Definicje

Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Technika, umożliwiająca wprowadzenie mutacji w ściśle określonym miejscu łańcucha DNA. Aby można ją było zastosować, konieczna jest znajomość wyjściowej sekwencji nukleotydów w genie. Obecnie, ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się standardowo w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i odpowiednio zmodyfikowane oligonukleotydy (startery).

Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest efektem złożenia za pomocą wybranych technik laboratoryjnych fragmentów materiału genetycznego pochodzących z różnych źródeł/organizmów. Utworzone w ten sposób sekwencje DNA nie występują naturalnie w przyrodzie. Jednak dzięki obecności odpowiednich elementów regulatorowych mogą być powielane oraz mogą ulegać ekspresji po wprowadzeniu do komórek gospodarza.

PCR Powielany fragment DNA

Cykl 2

3’ 5’ 3

’

5’

5’

3’ 3

’ 5’ 3’

5’ 3

’ 5’ 5

’ 3’

5’

3’

matrycowy DNA produkt reakcji z cyklu 1 produkt reakcji z cyklu 2 produkt reakcji z cyklu 3

Cykl 3

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3

’ 5’

3’

5’ 3

’

3’ 5’

3’ 5’

5’ 3

’

5’ 3’

5’

3’

3’

5’

3’ 5’

5’ 3’

5’

3’

5’ 5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’ 3’ 5’

Cykl 1 powielany odcinek DNA

Denaturacja (95°C)

przyłączenie starterów (45-65°C) i wydłużanie nici DNA

(72°C)

PCR, w praktyce wygląda to tak… Powielany fragment DNA

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’ 3’ 5’

Sekwencja startera 2 (reverse, right) pokrywa się z sekwencją nici antysensownej (matrycowej)

sekwencja startera 1 (forward, left) pokrywa się z sekwencją nici sensownej (kodującej)

Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR

OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków

3’ 5’5’ 3’

5’3’3’5’

3’5’5’3’

PCR 1

A

C

5’3’3’5’

3’5’5’3’

PCR 2 B

D

3’5’

5’3’3’5’5’3’

PCR 3

A

B

Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR

OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków

3’ 5’5’ 3’

5’3’3’5’

3’5’5’3’

PCR 1

A

C

5’3’3’5’

3’5’5’3’

PCR 2 B

D

3’5’

5’3’3’5’5’3’

PCR 3

A

B

reakcja 1 reakcja 2

starter A starter D

starter C starter B

produkt reakcji 1 produkt reakcji 2 zmieszanie

denaturacja rehybrydyzacja

dNTP, polimeraza, startery B i A

nie ulega wydłużeniu

ulega wydłużeniu

produkt reakcji 3

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’ 3’ 5’

3’ 5’ 5’ 3’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

3’

3’

3’

3’

Wprowadzanie modyfikacji na końcach genów

3’5’

5’3’

5’3’3’5’

3’5’

5’3’

5’3’3’5’

Wykorzystanie zmodyfikowanych starterów do wprowadzania mutacji na 5’ i 3’ końcu genu

Wprowadzenie/usuwanie sekwencji Shine-Dalgarno/Kozak, kodonu STOP, kodonu START, miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych

3’5’

5’3’

5’3’

3’5’

Na początku lub na końcu genu

W środku genu

3’5’

3’5’

5’3’

5’3’

5’3’

3’5’

3’5’3’5’

5’3’

5’3’

A

C

D

B PCR 1 – startery A i C PCR 2 – startery D i B

PCR 3 – startery A i B

Modyfikacje DNA, wprowadzanie delecji przy pomocy PCR

Mutageneza ukierunkowana c.d., metoda Quik Change ®

Większość szczepów E. coli prowadzi metylację dam+. Endonukleaza DpnI rozpoznaje i trawi jedynie metylowaną sekwencję 5´-Gm6ATC-3´.

1. Wektor z genem wyizolowany z bakterii dam+, docelowe miejsce wprowadzenia mutacji

2. Startery wprowadzające mutację są do siebie komplementarne

3. Powielanie dwóch nici wektora, wprowadzenie mutacji

4. Trawienie bakteryjnego DNA, usunięcie nici nie zawierających mutacji

Stratagene

Quik Change ® – warunki reakcji

W wysokiej temperaturze DNA może ulegać depurynacji. Proporcjonalnie, dłuższe matryce będą bardziej uszkodzone niż krótkie. Przy powielaniu długich fragmentów DNA istotne jest skrócenie czasu denaturacji oraz obniżenie temperatury wydłużania.

1A – denat. 94°C/60 sek. 2A – denat. 94°C/30min/bez DNA matrycowego/test. aktywności polimerazy 3A – denat. 94°C/10 sek./z DNA matrycowym

A B

Etap Cykl Temperatura Czas

1 1 95°C 30 sek. 2 12–18 95°C

55°C 68°C

30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA

Etap Cykl Temperatura Czas

1 1 95°C 3 min 2 25–30 95°C

55°C 72°C

30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA

QC PCR

Normalny PCR

Klonowanie klasyczne

wektor

wektor pocięty enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI

wektor po wklonowaniu wstawki – rekombinowanego DNA

fragment DNA zawierający interesujący nas gen

fragment DNA (wstawka) po trawieniu enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI

ligacja (ligaza DNA)

Enzymy restrykcyjne a metylacja DNA

Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) wystę-pują naturalnie u sinic i bakterii. Razem z komplementarnymi metylazami tworzą system restrykcji-modyfikacji, dzięki któremu mikroorganizmy bronią się przed wnikaniem obcego DNA, np. bakteriofagów.

Specyficzna metylacja własnego DNA służy ochronie przed restryktazami syntetyzowanymi przez organizm – obcy DNA, niemetylowany według określonego wzoru, ulega degradacji.

Enzymy restrykcyjne

EcoRI

EcoRV

PstI

Izoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje i tnące je w ten sam sposób, np. MspI i HpaII 5'...C^C G G...3' 3'...G G C^C...5'

Neoizoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje, ale tnące je w różny sposób, np. SmaI 5'...C C C^G G G...3‘ i XmaI 5'...C^C C G G G...3‘ 3'...G G G^C C C...5‘ 3'...G G G C C^C...5‘

Metoda OE PCR cloning – klonowanie przy pomocy PCR

Wektor, do którego

chcemy wprowadzić

gen

Gen, który chcemy wprowadzić do wektora

Projektujemy startery, częściowo komplementarne do genu a częściowo komplementarne do wektora

W wyniku reakcji PCR otrzymujemy gen, na którego końcach

znajdują się sekwencje

komplementarne do wektora

Tak zmodyfikowany gen wykorzystywany jest w kolejnej reakcji PCR, gdzie służy za starter

Po zakończeniu reakcji zmetylowany wektor,

który służył jako matryca zostaje pocięty

za pomocą enzymu DpnI

Namnożony,niezmetylowany wektor z wklonowanym

genem zostaje wprowadzony

do komórek gospodarza,

gdzie gen może ulec ekspresji

Termostabilne polimerazy DNA

Polimeraza Pochodzenie Aktyw. 5’ – 3’

egzonukl.

Aktyw. 3’ – 5’

egzonukl.

Częstość błędów [1x10-6]a

Wydłu- żanie

3’-końca Termo-

stabilność Proce-

sywnośćb

Taq 1976 Thermus aquaticus tak nie 22 tak 9’ w 97,5°C 50

Pwo Pyrococcus

woesei nie tak 3,2 nie >2h w 100°C 20–30

Pfu 1991 Pyrococcus

furiosus nie tak 2,6 nie 4h w 95°C

DeepVent Pyrococcus

szczep GB-D nie tak 5 nie 8h w 100°C

Phusion nie tak 0,44 nie

a częstość błędów: ilość błędów/pz/cykl b ilość nukleotydów przyłączonych zanim polimeraza odłączy się od matrycy

PCR – ogólne zasady projektowanie starterów

Długość starterów – od 18 do 30 zasad, krótsze startery mogą się niespecyficznie wiązać z matrycą

3’ koniec startera – nie powinien zawierać więcej niż 3 zasady G i/lub C, gdyż mogą one stabilizować niespecyficzne oddziaływania starter–matryca

5’ koniec startera – jest mniej krytyczny dla specyficznego przyłączania startera do matrycy dlatego może być modyfikowany

Zawartość GC – zasady GC powinny stanowić od 40 do 60 % sekwencji

Hybrydyzacja – 3’ koniec starterów nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów, startery używane w reakcji nie powinny tworzyć homo- i/lub heterodupleksów

Temperatura topnienia – startery używane w reakcji powinny mieć zbliżoną temperaturę topnienia (różnica 2–5°C), optymalnie – nieco powyżej 60°C

hybrydyzacja starterów na końcu 3’

Optymalizacja warunków PCR

Stężenie starterów: końcowe stężenie każdego ze starterów powinno się zawierać w przedziale między 0,1 a 0,5 µM (6×1012 – 3×1013 cząsteczek). Wyższe – zwiększa prawdopodobieństwo powstania niespecyficznych produktów

Stężenie matrycy DNA: ilość używanego matrycowego DNA zależy od jego pochodzenia. Zwykle stosuje się 100–250 ng genomowego i 20–50 ng plazmidowego DNA na 50 µl reakcji

Stężenie nukleotydów: końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów powinno wynosić ok. 0,2 mM (ilość, która pozwala uzyskać ok. 6–6,5 µg DNA)

Ilość cykli – od 25 do 35, w zależności od pochodzenia DNA i ilości matrycy

Czas wydłużania starterów – zwykle przyjmuje się regułę 60 sek/1000 zasad

Bufor – standardowy bufor zawiera 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Podniesienie stężenia KCl do 70–100 mM może zwiększyć wydajność syntezy fragmentów o długości <500 pz. Niektóre bufory obok jednowartościowych jonów K+

zawierają jony NH4+ (obecność jonów NH4

+ minimalizuje potrzebę optymalizacji stężenia jonów Mg2+ oraz temperatury przyłączania starterów.

Critical Factors, for Successful PCR, Users Manual, Qiagen

temp °C

produkt PCR

niespecyficzne produkty PCR

Temperatura przyłączania starterów (annealing temperature) – im wyższa, tym bardziej specyficzny produkt reakcji

Optymalizacja warunków PCR

Stężenie jonów magnezu – im wyższe, tym większa wydajność reakcji ale także ilość produktów niespecyficznych

Obliczanie temperatury topnienia starterów

Dla starterów liczących nie więcej niż 20 nukleotydów temperaturę topnienia (melting temperature) można wyliczyć wg empirycznej zasady Wallace’a: Tm = 2°C × (A + T) + 4°C × (G + C)

Dla dłuższych oligonukleotydów (do 70 zasad), gdy stężenie kationów jest ≤ 0,4 M można zastosować równanie: Tm = 81°C + 16,6 (log10 [K+]) + 0,41(%[G + C])

Temperatura hybrydyzacji (annealing temperature) jest na ogół o 5–10°C niższa od Tm, należy ją ustalić empirycznie.

Abso

rban

cja pr

zy 26

0 nm

Tm=69 °C

Dwuniciowy DNA

Częściowo rozwinięty DNA

Jednoniciowy DNA

Temperatura [°C]

Czynniki wpływające negatywnie na PCR

Wysoka zawartość zasad GC jest odpowiedzialna za powstawanie struktur drugorzędowych w obrębie DNA, co prowadzić może do zahamowania aktywności polimerazy. Glicerol, DMSO (2–10%), chlorek tetrametyloamonu (0,01–10 mM), formamid (5–20%) poprawiają wydajność tego typu reakcji PCR.

Zanieczyszczenia związkami używanymi przy oczyszczaniu matrycowego DNA Do związków hamujących aktywność polimerazy należą: SDS (>0,005% w/v), fenol (>0,2% v/v), etanol (> 1% v/v), izopropanol (>1% v/v), octan sodu (>5 mM), EDTA (> 0,5 mM).

Czystość starterów zależy od sposobu ich oczyszczenia po syntezie. Standardowo startery oczyszcza się stosując sączenie molekularne. Startery o długości powyżej 70 zasad powinny być oczyszczane za pomocą HPLC.

― stworzone na potrzeby klonowania i/lub ekspresji genów ― posiadają m. in:

• polilinker, MCS (multi cloning site) • ori (origin) miejsce startu replikacji • marker selekcyjny: np. gen oporności na antybiotyk • promotor

Wektory plazmidowe

― naturalnie występujące u bakterii pozachromosomalne, koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA, 1–200 kpz.

― ich replikacja przebiega niezależnie od chromosomalnego DNA ― posiadają mechanizmy umożliwiające zachowanie stałej liczby cząsteczek

w komórce gospodarza oraz odpowiednią segregację do komórek potomnych ― replikacja i transkrypcja genów plazmidowych przebiega zwykle w oparciu

o enzymy gospodarza ― w plazmidach naturalnych zawarta jest informacja decydująca o:

oporności/produkcji antybiotyków, syntezie bakteriocyn, enterotoksyn, wytwarzaniu enzymów restrykcyjnych, rozkładzie złożonych związków organicznych, oporności na jony metali ciężkich, zdolności do koniugacji, itp.

Plazmidy

Wektory plazmidowe

− dodatkowo mogą zawierać sekwencje kodujące metki ułatwiające oczyszczanie lub sekwencje białek wykorzystywanych jako partnerzy fuzyjni

Wektor do tworzenia białek fuzyjnych (Clontech)

Wektor do równoległej ekspresji dwóch białek (Invitrogen)