję światła (PHYTOCHROME A, CRYPTOCHROM2) lub składniki regulujące zegar okołodobowy (GIGANTEA, ELF3).

• Geny te ostatecznie aktywują gen CO (CONSTANS) (mutany co są późnokwitnące, nadekspresja CO powoduje wczesne kwitnienie).

• CO koduje białko jądrowe zawierające dwie domeny palców cynkowych.

AP1 LFY

Kontrola czasu kwitnienia – gibereliny

• Mutanty z defektem w biosyntezie giberelin (np. ga1) są bardzo późno kwitnące w krótkim dniu, ale nie w długim, co wskazuje, że szlak GA ma kluczowe znaczenie w indukcji kwitnienia w sytuacji braku sygnału indukującego długiego dnia (fotoperiodycznego)

AP1 LFY

Kontrola czasu kwitnienia – szlak autonomiczny i szlak wernalizacyjny

• Geny szlaku autonomicznego kontrolują kwitnienie niezależne od długiego dnia (Arabidopsis jest normalnie rośliną kwitnącą w długim dniu, ale po dłuższym okresie zakwita także w krótkim dniu). Kwitniecie w krótkim dniu jest indukowane przez geny szlaku autonomicznego.

• Geny szlaku wernalizacyjnego są związane z indukcją kwitnienia związana z przejściem zimowego przechłodzenia.

• Geny FLC, SOC1, FT i LFY pełnią funkcję integratorów sygnałów z różnych szlaków kontroli czasu kwitnienia.

AP1 LFY

• wybór właściwego czasu kwitnienia jest kluczowy dla sukcesu reprodukcyjnego roślin

• ewolucja doprowadziła do powstania wielu ścieżek regulujących czas kwitnienia

Regulacja czasu kwitnieniaPrzykład badań

Czynnikiwewnętrzne

Czynnikizewnętrzne

Ścieżka zależna od GA

ŚcieżkaAutonomiczna

Wernalizacja

Fotoperiod

Kontrola czasu kwitnienia

temperatura

FLC (Flowering Locus C) jest centralnym regulatorem

kwitnienia

FLC

ATG TAG

gen FLC

Struktura genu FLC

mRNA genu FLC jest podwyższony w późno kwitnących ekotypach

Arabidopsis

FLC podlega supresji przez Ścieżkę Autonomiczną

FLC

Ścieżka Autonomiczna

FCA, FY

RBD WWQ QRBD FCAbiałko wiążące RNAZwiązane z obróbką 3` końca transkryptów

FYrejon WD silnie konserwowanyu wszystkich eukariontów

WDWD WDWDPPLP PPLP

WD WDWD

PPLP

FY

pA/cleavage complex

WD40

sygnałypoliadenylacji

RNP

WWFCA

transcripty -FLC ? -FCA

SWI3

model działania kompleksu FCA & FY

czy FLC jest regulowany przez RNAi

FLC

RNAi

?

RNAi (RNA interference)

cechą charakterystyczną wszystkich odmian RNAi są małe 21-24nt RNA

RNAi powstało najprawdopodobniej jako mechanizm obrony przeciw wirusom, występuje u wszystkich badanych eukariontów

RNAi został wykorzystany przez komórki do utrzymywania heterochromatyny na cetromerach i obszarach zawierających wielokrotne powtórzenia

odmianą RNAi używaną przez wszystkie znane eukarionty wielokomórkowe jest RNAi z udziałem miRNA

21-24 ntmałe RNA

RISC(RNA induced Silencing Complex)

cięcie mRNA lub inhibicja translacji

RITS(RNA induced Transcriptional Silencing)

tworzenie heterochromatyny:metylacja DNA, metylacja histonu H3 K9

prekursor dsRNA

miRNA siRNA

TGS(Transcriptional Gene Silencing)

PTGS(Post Transcriptional Gene Silencing)

model RNAi

RISC(RNA induced Silencing Complex)

RITS(RNA induced Transcriptional Silencing)

TGS(Transcriptional Gene Silencing)

PTGS(Post Transcriptional Gene Silencing)

regulacja ekspresji genów (30% ludzkich genów)

Integralność centromerów, kontrolowanie transpozonów, regulacja ekspresji genów?

21-24 ntmałe RNA

prekursor dsRNA

model RNAi

RISC

PTGS TGS

DCL1

AGO1

HEN1

AGO4

DCL3

RITS

CMT3, DRM2, MET1, DDM1, MBD5, MBD6, HDA6, DRD1, SUVH2, SUVH4, RDR2, NRPD

model RNAi

FLC

RNAi

?

czy FLC jest regulowany przez RNAi

nowe małe RNA o sekwencji homologicznej do rejonu 3`FLC

użyta sonda

ATG TAG

liście

ro

zety

łuszczyn

ki

liście

pęd

u

pęd

kw

iaty

sie

wki

30nt

20nt

sonda do rejonu3`FLC

EtBR

model RNAi

RI SC

PTGS TGS

DCL1

AGO1 AGO4

DCL3

RI TS

CMT3, DRM2, MET1, DDM1, MBD5, MBD6, HDA6, DRD1, SUVH2, SUVH4, RDR2, NRPD

HEN1

model RNAi

RI SC

PTGS TGS

DCL1

AGO1 AGO4

DCL3

RI TS

CMT3, DRM2, MET1, DDM1, MBD5, MBD6, HDA6, DRD1, SUVH2, SUVH4, RDR2, NRPD

HEN1

poziom małych RNA z 3`FLC jest obniżony w mutantach ze ścieżki polIV

Ler

Col

-0

dcl

2

dcl

3

sgs2

/rd

r6

nrp

d1a

-3

nrp

d1a

-2

rdr2

ago4

-1

30nt

20nt

TGS

RISC RITS

Integralność centromerów, kontrolowanie transpozonów, regulacja ekspresji genów?

PTGS

regulacja FLC przez RNAi– pierwszym przykładem regulacji jednokopijnego genu nie związanego z transpozonami przez siRNA

model RNAi

small RNA region

ATG TAG

small RNA region

ATG TAG

orientacjasens

orientacja antysens

3`koniec FLC jest związany z transkrypcją w orientacji sens i antysens

Yamada et al. Science 2003

flc_utr4 flc_utr3

flc_utr5

rejon małych RNA

ATG TAG

mutanty T-DNA w rejonie 3`FLC

Insercja w rejon 3`FLC zaburza negatywną regulację FLC

poziommRNA FLC

utr 3Col-0 utr 4 utr 5

poziommRNA B- tubuliny

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

Col-0 utr3.6.33 utr_4.3.8 utr5.2.01

ilość liściw warunkachdługiego dnia

55

60

65

70

75

80

Col dcl2-1 dcl3-1 rdr2-1 sde4-2

sde4-3

ilość liś

ci w

kró

tkim

dn

iuFLC podlega supresji przez

mutanty ścieżki RNAi

Struktura chromatyny

Struktura chromatyny

H3 K9 diME

H3 K9 diME

euchromatyna heterochromatyna

przeciwciała specyficzne doH3 di-meK9

amplifikacja PCRwzbogaconych fragmentów

metoda ChIP (Chromatin Immuno

Precipitation)

Jenuwein T

metoda ChIP

ChIPNoAB

ŁU

SZ

CZ

YN

KI

SIE

WK

I

ŁU

SZ

CZ

YN

KI

SIE

WK

I

Ta3

rejon3`FLC

W łuszczynkach rejon 3`FLC jest związany ze znacznikiem H3 K9 di-

methyl

Wzbogacenie zanaczonych reionów w H3 di-me K9; ChIP nad Input

Wzb

og

ace

nie

w s

tosu

nku

do k

on

troli

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

3`FLC1 3`FLC2 UTR At5g10130

znacznik H3 K9 di-methyl jest ograniczony do rejonu 3`FLC

ATG TAG

regulacja FLC

FLC

RNAi

FLC

RNAiWernalizacja

FRI

regulacja FLC

Ścieżka Autonomiczna

FCA, FY

Świeżewski, S., Crevillen, P., Liu, F., Ecker, J.R., Jerzmanowski, A. and Dean, C. (2007) Small RNA-mediated chromatin silencing directed to the 3’ region of the Arabidopsis gene encoding the

developmental regulator, FLC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 3633-3638.