Projektowanie bioaktywnych materiałów kompozytowych polimerowo-ceramicznych w formie...
description
Transcript of Projektowanie bioaktywnych materiałów kompozytowych polimerowo-ceramicznych w formie...
WYDZIAŁ ELEKTROTECHNIKI, AUTOMATYKI,INFORMATYKI I INŻYNIERII BIOMEDYCZNEJ
Praca dyplomowa inżynierska
Projektowanie bioaktywnych materiałów kompozytowych polimerowo-ceramicznych w formie przestrzennych rusztowań przy zastosowaniu metody odlewania z wymywaniem porogenu (SCPL)
Designing of bioactive polymer-ceramic composites by the solvent casting particulate leaching (SCPL method)
Autor: Małgorzata Ul
Kierunek studiów: Inżynieria Biomedyczna
Opiekun pracy: dr inż. Katarzyna Cholewa-Kowalska
Kraków, 2015
Oświadczam, świadomy(-a) odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę dyplomową wykonałem(-am) osobiście i samodzielnie i że nie korzystałem(-am) ze źródeł innych niż wymienione w pracy.
Dziękuję serdecznie mojej promotorce dr inż. Katarzynie Cholewie-Kowalskiej oraz
mgr. inż. Michałowi Dziadkowi za nieocenioną pomoc, poświęcony czas i okazane wsparcie
podczas przygotowywania niniejszej pracy.
Spis treściWstęp..........................................................................................................................................7
I. Podłoża dla inżynierii tkankowej......................................................................................11
1. Inżynieria tkankowa.......................................................................................................11
2. Przestrzenne rusztowania dla inżynierii tkankowej – skafoldy.....................................11
3. Wymagania stawiane podłożom tkankowym................................................................12
3.1. Biokompatybilność.....................................................................................................13
3.2. Biodegradowalność...................................................................................................13
3.3. Właściwości mechaniczne.........................................................................................13
3.4. Architektura rusztowań.............................................................................................14
3.5. Technologia wytwarzania.........................................................................................15
II. Materiały wykorzystywane w inżynierii tkankowej......................................................17
1. Ceramika........................................................................................................................18
1.1. Szkła wytwarzane metodą topienia............................................................................19
1.2. Szkła żelowe...............................................................................................................19
2. Polimery.........................................................................................................................21
2.1. Polimery syntetyczne.................................................................................................21
2.2. Polimery naturalne......................................................................................................22
3. Kompozyty.....................................................................................................................24
III. Metody wytwarzania porowatych rusztowań dla inżynierii tkankowej........................27
1. Konwencjonalne techniki produkcji rusztowań dla inżynierii tkankowej.....................27
1.1. Odlewanie z roztworu z wymywaniem porogenu......................................................27
1.2 Spienianie gazem........................................................................................................28
1.3. Separacja faz..............................................................................................................29
1.4. Formowanie ze stopu.................................................................................................29
2. Zaawansowane techniki produkcji rusztowań dla inżynierii tkankowej.......................30
2.1. Metody szybkiego wytwarzania (Rapid Prototyping)..............................................30
2.2. Elektroprzędzenie.......................................................................................................30
IV. Charakterystyka materiałów wyjściowych....................................................................35
1. Poli(ε-kaprolakton)........................................................................................................35
2. Bioszkła otrzymywane w syntezie zol-żel.....................................................................35
3. Rodzaje porogenów.......................................................................................................36
V. Otrzymywanie porowatego kompozytu PCL/bioszkło żelowe......................................37
VI. Metody badań.................................................................................................................41
1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)..............................................................41
2. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC).................................................................42
VII. Charakterystyka otrzymanych rusztowań......................................................................45
1. Charakterystyka makroskopowa rusztowań..................................................................45
2. Charakterystyka mikroskopowa rusztowań – SEM/EDX..............................................46
3. Charakterystyka właściwości mechanicznych – DSC...................................................52
Podsumowanie i wnioski..........................................................................................................55
Bibliografia........................................................................................................................57
Wstęp
Choroby, urazy i wypadki mogą prowadzić do zniszczeń oraz degeneracji tkanek w
ludzkim ciele, co wymaga leczenia związanego z ich naprawą, zastąpieniem czy regeneracją.
Jeszcze do nie tak dawna leczenie to ograniczało się jedynie do przeszczepów tkankowych,
czy to autograftów (kiedy zarówno biorcą jak i dawcą jest ten sam pacjent) lub też
allograftów. Mimo tego, iż metody te stały się rewolucyjnymi sposobami ratowania życia
jednak nadal istnieją ważne problemy w obu tych technikach popychające naukowców do
dalszych badań. Dzięki temu w ciągu zaledwie 10 lat poczyniono ogromne postępy nad
opracowaniem żywych substytutów tkanek i narządów. Większość z nich nadal jest na etapie
badań, jednak inżynieria tkankowa staje się coraz prężniej rozwijającą dziedziną dążącą do
uzyskania funkcjonalnego materiału biologicznego, który będzie w stanie zastąpić lub
zregenerować uszkodzoną tkankę w organizmie i przywrócić jej funkcje.
Liczne badania pomogły określić cechy jakimi powinny charakteryzować się idealne
materiały dla inżynierii tkankowej. Muszą one cechować się jednocześnie wysoką
biozgodnością jak i odpowiednimi parametrami mechanicznymi . Wszystkie te cechy mogę
być uzyskiwane dzięki odpowiednim materiałom oraz metodom ich otrzymywania. Każda
kolejna próba dostarcza nam nową wiedzę na ten temat dzięki czemu pomału zmierzamy do
uzyskania podłoża tkankowego będącego idealnym rusztowaniem dla rozwoju komórek a co
za tym idzie dalszej regeneracji tkanki.
W niniejszej pracy przedstawiony zostanie procesu otrzymywania przestrzennego
rusztowania przy zastosowaniu metody odlewania z roztworu z wymywaniem porogenu.
Skafold w projekcie otrzymywano z bioaktywnych materiałów kompozytowych polimerowo-
ceramicznych, osnowę kompozytu stanowił polikaprolakton (PCL), natomiast fazą
modyfikującą były cząstki bioaktywnych szkieł żelowych z układu SiO2-CaO-P2O5 o różnym
udziale poszczególnych tlenków. Badano wpływ użytego w procesie porogenu (wykorzystano
NaCl oraz sacharozę) na architekturę otrzymanego podłoża tkankowego oraz wpływ użytych
modyfikatorów na krystaliczność osnowy skafoldu.
7
8
Część literaturowa
9
10
11
I. Podłoża dla inżynierii tkankowej
1. Inżynieria tkankowa
Termin „inżynieria tkankowa” po raz pierwszy został oficjalnie użyty na warsztatach
National Science Foundation w roku 1988 i miał oznaczać stosowanie zasad i metod
inżynierii i nauk przyrodniczych w kierunku fundamentalnego zrozumienia relacji struktury i
funkcji w normalnych i patologicznych tkankach ssaków oraz rozwój biologicznych
substytutów dla odbudowy, utrzymania lub poprawienia funkcji tkanek[1].
Inżynieria tkankowa, zaraz po transplantologii i chirurgii rekonstrukcyjnej, uważana jest
za trzecią z form terapii w medycynie. Dzięki swoim innowacyjnym metodom pozwala na
uniknięcie problemów związanych z tradycyjną transplantologią, takich jak niewystarczająca
liczba organów, czy też leki immunosupresyjne. Nie jest też konieczną implantacja
sztucznych protez, materiałów o dosyć niskiej biozgodności. Wszystkie wymienione dobre
strony inżynierii tkankowej sprawiają, iż coraz realniejszym staje się powodzenie realizacji
procesu regeneracji tkankowej, z jednoczesnym ograniczeniem liczby powikłań [2].
Wyróżniamy trzy podejścia jeśli chodzi o inżynierię regeneracyjną. Dwa pierwsze mają
dość ograniczone zastosowanie i wykorzystuje się je jedynie w przypadku mniejszych
uszkodzeń tkanek. Pierwszym z nich jest zastosowanie wyizolowanych komórek w celu
miejscowej regeneracji odpowiednich tkanek za pomocą wstrzyknięcia zawiesiny
komórkowej w pożądane miejsce i zastąpienie komórek odpowiedzialnych za odpowiednie
funkcje. Natomiast drugim jest dostarczanie czynników wzrostu indukujących różnicowanie
się komórek i wzrost tkanki do konkretnych lokalizacji. Trzecim podejściem, dającym
największe możliwości dotyczy hodowli komórek na trójwymiarowych rusztowaniach, o
których to mówić będzie dalsza część pracy[3,4].
2. Przestrzenne rusztowania dla inżynierii tkankowej – skafoldy
Wyróżniamy skafoldy naturalne oraz syntetyczne używane w zależności od wskazań
medycznych. Inteligentne biomateriały zdolne do zmiany właściwości w odpowiedzi na
zmianę warunków środowiska (np. pH, temperatury) stanowią przyszłość inżynierii
tkankowej. Rusztowania, które stosuje się w inżynierii regeneracyjnej łączy się z różnymi
rodzajami komórek. Coraz częściej jednak stosuje się rusztowania pozbawione komórek.
Główną ideą używania podłoży z osadzonymi na nich komórkami jest pobudzanie procesu
syntezy tkanek. Aby możliwy był dostęp komórek do składników odżywczych i aby zapewnić
odpowiednią powierzchnię wzrostu projektuje się porowate, trójwymiarowe konstrukcje[5].12
Jedna z głównych metod inżynierii tkankowej obejmuje hodowanie odpowiednich
komórek in vitro w celu otrzymania odpowiednich trójwymiarowych (3D) narządów lub
tkanek. Komórki jednak samoistnie nie posiadają zdolności wzrastania w pożądanych przez
nas trójwymiarowych kierunkach odpowiadających za anatomiczny kształt tkanki. Zamiast
tego migrują one losowo tworząc dwuwymiarowe warstwy komórek. W celu osiągnięcia
wymaganych przez nas kształtów wzrostu tkanek wykorzystuje się porowate matryce, tak
zwane rusztowania, do których komórki adherują oraz proliferują. Rusztowania w związku z
tym są bardzo ważnym elementem dla inżynierii tkankowej[6].
Z tego względu stawiane im są ścisłe wymagania. Ponieważ mają one stanowić specyficzne
podłoże dla żywych komórek, muszą być zaprojektowane w ten sposób, aby w jak
największym stopniu przypominały swoją budową oraz właściwościami naturalną macierz
zewnątrzkomórkową, występującą we wszystkich żywych komórkach. Macierz ta, w
naturalnych warunkach organizmu ludzkiego odpowiada za utrzymanie struktur tkankowych,
ich właściwości mechaniczne, a co najważniejsze dzięki swojej porowatej strukturze
odpowiada za odżywianie komórek oraz stanowi dla nich przyczep. Zbudowana jest głównie
z białek kolagenowych i niekolagenowych, hydroksyapatytu, płynu tkankowego, kwasu
hialuronowego, zależnie od tkanki, w której występuje[7].
Wymagania określone jako kluczowe dla wytwarzania rusztowań mówią, iż trójwymiarowe
podłoża powinny posiadać system połączonych ze sobą porów o odpowiedniej wielkości
umożliwiając tkance przerastanie i unaczynienie oraz iż powinny być wykonane z materiału o
kontrolowanej biodegradacji lub bioresorpcji. Ponadto rusztowania mają działać w taki
sposób, aby ostatecznie zostać zastąpione przez przerastającą tkankę, ich parametry
powierzchni (zwilżalność, topografia, łądunek, obecność grup funkcyjnych) musi sprzyjać
przyłączaniu, proliferacji oraz różnicowaniu się komórek. Właściwości mechaniczne muszą
być odpowiednie w zależności od miejsca wszczepienia, skafoldy nie powinny powodować
żadnych niekorzystnych reakcji organizmy oraz powinna je charakteryzować łatwość
wytwarzania w różnorodnych kształtach oraz rozmiarach[6].
3. Wymagania stawiane podłożom tkankowym
Większość rusztowań wytwarzanych z różnych biomateriałów i za pomocą wielu
rozmaitych metod otrzymywania zostały użyte w celach regeneracji odmiennych tkanek oraz
narządów w organizmie człowieka. Jednak niezależnie od rodzaju odbudowywanej tkanki
najistotniejsze parametry charakteryzujące skafold pozostają niezmienne projektowaniu oraz
określaniu przydatności rusztowania do stosowania w inżynierii tkankowej[1].
13
3.1. Biokompatybilność
Pierwszym i najważniejszym kryterium jakie musi spełniać rusztowanie dla inżynierii
tkankowej jest to, że muszą być one biokompatybilne. Komórki muszą adherować,
prawidłowo funkcjonować i migrować na powierzchnię i w końcu wewnątrz rusztowania oraz
zaczynać się rozmnażać zanim ustali się nowa matryca. Po implantacji trójwymiarowe
podłoże komórkowe musi wywołać nieznaczną odpowiedź immunologiczną aby zapobiec
poważnej odpowiedzi zapalnej tkanki mogącej spowodować pogorszenia gojenia się ran lub
odrzucenie wszczepu[1].
3.2. Biodegradowalność
Celem inżynierii tkankowej jest pozwolenie własnym komórkom organizmu, aby po
upływie określonego czasu finalnie zastąpiły skafold. Rusztowania nie mają bowiem w
zamierzeniu być implantami stałymi. Podłoże zatem musi być biodegradowalne w taki
sposób, aby komórki mogły wytworzyć własną matryce zewnątrzkomórkową. Ponadto
produkty uboczne tej degradacji powinny być nietoksyczne oraz zdolne do opuszczenia
organizmu bez wywołania skutków ubocznych. W celu umożliwienia stopniowej degradacji
zsynchronizowanej ze wzrostem tkanki konieczna jest niewielka odpowiedz zapalna
organizmu połączone z kontrolowaną infuzją komórek takich jak makrofagi. Obecnie
strategie inżynierii tkankowej są wprowadzane do praktyki lekarskiej o wiele częściej, a
immunologia odgrywa coraz większą rolę w badaniach[1].
3.3. Właściwości mechaniczne
Idealnym byłoby, aby skafold posiadał właściwości mechaniczne zgodne z
anatomicznym miejscem wszczepu oraz jednocześnie był na tyle wytrzymały, aby umożliwić
chirurgiczne postępowania podczas implantacji. O ile jest to ważne w przypadku wszystkich
tkanek ciała, jednak może stanowić wyzwanie w przypadku implantacji do układu sercowo-
naczyniowego oraz kostnego. Produkcja rusztowań z adekwatnymi właściwościami
mechanicznymi jest jedną z najtrudniejszych zadań w przypadku kości i chrząstki. Dla tych
tkanek, implantowane podłoże musi charakteryzować się odpowiednią odpornością
mechaniczną dla zachowania funkcjonalności przez cały okres od wszczepienia, aż do
całkowitego zastąpienia biomateriału przez tkankę. Kolejny problem stanowi fakt, iż
możliwości regeneracyjne organizmu zmieniają się wraz z wiekiem, na przykład u osób
młodych złamania goją się w około sześć tygodni, natomiast pełne zdolności mechaniczne
kości wracają po około roku, kiedy w przypadku osób starszych tempo samonaprawy kości
jest znacznie spowolnione. To też musi być brane pod uwagę w przypadku projektowania
skofoldów aplikowanych w ortopedii.
14
Jednak, wraz z rozwojem dziedziny można dojść do wniosku, iż zbyt wiele uwagi
poświęcono na próby skonstruowania rusztowań z podobnymi właściwościami
mechanicznymi do kości i chrząstki. Wiele materiałów zostało wyprodukowanych z dobrymi
parametrami mechanicznymi jednak kosztem zmniejszonej porowatości, co skutkowało
fiaskiem w momencie wszczepienia z powodu niewystarczającej zdolności do unaczynienia,
mimo iż materiał wykazywał potencjał w przypadku badań in vitro[1].
Oczywistym zdaje się być fakt, iż równowaga pomiędzy własnościami
mechanicznymi i porowatością umożliwiającą infiltracje komórkową i unaczynienie jest
kluczem do sukcesu każdego rusztowania [1].
3.4. Architektura rusztowań
Ogólnie znanym w materiałoznawstwie i inżynierii jest fakt, iż organizacja
mikrostruktury materiału w sposób kluczowy określa jego właściwości. Podobnie, tkanki
biologiczne charakteryzują się unikalną architekturą odpowiadającymi za określone ich
funkcje [8].
Architektura rusztowań w inżynierii tkankowej ma decydujące znaczenie. Mikrostruktura
podłoży tkankowych powinna charakteryzować się dużą porowatością otwartą, aby zapewnić
komórkom możliwość swobodnego przemieszczania się oraz dyfuzję składników
odżywczych, musi również zapewniać warunki do wytworzenia macierzy
zewnątrzkomórkowej. Co więcej, struktura połączonych ze sobą porów jest konieczna w celu
umożliwienia wydostania się na zewnątrz struktury produktów przemiany materii komórki
oraz produktów degradacji samego rusztowania, aby mogły opuścić organizm człowieka nie
kontaktując się z otaczającymi narządami.
Kwestia degradującego rdzenia wynikającego z niewystarczającego unaczynienia oraz z
usuwania odpadów od środka konstrukcji tkankowej jest jednym z głównych problemów w
dziedzinie inżynierii tkankowej. Innym kluczowym zagadnieniem architektury konstrukcji
jest średnia wielkość porów rusztowania. Komórki oddziaływują z rusztowaniami przede
wszystkim poprzez grupy chemiczne (ligandy) ma powierzchni materiału. Rusztowania
wytwarzana z materiałów budujących naturalną matrycę zewnątrzkomórkową (np. kolagenu)
naturalnie wytwarzają na powierzchni ligandy w postaci sekwencji wiążących Arg-Gly-Asp
(Rys.1), zaś rusztowania wykonane z syntetyczne biomateriałów mogą wymagać celowego
przyłączenia tych ligandów, na przykład poprzez adsorpcję białek. Wpływ na gęstość
upakowania ligandów ma specyficzna powierzchnia właściwa , czyli na porowate
powierzchnia do której mogą przylegać komórki. Zależy to od wartości średniej wielkości
porów rusztowania.
15
Zatem pory muszą być wystarczająco duże, aby komórki mogły migrować do
struktury, gdzie ostatecznie zostają związane do ligandów w obrębie rusztowania, ale
jednocześnie na tyle małe aby zdołały utworzyć dostatecznie dużą powierzchnię właściwą, co
prowadzi do minimalnej gęstości upakowania ligandów co pozwala na sprawne wiązanie
krytycznej ilości komórek do skafoldu. Dlatego też dla każdego rusztowania istnieje
krytyczny zakres rozmiaru porów, który może się różnić w zależności od typu komórek
wiązanych do podłoża oraz rodzaju tkanki jaka nas interesuje[1].
Rys.1 Mikrofotografia konfokalna pokazujące osteoblasty (zielony) przyłączone do
wysoce porowatego rusztowania kolagen-GAG (czerwony). Mechanizm dzięki któremu
komórki przyłączają się do biomateriałów i rusztowań jest bardzo ważne dla udanej
regeneracji komórki [1].
3.5. Technologia wytwarzania
W celu zapewnienia określonemu podłożu przeznaczonego dla zastosowań inżynierii
tkankowej, klinicznej i ekonomicznej realności wykonania, powinna być ona tania oraz
stosunkowo szybka i łatwa w produkcji. Innym ważnym czynnikiem jest określenie sposobu
w jakim produkt będzie dostarczany i udostępniany lekarzowi. Pozwala to ustalić w jaki
sposób skafold powinien być przechowywany. Lekarze zazwyczaj preferują produkty gotowe
do użycia od razu po wyjęciu z opakowania bez potrzeby stosowania dodatkowych zabiegów
chirurgicznych w celu wyhodowania komórek in vitro kilka tygodni przed implantacją.
Jednak, w niektórych typach tkanek nie jest to możliwe i hodowle in vitro przed implantacją
są konieczne[1].
Ostatecznym kryterium w projektowaniu rusztowań dla inżynierii tkankowej i taki, od
którego zależą wszystkie wymienione powyżej, jest wybór odpowiedniego biomateriału z
jakiego skafold powinien być wykonany.
16
17
II. Materiały wykorzystywane w inżynierii tkankowej
Wiele rodzajów biomateriałów może być używanych do produkcji porowatych rusztowań
dla inżynierii tkankowej, pod warunkiem , że technologia ich przetwarzania jest zgodna z
właściwościami biomateriału. Ogólnie, biomateriały używane do wytwarzania porowatych
rusztowań możemy podzielić zależnie od ich źródła na biomateriały naturalne i syntetyczne.
Naturalnie występujące biomateriały można uzyskać z ich naturalnych źródeł, przetwarzając
następnie w celu uzyskania porowatych rusztowań. Materiały te mogą występować w swojej
naturalnej postaci, jak na przykład ECM (matryca zewnątrzkomórkowa) w postaci
przeszczepów kseno- lub allogenicznych lub mogą też być w formie naturalnych
nieorganicznych ceramik (np. fosforany wapnia) i polimerów organicznych takich jak białka,
polisacharydy. Naturalne materiały zazwyczaj charakteryzują się doskonałą
biokompatybilnością, dzięki czemu komórki mogą przyczepiać się i wzrastać na nich z bardzo
dużą efektywnością. Istnieje jednak problem w przypadku naturalnych biomateriałów, a
mianowicie ich ograniczona stabilność fizyczna i chemiczna przez co mogą one nie być
odpowiednie dla niektórych zastosowań inżynierii tkankowej. Jest to powód który skłonił
naukowców używających naturalnych biomateriałów do opracowania technologii
poprawiających ich właściwości mechaniczne oraz stabilność kształtu. Przykładami są
chociażby kompozyty z syntetycznymi materiałami. Kolejnym problemem jest odpowiedź
immunologiczna organizmu, ponieważ naturalne biomateriały pochodzące z przeszczepów
mogą być odrzucone przez gospodarza.
Biomateriały syntetyczne generalnie mogą być podzielone na materiały nieorganiczne,
takie jak bioszkła, oraz organiczne, takie jak syntetyczne polimery. Powszechnie uważa się,
że syntetyczne biomateriały mają stabilniejsze fizyczne i mechaniczne właściwości oraz mogą
być używane w przypadku zarówno tkanek twardych jak i miękkich. Niemniej jednak, dla
materiałów syntetycznych biokompatybilność staje się poważnym problemem, ponieważ
komórki mogą mieć trudności zarówno w zaadherowaniu się jak i wzroście na tych
materiałach. Dlatego też zostało opracowanych wiele sposobów modyfikacji powierzchni
oraz właściwości w celu zwiększenia biokompatybilności. Przykłady obejmują inżynierię
laserową i pokrywanie naturalnymi materiałami biologicznymi, takimi jak kolagen. Wraz z
rozwojem materiałów kompozytowych ilość kombinacji materiałów mogących tworzyć
porowate skafoldy okazała się być ogromna [9].
18
Rys. 2 a-c. Fotografie z mikroskopu skaningowego przedstawiające trzy klasy biomateriałów.
a - Naturalny biomateriał (gąbka kolagenowa), b - macierz zewnątrzkomórkowa, c –polimer
syntetyczny [10].
1. Ceramika
Ceramika stosowana w celach biomedycznych jest klasyfikowana jako ceramika
bioinertna, bioaktywna lub bioresorbowalna. Do ceramiki bioinertnej możemy zaliczyć takie
materiały jak tlenek glinu i cyrkonu, natomiast ceramikę bioaktywną stanowią fosforany
wapnia (HA, TCP i BCP), bioszkła oraz szkło-ceramika. Ceramika bioresorbowalna to przede
wszystkim α-TCP, BCP oraz niektóre szkła fosforanowe. Dodatkowo ceramikę bioaktywną
można podzielić na osteokonduktywną (wspiera wzrost kości) oraz osteoinduktywną
(stymuluje wzrost kości).
Bioceramika na bazie fosforanu wapnia, bioszkła oraz materiały szkło-ceramiczne są
powszechnie stosowane jako podłoża dla wzrostu tkanki kostnej i mają zbliżony skład
chemiczny i/lub fazowy do mineralnej fazy kości [11].
Hydroksyapatyt (HA) oraz fosforan trójwapniowy (TCP) to dwa powszechnie
wykorzystywane materiały ceramiczne w inżynierii tkankowej. TCP jest stosowany jako
składnik ulegającym resorpcji rusztowaniom, podczas gdy HA, który nie jest bioresorbowalny
oraz ma charakter osteokondukcyjny, jest zwykle używany do pokrywania implantów
biomedycznych co wzmaga regeneracje kości integrując tym samym implant z otaczającą go
tkanką, a także w postaci granul i proszków do wypełniania ubytków kostnych. Z tego
powodu HA zyskał dużą popularność jako materiał, z którego wytwarza się rusztowania dla
inżynierii tkankowej [12].
19
1.1. Szkła wytwarzane metodą topienia
Bioaktywne szkła oraz materiały szkło-ceramiczne powstają w procesie topnienia w
temperaturach przekraczających 1500°C [13]. Badania nad materiałami bioaktywnymi
rozpoczęło odkrycie, iż szkła krzemiankowe o określonym składzie mają zdolność wiązania
się z kością.
Pierwszym bioaktywnym szkłem wytworzonym techniką topienia było Bioglass®
45S5, wprowadzone w 1971 roku przez Hencha i wciąż pozostaje jednym z najpowszechniej
wykorzystywanym oraz najbardziej obiecującym bioszkłem w zastosowaniach klinicznych.
Wytwarzane jest ono na drodze fuzji i ma bardzo specyficzny skład : 45% SiO2, 24.5% CaO,
24.5% Na2O, 6% P2O5 (w % wagowych)[14].
W późniejszych latach prowadzono badania nad poprawą właściwości szkła poprzez
zmianę jego składu procentowego co wykazało, iż dodatki tlenków metali mogą zmieniać
właściwości szkła. Zawartość krzemionki dla bioszkieł topionych nie może jednak
przekraczać 60 %, gdyż powoduje to spadek bioaktywności materiału.
1.2. Szkła żelowe
Prace nad materiałami bioaktywnymi pozwoliły na wysunięcie wniosku mówiącego o
tym, iż nie tylko skład fazowy czy chemiczny odpowiada za właściwości materiału, ale
również metoda jego wytwarzania. W przypadku szkieł bioaktywnych zaowocowało to
rozwojem nowej metody produkcji jaką jest metoda zol-żel. (Rys.3)
Rys. 3 Schemat przygotowania roztworów wyjściowych do syntezy biomateriałów A2, T2, S2[13].
20
Wyższość syntezy zol-żel nad tradycyjną metodą topienia polega na możliwości
uzyskania szkieł o większym stopniu rozwinięcia powierzchni (są wysoce porowate) i
zachowaniu powierzchniowych grup silanolowych, co skutkuje większą bioaktywnością
biomateriału, otrzymane tą metodą szkła mogą charakteryzować się również większą
resorbowalnością w organizmie[13].
Metoda ta charakteryzuje się całkowitym pominięciem etapu ogniowego i opiera się
głównie na reakcjach zachodzących równolegle w fazie ciekłej – hydrolizie i polikondensacji.
Warunkują one przejście roztworu wyjściowego w żel, który w wyniku obróbki termicznej w
temperaturach dużo niższych, niż ma to miejsce w przypadku szkieł topionych, może przejść
w szkło. Głównymi surowcami są zwykle alkoholany oraz estry, a także kombinacje
związków organicznych i nieorganicznych (azotany, chlorki). Są one prekursorami
pierwiastków szkłotwórczych oraz modyfikujących.
Rys. 4 Schemat otrzymywania proszków i materiałów spiekanych pochodzenia
żelowego [13].
21
2. Polimery
2.1. Polimery syntetyczne
Kontrolowane właściwości mechaniczne, fizyczne i biologiczne polimerów
syntetycznych czynią je materiałami bardziej przewidywalnymi niż polimery ze źródeł
naturalnych. Ważna zaletą wynikającą ze stosowania syntetycznych polimerów jest
możliwość zmieniania właściwości materiału poprzez dostosowywanie proporcji jednostek
monomerowych oraz przez przyłączanie do łańcuchów odpowiednich grup chemicznych
( np. peptydów RGD, rozpoznawalnych przez komórki). Ponadto, szybkość i produkty
degradacji mogą być kontrolowane przez odpowiedni wybór segmentów, dzięki czemu
możemy uzyskać w wyniku rozkładu składniki metabolizowane do produktów
nieszkodliwych. Wśród wielu polimerów syntetycznych stosowanych w inżynierii tkankowej
najpowszechniejszymi jest kwas polimlekowy (PLA - polilaktyd), kwas poliglikolowy (PGA
– poliglikolid)i ich kopolimery – Poli(laktyd-ko-glikolid) – PLGA. Te polimery degradują w
wyniku mechanizmów hydrolitycznych i są często używane, ponieważ produkty ich
degradacji mogą być usunięte z organizmu jako dwutlenek węgla i woda. Jednak ich wadą
jest to, iż zakwaszają środowisko w obszarze implantacji w wyniku rozkładu do kwaśnych
produktów.
Polikaprolakton (PCL) jest degradowany na drodze hydrolizy w warunkach
fizjologicznych (rys.3). Ponadto, jest on rozkładany enzymatycznie, a otrzymane fragmenty o
niskiej masie cząsteczkowej są najprawdopodobniej pochłaniane przez makrofagi i trawione
wewnątrz komórki. PCL jest najczęściej stosowany jako nośnik leku, ponieważ ma mniejszą
szybkość degradacji niż PGA i PLA. Jednak ostatnio, coraz częściej znajduje zastosowanie w
inżynierii tkankowej [15] .
Rys. 5 Skafold wykonany z kompozytu polikaprolakton/fosforan wapnia[16].
Tradycyjnie poliuretany były stosowane w dziedzinach biomedycyny jako materiały
przeznaczone do kontaktu z krwią oraz były używane w formie niedegradujących powłok. 22
Ostatnio zyskały one biodegradowalność dzięki kombinacji z degradowalnymi
polimerami takimi jak PLA i są stosowane w inżynierii tkankowej i przeznaczone dla tkanek
miękkich [17].
Rys. 6 Struktury chemiczne biodegradowalnych polimerów syntetycznych stosowane
zręby w inżynierii tkankowej[12].
Glikol polietylenowy (PEG) jest biozgodnym, nietoksycznym, rozpuszczalnym w
wodzie polimerem, który występuje w postaci cieczy w niskich temperaturach, natomiast w
temperaturze 37° C przyjmuje formę elastycznego żelu[18]. Kopolimery bazujące na PEG są
używane jako wstrzykiwane rusztowania kości oraz jako nośniki leków.
2.2. Polimery naturalne
Polimery naturalne stanowią alternatywę dla układów polimerowych syntetycznych,
ponieważ mają one zdolność imitowania matrycy zewnątrzkomórkowej tkanek. Alginian i
chitozan są to dwa naturalne polisacharydy, które nie występują w organizmie człowieka, ale
znalazłe swoje zastosowanie w inżynierii tkankowej, ponieważ są strukturalnie podobne do
glikozaminoglikanów (GAG) występujących w naturalnych matrycach
zewnątrzkomórkowych tkanek, na przykład skóry, kości i naczyń krwionośnych.
Alginian pochodzi z wodorostów i jest atrakcyjnym materiałem ze względu na niską
toksyczność, dużą rozpuszczalność w wodzie oraz prostym mechanizmem żelowania w
obecności jonów wapniowych. Hydrożele alginianowe stosuje w projektowaniu podłoży dla
regeneracji chrząstki [17], wątroby [18], oraz w produkcji opatrunków[21] .
Chitozan jest pochodną naturalnie występującej chityny, która znajduje się w
szkieletach skorupiaków. Ma niską toksyczność i jest biokompatybilny. Skafoldy zbudowane
z chitozanu są wykorzystywane w regeneracji skóry i kości [22].
23
Na podstawie wcześniej podanego znaczenia GAG w stymulowaniu normalnego
wzrostu tkanek, można dojść do prostego wniosku, iż zastosowanie glikozaminoglikanów
jako składników rusztowań dla inżynierii tkankowej wydaje się być dobrym pomysłem.
Kwas hialuronowy jest jednym z największych elementów GAG występującym w
naturalnej matrycy zewnątrzkomórkowej wszystkich tkanek miękkich oraz w mazi
stawowej[23]. Stosowanie czystego kwasu hialuronowego w inżynierii tkankowej jest
ograniczone z powodu jego dużej rozpuszczalności w wodzie i szybkiej degradacji w
środowisku biologicznym. Jednakże, może być on chemicznie modyfikowany w celu
uzyskania bardziej hydrofobowych cząsteczek zmniejszając w ten sposób jego
rozpuszczalność w wodzie. Rusztowania z kwasu hialuronowego są znane jako biozgodne
oraz komórki chętnie adhezują i prolifeują na tym materiale. Kwas hialuronowy odgrywa
również ważną rolę w preparatach usprawniających gojenie się ran oraz jako nośnik
leków[12].
Białka strukturalne, takie jak fibryna mogą być również wykorzystywane w
zastosowaniach inżynierii tkankowej. Fibryna może być stosowana jako naturalny materiał
wspomagający gojenie się ran oraz znalazł swoją rolę w chirurgii jako spoiwa i środek
wiążący. Może być produkowana z własnej krwi pacjenta i użyta jako autologiczny skafold.
Jednakże trwałość tego materiału jest ograniczona, ponieważ łatwo ulega on rozkładowi
(używa się apronityny – inhibitora białkowego, w celu kontroli stopnia degradacji fibryny).
Hydrożele fibrynowe stosowano do inżynierii tkankowej jako podłoża dla komórek mięśni
gładkich i chondrocytów[24,25] .
Alternatywnie żelatynę (pochodną kolagenu, która jest wytwarzana przez zmianę
struktury spiralnej cząsteczki kolagenu, łamiąc ją do cząsteczek pojedynczych nici) używano
w celu regeneracji tkanki chrzęstnej[26]. Jednakże jedną z głównych wad żelatyny jest jej
słaba wytrzymałość mechaniczna.
Kolagen, główny składnik macierzy międzykomórkowej tkanki łącznej ssaków,
znalazł zastosowanie w dziedzinach inżynierii tkankowej jako składnik substytutów skóry,
rusztowań dla kości, chrząstek, zastosowaniach w regeneracji układu naczyniowego oraz w
systemach dostarczania leków[27]. Jak wszystkie wcześniej wymienione polimery naturalne,
żele kolagenowe również charakteryzują się słabymi właściwościami mechanicznymi.
Jednakże, mogą być one ulepszane przez zastosowanie fizycznego i chemicznego
sieciowania. Fizyczne metody sieciowania obejmują promieniowanie UV oraz zabiegi
dehydrotermalne, podczas gdy środki sieciujące, takie jak glutaraldehyd i karbodiimidy
(EDAC) mogą być stosowane do wytwarzania chemicznie usieciowanych hydrożeli
kolagenowych o polepszonych właściwościach mechanicznych[12].
24
Rys. 7 Struktury chemiczne niektórych polimerów naturalnych stosowane jako rusztowania w
zastosowaniach inżynierii tkankowej [12].
3. Kompozyty
Ze względu na pewne problemy związane ze stosowaniem rusztowań
syntetyzowanych z materiałów jednofazowych (np. słabych właściwości mechanicznych i
biokompatybilności, odpowiednio polimerów naturalnych i syntetycznych oraz słabą zdolność
biodegradacji bioceramiki), naukowcy opracowali rusztowania kompozytowe składające się z
dwóch lub większej ilości faz w celu wykorzystania korzystnych właściwości każdego ze
składników. Na przykład zaczęto używać kompozytu polimer/kompozyty ceramiczne z
PLGA i hydroksyapatytu w inżynierii tkankowej [28].
Jednakże, chociaż złożone rusztowania wykazują pewne obiecujące cechy szczególnie jako
wszczepy do kości lub chrząstki, w przypadku ,gdy każdy z nich składa się z co najmniej
jednej fazy, która nie występuje naturalnie w organizmie skutkuje to problemami zarówno z
biokompatybilnością jak i biodegradacją.
25
Tabela 1 podsumowuje różne rodzaje biomateriałów opisanych powyżej i przeznaczonych do
użytku jako rusztowań w inżynierii tkankowej oraz wymienia zalety i wady każdego z nich.
Tab. 1 Właściwości, zalety i wady biomateriałów stosowanych jako rusztowania w inżynierii
tkankowej [12].
26
27
Bioceramika Właściwości Zalety WadyHydroksyapatyt (HAp)
Naturalny składnik mineralnej części kości
Biokompatybilny, Osteoinduktywny
Nieresorbowalny, Słabe właściwości mechaniczne
Fosforan Wapnia (TCP)
W składzie podobny do mineralnej części kości
Biokompatybilny, Biodegradowalny
Słabe właściwości mechaniczne
Polimery syntetycznePolilaktyd, Poliglikoid i ich kopolimery
Właściwości mechaniczne oraz związane z degradacją mogą być modyfikowane poprzez zmianę segmentów polimerów
Biokompatybilne Produkty degradacji (CO2 i H2O) zakwaszają środowisko
Glikol polietylenowy
Używany jako wstrzykiwalny żel, właściwości mechaniczne oraz związane z degradacją mogą być modyfikowane poprzez zmianę segmentów polimerów
Biokompatybilny, Hydrofilowy
Słaba adhezja komórek
Polimery naturalneKolagen Składnik naturalnej matrycy
zewnątrzkomórkowej (ECM)Biokompatybilny, Dobra zgdoność tkankowa
Słabe właściwości mechaniczne
Kwas Hialuronowy
Odgrywa ważną rolę w procesie gojenia ran, Składnik naturalnej matrycy zewnątrzkomórkowej (ECM)
Biokompatybilny, Dobra zgdoność tkankowa
Słabe właściwości mechaniczne
Alginian Otrzymywany z alg, Strukturalnie podobny do glikozoaminoglikanów (GAG)
Biokompatybilny, Łatwe metody żelowania
Słabe właściwości mechaniczne
KompozytyPolimer - Ceramika
Naturalne bądź syntetyczne polimery w połączeniu z ceramiką, Często używane do regeneracji tkanki kostnej
Zdolność do mechanicznego wiązania, degradacji, posiadają właściwości biologiczne
Zrezygnowanie z "najlepszych" cech poszczególnych materiałów na rzecz ogólnych cech skafoldu
Polimer - Polimer
Możliwe kombinacje syntetyczny - syntetyczny, naturalny - naturalny, syntetyczny - naturalny
Zdolność do mechanicznego wiązania, degradacji, posiadają właściwości biologiczne
Zrezygnowanie z "najlepszych" cech poszczególnych materiałów na rzecz ogólnych cech skafoldu
III. Metody wytwarzania porowatych rusztowań dla inżynierii
tkankowej
Ogólnie rzecz biorąc technologie produkcji skafoldów możemy podzielić na procesy,
których używane są porogeny, metody rapid prototyping oraz techniki z użyciem tkanych lub
nietkanych włókien. W pierwszej kategorii ciała stałe lub rozpuszczone w rozpuszczalnikach
są sprzężone z porogenem, którym mogą być gazy, takie jak dwutlenek węgla, ciecze takie
jak woda lub substancje stałe jak parafina. Mieszanki są przetwarzane, następnie formowane
lub wyciskane. Porogeny są usuwane po procesach produkcyjnych z użyciem metod takich
jak, sublimacja, wymywanie, parowanie lub topnienie w celu otrzymania porowatej struktury
skafoldu. Przykładowymi metodami działającymi na tej zasadzie są: formowanie przez
zanurzenie, odlewanie z wymywaniem porogenu, spienianie gazem, liofilizacja oraz rozdział
faz[29]. W drugiej kategorii, hierarchiczne struktury porowate są wytwarzane poprzez kolejne
dostawy materiałów i/lub energii potrzebnej do łączenia tych materiałów w
zaprogramowanych punktach w przestrzeni. Niektóre z tych technologie, takie jak spiekanie
laserowe, stereolitografia oraz drukowanie 3D zależą od precyzyjnego dostarczenia światła
lub energii cieplnej w systemie skanera do punktów w przestrzeni materialnej podłoża, tak
aby połączyć materiały w celu wytworzenia struktury stałej. Inne, takie jak drukowanie
polegają na jednoczesnym dostarczaniu materiałów stałych i wymiennych materiałów
pomocniczych technologią layer-by-layer (warstwa po warstwie) [30]. W trzeciej kategorii,
tkane lub nietkane struktury włókniste, mogą być ustawiane w sztos i łączone ze sobą za
pomocą energii cieplnej lub klejów, w ten sposób tworząc porowatą strukturę technikami
takimi jak formowanie włókien, lub też włókna mogą być wytwarzane techniką
elektroprzędzenia,w której roztwór polimeru przepuszczany jest zwykle przez dyszę
przędzalniczą, na której utrzymuje się wysokie napięcie. Siły odpychania elektrostatycznego
powodują wypuszczenie cienkiej, włóknistej wiązki. Następnie włókna te gromadzone są na
odbieralniku, który uziemiony lub naładowany przeciwnie gromadzi je zamieniając się w
wypełnioną porami sieć[29].
1. Konwencjonalne techniki produkcji rusztowań dla inżynierii
tkankowej
1.1. Odlewanie z roztworu z wymywaniem porogenu
Techniki odlewania z roztworu w wymywaniem cząstek porotwórczych polegają na
stosowaniu roztworu polimeru zmieszanego z cząstkami porogenu o odpowiadającej nam
średnicy. Następnie rozpuszczalnik zostaje odparowany pozostawiając matrycę polimerową z
zatopionymi w niej cząstkami porogenu.
28
W celu pozbycia się porogenu podłoże zanurzamy w roztworze stanowiącym
rozpuszczalnik jedynie dla cząstek porotwórczych (np. w wodzie jeżeli nasz porogen stanowił
NaCl), w celu wymycia porogenu i wytworzenia porowatej struktury[31].
Metoda ta stwarza możliwość wytworzenia silnie porowatych rusztowań, z
porowatością na poziomie 93% i średniej średnicy porów aż do 500 µm.
Rys.8 Schemat techniki odlewania z roztworu z wymywaniem porogenu [32].
1.2 Spienianie gazem
Podczas procesu spieniania gazem, uformowane wcześniej polimery biodegradowalne
sprężane są, w warunkach wysokiego ciśnienia, gazem spieniającym, takim jak dwutlenek
węgla, azotu. Powoduje to zarodkowanie oraz wzrost pęcherzyków gazowych w polimerze o
wielkości w zakresie od 100 do 500 mikrometrów.
Zaletą tej techniki jest brak konieczności stosowania substancji porogennych. Główną
wadę natomiast stanowi brak połączeń między wytworzonymi pęcherzykami oraz
nieporowata powierzchnia zewnętrzna [33].
Rys. 9 Schemat metody spieniania gazem [32].
29
1.3. Separacja faz
Podczas procesu separacji faz, roztwór polimerowy jest ochłodzony i przechodzi
rozdział tworząc dwie fazy. Separację fazową można wywołać w dwojaki sposób:
ochładzając roztwór polimeru lub stosując nierozpuszczalnik dla polimeru. Pierwszą z nich
stanowi fazy bogata w polimer, natomiast drugą jest faza uboga w polimer. Faza bogata w
polimer krzepnie, zaś faza uboga w polimer jest usuwana (na przykład w drodze sublimacji)
pozostawiając silnie porowate podłoże polimerowe[34]. Mikro- i makrostruktura powstałych
skafoldów mogą być modyfikowane poprzez zmiany parametrów procesu, takich jak stężenie
polimeru, czy temperaturę mrożenia.
Proces prowadzi się w niskich temperaturach, dzięki czemu na etapie wytwarzania
można włączać do struktury materiału aktywne biologicznie cząstki. Technika ta umożliwia
formowanie włóknistych nanostruktur , które naśladują naturalną architekturę macierzy
zewnątrzkomórkowej oraz zapewnia lepsza warunki dla przyłączenia się i funkcjonowania
komórek [35].
Rys. 10 Schemat separacji faz [32].
1.4. Formowanie ze stopu
Formowanie ze stopu polega na wypełnianiu formy sproszkowanym polimerem i
składnikiem porogennym, a następnie ogrzewaniu do temperatury powyżej temperatury
zeszklenia polimeru, przy jednoczesnym zastosowaniu nacisku na mieszaninę [36]. W trakcie
procesu wytwarzanie, surowe materiały zwiążą się ze sobą tworząc rusztowanie z
zaprojektowanym specyficznym kształtem wewnętrznym. Po ostygnięciu materiału i
usunięciu go z formy, następnie substancja porotwórcza jest wypłukiwana, a powstałe
porowate rusztowanie suszone.
Proces formowania ze stopu z wypłukiwaniem porogenu jest to proces pozwalający na
niezależną regulacje morfologii i kształtu rusztowania. Dodatkowo nie zachodzi potrzeba
stosowania rozpuszczalników. Jednak wadami tej metody jest możliwość pozostania
szczątkowych ilości porogenu w skafoldzie oraz wysokie temperatury stosowane w trakcie
wytwarzania struktury, które uniemożliwiają przyłączenie bioaktywnych molekuł na etapie
wytwarzania [37].
30
Rys. 11 Schematycznie przedstawiony proces formowania ze stopu[32].
2. Zaawansowane techniki produkcji rusztowań dla inżynierii
tkankowej
2.1. Metody szybkiego wytwarzania (Rapid Prototyping)
Jako alternatywa dla konwencjonalnych metod wytwarzania skafoldów ,
wprowadzono grupę metod opartych na technikach Rapid Prototyping (RP). Techniki oparte
na RP, bazujące na komputerowych technologiach CAM/CAD , ułatwiają kontrolę nad
kluczowymi właściwościami rusztowań, takich jak architektura [38, 39].
Trzy podstawowe systemy typu RP: bazujące na cieczy, ciele stałym, oraz proszku są
oparte na właściwościach różnych materiałów stosowanych do produkcji rusztowań dla
inżynierii tkankowej. Wyróżniamy podstawowe techniki RP stosowane między innymi do
produkcji skafoldów : selektywnego spiekania laserowego (SLS), osadzania topionego
materiału (fused deposition modeling, FDM), drukowania trójwymiarowego (3D). Wybór
materiałów do technik RP obejmuje różne polimery, ceramiki i metale. Ostatnio techniki RP
wykazały również możliwość osadzania na rusztowaniach żywych komórek [40, 41] oraz
czynników wzrostu [42] podczas procesu wytwarzania, co w efekcie udowodniło ich
przydatność w tworzeniu biomimetycznych podłoży tkankowych.
2.2. Elektroprzędzenie
Elektroprzędzenie jest to bardzo wszechstronna metoda, umożliwiająca wytwarzanie
włókien o średnicach rzędu mikro- i nanometrów. Bazuje ona na wykorzystaniu ładunków
elektrycznych w celu wytworzenia włókien. W ciągu ostatnich lat , istotne modyfikacje tej
techniki pozwoliły na stworzenie rusztowań z różnych materiałów, a co za tym idzie
technologia ta zyskała dużą popularność w badaniach inżynierii tkankowej. Architektury
nanowłókniste znane są ze swoich możliwości modulowania właściwości w celu wpływania
na zachowanie komórek. Struktura nanowłóknista może pobudzać przyczepianie i proliferacje
komórek w większym stopniu niż w przypadku struktur mikroporowatych (Rys. 12).
31
Rusztowania z nanowłókien mają większe powierzchnie do adsorpcji białek, stwarzając
więcej punktów wiązania dla receptorów błony komórkowej [43].
Techniki elektroprzędzenia były szeroko wykorzystywane do produkcji porowatych
struktur włóknistych, które mogą naśladować budowę oraz funkcje biologiczne naturalnej
macierzy zewnątrzkomórkowej [44]. Dzięki tej technologii możliwe jest generowanie
włókien o średnicy w zakresie od 2 nm do kilku mikrometrów, z zastosowaniem roztworów
zarówno polimerów syntetycznych jak i naturalnych. Wytwarzane tą metodą rusztowania
charakteryzują się bardzo małą wielkością porów oraz dużym stosunku powierzchni do
objętości[45].
Rys. 12 Wpływ architektury rusztowań na ich właściwości wiążące komórki. (zmienione z [43]).
32
33
Część doświadczalna
34
IV. Charakterystyka materiałów wyjściowych
1. Poli( -kaprolakton)ε
Jako osnowy dla wytwarzanych kompozytów użyto Poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) o
masie cząsteczkowej Mn = 80 kDa i polidyspersyjności Mw/Mn < 2. Miał on postać białych,
twardych i nieregularnych granulek o zróżnicowanej wielkości (rys.13).
Rys. 13 Obraz makroskopowy PCL 80 kDa.
2. Bioszkła otrzymywane w syntezie zol-żel
Do wytworzenia kompozytów zastosowano dwa rodzaje bioaktywnych szkieł
żelowych A2 - wysokowapniowe (rys. 14b) i S2 - wysokokrzemionkowe (rys.14a). Użyte w
badaniach oba rodzaje szkieł zostały otrzymane metodą zol – żel, zgodnie z przedstawionym
w części literaturowej schematem otrzymywanie. Ich skład tlenkowy przedstawiono w
Tabeli 2.
Tab. 2 Skład chemiczny bioszkieł A2 i S2.
Tlenek Stężenie [% mol.]
A2 S2
SiO2 40 80
CaO 54 16
P2O5 6 435
Rys. 14 Obraz makroskopowy bioszkła żelowego S2 (a) oraz A2 (b).
3. Rodzaje porogenów
Celem badania było uzyskanie porowatej struktury wytwarzanych materiałów, aby to
osiągnąć użyto dwóch rodzajów porogenów: sacharozy oraz chlorku sodu (NaCl). Odczynniki
zostały uprzednio odpowiednio przygotowane, aby można było uzyskać odpowiednią
wielkość porów. Potrzebna do naszych celów frakcja ziarnowa mieściła się w zakresie 315 –
400 µm. Zarówno chlorek sodu jak i sacharozę wstępnie rozdrobniono w moździerzu, a
następnie przesiano używając zestawu sit.
36
V. Otrzymywanie porowatego kompozytu PCL/bioszkło żelowe
W początkowej fazie procesu otrzymywania kompozytów sporządzono roztwory PCL
o stężeniu 5% wt/vol z rozpuszczalnikiem, którym w naszym przypadku był 1,4-Dioksan
(DIOX). Próbka kontrolna wykonana została jedynie z roztworu polimeru z
rozpuszczalnikiem oraz odpowiednich porogenów, natomiast przygotowanie próbek
kompozytowych polegało dodatkowo na zmodyfikowaniu właściwości polikaprolaktonu
dodatkiem szkieł bioaktywnych A2 i S2. Stężenie polimeru w każdym roztworze wyjściowym
wynosiło 5% wt/vol. Cząstki szkieł A2 i S2 pochodzenia żelowego dodawano do roztworów
w ilości 21% vol. Każdy z wytworzonych roztworów (PCL+DIOX, PCL/21S2+DIOX,
PCL/21A2+DIOX) podzielono w następnej kolejności na pół ze względu na dwojakość
używanych w późniejszych etapach porogenów.
Odczynniki (PCL, A2, S2) odważano na szalkach Petri’ego, a następnie umieszczane
w szklanych butelkach z nakrętką, do których za pomocą cylindra miarowego pod
dygestorium dodawano lotny rozpuszczalnik. Po umieszczeniu w butelkach teflonowych
elementów mieszających, zostały one szczelnie zamknięte praz umieszczone na mieszadłach
magnetycznych. Proces mieszania roztworów trwał 24 h.
Następnym etapem było dodawanie do każdego z roztworów przypisanego mu
porogenu w ilościach , która miała zapewnić porowatość materiałów na poziomie 85 %.
Proces ten dokonywał się na szalkach Petri’ego za pomocą bagietki. Mieszanie było
długotrwałe, miało bowiem na celu odparowanie lotnego rozpuszczalnika (DIOX) w celu
uzyskania gęstej pasty. Opisane wyżej procesy zostały schematycznie przedstawione na rys.
15 i 16. Po uzyskaniu odpowiedniej konsystencji, każdą z próbek umieszczano w
przygotowanych wcześniej polietylenowych cylindrycznych formach. W tabeli 3
przedstawiono oznaczenia próbek wraz z parametrami ich wytwarzania.
Tab. 3 Oznaczenie próbek wraz z parametrami otrzymywania.
Próbka Porogen Modyfikacja
PCL/DIOX/NaCl NaCl -
PCL/DIOX/Sach. sacharoza -
PCL/DIOX/21A2/NaCl NaCl szkło A2
PCL/DIOX/21A2/Sach. sacharoza szkło A2
PCL/DIOX/21S2/NaCl NaCl szkło S2
PCl/DIOX/21S2/Sach. sacharoza szkło S2
37
W ten sposób po całkowitym odparowaniu rozpuszczalnika metodą suszenia
próżniowego otrzymano walcowe kształtki. Po wyciągnięciu materiałów z form pocięto go
następnie na próbki o grubości około 3 mm, które następnie wielokrotnie płukano w wodzie
destylowanej z pomocą mieszadła magnetycznego w celu wypłukania porogenu do uzyskania
przewodności właściwej wody <10 µS/cm, a następnie ponownie suszono w temp. 37 °C
przygotowując ostatecznie do badań.
Rys. 15 Schemat przygotowywania próbek polimerowych.
38
Rys. 16 Schemat przygotowywanie próbek kompozytowych.
Ostatecznie otrzymano 6 rodzajów porowatych materiałów polimerowych :
PCL/DIOX/NaCl
PCL/DIOX/Sach.
PCL/A2/DIOX/NaCl
PCL/A2/DIOX/Sach.
PCL/S2/DIOX/NaCl
PCL/S2/DIOX/Sach.
39
40
VI. Metody badań
1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
Skaningowy mikroskop elektronowy jest jednym z najbardziej użytecznych urządzeń
umożliwiających badanie mikrostruktury oraz morfologii powierzchni materiałów. Jego idea
polega na skanowaniu powierzchni materiału zogniskowaną wiązką elektronów. Podczas tego
procesu odpowiedni detektor zbiera sygnały emitowane z zeskanowanego punktu próbki. W
tym samym czasie steruje się wiązką monitora. Intensywność obrazu jest modulowana przez
wzmacnianie sygnału wybranego detektora. Powiększenie mikroskopu jest stosunkiem
wielkości pola jednotonalnego obrazu składającego się z drobnych kropek (rastra) monitora
do wielkości pola rastra próbki – uzyskane powiększenie nie wymaga stosowania soczewek.
Mikroskop skaningowy składa się z (rys. 17) :
działa elektronowego, gdzie wytwarzana jest wiązka elektronów,
kolumny, w której następuje przyspieszanie i ogniskowanie wiązki elektronów,
komory próbki, gdzie ma miejsce interakcja elektronów wiązki z próbką,
zestawu detektorów odbierających różne sygnały emitowane przez próbkę,
systemu przetwarzania sygnałów na obraz.
Rys. 17 Schemat skaningowego mikroskopu elektronowego.
Do tworzenia obrazu wykorzystuje się sygnały wtórne, generowane w wyniku
oddziaływania wiązki pierwotnej elektronów z próbką:
elektrony wtórne SE – powstają w wyniku niesprężystych zderzeń elektronów
bombardujących próbkę z elektronami powłok zewnętrznych, a ich ważną cechą
jest zależność ich emisji od kąta padania elektronów pierwotnych, co wykorzystuje
się w badaniach topologii powierzchni;
41
elektrony wstecznie rozproszone BSE - powstają w wyniku zderzeń sprężystych,
do obrazowania powierzchni używa się stosunek ich emisji od liczby atomowej,
dzięki czemu możliwe jest rozróżnianie obszarów o różnym składzie chemicznym;
promienie rentgenowskie – w wyniku wybicia elektronu z wewnętrznej powłoki i
przeskoku elektronu z poziomu o wyższej energii na miejsce tego z powłoki
zewnętrznej wydzielana jest energia, czemu towarzyszy emisja promieniowania
rentgenowskiego; energia i długość fali tego promieniowania są charakterystyczne
dla poszczególnych pierwiastków, co umożliwia analizę składu chemicznego w
mikroobszarach.
Badanie mikrostruktury otrzymanych próbek z wykorzystaniem SEM przeprowadzono
w Laboratorium Mikroskopii Skaningowej i Mikroanalizy Wydziału Inżynierii Materiałowej i
Ceramiki AGH. Próbki przeznaczone do badania napylono cienką warstwą węgla. Analiza
powierzchni próbek została wykonana za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego
NanoSEM FEI, USA z analizatorem EDS (EDAX).
2. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC)
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC – differentia scanning calorimetry) to
obecnie najpowszechniej wykorzystywana technika termoanalityczna. Istotą pomiaru jest
uzyskanie różnicy pomiędzy ciepłem przepływającym przez komorę z próbką oraz przez
drugą komorę z materiałem wzorcowym, poddanym tym samym temperaturom.
Oznaczenia techniką DSC dostarczają danych odnośnie efektów termicznych
opisywanych zmianą entalpii oraz zmianami temperatury, jak topnienie, krystalizacja,
przejście fazowe solid-solid oraz reakcje chemiczne.
W różnicowych kalorymetrach skaningowych obie próbki umieszczane są w
jednakowych naczynkach pomiarowych symetrycznie we wspólnym piecu, którego
temperatura jest regulowana w sposób niezależny od zmian właściwości próbek w czasie
pomiaru, zgodnie z założonym programem temperaturowym. Gdy piec kalorymetru jest
ogrzewany, a układ jest symetryczny cieplnie, do obu próbek płynie taki sam strumień ciepła,
różnica ich temperatur wynosi wówczas zero.
Gdy stan równowagi termodynamicznej zostaje zakłócony przemianą w próbce lub
gdy istnieje asymetria cieplna układu powodowana różnicą pojemności cieplnej próbek,
obserwujemy różnicę temperatur proporcjonalną do różnicy strumieni cieplnych do próbki i
do próbki odniesienia.
42
Rys. 18 Schemat skaningowego kalorymetru różnicowego.
Z każdego z otrzymanych materiałów przygotowano próbki o wadze 10 mg, które
następnie umieszczono w aluminiowych, jednorazowych tyglach do badań DSC zamykając za
pomocą specjalnej prasy. Pomiary przeprowadzono przy temperaturze początkowej równej
20°C, z szybkością grzania 10°C/min osiągając temperaturę końcową równą 80°C. Analiza
została wykonana przy użyciu kalorymetru różnicowego Perkin Elmer DSC 7.
43
44
VII. Charakterystyka otrzymanych rusztowań.
1. Charakterystyka makroskopowa rusztowań.
Otrzymano dwa rodzaje rusztowań dla inżynierii tkankowej – skafoldy z czystego
polimeru (PCL) oraz skafoldy kompozytowe, o osnowie polimerowej z dwoma rodzajami
szkła żelowego (wysokowapniowego - A2, wysokokrzemionkowego - S2). Pomiędzy
obiema grupami rusztowań nie występowały istotne różnice dające się zaobserwować na
poziomie makroskopowym (Rys. 19). Dalsza analiza pozwoliła jednak stwierdzić, iż
materiały wytworzone z czystego polimeru są bardziej sprężyste oraz mniej spójne od
tych z dodatkiem bioszkieł (niezależnie od rodzaju bioszkła), a co za tym idzie
charakteryzowały się mniejszą od nich wytrzymałością mechaniczną (bardzo łatwo
ulegały zniszczeniu).
Otrzymane skafoldy różniły się również użytymi do ich produkcji porogenami. Jednak
obserwując jedynie budowę makroskopową nie było możliwym stwierdzenie
jakichkolwiek różnic wynikających z tego faktu.
45
Rys. 19 Obraz makroskopowy otrzymanych rusztowań z PCL bez dodatku bioszkła oraz
kompozytowych, w których matryce stanowi PCL.
2. Charakterystyka mikroskopowa rusztowań – SEM/EDX.
Przeprowadzone badanie z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego
miało na celu analizę zmian mikrostruktury otrzymanych skafoldów w zależności od
zastosowanych materiałów (dodatki szkieł żelowych) oraz rodzaju porogenu. Dokonano
również analizy składu pierwiastkowego próbek kompozytowych, co pomogło nam określić
miejsce występowania cząstek bioszkła, dokonano ich zarówno dla określonych punktów jak i
całych obrazów (rys.20-26).
Z analizy porównawczej przedstawionych w tabeli nr 4 mikrofotografii możemy
stwierdzić, iż zarówno dodatek szkła jak i rodzaj zastosowanego porogenu miały duży wpływ
na wielkość oraz kształt porów jak i na ogólne rozwinięcie powierzchni skafoldów.
I tak w przypadku próbek z czystego PCL na obrazach widzimy wyraźnie duże pory,
jednak ogólne rozwinięcie powierzchni materiału jest o wiele mniejsze niż w przypadku
próbek kompozytowych. W ich przypadku oprócz porów występujących również w czystym
PCL obserwujemy także dużą ilość mniejszych porów występujących na ściankach większych
porów. Świadczy to o pozytywnym wpływie dodatków szklanych na ogólną mikrostrukturę
rusztowań, głównie ze względu na ich funkcjonalność – im większa porowatość, połączenie
porów i rozwinięcie powierzchni materiałów, tym łatwiejsza adhezja, proliferacja oraz
odżywianie komórek. Na podstawie mikrofotografii SEM można różwnież zauważyć, iż
materiały kompozytowe odznaczają się niższą porowatością, a także zmniejszoną wielkością
porów w stosunku do materiałów polimerowych.
Również w przypadku zastosowanych porogenów widać wyraźną różnicę w charakterze
porowatości otrzymanych materiałów. Mianowicie pory uzyskane przez użycie NaCl są o
wiele większe i wyraźniejsze od tych wytworzonych przez sacharozę mimo jednakowej
średnicy początkowej ziaren obu rodzajów porogenów (315-400 µm) Może to świadczyć o
lepszych właściwościach porotwórczych chlorku sodu. Jednak w przypadku materiałów
uzyskanych z użyciem sacharozy można zauważyć znacznie większą porowatość ścian
dużych porów. Ponadto wydaje się, iż materiały uzyskane przez zastosowanie sacharozy jako
porogenu, posiadają wyższe rozwinięcie powierzchni w stosunku do materiałów, w których
porowatość uzyskano stosując chlorek sodu.
Na mikrofotografiach próbek pobranych ze skafoldów kompozytowych widzimy
wyraźnie widoczne ziarna bioszkieł zatopione w matrycy polimerowej. Ma to wpływ na
umocnienie struktury rusztowania. Punkty z widocznymi ziarnami zostały poddane
porównawczej analizie EDX (rys.20-26).
46
Tab. 4 Mikrofotografie SEM próbek wszystkich otrzymanych materiałów.
47
PC
L/D
IOX
/NaC
lP
CL
/DIO
X/S
ach
PC
L/A
2/D
IOX
/NaC
lP
CL
/A2/
DIO
X/S
ach
PC
L/S
2/D
IOX
/NaC
lP
CL
/S2/
DIO
X/S
ach
.
Rys.20 Uśredniona mikroanaliza PCL/A2/DIOX/NaCl
Rys. 21 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 22 Mikroanaliza Punktu 2
48
Rys.23 Uśredniona mikroanaliza PCL/A2/DIOX/Sach.
Rys. 24 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 25 Mikroanaliza Punktu 2.
49
Rys. 26 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 27 Mikroanaliza Punktu 2.
Rys.28 Uśredniona mikroanaliza PCL/S2/DIOX/Sach.
50
Rys. 29 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 30 Mikroanaliza Punktu 2.
Na podstawie analizy składu pierwiastkowego próbek pobranych ze skafoldów
kompozytowych możemy wywnioskować, iż w miejscach w których widzimy podwyższoną
ilość krzemu, wapnia i fosforu (pierwiastki pochodzące od szkła) znajdują się ziarna bioszkieł
żelowych. W przypadku szkła A2 zawartość krzemu jest znacznie mniejsza niż wtedy, gdy
mamy do czynienia ze szkłem S2, co potwierdza różnice składu zastosowanych szkieł. Punkty
o podwyższonej zawartości węgla świadczą o przeważającej obecności polimeru. Na
załączonych mikrofotografiach kompozytów widać, iż cząstki szkieł są równomiernie
rozmieszczone w matrycy polimerowej, a także w niej zatopione (Rys. 28).
51
3. Charakterystyka właściwości mechanicznych – DSC.
Na rysunku 31 przedstawiono termogram DSC wykonany dla każdego otrzymanego w
trakcie badań rodzaju skafoldu. W tabeli 5 zestawiono wielkości wyznaczone na podstawie
zarejestrowanych krzywych termograficznych DSC – temperaturę oraz entalpię topienia, a
także stopień krystaliczności PCL.
Z wyników badań termicznych otrzymanych materiałów wynika, iż dodatek cząstek
szkła do matrycy polimerowej powoduje obniżenie stopnia krystaliczności PCL.
Prawdopodobnie zjawisko to związane było z obecnością cząstek w matrycy polimerowej,
które ograniczają mobilność łańcuchów polimeru, a tym samym zdolność do przegrupowania
i rekrystalizacji. Krystaliczność wszystkich materiałów kompozytowych była na zbliżonym
poziomie, co świadczy o tym, iż skład chemiczny szkła nie wpływa na opisywany parametr.
Porównując stopień krystaliczności zarówno materiałów polimerowych, jak również
kompozytowych wytworzonych z użyciem różnych porogenów, również można stwierdzić, iż
rodzaj porogenu nie wpływa w istotny sposób na krystaliczność PCL. Temperatura topienia,
niezależnie od dodatku i składu cząstek szkła, a także zastosowanego porogenu nie ulega
istotnym zmianom. To z kolei mogło świadczyć o tym, iż cząstki bioaktywnego szkła oraz
porogenów nie wpływają na zmianę długości łańcuchów polimeru (masę cząsteczkową PCL),
a także na wielkość i stopień uporządkowania obszarów krystalicznych PCL.
Rys. 31 Termogramy DSC dla wszystkich próbek.
52
Tab. 5 Temperatura topienia, entalpia topienia oraz stopień krystaliczności osnowy
polimerowej otrzymanych materiałów.
Próbka Temperatura
topnienia
Tm [°C]
Entalpia
(topienia)
ΔHm (J/g)
Stopień
krystaliczności
[%]
PCL/DIOX/NaCl 64 51,46 39,6
PCL/DIOX/Sach. 64,5 59,45 42,6
PCL/A2/DIOX/NaCl 64,2 25,7 18,4
PCL/A2/DIOX/Sach. 63,2 21,48 15,4
PCL/S2/DIOX/NaCl 63,8 27,59 19,8
PCL/S2/DIOX/Sach. 64,2 26,45 19
53
54
Podsumowanie i wnioski
Celem przeprowadzonych badań było wytworzenie było otrzymanie kompozytowych
rusztowań dla inżynierii tkankowej, których osnowę stanowi polimer PCL o masie
cząsteczkowej Mn = 80 kDa. Fazą modyfikującą kompozytu są ziarna wysokowapniowego
bioaktywnego szkła pochodzenia żelowego o składzie SiO2 – 40% mol, CaO – 54% mol, P2O5
– 6% mol oraz wysokokrzemionkowego szkła pochodzenia żelowego o składzie SiO2 – 80%
mol, CaO – 16% mol, P2O5 – 4% mol, stanowiące 21% objętości kompozytu. Materiał
otrzymano w postaci porowatych rusztowań 3D metodą odlewania z roztworu z
wymywaniem porogenu. Pory otrzymano z użyciem dwóch rodzajów porogenów – NaCl i
sacharozy.
Ocena makroskopowa otrzymanych materiałów nie wykazała znaczących różnic
pomiędzy otrzymanymi skafoldami w zależności od użytego szkła, czy też porogenu. Jednak
rusztowania otrzymane za czystego polimeru wyraźnie różniły się od kompozytowych
wytrzymałością oraz elastycznością. Okazały się być znacznie mniej trwałe. Natomiast
badania mikrostruktury, a także stopnia krystaliczności osnowy wykazała istotne różnice
pomiędzy otrzymanymi materiałami, głównie pomiędzy wytworzonymi z czystego PCL, a
kompozytowymi, rodzaj użytego porogenu również okazał się mieć duże znaczenie.
Architekturę (kształt, wielkość, rozmieszczenie i połączenie porów) oraz morfologię
powierzchni otrzymanych materiałów badano metodą skaningowej mikroskopii elektronowej
SEM. Do oceny rozmieszczenia cząstek szkła w matrycy polimerowej dodatkowo użyto
analizatora widma promieniowania rentgenowskiego EDS. Badania mikroskopowe wykazały,
iż zarówno rodzaj użytego szkła do modyfikacji matrycy polimerowej, jak i rodzaj użytego
porogenu mają duży wpływ na architekturę i morfologię powierzchni materiału. Pory
otrzymane za pomocą chlorku sodu okazują się być widocznie większe od tych
pozostawionych po wypłukaniu cząstek sacharozy, co mogłoby sugerować, iż jest on lepszym
porogenem. Jednak przy głębszej analizie widzimy iż rozwinięcie powierzchni materiału,
ilość małych porów w ścianach tych większych oraz połączenie między porami jest znacznie
lepsze w przypadku, gdy substancją porotwórczą była sacharoza. Natomiast w przypadku
użycia szkła o różnym składzie chemicznym (A2 lub S2) mikrostruktura materiałów
kompozytowych nie jest znacząco różna, zarówno w przypadku szkła
wysokokrzemiankowego (S2) jak i wysokowapniowego (A2) widzimy wyraźne cząstki
bioszkła równomiernie rozmieszczone i zatopione w matrycy polimerowej. Potwierdza to, iż
metoda odlewania z roztworu z wymywaniem porogenu pozwala na uzyskanie jednorodnych
materiałów kompozytowych modyfikowanych cząstkami bioszkła o wielkości <50 µm.
Analiza EDS powierzchni skafoldów jednoznacznie pokazuje miejsca występowania ziaren
bioszkła, dzięki znacznie podwyższonej ilości krzemu (w przypadku szkła
wysokokrzemionkowego) oraz wapnia (szkło wysokowapniowe).
55
Badanie termiczne DSC, którym poddano wszystkie otrzymane próbki, nie wykazało
znacznego wpływu dodanych szkieł oraz rodzaju użytego porogenu na temperaturę topnienia
kompozytów. Może to świadczyć o tym, iż zarówno dodatek szkła oraz porogenu nie ma
wpływu na długość łańcuchów polimeru polimeru, a także na zmianę wielkości oraz
uporządkowania obszarów krystalicznych PCL.
Zauważono jednak spadek stopnia krystaliczności PCL pod wpływem modyfikacji
cząstkami bioszkieł. Skład pierwiastkowy użytego szkła oraz rodzaj użytego porogenu nie
miał jednak na to większego wpływu o czym świadczyła zbliżona wartość stopnia
krystaliczności wszystkich badanych kompozytów. Zmniejszenie stopnia krystaliczność PCL
może być skutkiem ograniczenie możliwości do przemieszczania się łańcuchów
polimerowych przez obecność ziaren szkła, co z kolei utrudniało porządkowanie łańcuchów
PCL.
Na podstawie otrzymanych wyników badań można stwierdzić, iż porowate
rusztowanie kompozytowe PCL/bioaktywne szkło żelowe, jest obiecującym materiałem,
który potencjalnie może zostać użyty w zastosowaniach inżynierii regeneracyjnej. Wymagają
one jednak dalszych badań między innymi wytrzymałościowych, a także stopnia
bioaktywności i odpowiedzi komórkowej w celu określenia konkretnej użyteczności
materiału.
56
Bibliografia[1] Fergal J. O’Brien „Biomaterials and scaffolds for tissues engineering”, Materials Today,
March 2011, vol.14, no. 3.
[2] Y.Tabata “Recent progress in tissue engineering” DrugDiscovery Today, Vol.6, Issue 9,
(2001), p. 483-487.
[3] R. Langer, J.P. Vacanti “Tissue engineering” Science Vol. 260, no. 5110, (1993), p.920-
926
[4] Rui L. Reis “Tissue engineering: The essential elements” 3B’s Research
GroupBiomaterials, Biodegradables and Biomimetics. University of Minho, Campus de
Gualtar. Posrtugal.
[5] Anna Kaznica, Romana Joachimiak, Tomasz Drewa, Tomasz Rawo, Jaroslaw
Deszczynski, „New trends in tissue engineering” , Arthroscopy and Joint Surgery, 2007; 3(3):
11-16.
[6] E. Sachlos and J.T. Czernuszka “Making tissue engineering scaffolds work. Review on the
application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineerings
scaffolds.” European Cells and Materials Vol. 5. 2003 (pages 29-40).
[7] Yang S., Leong K.F., Du Z., Chua C., The Design of Scaffolds for Use in Tissue
Engineering. Part I.
Traditional Factors, Tissue Eng, 2001, vol.7, pp.679- 689.
[8] Brett C. Isenberg and Joyce Y. Wong “Building structure into engineered tissues” ,
Materials Today, December 2006, vol.9 , no. 12.
[9] B. P. Chan, K. W. Leong “Scaffolding in tissue engineering: general approaches
and tissue-specific considerations” Eur Spine J (2008) 17 (Suppl 4):S467–S479.
[10] Byung-Soo Kim, Carlos E. Baez, Anthony Atala, “Biomaterials for tissue engineering”
, World J Urol (2000) 18: 2±9.
[11] K. A. Hing,” Bioceramic bone graft substitutes:Influence of porosity and chemistry”,
Int. J. Appl. Ceram. Technol., 2 (2005), 184-199.
[12] S. Partap, F. Lyons, F.J. O’Brien, “Scaffolds & Surfaces” , Chapter 5. Biomaterials and
Tissue Engineering
[13] Blażewicz J. i inni: „Biocybernetyka i inżynieria biomedyczna”, 2000, tom 4.
Akademicka Oficyna Wydawnicza Elit, Warszawa 2003
[14] Koch W, Holthausen MC. A Chemist’s guide to Density Functional Theory, Wiley-VCH,
2000.
57
[15] L. Savarino, N. Baldini, M. Greco, O. Capitani, S. Pinna, S. Valentini, B. Lombardo, M.
T. Esposito, L. Pastore, L. Ambrosio, S. Battista, F. Causa, S. Zeppetelli, V. Guarino and P.
A. Netti, “The performance of poly-epsilon-caprolactone scaffolds in a rabbit femur model
with and without autologous stromal cells and bmp4” Biomaterials 28 (2007), 3101-9.
[16] M. J. Mondrinos, R. Dembzynski, L. Lu, V. K. Byrapogu, D. M. Wootton, P. I. Lelkes
and J. Zhou, “Porogen-based solid freeform fabrication of polycaprolactone-calcium
phosphate scaffolds for tissue engineering” Biomaterials 27 (2006), 4399-408.
[17] A. S. Rowlands, S. A. Lim, D. Martin and J. J. Cooper-White,
“Polyurethane/poly(lactic-co-glycolic) acid composite scaffolds fabricated by thermally
induced phase separation”, Biomaterials 28 (2007), 2109-21.
[18] P. J. Martens, S. J. Bryant and K. S. Anseth, “Tailoring the degradation of hydrogels
formed from multivinyl poly(ethylene glycol) and poly(vinyl alcohol) macromers for cartilage
tissue engineering “, Biomacromolecules 4 (2003), 283-92.
[19] W. J. Marijnissen, G. J. van Osch, J. Aigner, S. W. van der Veen, A. P. Hollander, H. L.
Verwoerd-Verhoef and J. A. Verhaar,” Alginate as a chondrocyte-delivery substance in
combination with a non-woven scaffold for cartilage tissue engineering”, Biomaterials 23
(2002), 1511-7.
[20] J. Yang, M. Goto, H. Ise, C. S. Cho and T. Akaike, “Galactosylated alginate as a scaffold
for hepatocytes entrapment” Biomaterials 23 (2002), 471-9.
[21] D. Bettinger, D. Gore and Y. Humphries, “Evaluation of calcium alginate for skin graft
donor sites”, J Burn Care Rehabil 16 (1995), 59-61.
[22] C. Mao, J. J. Zhu, Y. F. Hu, Q. Q. Ma, Y. Z. Qiu, A. P. Zhu, W. B. Zhao and J. Shen,”
Surface modification using photocrosslinkable chitosan for improving hemocompatibility”,
Colloids Surf B Biointerfaces 38 (2004), 47-53.
[23] J. L. Drury and D. J. Mooney, “Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design
variables and applications”, Biomaterials 24 (2003), 4337-4351.
[24] C. L. Cummings, D. Gawlitta, R. M. Nerem and J. P. Stegemann, “Properties of
engineered vascular constructs made from collagen, fibrin, and collagen-fibrin mixtures”,
Biomaterials 25 (2004), 3699-706.
[25] C. J. Hunter, J. K. Mouw and M. E. Levenston,” Dynamic compression of chondrocyte-
seeded fibrin gels: Effects on matrix accumulation and mechanical stiffness”, Osteoarthritis
Cartilage 12 (2004), 117-30.
[26] M. S. Ponticiello, R. M. Schinagl, S. Kadiyala and F. P. Barry, “Gelatin-based resorbable
sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration
therapy”, J Biomed Mater Res 52 (2000), 246-55.
58
[27] V. Yannas and J. F. Burke, “Design of an artificial skin. I. Basic design principles”, J
Biomed Mater Res 14 (1980), 65-81.
[28] S. S. Kim, M. Sun Park, O. Jeon, C. Yong Choi and B. S. Kim, “Poly(lactide-co-
glycolide)/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering”, Biomaterials 27
(2006), 1399-409.
[29] Yang S, Leong KF, Du Z, Chua CK.” The design of scaffolds for use in tissue
engineering: Part II. Rapid prototyping techniques.” ,Tissue Eng. 2002;8(1):1–11.
[30] Hollister SJ. “Porous scaffold design for tissue engineering.” Nat Mater. 2005;4(7):518–
524. doi: 10.1038/nmat1421.
[31] Mikos AG, Thorsen AJ, Czerwonka LA, Bao Y, Langer R, Winslow DN, “ Preparation
and characterization of poly(L-lactic acid) foams.” , Polymer 1994 1994;35(5):1068-1077.
[32] Puppi D, Chiellini F, Piras AM, Chiellini E., “ Polymeric materials for bone and cartilage
repair.” Progress in Polymer Science 2010 Apr;35(4):403-440.
[33] Quirk RA, France RM, Shakesheff KM, Howdle SM.” Supercritical fluid technologies
and tissue engineering scaffolds.” Current Opinion in Solid State & Materials Science 2004
Jun-Aug;8(3-4):313-321.
[34] Lee KWD, Chan PK, Feng XS.” Morphology development and characterization of the
phase-separated structure resulting from the thermal-induced phase separation phenomenon in
polymer solutions under a temperature gradient.”, Chemical Engineering Science 2004
Apr;59(7):1491-1504.
[35] Ma PX, Zhang RY. “Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix.” Journal of
Biomedical Materials Research 1999 Jul;46(1):60-72.
[36] Thomson RC, Wake MC, Yaszemski MJ, Mikos AG.” Biodegradable polymer scaffolds
to regenerate organs.” Advances in Polymer Science 1995: 245-274.
[37] Prof. Xiongbiao Chen "Advances in Biomaterials Science and Biomedical Applications",
book edited by Rosario Pignatello, ISBN 978-953-51-1051-4, Published: March 27, 2013
under CC BY 3.0 license. © The Author(s).
[38] Peltola SM, Melchels FPW, Grijpma DW, Kellomaki M.” A review of rapid prototyping
techniques for tissue engineering purposes.” Annals of Medicine 2008;40(4):268-280.
[39] Yeong WY, Chua CK, Leong KF, Chandrasekaran M. ”Rapid prototyping in tissue
engineering: challenges and potential. “, Trends in Biotechnology 2004 Dec;22(12):643-652.
[40] Khalil S, Sun W. “Bioprinting endothelial cells with alginate for 3D tissue constructs.”,
Journal of Biomechanical Engineering-Transactions of the ASME 2009 Nov;131(11).
59
[41] Mironov V, Kasyanov V, Drake C, Markwald RR. “Organ printing: promises and
challenges.”, Regenerative Medicine 2008 Jan;3(1):93-103.
[42] Yu D, Li Q, Mu X, Chang T, Xiong Z., “ Bone regeneration of critical calvarial defect in
goat model by PLGA/TCP/rhBMP-2 scaffolds prepared by low-temperature rapid-prototyping
technology.” , International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 2008 Oct;37(10):929-
934
[43] Stevens MM, George JH.,” Exploring and engineering the cell surface interface.”,
Science 2005 Nov 18;310(5751):1135-1138.
[44] Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S., “ A review on polymer nanofibers by
electrospinning and their applications in nanocomposites.”, Composites Science and
Technology 2003 Nov;63(15):2223-2253.
[45] Pham QP, Sharma U, Mikos AG., “ Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue
engineering applications: A review. “, Tissue Engineering 2006 May;12(5):1197-1211.
60