TECHNIKI OCZYSZCZANIA I

ANALIZY BIAŁEK

PLANOWANIE PROCESU OCZYSZCZANIA BIAŁKA

Parametry, które trzeba wziąć pod uwagę przy planowaniu procesu oczyszczania

Ilość pożądanego bia łka:Pełna analiza w łaściwości, ustalanie struktury 100 – 200 mgBadania kinetyczne 5 – 10 mgOtrzymanie przeciwcia ła poliklonalnego 500 gMikrosekwencjonowanie 10 g

Czystość preparatu końcowegoOtrzymywanie przeciwcia ła monoklonalnego 50%Otrzymywanie przeciwcia ła poliklonalnego >99%Analiza sekwencyjna >95%Badania kinetyczne brak czynników interferujących

Zachowanie aktywności biolog icznejBadania kinetyczne konieczneSekwencjonowanieOtrzymywanie przeciwcia ł nieistotne

Dotychczasowy stan wiedzy o bia łkuLokalizacja wewnątrz- lub pozakomórkowa; umiejscowienie w organelachStabilność, wrażliwość na zmiany pH, proteolizę, wymagania co do kofaktorówBia łko proste czy złożone (może być glikoproteiną, lipoproteiną itp.)

Koszt Szczególnie istotny przy produkcji przemysłowej

Szybkość procesu oczyszczania Dąży się do jak najmniejszej ilości etapówSzczególnie ważne dla bia łek niestabilnych

Podczas oczyszczania enzymu należy mierzyć i kontrolować:

1. Stężenie białka2. Aktywność oczyszczanego enzymu3. Liczbę białek obecnych w preparacie

Błękit kumazyny R-250 (CBB)

Przesunięcie lmax po związaniu białka

465 nm (czerwony) 595 nm (niebieski)

CuSO4 – kwas bicynchoninowy

Białko redukuje Cu(II) to Cu(I) w środowisku

zasadowym; kwas bicynchoninowy (BCA)

jest odczynnikiem chromogennym, specyficznym

dla Cu(I); tworzy z nimi purpurowy kompleks

o lmax = 562 nm

Niektóre metody oznaczania białka

PORÓWNANIE NAJPOPULARNIEJSZYCH METOD OZNACZANIA BIAŁKA

Metoda

Zakres oznaczalności

(mg)

Czy metoda jest

destrukcyjna dla próbki?

Zależność wyniku od składu

aminokwasowego

Komentarze dodatkowe

Biuretowa Lowry’ego UV 280 nm UV 205 nm Bradtford

0.5 – 5 0.05 – 0.5 0.2 – 2 0.01 – 0.05

0.005 – 0.05

tak tak nie nie tak

bardzo mała umiarkowana duża bardzo mała umiarkowana

wpływ obecności alkaliów i jonów amonowych wiele substancji interferujących; długi czas oznaczania wpływ substancji absorbujących w zakresie UV; użyteczna dla pomiarów ciągłych j.w; ograniczona specyficzność adsorbcja barwnika na szkle; krótki czas oznaczania

1. Oznaczanie [P] preferowane wobec [S];

2. Warunki oznaczenia powinny być optymalne:

pH, siła jonowa, wysycające stężenia substratu(ów)

i obecność kofaktorów;

3. Oznaczanie punktowe lub ciągłe?

4. Wybór metody: preferowane techniki spektroskopowe

(UV, vis); metody radiochemiczne – uniwersalne i dokładne

ale drogie, pracochłonne i niebezpieczne; często stosowane

metody sprzężone;

5. Zawsze należy stosować oznaczenia kontrolne (tło)

6. W przypadku metod sprzężonych należy zapewnić, że ilość

enzymu katalizującego reakcję sprzężoną powinna być na

tyle duża, aby reakcja ta nie była etapem limitującym

Oznaczanie aktywności enzymu

1. Elektroforeza w warunkach denaturujących

(SDS-PAGE)

2. Ogniskowanie izoelektryczne (IEF)

3. Western blotting

Metody oceny czystości preparatów białkowych

Etap

oczyszczania

Objętość

[ml]

Białko

całkowite

[mg]

Aktywność

całkowita

[U]

Specyficzna

aktywność

[U/mg]

Współczynnik

oczyszczenia

Wydajność

[%]

Surowy

ekstrakt

50 600 198 0,33 1 100

Siarczan

protaminy

50 420 178 0,43 1,3 90

Siarczan

amonu

10 66,3 142,5 2,15 6,5 72

Glikol

polietylenowy

6000

10 30 135,3 4 12,1 68,5

ResourceTM

Q 6 11,9 71,3 6 18,2 40

Superdex 200 3 9 59,4 6,6 20 30

Podsumowanie procesu oczyszczania syntazy GlcN-6-P

z Candida albicans

z lewej: analiza elektroforetyczna etapów oczyszczania

poniżej: zestawienie parametrów procesu

Postęp procesu oczyszczania enzymu można śledzić

Komórki, tkanki

Organele

Ekstrakt bezkomórkowy

Rozbicie komórekFrakcjonowanie struktur subkomórkowych

Ekstrakcja

Surowy preparat enzymatyczny

Oczyszczony enzym

Separacja wst ępnagłównie metody wytrąceniowe(duża pojemność, niska selektywność )

Separacja zasadniczagłównie techniki chromatograficzne(średnia i wysoka selektywno ść)

Chromatografia powinowactwa(wysoka selektywno ść)

Rozbicie komóreki organeliEkstrakcja

Strategia oczyszczania enzymów

Komórki zwierzęce – brak ściany; duże rozmiary; łatwość rozbicia

Komórki roślinne – ściana komórkowa (celuloza/ligniny/woski)

duże rozmiary; polifenole obecne w wakuolach

Bakterie - sztywna ściana komórkowa + błona zewnętrzna (tylko Gram-);

niewielkie rozmiary; komórki sferyczne – szczególne problemy

komórki rekombinowane – możliwe tworzenie ciał inkluzyjnych

Grzyby - bardzo sztywna ściana (chityna/glikan); aktywne enzymy

proteolityczne

Problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmu w momencie

rozbicia komórek; efekty cieplne związane z zastosowaniem

metod mechanicznych

Dezintegracja komórek - problemy

kontrola pH

kontrola temperatury

zapobieganie niekontrolowanej proteolizie

dodatek czynników stabilizujących

zapewnienie właściwych warunków przechowywania

Czynniki sprzyjające zachowaniu aktywności oczyszczanychenzymów

1. Utrzymywanie odpowiednio niskiej temperatury

2. Obecność inhibitorów proteaz

3. W niektórych przypadkach – ultrafiltracja z limitem

odcięcia <30 kDa

Inhibitory proteaz:

Fluorek fenylometylosulfonylu 0.5 mM

Pepstatyna A 1 M

E-64 /L-trans-epoksysukcinylo-leucylamido-(4-guanidyno)-butan 10 M

EDTA 1 mM

Zapobieganie proteolizie oczyszczanych enzymów

METODY DEZINTEGRACJI KOMÓREK

Technika Zastosowanie Zasada

Metody „łagodne”

Liza osmotyczna Działanie enzymów litycznych Liza chemiczna (autoliza) Homogenizator teflon-szkło

Erytrocyty Bakterie, grzyby, komórki roślinne Drożdże Komórki zwierzęce

Dezintegracja błony na skutek różnicy ciśnień osmotycznych Trawienie polisacharydów ściany komórkowej Częściowa solubilizacja błony, uwolnienie enzymów autolitycznych Przetłaczanie przez wąską szczelinę

Metody „umiarkowane’

Miksowanie Ucieranie z Aluminą

Większość tkanek zwierzęcych Bakterie, grzyby, komórki roslinne

Siły ścinające Siły ścinające

Metody „intensywne”

Prasa X, prasa Frencha, homogeniza-tor Mauton-Gaulin Sonifikacja Mielenie w młynach kulowych, mikrometoda z zastosowaniem kulek szklanych Nebulizacja

Bakterie, grzyby, komórki roślinne Komórki bakteryj-ne o wydłużonym kształcie Wszystkie Wszystkie

Przetłaczanie przez wąską szczelinę + dekompresja Działanie ultradźwięków Siły ścinające Intensywna kawitacja

Wybrane metody dezintegracji komórek

Prasa Frencha

Zasada działania:

W wyniki parcia wywieranego na zawartość komory przez tłok naciskany za pośrednictwem

prasy hydraulicznej, rośnie ciśnienie w komorze oraz ciśnienie wewnętrzne w komórkach. Podczas

uwalniania zawartości komory przez wąską dyszę, następuje gwałtowny spadek ciśnienia

w zawiesinie (na zewnątrz komórek) do atmosferycznego. Ciśnienie wewnątrzkomórkowe także

spada, ale wolniej. W efekcie, gradient ciśnienia po dwóch stronach błony cytoplazmatycznej

powoduje jej pęknięcie, a w efekcie uwolnienie cytoplazmy.

Szok osmotyczny przeniesienie z roztworu o wysokim

ciśnieniu osmotycznym do roztworu

o niskim ciśnieniu osmotycznym

Szok termiczny 80 C/gwałtowne ochłodzenie

Inne metody dezintegracji komórek

Metody fizyczne

Metody enzymatyczne

Bakterie: Gram-dodatnie lizozym + DNaza

Gram-ujemne lizozym + DNaza + EDTA

detergent niejonowy+ lizozym

Grzyby: chitinaza + -glukanaza

-glukuronidaza

Komórki roślinne: celulaza

Rozbite komórki

Osad Supernatant

Osad Supernatant

jądra

mitochondria lizosomy

Osad Supernatant

mikrosomy cytozol

600 x g, 10 min

10,000 x g, 10 min

105,000 x g, 3 h

Zastosowanie wirowania do separacji składników komórek

- w wyniku dodania do roztworu ziaren suchego, porowatego

polimeru. Wielkość porów musi być tak dobrana, aby nie wnikały

w nie cząsteczki białek (Sephadex G-25, glikol polietylenowy

- PEG);

- w wyniku usunięcia nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek

poprzez dyfuzję przez półprzepuszczalną membranę

(ultrafiltracja, dializa wobec suchego Sephadex-u lub PEG);

- w wyniku usunięcia wody pod zmniejszonym ciśnieniem

(liofilizacja)

Zatężanie roztworów białek

Materiały używane

do otrzymywania błon

półprzepuszczalnych:

Octan celulozy

poliwęglan

poliamidy

PCW

polisulfon

Ultrafiltracja

Odsalanie i wymiana buforu

Dializa

Filtracja żelowa

- wytrącanie poprzez zmianę pH

(kwas octowy lub cytrynowy dla pH 3-4;

dietanoloamina lub węglan sodu dla pH >8

- wytrącanie poprzez zmianę siły jonowej (wysalanie)

- wytrącanie poprzez dodatek rozpuszczalnika organicznego

- wytrącanie poprzez dodatek polimeru organicznego (PEG)

- wytrącanie poprzez denaturację termiczną

Oczyszczanie i zatężanie poprzez wytrącanie

Wytrącanie białek poprzez zmianę pH

Rozpuszczalność białek zależy od pH roztworu.Rozpuszczalność danego białka jest najmniejszaprzy pH odpowiadającym punktowi izoelektrycznemu (pH i) białka

Białka są wytrącane z roztworu w efekcie zwiększenia jego siły jonowej w wyniku dodania soli w postaci sypkiej lub stężonego roztworu.Stosowane sole: (NH4)2SO4, Na2SO4

Wysalanie białek

Białka są wytrącane w wyniku dodania do roztworu mieszających się z wodą,

niedenaturujących rozpuszczalników organicznych.

Najczęściej stosowane: aceton, etanol

Operacje prowadzi się w temperaturach poniżej 0 C.

Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi

Chromatograficzne metody separacji białek

Podstawa separacji są różnice we właściwościach fizykochemicznych białek:

- polarność chromatografia adsorpcyjnachromatografia hydrofobowa

- charakter jonowy chromatografia jonowymienna

chromatoogniskowanie

- rozmiary cząsteczki chromatografia rozmiarów wykluczających

-kształt cząsteczki; aktywność biologiczna chromatografia powinowactwa

Schemat zestawu do chromatografii kolumnowej białek

LPLC < 5 bar

MPLC 6 – 50 bar

HPLC > 50 bar

1 bar = 0.1 MPa

W oczyszczaniu białek stosuje się techniki chromatograficznenisko-, średnio- i wysokociśnieniowe

Chromatografia średniociśnieniowa

System FPLC

Materiały stosowane jako nośniki (matryce) dla złóż chromatograficznych wykorzystywanych dla oczyszczania białek

Matryca Czynnik sieciujący

lub skład kopolimeru

Zakres stabilności (pH)

Uwagi

Celuloza

Dekstran

Agaroza

Sepharose

Poliakrylamid

Polistyren

epichlorohydryna

epichlorohydryna

2,3-dibromopropanol

kopolimer dekstranu

I agarozy

produkt polikondensacji

diwinylobenzen

2 – 12

2 – 12

3 - 14

2 – 14

2 – 11

bez ograniczeń

tylko zawiesina

j.w.

Chromatografia jonowymienna białek

Rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony)kationity (wymieniają kationy)

Anionit czy kationit?

Chromatografia jonowymienna białek

- wybierz rodzaj złoża;

- dostosuj rodzaj buforu do rodzaju złoża(dla anionitów bufory kationowe, np. TRIS;dla kationitów bufory anionowe, np. fosforanowy);

- naniesienie próbki w roztworze o niskiej sile jonowej (<50 mM);

- elucja wzrastającym gradientem soli (zwykle 0 – 0.5 M KCl lub NaCl),gradientem pH (rzadziej stosowane) lub gradientem amfolitu

Cechy chromatografii jonowymiennej:

(+) następuje zagęszczenie próbki; praktycznie brak ograniczeń objętościpróbki nanoszonej na kolumnę; łagodne warunki nanoszenia i elucji;wysoka rozdzielczość

(-) bezwzględna konieczność zachowania niskiej siły jonowej próbki nanoszonejbiałka eluowane z kolumny roztworem o wysokiej sile jonowej

Zasada metody: Po zrównoważeniu żelu (zwykle polietylenoimino-agaroza) buforem o stosunkowo

wysokim pH, tworzy się gradient pH wzdłuż kolumny w wyniku elucji buforem

zawierającym amfolity o pH odpowiadającym dolnej granicy pożądanego

gradientu. W rezultacie, wytwarza się stały gradient pH w buforze o niskiej sile

jonowej. W miarę postępu elucji białka są wymywane ze złoża w roztworze,

którego pH jest równe, lub nieco wyższe od pI białka.

System FPLC:

Kolumny Mono P (MonoBeads® podstawione

aminami trzecio- lub czwartorzędowymi

Amfolity: Polybuffer 74, Polybuffer 96

Separacja mioglobiny

wieloryba, mioglobiny

końskiej i karboksy-

hemoglobiny przez

zastosowanie

chromatoogniskowania

FPLC

Zalety: wysoka rozdzielczość,

efekt ogniskowania;

Wady: amfolity obecne w eluacie.

Usuwanie poprzez filtrację żelową,

ultrafiltrację lub dializę

Chromatoogniskowanie

Hydroksyapatyt: Ca10(PO4)6(OH)2

- krystaliczny

- sferoidalny

- ceramiczny

Mechanizm adsorpcji:

Wiązanie na powierzchni złoża, w którym uczestniczą jony

Ca(II) i fosforanowe złoża oraz naładowane grupy funkcyjne

białek

Warunki adsorpcji: bufor fosforanowy Na/K (<20 mM)

pH obojętne

Warunki elucji: wzrastajacy gradient skokowy lub ciągły

buforu fosforanowego (zwykle 10 – 500 mM)

Chromatografia adsorpcyjna

Bio-Rad

Kolumna Bio-Scale CHT Type I

Upakowana ceramicznym

hydroksyapatytem

(wielkość ziaren – 10 m)

Inertne matryce funkcjonalizowane grupami arylowymi lub alkilowymi.

Matryce podstawione grupami alkilowymi są ogólnie bardziej hydrofobowe,

niż matryce podstawione grupami arylowymi

Mechanizm wiązania białek: wykorzystuje się obecność domen

hydrofobowych na powierzchni cząsteczek białka; siła napędowa – wzrost

entropii układu; jest potęgowana w roztworach o dużej sile jonowej.

Złoża do chromatografii hydrofobowej FPLC

Chromatografia hydrofobowa

Parametry próbki nanoszonej na kolumnę:środowisko buforu o dużej sile jonowej;

Elucja: a/ bufor o zmniejszającej się sile jonowej;b/ gradient rozpuszczalnika organicznego(alkohole alifatyczne, aminy alifatyczne) lubdetergentu niejonowego, np. Triton X-100

Chromatografia rozmiarów wykluczających (żelowa)

Zasada: Porowate ziarna złoża z materiału całkowicie inertnego (Sephadex,Sepharose, Superose, Superdex, poliakrylamid. Pory w ziarnach o kontrolowanej średnicy. Cząsteczki białek, w zależności od swoich rozmiarów wnikają do porów

(są zatrzymywane) lub przepływają obok.

Chromatografia rozmiarów wykluczających

Najbardziej zachowawcza technika chromatograficzna stosowana do oczyszczania białek.

Ograniczenie: objętość nanoszonej próbki powinna być jak najmniejsza

Dowolny skład próbki nanoszonej na kolumnę

Stosuje się kolumny długie, o niewielkiej średnicy

Bardzo istotne jest dokładne, jednorodne upakowanie złoża w kolumnie

Efekt dyfuzyjny Zależność szerokości pasma od objętościnanoszonej próbki

Jakość rozdziału w chromatografii żelowej

Chromatografia powinowactwa

Podstawą separacji są wysoce selektywne, specyficzne oddziaływania białko: ligand związany trwale ze złożem.

Ligandem może być np.: analog substratu, koenzymu, inhibitor kompetytywny, inhibitor allosteryczny

Istnieje możliwość indywidualnego zaprojektowania i otrzymania złoża specyficznego wobec danego białkalub zakupu jednego z komercyjnie dostępnych kilkuset złóż o różnej specyficzności

W niektórych przypadkach możliwe efektywne oczyszczenie białka w jednym etapie

Chromatografia powinowactwa

Możliwości połączenia cząsteczek liganda ze złożem

Produkty aktywacji agarozy za pomocą CNBr

Aktywacja nośnika

Przykładowe możliwości przytwierdzenialiganda do złoża

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia

powinowactwaimmobilizowanych

barwników

Analogia struktur przestrzennych

cząsteczki Cibacron BlueF3GA

(z lewej) i NAD (z prawej)

Chromatografia metalopowinowactwa

Zasada: wiązanie białek posiadających liczne reszty aminokwasowe z elektrodonorowymi ugrupowaniami w łańcuchach bocznych (His, Arg, Trp, Cys) z jonami metalu: Co(II), Ni(II), Zn(II), Cu(II) lub Fe(II), Immobilizowanymi na złożu. Szczególnie przydatna dla izolacji białek posiadających struktury typu tzw. „palca cynkowego” oraz białek fuzyjnych z „ogonami poliHis”

Izolacja białka His6-SSB1 – markery masy cząsteczkowej

2 – surowy lizat E. coli

3 – surowy lizat E. coli

nadprodukujących His6-SSB

4 – eluat z kolumny

Ni(II)-TED-Sepharose

(elucja 0.5 M roztworem

imidazolu)

Chromatografia metalopowinowactwa

O

OC N CH CH2

COOH

CH2 C

O

NH CH S S

NC O

NH

CH2 COOH

Activated Thiol-Sepharose

O CH2 CH

OH

CH2 S S

N

Thiopropyl-Sepharose

O S S

N

+ R1 SH O S S R1 +

N

S

H

S S R1O + O SH2 R2 SH + R1 SH + R2 S S R2

SHO +

N

S S

N

S S

NO

N

S

H

+

CHROMATOGRAFIA KOWALENCYJNA

Grupy czynne stosowanych wypełnień

Zasada metody

A/ Związanie

B/ Elucja

C/ Regeneracja

Immunochromatografia

W celu izolacji enzymów lub innych białek: immunoadsorbent powstaje w wyniku przyłączenia do nośnika przeciwciał monoklonalnych rozpoznającychdane białko

Preparatywnaelektroforeza

Planowanie procedury oczyszczania eznymu

Kolejność etapów nie jest dowolna

Co oprócz chromatografii ?

Elektroforeza SDS-PAGE

Rezultaty

Western blotting

Wynik

OD – optical density

ELISA – enzyme linked immunosorbent assay

Rezultaty

ANALIZA

Biologiczne bazy danych

PubMed

Chemicals & Bioassays Data & SoftwareDNA & RNA Domains & StructuresGenes & Expression Genetics & MedicineGenomes & Maps Homology

Proteins Sequence Analysis LiteratureTaxonomy Variation

BLAST