Próba syntezy multimerycznej formy aktywnego analogu Próba syntezy multimerycznej formy aktywnego analogu lamininy YIGSRlamininy YIGSR

Marta SowińskaMarta SowińskaPraca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów pod kierunkiem dr Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów pod kierunkiem dr

Ewy WitkowskiejEwy Witkowskiej

CEL PRACY

Celem pracy była synteza w roztworze – przy wykorzystaniu strategii tworzenia dendrymeru - multimerycznej formy aktywnego analogu lamininy YIGSR, w której do specjalnego rusztowania (tzw. rdzenia) przyłączone są cztery reszty pentapeptydowe Dat-Ile-Gly-Ser-Har. Spodziewamy się, że taka multimeryczna struktura będzie wykazywać zwiększone właściwości adhezyjne w porównaniu do formy monomerycznej dzięki poliwalentnemu oddziaływaniu z receptorami. Wybór pentapeptydu Dat-Ile-Gly-Ser-Har jako związku poddawanego multimeryzacji, spośród innych zsyntetyzowanych dotychczas analogów lamininy YIGSR, wynika z jego zwiększonej aktywności adhezyjnej i odporności na degradację enzymatyczną.

Lys - DAB - Lys

BocLys(Fmoc)

BocLys(Fmoc)

BocLys(Fmoc)

BocLys(Fmoc)

Lys - DAB - Lys

Lys(Fmoc)

Lys(Fmoc)

(Fmoc)Lys

(Fmoc)Lys

Lys - DAB - Lys

BocLys

BocLys

LysBoc

LysBoc

Lys - DAB - Lys

BocSer(Bzl)-Lys(Fmoc)

BocSer(Bzl)-Lys(Fmoc)

(Fmoc)Lys-Ser(Bzl)Boc

(Fmoc)Lys-Ser(Bzl)Boc

Lys - DAB - Lys

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Fmoc)

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Fmoc)

(Fmoc)Lys-Ser(Bzl)-Gly-Ile-Dat

(Fmoc)Lys-Ser(Bzl)-Gly-Ile-Dat

Lys - DAB - Lys

Lys - DAB - Lys

[Z(2-Br)]Har-Ser(Bzl)-Gly-Ile-Dat

Z(2-Br)]Har-Ser(Bzl)-Gly-Ile-Dat

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Har[Z(2-Br)]

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Har[Z(2-Br)]

Lys - DAB - Lys

Har-Ser-Gly-Ile-Dat

Har-Ser-Gly-Ile-Dat

Dat-Ile-Gly-Ser-Har

Dat-Ile-Gly-Ser-Har

(1:1:48)

BocHar[Z(2-Br)]

Lys - DAB - Lys

[(2-Br)Z]HarBoc

[(2-Br)Z]HarBoc

BocHar[Z(2-Br)]

BocSer(Bzl)-Har[Z(2-Br)]

Lys - DAB - Lys

[(2-Br)Z]Har-Ser(Bzl)Boc

[(2-Br)Z]Har-Ser(Bzl)Boc

BocSer(Bzl)-Har[Z(2-Br)]

BocLys(Z)*DCHA

HCl*Lys(Z)OMe

BocSer(Bzl)Lys(Z)OMe

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)Lys(Z)OMe

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)LysOMe

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Har[Z(2-Br)]OMe

Dat-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Har[Z(2-Br)]OH

Dat-Ile-GlyOMe

BocIle-GlyOMe

HCl*GlyOMe

NH2

NH2

DAB

BocLys(Fmoc) 4 ekw.

H / Pd - C

S

[(o-Br)Z]HN N[Z(o-Br)]

CH3

S

[(o-Br)Z]HN N[Z(o-Br)]

CH3

2

2. 20% HCl/MeOH

BocSer(Bzl)

HBTU, HOBt, TEA

1. TFA2. Dat-Ile-GlyOH

HBTU, HOBt, TEA

S

[(o-Br)Z]HN N[Z(o-Br)]

CH3

DMAP, DMF

NaOH/dioksan

Lys - DAB - Lys

HBTU, HOBt, TEA

NaOH/dioksan

HBTU, HOBt, TEA

HBTU, HOBt, TEA

1. 1N H2SO4

H2 / Pd - C

NH3

O

NH2

NH2OH

Boc 2O, 2 ekw.

NaOH, H2Ot - BuOHLys

1. BocLys(Boc) 2 ekw.

HBTU, HOBt, TEA

HBTU, HOBt, TEA

4 ekw

2. BocSer(Bzl) 4 ekw.

HBTU, HOBt, TEA

HBTU, HOBt, TEA

2. Dat-Ile-GlyOH 4 ekw.

HBTU, HOBt, TEA

BocSer(Bzl) 4 ekw.

HBTU, HOBt, TEA

2. Dat-Ile-GlyOH 4 ekw.

4 ekw.

DROGA 1 DROGA 2

DROGA 3

1. TFA

1. TFA

DMAP DMF

piperydyna/DBU/DMF

2. TFA

TFA

1. TFA

DMAP, DMF

1. TFA

BocIle

2. Dat

Model docelowego peptydu zaprojektowany w programie HyperChem

SYNTEZA i WNIOSKI

Podjęłam próbę syntezy tego peptydu na trzech drogach (przedstawionych na schemacie) przy wykorzystaniu strategii stosowanych w syntezie dendrymerów.Otrzymane pośrednie produkty oczyszczałam za pomocą różnych metod chromatograficznych: cieczowej, wykluczania, preparatywnej.Poprawność otrzymanych produktów potwierdzałam za pomocą spektrometrii mas, hydrolizy oraz temp. topnienia.

Reakcje sprzęgania na drogach 1 i 2 przebiegają z małymi wydajnościami. Spowodowane to jest prawdopodobnie zawadą przestrzenną wprowadzaną przez osłony grup funkcyjnych w łańcuchach bocznych aminokwasów. Obserwuje się również na tych drogach trudności w całkowitej deprotekcji osłon Fmoc.Na wydajność reakcji duży wpływ ma rodzaj zastosowanej metody sprzęgania.

WPROWADZENIE

Niepowodzenia w leczeniu nowotworów są spowodowane nadzwyczajną liczbą i złożonością mechanizmów prowadzących do wystąpienia tych chorób. Poznanie i zrozumienie procesów komórkowych jest niezbędne dla opracowania leków skierowanych wybiórczo w stosunku do czynników odpowiedzialnych za inwazyjność nowotworów. Jednym z etapów powstawania przerzutu nowotworu jest migracja komórek nowotworowych przez błony podstawne. Wiązanie komórek nowotworowych przez białka adhezyjne, m. in. lamininę, powoduje ich zakotwiczenie w błonie.

Schemat budowy dendrymerów o różnej generacji przenoszących reszty peptydowe.

Schemat syntezy peptydu na trzech drogach:

Proces ten jest uznawany za etap krytyczny w tworzeniu przerzutu, gdyż umożliwia zapoczątkowanie inwazji komórek nowotworowych na odległe organy. Wykazano, że wyizolowany z lamininy pentapeptyd o sekwencji YIGSR ma zdolność inhibicji rozwoju nowotworu i jego przerzutów, w związku z czym może znaleźć potencjalne zastosowanie w walce z tą chorobą. Możliwość wykorzystania peptydu YIGSR jako antynowotworowego leku wiąże się z pokonaniem różnych barier, wynikających z warunków stawianych lekom. Lek przede wszystkim powinien oddziaływać w organizmie ze swym docelowym obiektem w sposób możliwie silny oraz musi być w stanie do tego obiektu dotrzeć. Biorąc pod uwagę te wymagania dąży się do otrzymania analogu peptydu YIGSR, który wykazywałby jak największą aktywność adhezyjną oraz odporność na degradację enzymatyczną. Duże możliwości na tej płaszczyźnie stwarza zastosowanie strategii tworzenia dendrymeru.Dendrymery są wysoce rozgałęzionymi, monodyspersyjnymi makrocząsteczkami, których przestrzenna struktura przypomina budowę drzewa (stąd nazwa cząsteczek, od greckiej nazwy drzewa – dendron).Wszystkie dendrymery posiadają w swoim centrum rdzeń, do którego warstwami przyłączone są rozgałęzione monomery. Im więcej jest warstw monomerów, tym wyższa jest tzw. generacja dendrymeru.Konsekwencją takiej budowy jest obecność licznych grup funkcyjnych na powierzchni, które mogą posłużyć m. in. do przyłączenia aktywnych peptydów. Poprzez fakt, że jedna cząsteczka dendrymeru może na swojej powierzchni przenosić wiele cząsteczek bioaktywnego peptydu, uzyskuje się intensyfikację efektu terapeutycznego.