POST. MIKROBIOL., IMMUNOTOKSYNY … · Testy kliniczne. 5.2.1. Immunotoksyny oparte o PE. 5.2.2....

16
POST. MIKROBIOL., 2010, 49, 4, 239254 http://www.pm.microbiology.pl 1. WstŒp Pod koniec XIX wieku zaobserwowano, ¿e barw- niki wstrzykniŒte do cia‡ zwierz„t wybarwiaj„ okre- lone tkanki. Paul E h r l i c h w 1906 r. postulowa‡, ¿e jest mo¿liwe po‡„czenie barwników z niektórymi metalami o w‡aciwociach toksycznych. Mo¿e to byæ drog„ do stworzenia nowego rodzaju leków tkankowo- specyficznych [18]. Kontynuacj„ tej myli s„ prowa- dzone w ci„gu ostatnich kilkudziesiŒciu lat badania nad immunotoksynami, które maj„ byæ wykorzystane w celowanej terapii przeciwnowotworowej. Konwencjonalne terapie stosowane obecnie w le- czeniu nowotworów maj„ liczne ograniczenia. Radio- terapia oddzia‡uje negatywnie nie tylko na nowotwór, ale równie¿ na normalne, zdrowe tkanki z nim s„sia- duj„ce. WiŒkszoæ chemioterapeutyków oraz promie- niowanie jonizuj„ce, wykorzystywane w radioterapii, powoduj„ uszkodzenia DNA prowadz„ce do mutacji, które s„ jedn„ z przyczyn powstawania nowotworów. Z kolei chirurgiczne usuniecie tkanki nowotworowej ma zastosowanie wy‡„cznie na wczesnych etapach rozwoju raka i nie ma zastosowania w przypadku nowotworów hematologicznych [64]. Od pocz„tku historii badaæ nad immunotoksyna- mi, koncepcje dotycz„ce ich konstrukcji przybiera‡y wiele form. Na pocz„tku koniugaty syntetyzowano metodami chemicznymi z wykorzystaniem przeciwcia‡ (pocz„tkowo poliklonalnych, póniej wypartych przez przeciwcia‡a monoklonalne) oraz toksyn hamuj„cych IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE Micha‡ Kamiæski 1 , Rados‡aw Stachowiak 1 *, Jacek Bielecki 1 1 Zak‡ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia‡ Biologii UW, 00-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1 Wp‡ynŒ‡o w lipcu 2010 r. 1. WstŒp. 2. Toksyny bia‡kowe. 2.1. Toksyny bakteryjne. 2.1.1. Toksyna b‡onicza Corynebacterium diptheriae (DT). 2.1.2. Egzo- toksyna A Pseudomonas aeruginosa (PE). 2.2. Toksyny rolinne. 2.3. Toksyny zwierzŒce. 2.4. Toksyny grzybowe. 3. Cz„steczki nonikowe. 3.1. Przeciwcia‡a i ich pochodne. 3.2. Cytokiny, czynniki wzrostowe oraz hormony. 4. Skutki uboczne immunotoksyn. 4.1. Zespó‡ przesiŒkania naczyniowego (VLS). 4.2. Hepatotoksycznoæ. 4.3. Zespó‡ hemolityczno-mocznicowy (HUS). 4.4. Inne skutki uboczne. 5. Próby zastosowania immunotoksyn. 5.1. Testy przedkliniczne. 5.1.1. Immunotoksyny oparte o PE. 5.1.2. Immuno- toksyny oparte o DT. 5.2. Testy kliniczne. 5.2.1. Immunotoksyny oparte o PE. 5.2.2. Immunotoksyny oparte o DT. 6. Podsumowanie Immunotoxins characteristics and applications Abstract: Immunotoxins are a new group of therapeutics of potential use in targeted tumor therapy. The research has been conducted for the past 3040 years but finding specific surface structures on targeted cells remains a major problem. Immunotoxins consist of two main fragments: protein toxin, which kills target cell after internalization, and carrier molecules which specifically identify and bind cancer cells. Toxins used for immunotoxin preparation have various origin (plant, bacterial, fungal and animal). The most popular among them are: exotoxin A derived from Pseudomonas aeruginosa (PE), diphtheria toxin from Corynebacterium diphtheriae (DT) and ricin from Ricinus communis. The induction of cell death depends on the protein synthesis inhibition due to interactions with various targets such as a ribosomes or EF-2. Monoclonal antibodies, growth factors or cytokines are used as carrier molecules. The specificity of tumor antigen binding determines the type and severity of side effects, occurring due to immunotoxins binding with non-cancerous cells. Unfortunately, the majority of antibodies currently used for immunotoxins preparation recognize antigens that are expressed in both neoplastic and normal cells. Most common side effects include vascular leak syndrome (VLS) and hepatotoxicity. A wide variety of immunotoxins have recently been tested in preclinical and clinical trials. Some of them show promising results, bringing hope for treatment of chemoresistant cancers. 1. Introduction. 2. Protein toxins. 2.1. Bacterial toxins. 2.1.1. Diphtheria toxin from Corynebacterium diptheriae (DT). 2.1.2. Egzotoxin A from Pseudomonas aeruginosa (PE). 2.2. Plant toxins. 2.3. Animal toxins. 2.4. Fungal toxins. 3. Carrier molecules. 3.1. Antibodies and antibody derivatives. 3.2. Cytokines, growth factors and hormones. 4. Immunotoxins side effects. 4.1. Vascular-leak syndrome (VLS). 4.2. Hepatotoxicity. 4.3. Hemolytic uremic syndrome (HUS). 4.4. Other side effects. 5. Immunotoxin trials. 5.1. Pre-clinical trials. 5.1.1. PE based immunotoxins. 5.1.2. DT based immunotoxins. 5.2. Clinical trials. 5.2.1. PE based immunotoxins. 5.2.2. DT based immunotoxins 6. Summary S‡owa kluczowe: immunotoksyny, DT, PE, VLS, denileukin diftitox Key words: immunotoxins, DT, PE, VLS, denileukin diftitox * Autor korespondencyjny: Zak‡ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia‡ Biologii UW, 00-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1, tel. 22 55 41 312; e-mail: [email protected]

Transcript of POST. MIKROBIOL., IMMUNOTOKSYNY … · Testy kliniczne. 5.2.1. Immunotoksyny oparte o PE. 5.2.2....

  • POST. MIKROBIOL.,2010, 49, 4, 239254http://www.pm.microbiology.pl

    1. Wstêp

    Pod koniec XIX wieku zaobserwowano, ¿e barw-niki wstrzykniête do cia³ zwierz¹t wybarwiaj¹ okre-lone tkanki. Paul E h r l i c h w 1906 r. postulowa³,¿e jest mo¿liwe po³¹czenie barwników z niektórymimetalami o w³aciwociach toksycznych. Mo¿e to byædrog¹ do stworzenia nowego rodzaju leków tkankowo-specyficznych [18]. Kontynuacj¹ tej myli s¹ prowa-dzone w ci¹gu ostatnich kilkudziesiêciu lat badanianad immunotoksynami, które maj¹ byæ wykorzystanew celowanej terapii przeciwnowotworowej.

    Konwencjonalne terapie stosowane obecnie w le-czeniu nowotworów maj¹ liczne ograniczenia. Radio-terapia oddzia³uje negatywnie nie tylko na nowotwór,

    ale równie¿ na normalne, zdrowe tkanki z nim s¹sia-duj¹ce. Wiêkszoæ chemioterapeutyków oraz promie-niowanie jonizuj¹ce, wykorzystywane w radioterapii,powoduj¹ uszkodzenia DNA prowadz¹ce do mutacji,które s¹ jedn¹ z przyczyn powstawania nowotworów.Z kolei chirurgiczne usuniecie tkanki nowotworowejma zastosowanie wy³¹cznie na wczesnych etapachrozwoju raka i nie ma zastosowania w przypadkunowotworów hematologicznych [64].

    Od pocz¹tku historii badañ nad immunotoksyna-mi, koncepcje dotycz¹ce ich konstrukcji przybiera³ywiele form. Na pocz¹tku koniugaty syntetyzowanometodami chemicznymi z wykorzystaniem przeciwcia³(pocz¹tkowo poliklonalnych, póniej wypartych przezprzeciwcia³a monoklonalne) oraz toksyn hamuj¹cych

    IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    Micha³ Kamiñski1, Rados³aw Stachowiak1*, Jacek Bielecki1

    1 Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii UW,00-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1

    Wp³ynê³o w lipcu 2010 r.

    1. Wstêp. 2. Toksyny bia³kowe. 2.1. Toksyny bakteryjne. 2.1.1. Toksyna b³onicza Corynebacterium diptheriae (DT). 2.1.2. Egzo-toksyna A Pseudomonas aeruginosa (PE). 2.2. Toksyny rolinne. 2.3. Toksyny zwierzêce. 2.4. Toksyny grzybowe. 3. Cz¹steczkinonikowe. 3.1. Przeciwcia³a i ich pochodne. 3.2. Cytokiny, czynniki wzrostowe oraz hormony. 4. Skutki uboczne immunotoksyn.4.1. Zespó³ przesiêkania naczyniowego (VLS). 4.2. Hepatotoksycznoæ. 4.3. Zespó³ hemolityczno-mocznicowy (HUS). 4.4. Inneskutki uboczne. 5. Próby zastosowania immunotoksyn. 5.1. Testy przedkliniczne. 5.1.1. Immunotoksyny oparte o PE. 5.1.2. Immuno-toksyny oparte o DT. 5.2. Testy kliniczne. 5.2.1. Immunotoksyny oparte o PE. 5.2.2. Immunotoksyny oparte o DT. 6. Podsumowanie

    Immunotoxins characteristics and applications

    Abstract: Immunotoxins are a new group of therapeutics of potential use in targeted tumor therapy. The research has been conductedfor the past 3040 years but finding specific surface structures on targeted cells remains a major problem. Immunotoxins consistof two main fragments: protein toxin, which kills target cell after internalization, and carrier molecules which specifically identifyand bind cancer cells.

    Toxins used for immunotoxin preparation have various origin (plant, bacterial, fungal and animal). The most popular amongthem are: exotoxin A derived from Pseudomonas aeruginosa (PE), diphtheria toxin from Corynebacterium diphtheriae (DT) andricin from Ricinus communis. The induction of cell death depends on the protein synthesis inhibition due to interactions with varioustargets such as a ribosomes or EF-2. Monoclonal antibodies, growth factors or cytokines are used as carrier molecules. The specificityof tumor antigen binding determines the type and severity of side effects, occurring due to immunotoxins binding with non-cancerouscells. Unfortunately, the majority of antibodies currently used for immunotoxins preparation recognize antigens that are expressed inboth neoplastic and normal cells. Most common side effects include vascular leak syndrome (VLS) and hepatotoxicity.

    A wide variety of immunotoxins have recently been tested in preclinical and clinical trials. Some of them show promisingresults, bringing hope for treatment of chemoresistant cancers.

    1. Introduction. 2. Protein toxins. 2.1. Bacterial toxins. 2.1.1. Diphtheria toxin from Corynebacterium diptheriae (DT). 2.1.2. Egzotoxin Afrom Pseudomonas aeruginosa (PE). 2.2. Plant toxins. 2.3. Animal toxins. 2.4. Fungal toxins. 3. Carrier molecules. 3.1. Antibodies andantibody derivatives. 3.2. Cytokines, growth factors and hormones. 4. Immunotoxins side effects. 4.1. Vascular-leak syndrome (VLS).4.2. Hepatotoxicity. 4.3. Hemolytic uremic syndrome (HUS). 4.4. Other side effects. 5. Immunotoxin trials. 5.1. Pre-clinical trials.5.1.1. PE based immunotoxins. 5.1.2. DT based immunotoxins. 5.2. Clinical trials. 5.2.1. PE based immunotoxins. 5.2.2. DT basedimmunotoxins 6. Summary

    S³owa kluczowe: immunotoksyny, DT, PE, VLS, denileukin diftitoxKey words: immunotoxins, DT, PE, VLS, denileukin diftitox

    * Autor korespondencyjny: Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii UW, 00-096 Warszawa,ul. Miecznikowa 1, tel. 22 55 41 312; e-mail: [email protected]

  • 240 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    produkcjê bia³ek na poziomie rybosomalnym. Próbo-wano równie¿ wykorzystaæ inne cz¹steczki wyka-zuj¹ce powinowactwo do powierzchni komórek no-wotworowych, takie jak hormony, czynniki wzrostu,cytokiny, transferrynê, "-2-makroglobulinê oraz innecz¹steczki zdolne do oddzia³ywania ze strukturamipowierzchniowymi znajduj¹cymi siê na komórkachnowotworowych [18].

    Do produkcji immunotoksyn u¿ywa siê ró¿nychtoksyn pochodzenia rolinnego (rycyna, abryna, ge-lonina czy saporyna), grzybicznego (restryktocyna),zwierzêcego (cytotoksyczne kationowe peptydy z jadukobry indochiñskiej Naja naja siamensis) [65] orazbakteryjnego (toksyna b³onicza, egzotoksyna A Pseudo-monoas aeruginosa) [64]. Wykazuj¹ one bardzo silnew³aciwoci toksyczne, niewielka ich iloæ po dostaniusiê do komórki jest w stanie spowodowaæ jej mieræ.W przypadku najsilniejszych z nich wystarczy wnik-niêcie zaledwie jednej cz¹steczki [61]. Wiêkszoæ grupbadawczych konstruuje immunotoksyny na bazie tok-syny b³oniczej Corynebacterium diphtheriae, egzotok-syny A P. aeruginosa oraz rycyny z Ricinus communis.

    W oparciu o datê odkrycia, metodê konstrukcjioraz skutecznoæ mo¿na wyró¿niæ trzy generacje im-munotoksyn.

    Immunotoksyny pierwszej generacji by³y prymi-tywnymi cz¹steczkami sk³adaj¹cymi siê z kompletnegobia³ka toksyny z wprowadzonymi mutacjami, maj¹-cymi na celu inaktywacjê domeny wi¹¿¹cej receptor. Dotoksyny do³¹czano metodami chemicznymi (poprzezwytworzenie mostków dwusiarczkowych lub wi¹zañamidowych) przeciwcia³a poliklonalne, które z czasemzosta³y wyparte przez przeciwcia³a monoklonalne.Cz¹steczki tego typu wykazywa³y niski stopieñ pene-tracji tkanki nowotworowej oraz przed³u¿ony okrespo³owicznego rozpadu, wi¹¿¹cy siê z wystêpowaniemniepo¿¹danych skutków ubocznych. Ponadto ze wzglê-du na du¿y rozmiar, cz¹steczki te indukowa³y wysok¹immunogennoæ ogóln¹, co znacz¹co obni¿a³o ichskutecznoæ [64].

    Kolejnym krokiem w kierunku zniwelowania wadi zwiêkszenia skutecznoci by³o stworzenie drugiej ge-neracji immunotoksyn. Toksyny w nich wykorzystaneby³y ca³kowicie pozbawione domeny wi¹¿¹cej recep-tor, a cz¹steczkê nonikow¹ do³¹czano metodami in¿y-nierii genetycznej. W celu zwiêkszenia specyficznocijako cz¹steczki nonikowe wykorzystano fragmentyprzeciwcia³ rekombinowanych oraz cDNA koduj¹ceczynniki wzrostowe lub cytokiny, wykazuj¹ce powino-wactwo do cz¹steczek powierzchniowych ulegaj¹cychnadekspresji w komórkach nowotworowych [12, 64].

    Ostatni¹ i najnowsz¹ grup¹ s¹ immunotoksynytrzeciej generacji, czyli tzw. immunotoksyny bispecy-ficzne. Ich cech¹ charakterystyczn¹, od której wywo-dzi siê ich nazwa, jest zdolnoæ do rozpoznawania

    dwóch ró¿nych struktur na powierzchni komórek no-wotworowych. Dziêki tej innowacji uzyskano znacz-ny wzrost specyficznoci oraz spadek niepo¿¹danejtoksycznoci [64, 84].

    W poni¿szej pracy przedstawiono obecny stan wie-dzy na temat budowy, sk³adników oraz wykorzystaniaimmunotoksyn w celowanej terapii przeciwnowotwo-rowej, z któr¹ onkologia wi¹¿e coraz wiêksze nadzieje.

    2. Toksyny bia³kowe

    Mechanizm cytotoksycznoci immunotoksyn zale-¿y od zastosowanej do ich konstrukcji toksyny. G³ów-nie s¹ to bia³ka hamuj¹ce translacjê. Wykazuj¹ oneliczne podobieñstwa w sposobie dzia³ania jak równie¿w strukturze.

    2.1. Toksyny bakteryjne

    Zarówno toksyna b³onicza C. diphtheriae jak i eg-zotoksyna A P. aeruginosa posiadaj¹ domenê katali-tyczn¹, która przeprowadza reakcjê ADP-rybozylacjiczynnika translacyjnego EF-2. Jednak¿e poza iden-tycznym mechanizmem hamuj¹cym translacjê, PEi DT ró¿ni¹ siê znacz¹co pod wzglêdem sekwencjiaminokwasowej oraz rozmieszczenia poszczególnychdomen w cz¹steczce [42, 51].

    2.1.1. Toksyna b³oniczaCorynebacterium diphtheriae (DT)

    DT jest bia³kiem o d³ugoci 535 aminokwasów,sk³adaj¹cym siê z jednego ³añcucha [42]. Wytwarzanejest przez C. diphtheriae tlenow¹, Gram-dodatni¹pa³eczkê, która wywo³uje b³onicê. W strukturze tegobia³ka mo¿na wyró¿niæ fragment A zawieraj¹cy enzy-matyczn¹ domenê C (aminokwasy 1193) znajduj¹c¹siê na C-koñcu oraz fragment B, w sk³ad któregowchodzi domena wi¹¿¹ca R (aminokwasy 482535)oraz domenê T transmembranowa (aminokwasy205379), która zawiera dziewiêæ "-helis. Pierwszetrzy helisy tworz¹ rejon amfipatyczny, który pomagaw stabilizacji cz¹steczki na powierzchni b³ony komór-kowej. Helisy 5, 6, 8 i 9 s¹ niepolarne, uprotonowanieich anionowych reszt prowadzi do utraty ³adunku,co pozwala domenie C na przejcie przez b³onê.W formie monomerycznej DT wykazuje w³aciwocitoksyczne i ma kszta³t litery Y, natomiast w postacidimeru jest nietoksyczna [64].

    W formie natywnej toksyna b³onicza wi¹¿e siê donab³onkowego czynnika wzrostu wi¹¿¹cego heparynê(HB-EGF), który znajduje siê w b³onie komórkowej.Nastêpnym etapem jest transport DT do retikulumendoplazmatycznego w postaci pêcherzyka, który po-

  • 241IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    wstaje na drodze endocytozy zale¿nej od receptora.Dynamina, bêd¹ca rozpuszczalnym bia³kiem cyto-plazmatycznym u³atwia od³¹czenie siê pêcherzyka odb³ony komórkowej. Podczas transportu przez cytozol,pêcherzyk zostaje op³aszczony przez klatrynê, któratworzy wokó³ niego strukturê przypominaj¹c¹ klatkê.Tu¿ przed po³¹czeniem siê pêcherzyka z retikulum en-doplazmatycznym klatryna zostaje od³¹czona. ATPazyznajduj¹ce siê w pêcherzyku odpowiadaj¹ za zakwasze-nie wewnêtrznego rodowiska do pH = 6. W kwaso-wym pH domena T ulega zmianom konformacyjnym,w wyniku czego ulega czêciowemu rozfa³dowaniu,a hydrofobowe ³añcuchy boczne zostaj¹ wyekspono-wane na zewn¹trz cz¹steczki bia³ka. W ten sposób tok-syna b³onicza naladuje strukturê bia³ek b³onowych(transmembranowych), co zapewnia ³atwiejsze wbu-dowanie siê do b³ony pêcherzyka [68]. Kolejnym eta-pem jest utworzenie kana³u, poprzez który domena Cmo¿e przemieciæ siê do cytoplazmy, gdzie nastêpujeredukcja wi¹zania dwusiarczkowego i od³¹czenie oddomeny T. Bia³ko Hsp 90 odpowiada za uzyskanieprawid³owej struktury trzeciorzêdowej przez domenêC. Receptor (HB-EGF) wraca do b³ony komórkowejpoprzez egzocytozê, natomiast pozosta³oci domeny Ti B zostaj¹ zdegradowane [64] (rys. 1).

    Wewn¹trz cytoplazmy domena katalityczna prze-nosi cz¹steczkê ADP rybozy z NAD na 715 resztêzmodyfikowanej posttranslacyjnie histydyny (zwanejdiftamid) w cz¹steczce czynnika translacyjnego EF-2[86]. Powoduje to jego inaktywacjê w wyniku czegozatrzymana zostaje synteza bia³ek i komórka umiera[21]. Jest to reakcja nieodwracalna, podczas którejzachodzi zmiana konfiguracji NAD z anomeru $ do ".Czynniki translacyjne EF-2 wystêpuj¹ce u eukariotów,dro¿d¿y i archeonów s¹ wra¿liwe na toksyny ADP-rybozyluj¹ce, natomiast bakteryjne EF-2 s¹ niewra¿-liwe. Mutanty niezdolne do wytwarzania diftamiduwykazuj¹ odpornoæ na dzia³anie DT [64].

    2.1.2. Egzotoksyna A Pseudomonas aeruginosa (PE)

    P. aeruginosa jest Gram-ujemn¹ bakteri¹ bêd¹c¹patogenem oportunistycznym. Najpowa¿niejszymi cho-robami wywo³ywanymi u ludzi przez P. aeruginosa s¹:ostry wewn¹trzga³kowy infekcyjny stan zapalny, zapa-lenie wsierdzia, aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, posocznica oraz zapalenia p³uc u osóbchorych na mukowiscydozê.

    Egzotoksyna A nale¿y do rodziny mono-ADP-rybo-zylotransferaz. £añcuch bia³kowy ma d³ugoæ 638 ami-nokwasów, z czego 613 aminokwasów tworzy w³aci-we bia³ko, natomiast pozosta³e 25 wchodzi w sk³adsilnie hydrofobowego peptydu sygnalnego, który jestodcinany podczas sekrecji. Na N-koñcu znajduje siêdomena Ia (aminokwasy 1252), która jest odpowie-

    dzialna za rozpoznanie komórki. Domena II (amino-kwasy 253364) zbudowana jest z szeciu ci¹g³ych" helis nastêpuj¹cych po sobie i jest niezbêdna do tego,aby zasz³a translokacja domeny katalitycznej poprzezb³onê. Funkcja domeny Ib (aminokwasy 365404) niezosta³a dotychczas dok³adnie zbadana, ale przypuszczasiê, ¿e mo¿e byæ potrzebna podczas sekrecji toksyny.Domena III (aminokwasy 405613) wraz z czteremaostatnimi aminokwasami domeny Ib (400404) tworz¹katalityczn¹ czêæ bia³ka, która jest odpowiedzialnaza proces zahamowania syntezy bia³ek w komórkachdocelowych [1, 50, 95].

    Pierwszym etapem w mechanizmie cytotoksycz-noci PE jest odciêcie lizyny 613 na C-koñcu przezkarboksypeptydazê wystêpuj¹c¹ w osoczu, dziêki cze-mu motyw REDLK ulega zmianie i powstaje REDL,który dzia³a jak sygna³ kieruj¹cy do retikulum endo-plazmatycznego. Nastêpnie domena Ia wi¹¿e siê z re-ceptorem CD91 zwanym równie¿ "2MR/LRP, któryznajduje siê na powierzchni komórki. Po zwi¹zaniu siêdo powierzchni komórki egzotoksyna A mo¿e wnikn¹ædo komórki na dwa sposoby [37, 40, 95].

    Rys. 1. Mechanizm dzia³ania toksyny b³oniczej (DT).Toksyna DT po wnikniêciu do komórki przechodzi proteolizê a nastêp-nie redukcjê mostków dwusiarczkowych w celu oddzielenia domenykatalitycznej (³añcuch A DT) od domeny wi¹¿¹cej (³añcuch B DT).DT jest przecinane pomiêdzy aminokwasami 193 i 194. Nastêpnie kata-lityczny ³añcuch A przemieszcza siê wewn¹trz endosomu, przy pomocydomeny translokacyjnej (T), która tworzy kana³ w b³onie endosomu,przedostaje siê do cytozolu. mieræ komórki spowodowana przez DT

    przebiega podobnie do apoptozy. EF2 czynnik elongacyjny 2.

  • 242 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    Wiêkszoæ cz¹steczek PE dziêki obecnoci specy-ficznego receptora wnika za porednictwem endocy-tozy klatryno-zale¿nej. We wczesnych endosomach PE

    pod wp³ywem lekko kwasowego rodowiska od³¹czasiê od CD91, przechodzi zmiany konformacyjne i jestprzecinane przez furynê pomiêdzy 279 arginin¹ a 280glicyn¹ w wyniku czego powstaje N-koñcowy frag-ment o masie 27 kDa oraz C-koñcowy fragment o ma-sie 37 kDa, zawieraj¹cy domenê Ib, II oraz III. Oba tefragmenty pozostaj¹ po³¹czone mostkiem dwusiarcz-kowym pomiêdzy cysteinami 265 i 287. W lekko kwa-sowym rodowisku endosomów bia³ko ulega rozfa³-dowaniu, powoduje to wyeksponowanie wi¹zaniadwusiarczkowego, a nastêpnie redukcjê przy udzialeizomerazy disulfidowej, w wyniku czego uwalniany jestC-koñcowy fragment zawieraj¹cy domenê katalityczn¹.Nastêpnie fragment ten przemieszcza siê za porednic-twem pónych endosomów i drogi Rab9-zale¿nej dosieci trans aparatu Golgiego. Tam na drodze pH-zale¿-nej wi¹¿e siê do receptora rozpoznaj¹cego sekwencjêKDEL poprzez sekwencjê REDL, która j¹ imituje.W skutek tego C-koñcowy fragment PE zostaje prze-transportowany do retikulum endoplazmatycznegow czym uczestniczy kinaza tyrozynowa Src [40, 93, 96].

    Druga droga, za pomoc¹ której PE mo¿e dostaæ siêdo cytoplazmy wymaga zwi¹zania przez cz¹steczkêtoksyny oprócz CD91 równie¿ DRM (mikrodomenyodpornej na detergenty), PE zostaje wtedy przetrans-portowane do wczesnych endosomów za pored-nictwem specyficznych endosomów (caveosomes) nadrodze Rab5-zale¿nej. We wczesnych endosomach PEulega takim samym przemianom jak w przypadkupierwszej drogi wnikania, a nastêpnie przemieszczasiê bezporednio do retikulum endoplazmatycznego zaporednictwem drogi Rab6-zale¿nej. Kiedy ju¿ 37 kDafragment C-koñcowy znajdzie siê w retikulum endo-plazmatycznym, wówczas sekwencje znajduj¹ce siêw domenie II indukuj¹ sekrecje tego fragmentu do cy-tozolu w czym uczestniczy translokon Sec61p [36, 95].

    Kiedy enzymatycznie aktywna czêæ PE znajdzie siêw cytoplazmie, katalizuje ona reakcjê ADP-rybozylacjiczynnika translacyjnego EF-2 przebiegaj¹c¹ wed³ugtego samego mechanizmu jaki wystêpuje w przypadku

    Rys. 2. Mechanizm dzia³ania egzotoksyny A P. aeruginosa (PE).Egzotoksyna PE po wnikniêciu ulega proteolizie a nastêpnie redukcjimostków dwusiarczkowych w wyniku czego nastêpuje oddzielenie dome-ny katalitycznej (domena III PE) od domeny wi¹¿¹cej (domena Ia PE).W cz¹steczce PE nastêpuje usuniêcie C-koñcowej lizyny (K) jak równie¿przeciêcie pomiêdzy aminokwasami 279 i 280, w wyniku czego powstaje37 kDa C-koñcowy fragment zakoñczony sekwencj¹ REDL. Fragment tenz kolei jest transportowany dziêki zwi¹zaniu receptora KDEL w aparacieGolgiego do retikulum endoplazmatycznego (ER), gdzie na koniec ulegaprzemieszczeniu do cytozolu. mieræ komórki spowodowana przez PE

    przebiega podobnie do apoptozy. EF2 czynnik elongacyjny 2.

    Rys. 3. Egzotoksyna A P. aeruginosa (PE).Rysunek przedstawia strukturalne i funkcjonalne domeny PE. Domena Ia (aa 1252) pe³ni funkcjê domeny wi¹¿¹c¹ receptor. Domena II (aa 253364)jest niezbêdna do translokacji toksyny poprzez b³ony komórkowe. Domena katalityczna o aktywnoci ADP-rybozylotransferazy (aa 40 0613) sk³adasiê z fragmentu domeny Ib (aa 365404) oraz domeny III (aa 405613). Miejsce ciêcia rozpoznawane przez furynê (aa 274280) znajduje siê

    wewn¹trz domeny II, natomiast sekwencja zatrzymania ER (aa 609613) na C-koñcu i stanowi wa¿ny motyw PE.

  • 243IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    DT. Ostanie badania struktury PE wskazuj¹ na to,¿e interakcja tego bia³ka z EF-2 ³udz¹co przypominanormalne oddzia³ywanie EF-2 z podjednostk¹ 60Srybosomu [31, 81, 95].

    2.2. Toksyny rolinne

    Bia³ka inaktywuj¹ce rybosomy (RIP)Bia³ka inaktywuj¹ce rybosomy (RIP) s¹ rodzin¹

    toksyn rolinnych, które uszkadzaj¹ rybosomy w spo-sób nieodwracalny. Mo¿na je podzieliæ na dwa typy.RIP typu I (hemitoksyny) s¹ zbudowane z jednego ³añ-cucha bia³kowego, wykazuj¹cego analogiê funkcjo-naln¹ do ³añcucha A np. rycyny albo abryny, jednak¿ez powodu braku ³añcucha B s¹ du¿o mniej toksyczne.

    RIP typu II (holotoksyny), np. rycyna, abryna, s¹heterodimerami o masie oko³o 6065 kDa, w sk³adktórych wchodzi enzymatycznie aktywny ³añcuch Apo³¹czony mostkiem dwusiarczkowym z ³añcuchemB, który pe³ni funkcjê domeny wi¹¿¹cej i mo¿e ³¹czyæsiê z receptorami znajduj¹cymi siê na powierzch-ni komórki, zakoñczonymi grup¹ galaktozylow¹. Jestrównie¿ bardzo prawdopodobne, ¿e ³añcuch B odpo-wiada za kontrole wewn¹trzkomórkowego transportu³añcucha A oraz jego translokacje poprzez b³ony orga-nelli komórkowych [18].

    Bia³ka inaktywuj¹ce rybosomy s¹ rRNA N-gliko-zydazami, poniewa¿ mog¹ usun¹æ pojedyncz¹ resztêadeninow¹ z rRNA [13, 18]. W przypadku holotoskyndomena B wi¹¿e siê z powierzchni¹ komórki, nastêpniekatalityczna domena A ulega translokacji do cytozolu.Aby proces ten przebiega³ prawid³owo, niezbêdna jestredukcja mostku dwusiarczkowego ³¹cz¹cego obieomeny. Dok³adny mechanizm przemieszczenia dome-ny A przez b³onê komórkow¹ nie jest znany, procesten jest najprawdopodobniej ró¿ny dla poszczegól-nych toksyn rolinnych. RIP uniemo¿liwiaj¹ przy³¹-czanie siê czynnika translacyjnego EF-1 i EF-2 dopodjednostki 60S rybosomu poprzez usuniêcie A4324

    w 28S rRNA. Rycyna usuwa równie¿ s¹siaduj¹c¹G4323. mieræ komórki jest zwi¹zana z apoptoz¹.

    2.3. Toksyny zwierzêce

    C y t o t o k s y c z n e k a t i o n o w e p e p t y d yz j a d u N a j a n a j a s i a m e n s i s

    W jadzie indochiñskiej kobry pluj¹cej znalezionowiele cytotoksycznych peptydów kationowych (CTX)wykazuj¹cych du¿¹ homologiê i sk³adaj¹cych siêz 6063 aminokwasów, które tworz¹ cztery mostkidwusiarczkowe buduj¹ce centralny, globularny region,z którego wystaj¹ trzy pêtle.

    W przeciwieñstwie do niektórych kationowychpeptydów takich jak melityna, która wystêpuje w jadziepszczo³y i powoduje lizê komórek ka¿dego rodzaju,

    CTX preferencyjnie zabija komórki czerniaka oraz ko-mórki nowotworowe centralnego uk³adu nerwowego.Ponadto wykazano, ¿e CTX równie¿ powoduje lizêb³on komórkowych nowotworowych limfocytów Tw stê¿eniach du¿o ni¿szych ni¿ te, które powoduj¹ lizênormalnych, zdrowych limfocytów T. £atwy sposóbizolacji oraz wysoka wydajnoæ tego procesu stanowi¹kolejn¹ zaletê CTX. Struktura CTX jest dobrze pozna-na i scharakteryzowana. Ma³y rozmiar tych peptydówjest kolejn¹ zalet¹, gdy¿ dziêki temu nie oddzia³uj¹one z przeciwcia³ami monoklonalnymi skierowanymiprzeciw antygenom specyficznym dla nowotworów,a wiêc nie obni¿aj¹ aktywnoci immunotoksyn [65].

    2.4. Toksyny grzybowe

    R e s t r y k t o c y n a A s p e r g i l l u s r e s t r i c t u sRestryktocyna produkowana jest przez A. restrictus,

    nale¿y do grzybowych rybotoksyn i jest jednym z naj-silniejszych znanych inhibitorów translacji. Mechanizm

    Rys. 4. Rolinne toksyny i chemiczne koniugaty.Holotoskyny (np. rycyna i abryna) zawieraj¹ domenê katalityczn¹ (A)i wi¹¿¹c¹ (B) po³¹czone ze sob¹ mostkiem dwusiarczkowym, natomiasthemitoksyny zawieraj¹ tylko domenê katalityczn¹ (A). Ca³a cz¹steczkarycyny posiada wiele grup wêglowodanowych oraz reszt, które wi¹¿¹siê do komórek w¹troby i innych zdrowych tkanek. Redukcja mostkudwusiarczkowego pozwoli³a otrzymaæ ³añcuch A rycyny (RTA), któryma zmniejszon¹ zdolnoæ wi¹zania do normalnych tkanek. Aby bardziejobni¿yæ niespecyficzne wi¹zanie do normalnych tkanek skonstruowanorRA (rekombinowany RTA w Escherichia coli), dgA (chemicznie degli-kozylowany RTA) oraz bR (chemicznie zablokowane grupy wêglowoda-nowe na RTA). Immunotoksyny otrzymywane metodami chemicznymizawieraj¹ toksynê po³¹czon¹ najczêciej z przeciwcia³em monoklonal-nym. Miejsce po³¹czenie toksyny z przeciwcia³em oraz stosunek toksyny

    do przeciwcia³a w chemicznych koniugatach nie jest sta³y.

  • 244 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    jej dzia³ania jest prosty: restryktocyna przecina poje-dyncze wi¹zanie fosfodiestrowe w 28S rRNA w wy-niku czego translacja zostaje zatrzymana. Ze wzglêduna brak domeny wi¹¿¹cej, aby restryktocyna zadzia³a,niezbêdne jest dostarczenie jej do komórki [9]. Jestto zalet¹ w przypadku wykorzystania restryktocynydo tworzenia immunotoksyn, dziêki czemu mo¿napomin¹æ etap usuwania oryginalnej domeny wi¹¿¹cej,która jest niepo¿¹dana.

    3. Cz¹steczki nonikowe

    Do konstruowania immunotoksyn mo¿na wyko-rzystaæ kilka rodzajów cz¹steczek nonikowych (roz-poznaj¹ ró¿ne struktury powierzchniowe), np. prze-ciwcia³a lub ich fragmenty, cytokiny, czynniki wzrostuoraz rozpuszczalne receptory [18]. Cz¹steczki te s¹niezbêdne, gdy¿ to w³anie one odpowiadaj¹ za spe-cyficznoæ immunotoksyn.

    3.1. Przeciwcia³a i ich pochodne

    G³ównym rodzajem cz¹steczek nonikowych wy-korzystywanych w immunotoksynach s¹ przeciwcia³alub ich fragmenty. Dzieje siê tak ze wzglêdu na ichzdolnoci do selektywnego rozpoznawania i wi¹zaniaró¿norodnych antygenów. Pierwsze immunotoksynywykorzystywa³y poliklonalne przeciwcia³a po³¹czonez niemodyfikowanym bia³kiem toksyny np. b³oniczej[83]. W ci¹gu kolejnych lat badañ przeciwcia³a po-liklonalne zosta³y wyparte przez przeciwcia³a mono-klonalne (mAb). Koniugaty zbudowane z przeciwcia³po³¹czonych z toksyn¹ znalaz³y szerokie zastosowa-nie, pocz¹wszy od oczyszczania szpiku kostnego exvivo a skoñczywszy na leczeniu hematologicznychi litych nowotworów [18].

    W przypadku komórek nowotworowych, wieleu¿ywanych przeciwcia³ monoklonalnych jest skie-rowanych przeciwko antygenom ró¿nicowania, którewystêpuj¹ równie¿ na normalnych komórkach zdro-wych tkanek. Jednak¿e komórki rakowe charaktery-zuj¹ siê du¿o wy¿szym poziomem ekspresji niektórychantygenów ró¿nicowania, dziêki czemu mog¹ byæ pre-ferencyjnie zabijane. W przypadku, gdy przeciwcia³amonoklonalne skierowane przeciwko komórkom nowo-tworowym reaguj¹ z normalnymi tkankami, nie musito stanowiæ powodu do zaprzestania wykorzystywaniadanej immunotoksyny, gdy¿ niskie zagêszczenie anty-genów, bariery anatomiczne oraz ma³o wydajna endo-cytoza mog¹ obni¿aæ efektywnoæ zabijania normal-nych komórek posiadaj¹cych na swojej powierzchnistruktury wystêpuj¹ce równie¿ na komórkach nowo-tworowych. Z drugiej strony niektóre interakcje im-munotoksyn z normalnymi komórkami, uszkadzaj¹ce

    tkanki niezbêdne do prawid³owego funkcjonowaniaorganizmu, mog¹ byæ niemo¿liwe do wykrycia standar-dowymi metodami. Z tego w³anie powodu potrzebnes¹ odpowiednie modele zwierzêce, na których mo¿naby testowaæ bezpieczeñstwo nowych terapeutyków,które mia³yby byæ stosowane do leczenia ludzi [18].

    Jedn¹ z najwiêkszych wad przeciwcia³ monoklo-nalnych jako cz¹steczek nonikowych jest ich immuno-gennoæ spowodowana mysim pochodzeniem. W przy-padku gdy w terapiach poprzedzaj¹cych zastosowanieimmunotoksyny podawano immunosupresanty lubw przypadku gdy chory ma obni¿on¹ odpornoæ w wy-niku przebywanej choroby, immunogennoæ nie od-grywa tak znacz¹cej roli. Jednak¿e w sytuacji gdyorganizm jest w stanie wytworzyæ normaln¹ odpowiedimmunologiczn¹ przeciwko immunotoksynie stanowito du¿y problem. Zastosowanie chimerycznych lubhumanizowanych przeciwcia³ monoklonalnych mo¿eobni¿yæ immunogennoæ [7, 18, 51, 78, 93].

    Przeciwcia³a o podwójnej swoistoci, rozpoznaj¹-ce zarówno struktury powierzchniowe komórek jaki bia³ka toksyn, s¹ równie¿ badane pod k¹tem ichpotencjalnego zastosowania jako cz¹steczek noniko-wych. Powstaj¹ one na skutek chemicznego po³¹cze-nia dwóch ró¿nych przeciwcia³ monoklonalnych lubs¹ wytwarzane przez linie komórkowe zwane hybrid-hybrydoma powstaj¹ce na skutek po³¹czenia dwóchhybrydom (hybrydoma powstaje w wyniku fuzji nor-malnej komórki np. ledziony myszy z komórk¹ no-wotworow¹ np. ch³oniaka, u¿ywana do uzyskiwaniaprzeciwcia³ monoklonalnych) [7, 18, 78].

    3.2. Cytokiny, czynniki wzrostu oraz hormony

    Inne rodzaje cz¹steczek nonikowych wykorzys-tywanych do konstrukcji immunotoksyn to g³ówniecytokiny i czynniki wzrostu, takie jak IL-2, IL-3,IL-4, IL-6, EGF, GM-CSF, transferyna oraz NGF.Mimo, ¿e wykazuj¹ one powinowactwo do normal-nych komórek, to receptory przez nie rozpoznawaneulegaj¹ podwy¿szonej ekspresji podczas aktywacji ko-mórek, ró¿nicowania oraz rozwoju nowotworu, dziêkiczemu mo¿na je wykorzystaæ do celowania w okre-lone niewielkie populacje komórek [18].

    Cytokiny i czynniki wzrostu s¹ bardzo efektywnepod wzglêdem wi¹zania struktur powierzchniowych,gdy¿ wykazuj¹ kilkukrotnie wy¿sze powinowactwow porównaniu do przeciwcia³ monoklonalnych. Ponad-to na drodze endocytozy zale¿nej od receptorów mog¹transportowaæ immunotoksyny do wnêtrza komórekz du¿o wiêksz¹ wydajnoci¹ ni¿ ma to miejsce w przy-padku przeciwcia³ [34]. Kolejn¹ zalet¹ jest ludzkie po-chodzenie cytokin i czynników wzrostowych, dziêkiczemu nie s¹ immunogenne. Du¿a dostêpnoæ sklono-wanych sekwencji genów koduj¹cych te cz¹steczki

  • 245IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    umo¿liwia ³atwe manipulacje w celu stworzenia bia-³ek fuzyjnych [18].

    Potencjalnymi wadami wi¹¿¹cymi siê z zastosowa-niem cytokin lub czynników wzrostu jako cz¹steczeknonikowych w immunotoksynach jest bardzo szybkietempo usuwania ich z organizmu. Powa¿ny problemstanowi równie¿ mo¿liwoæ promowania proliferacjikomórek docelowych w przypadku gdy stê¿enie cyto-kin/czynników wzrostu by³oby niewystarczaj¹ce douzyskania efektu toksycznego. Kolejn¹ wad¹ jest obec-noæ w organizmie rozpuszczalnych receptorów i ligan-dów, które mog¹ obni¿aæ skutecznoæ immunotoksynyzawieraj¹cej tego typu cz¹steczki nonikowe [18, 54].

    Hormony rzadko s¹ wykorzystywane w roli cz¹ste-czek nonikowych, a zwi¹zki powsta³e z po³¹czeniahormonów z toksynami bia³kowymi nosz¹ nazwê hor-monotoksyn [18].

    4. Skutki uboczne dzia³ania immunotoksyn

    Wszystkie immunotoksyny wywo³uj¹ niepo¿¹dan¹toksycznoæ w stosunku do zdrowych tkanek. Wródskutków ubocznych mo¿na wyró¿niæ trzy najwa¿niej-sze objawy, które pojawiaj¹ siê podczas stosowaniawiêkszoci immunotoksyn. S¹ to zespó³ przesiêkanianaczyniowego (VLS), hepatotoksycznoæ oraz zespó³hemolityczno-mocznicowy (HUS). Stanowi to du¿yproblem, gdy¿ w znacznym stopniu ogranicza mo¿li-woæ stosowania immunotoksyn w terapii klinicznej.

    4.1. Zespó³ przesiêkania naczyniowego (VLS)

    Zespó³ przesiêkania naczyniowego jest g³ównymskutkiem ubocznym limituj¹cym dawki immunotok-syn [43, 95]. Objawy towarzysz¹ce VLS to zwiêkszo-na przepuszczalnoæ naczyñ krwiononych, wycieka-nie p³ynów, wskutek czego powstaje ródmi¹¿szowyobrzêk i uszkodzenie organów. Poza tym zaobserwo-wano równie¿ pojawienie siê podcinienia, hypoalbu-minemiê (obni¿one stê¿enie albumin krwi), mocznicêoraz obrzêk p³uc [64].

    Po do¿ylnym podaniu terapeutyku cz¹steczki immu-notoksyny, aby dostaæ siê do tkanek, maj¹ do pokona-nia barierê, jak¹ stanowi¹ ciany naczyñ krwiononych,musz¹ wiêc przejæ przez wewnêtrzn¹ ich warstwê ko-mórek ródb³onka [42, 43]. W momencie, w którymnastêpuje kontakt miêdzy komórkami ródb³onkaa cz¹steczkami immunotoksyny, zachodz¹ procesyinicjuj¹ce powstanie VLS [43]. Mechanizm pozostajena razie niejasny. Najprawdopodobniej zawiera ci¹gzdarzeñ, które zaczynaj¹ siê w komórkach ródb³onkai ³¹cz¹ w sobie kaskadê reakcji odpowiedzi zapalnejoraz aktywnoæ cytokin [88]. Przypuszcza siê, ¿e nie-specyficzne wch³anianie immunotoksyn przez makro-

    fagi skutkuje uwolnieniem cytokin, które porednicz¹w kolejnych reakcjach skutkuj¹cych wyst¹pieniemVLS. Natomiast wnikanie immunotoksyn do komórekródb³onka powoduje uwalnianie tlenku azotu, który naskutek utleniania powoduje uszkodzenia, które równie¿indukuj¹ powstanie VLS [64, 87].

    Dowiedziono, ¿e istnieje motyw aminokwasowyodpowiedzialny za indukcjê VLS przez ró¿ne cz¹s-teczki immunotoksyn, który jest odpowiedzialny zaich wi¹zanie siê do komórek ródb³onka i inicjacjê,a nastêpnie propagacjê VLS. Ten zidentyfikowany mo-tyw to (x)D(y), gdzie w miejscu x wystêpuj¹ takie ami-nokwasy jak: leucyna, izoleucyna, glicyna lub walina,natomiast w miejscu oznaczonym y znajduje siê wali-na, leucyna lub seryna. Z wczeniejszych badañ wy-nika, ¿e wprowadzenie mutacji w obrêbie tego motywulub w sekwencjach blisko z nim s¹siaduj¹cych mo¿ezmniejszyæ lub nawet zapobiec powstaniu VLS [88].

    Grupa badaczy z Szanghaju przeprowadzi³a do-wiadczenie, w którym poprzez mutacje wprowadzilizmiany w motywie podejrzewanym o wywo³ywanieVLS. Otrzymali oni osiem ró¿nych zmutowanych wer-sji immunotoksyny SMFv-PE38KDEL zawieraj¹cychzmiany w sekwencji aminokwasowej wewn¹trz bada-nego motywu. Przeprowadzono testy cytotoksycznocina liniach komórkowych a nastêpnie in vivo na modelumysim. Po zebraniu i porównaniu wyników stwier-dzono, ¿e uda³o im siê tak zmodyfikowaæ cz¹steczkêimmunotoksyny, ¿e jej podanie praktycznie nie wywo-³ywa³o VLS, a skutecznoæ zabijania komórek docelo-wych by³a równie¿ prawie nie zmieniona w porówna-niu do cz¹steczki wyjciowej [88].

    Poza wy¿ej wspomnian¹ mutagenez¹ istniej¹ rów-nie¿ inne metody zmniejszenia objawów VLS. Mo¿nato osi¹gn¹æ poprzez konstruowanie immunotoksyn,których czas pó³trwania w osoczu jest krótki orazprzez zmniejszenie rozmiarów cz¹steczek. Ponadtopodawanie leków przeciwzapalnych oraz rodkówzapobiegaj¹cych wi¹zaniu siê immunotoksyn do ko-mórek ródb³onka mo¿e mieæ równie¿ pozytywnyefekt w postaci zmniejszenia czêstoci wystêpowaniazespo³u przesiêkania naczyniowego [64, 87].

    4.2. Hepatotoksycznoæ

    Hepatotoksycznoæ zwi¹zana jest w du¿ym stop-niu z produkcj¹ cytokin przez komórki Kupffera w w¹-trobie [42]. Stanowi to kolejny czynnik limituj¹cydawki potencjalnych terapeutyków opartych o immu-notoksyny [43]. Zosta³o to najlepiej zbadane na przy-k³adzie egzotoksyny A P. aeruginosa, która jest wy-korzystywana w wielu immunotoksynach.

    Badania in vitro nad wp³ywem PE dowodz¹, ¿ezwiêksza ona produkcjê TNF-" w ludzkich leuko-cytach oraz w mysich komórkach Kupffera [11, 27].

  • 246 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    Dowiedziono równie¿, ¿e TNF-" ³¹czy siê z w¹trobo-wym receptorem dla TNF (TNF-R), co indukuje apop-tozê hepatocytów poprzez blokowanie aktywacji czyn-nika transkrypcyjnego NF-6B. Jest to nietypowe, gdy¿zazwyczaj TNF-" aktywuje NF-6B. Ponadto poprzezreceptor TNF-R zachodzi in vivo indukcja hepatotok-sycznoci zale¿nej od limfocytów T. Poza tym udo-wodniono, ¿e PE w sposób poredni indukuje prolifera-cje splenocytów, aktywuje limfocyty T cytotoksyczne,wp³ywa na wydzielanie przez limfocyty T CD8+ per-foryn oraz indukcje hepatotoksycznoci in vivo. PEwp³ywa równie¿ na zwiêkszenie iloci produkowa-nych cytokin (oprócz TNF-"), takich jak IL-1 ", IL-2,IL-6, IFN-( oraz IL-18 [11].

    4.3. Zespó³ hemolityczno-mocznicowy (HUS)

    Efekt uboczny w postaci HUS zaobserwowano je-dynie w przypadku badañ nad immunotoksyn¹ BL22(RFB4Fv-PE38). W przypadku badania pozosta³ychimmunokonigatów zawieraj¹cych elementy egzotok-syny A nie stwierdzono wyst¹pienia HUS [43, 61].Objawami typowymi dla zespo³u hemolityczno-mocz-nicowego s¹ ostra niewydolnoæ nerek, ich mikroan-giopatyczna niedokrwistoæ oraz trombocytopenia [61].Niestety mechanizm oraz czynniki odpowiedzialne zawywo³ywanie HUS przez BL22 s¹ jak dot¹d nieznane.

    4.4. Inne skutki uboczne

    Do pozosta³ych skutków ubocznych, wystêpuj¹cychnie tylko podczas podawania immunotoksyn nale¿¹:nudnoci, wymioty, biegunka, odpowiedzi zapalne itp.W celu z³agodzenia tych objawów mo¿na podawaæprofilaktyczne leki.

    5. Próby zastosowania immunotoksyn

    W krajach wysoko rozwiniêtych gospodarczo od-setek ludzi choruj¹cych na nowotwory stale siê po-wiêksza. Dotychczas nie uda³o siê opracowaæ w pe³niskutecznej terapii przeciwnowotworowej, która by³abywysoce specyficzna i zarazem skuteczna, dlatego te¿coraz wiêcej uwagi powiêca siê immunotoksynom.Badania nad nimi s¹ prowadzone w wielu laborato-riach na ca³ym wiecie. Jednak¿e zanim te potencjalneterapeutyki zostan¹ zatwierdzone i wprowadzone dou¿ycia w terapiach klinicznych, musz¹ one przejæszereg bardzo rygorystycznych testów, maj¹cych nacelu okrelenie ich parametrów farmakokinetycznychjak równie¿ zidentyfikowanie i ewentualne wyelimi-nowanie niepo¿¹danych efektów ubocznych.

    Testy przedkliniczne przeprowadzane s¹ in vitro nahodowlach komórkowych oraz in vivo na modelach

    zwierzêcych, którymi zazwyczaj s¹ myszy, szczury lubte¿ ma³py. Nastêpnym etapem s¹ testy kliniczne, prze-prowadzane na ludziach. Ich celem jest zasadniczeokrelenie skutecznoci oraz przede wszystkim bez-pieczeñstwa stosowanie danego terapeutyku. Mo¿nawyró¿niæ 5 faz testów klinicznych faza 0, I, II, IIIi IV. W ka¿dym kolejnym etapie grupa pacjentów pod-dawana badaniu jest coraz liczniejsza, pocz¹wszy od1015 osób a skoñczywszy na kilku tysi¹cach.

    W poni¿szym rozdziale przedstawiono wybraneimmunotoksyny i stopieñ zaawansowania badañ nadnimi oraz wyniki ich zastosowania w testach przedkli-nicznych i klinicznych.

    5.1. Testy przedkliniczne

    5.1.1. Immunotoksyny oparte o PE

    Wiêkszoæ immunotoksyn przechodz¹cych obecnieetap badañ przedklinicznych jest oparta o egzotoksy-nê A P. aeruginosa. Informacje na temat wiêkszociz nich znajduj¹ siê w tabeli I. Oto kilka przyk³adów.

    Szwajcarska grupa badawcza pod przewodnictwemSandry Z i m m e r m a n n skonstruowa³a immunotok-synê (MOC31-ETA252-613) sk³adaj¹c¹ siê z ETA252-613,czyli fragmentu PE pozbawionego domeny I (wi¹¿¹-cej) i zawieraj¹cego dwie lizyny na N-koñcu, po³¹czo-nego z przeciwcia³em monoklonalnym MOC31 skie-rowanym przeciwko EGP-2 antygenowi obecnemuna powierzchni wielu komórek nowotworowych, m.in.drobnokomórkowego raka p³uc (SCLC) oraz rakagruczo³owego p³uc. Zalet¹ tego antygenu jest jegoograniczona obecnoæ na zdrowych komórkach na-b³onkowych. Badana immunotoksyna wykaza³a cyto-toksycznoæ wzglêdem komórek SCLC, w którychekspresji ulega EGP-2, niezale¿nie od stopnia ichopornoci na chemioterapiê. Myszy pozbawione grasi-cy z podskórnymi ksenograftami opornego na chemio-terapiê SCLC oraz raka gruczo³owego p³uc zosta³ypoddane dzia³aniu MOC31-ETA252-613. W przypadkuobu modeli nowotworów skutecznoæ podanej immu-notoksyny by³a zale¿na od obecnoci EGP-2 na po-wierzchni komórek, wielkoci dawki by³a odwrotnieproporcjonalna do rozmiarów nowotworu. Brak efek-tu w stosunku do du¿ych, aktywnych ksenograftówmo¿e byæ spowodowany niewystarczaj¹c¹ penetracj¹tkanek nowotworu przez badan¹ immunotoksynê, como¿e wynikaæ z du¿ych rozmiarów cz¹steczki [19].

    Kolejn¹ immunotoksyn¹ godn¹ zwrócenia uwagijest G28-5 sFv-PE40. Cz¹steczk¹ nonikow¹ u¿yt¹ dojej konstrukcji jest G28-5 sFv, jedno ³añcuchowa czêæzmienna przeciwcia³a monoklonalnego G28-5 skiero-wanego przeciwko antygenowi CD40, który ulega sil-nej ekspresji w komórkach nowotworów z³oliwychlimfocytów B, takich jak bia³aczka limfocytów B, NHL

  • 247IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    CD19-ETA scFv po³¹czone z PE38KDEL CD19 Ch³oniak, bia³aczka [75]

    Anty-Tac(Fv)-PE38KDEL [LMB2] scFv po³¹czone z PE38KDEL CD25 CD25 [67]+ komórki nowotworowe [67]

    Anty-Tac(Fv)-PE40KDEL scFv po³¹czone z PE40KDEL CD25 Bia³aczka limfatyczna [38]przewlek³a

    RTF5(scFv)-ETA scFv po³¹czone z PE40 CD25 Ch³oniak [3]

    RFB(dsFv)-PE38 [BL22] scFv po³¹czone z PE38 CD22 Bia³aczka [39]

    G28-5sFv-PE40 scFv po³¹czone z PE40 CD40 Ch³oniak Burkitta [20]

    Ki4(scFv)-ETA scFv po³¹czone z PE40 CD30 Ch³oniak Hodkina [35]

    CD7-ETA scFv po³¹czone z PE40 CD7 Ostra bia³aczka [62]limfoblastyczna

    OVB3-PE mAb po³. mostkiem dwusiarczk. Jajnikowy Jajnika [91]z PE

    B3-Lys-PE38 [LMB-1] mAb chemicznie po³¹czone LeY Ró¿ne [69]z PE38

    B1(dsFv)-PE38 dsFv po³¹czone z PE38 LeY LeY [5]+ komórki nowotworowe

    B3(dsFv)-PE38 dsFv po³¹czone z PE38 LeY LeY [5]+ komórki nowotworowe

    BR96sFv-PE40 [SGN-10] dsFv po³¹czone z PE40 LeY LeY [24]+ komórki nowotworowe

    IL4(38-37)PE38KDEL [NBI-3001] IL4 po³¹czone z PE38KDEL IL4-R Piersi, SCCHN, trzustki, [32]neuroblastoma

    IL13-PE38QQR IL13 po³¹czone z PE38QQR IL13-R G³owy i szyi [33]

    scFv(FRP5)-ETA scFv po³¹czone z PE40 erbB2 Jajnika, prostaty [72]

    AR209[e23(Fv)PE38KDEL] scFv po³¹czone z PE38KDEL erbB2 P³óc, prostaty [79, 80]

    Erb-38 scFv po³¹czone z PE38 erbB2 Naskórkowy, piersi [66]

    MR1(Fv)-PE38 scFv po³¹czone z PE38 EGFRvIII Gliomblastoma [4]

    TP38 TGF-a po³¹czone z PE38 EGFR Glioma [70]

    TP40 TGF-a po³¹czone z PE40 EGFR Glioma, prostate, [47]epidermoid

    425.3PE mAb chemicznie po³¹czone z PE EGFR Piersi [2]

    A5-PE40 scFv po³¹czone z PE40 PSMA Prostaty [94]

    SS1(dsFv)PE38[SS1P] dsFv po³¹czone z PE38 Mezotelina Jajnika, trzustki [28]

    scFv(MUC1)-ETA scFv po³¹czone z PE40 MUC1 Piersi [77]

    9.2.27-PE mAb chemicznie po³¹czone z PE HMW-MAA Gliomblastoma [29]

    TP-3(scFv)-PE38 scFv po³¹czone z PE38 Antygen Ostrosarcoma [55]osteosarcomy

    TP-3(dsFv)-PE38 dsFv po³¹czone z PE38 Antygen Ostrosarcoma [55]osteosarcomy

    8H9(dsFv)-PE38 dsFv po³¹czone z PE38 Glikoproteina Piersi, ostrosarcoma, [56]powierzchniowa neuroblastoma

    4D5MOCB-ETA scFv po³¹czone z PE40KDEL Ep-CAM P³uc, jelita grubego, SCC [12]

    HB21(Fv)-PE40 scFv po³¹czone z PE40 TfR Jelita grubego [76]

    Skróty: dsFV, Fv, stabilizowany mostkiem dwusiarczkowym; EGFR, receptor naskórkowego czynnika wzrostu; EGFRvIII, mutant delecyjny EGFR;erbB2, HER2/neu-receptor; HMW-MAA, antygen czerniaka o du¿ej masie molekularnej; IL13-R, receptor interleukiny 13; IL4-R, receptor interleu-kiny 4; LeY, antygen Lewisa; mAb, przeciwcia³o monoklonalne; MUC1, bia³ko z rodziny mucin; PE, egzotoksyna P. aeruginosa (aa 1-613); PE38,skrócona forma PE (aa253-364 i 381-613); PE38KDEL, PE38 z motywem zatrzymania retikulum endoplazmatycznego (KDEL) na C-koñcu;PE38QQR, PE38 z zamienionymi lizynami 590 i 606 na glutaminy i lizyn¹ 613 na argininê; PE40, skrócona forma PE (aa 253-613); PE40 KDEL,PE40 z motywem zatrzymania retikulum endoplazmatycznego (KDL) na C-koñcu; PSMA, antygen b³onowy specyficzny dla prostaty; SCC, rakp³askokomórkowy; SCCHN, rak p³askokomórkowy g³owy i szyi; scFv, jedno³añcuchowe Fv; TfR, receptor transferryny; TGF-", transformuj¹cyczynnik wzrostu alfa [wg 40, zmienione].

    Tabela ITesty przedkliniczne immunotoksyn opartych o PE

    Immunotoksyna KonstrukcjaWi¹zanyantygen

    NowotwórPimien-nictwo

  • 248 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    (ch³oniak nieziarniczy), HD (choroba Hodgkina) orazró¿nego rodzaju szpiczakach. W badaniu wykorzysta-no myszy SCID posiadaj¹ce ksenografty ludzkiegoch³oniaka. Zaobserwowano terapeutyczn¹ wydajnoæ,która by³a zale¿na od dawki oraz harmonogramu po-dawania immunotoksyny. Ze wzglêdu na wystêpowa-nie CD40 na rozmaitych zdrowych ludzkich tkankach,przeprowadzono badanie na makakach w celu okre-lenia niepo¿¹danej toksycznoci, których wyniki by³yobiecuj¹ce w przypadku dawek o dzia³aniu terapeu-tycznym, dziêki czemu G28-5 sFv-PE40 zosta³o za-kwalifikowane do testów klinicznych [20, 90, 95].

    IL-4(38-37)-PE38KDEL lub inaczej NBI-3001 jestimmunotoksyn¹ skierowan¹ przeciwko receptorowi dlaIL-4, który jest znajdowany na powierzchni komórekguzów litych i z³oliwych nowotworów hematologicz-nych. W testach przedklinicznych przeprowadzonychna komórkach ró¿nych nowotworów, wykazano regre-sje u myszy nios¹cych ksenografty ludzkiego rakapiersi, g³owy, szyi, SSCHN oraz raka trzustki [42, 95].NBI-3001 przesz³o pozytywnie etap testów przedkli-nicznych i zosta³o dopuszczone do testów klinicznych.

    Grupa niemieckich badaczy opracowa³a immuno-toksynê scFv(FRP5)-ETA, zawieraj¹c¹ jedno-³añcu-chow¹ czêæ zmienn¹ przeciwcia³a monoklonalnegoskierowanego przeciwko komórkom nowotworowymz nadekspresj¹ ErbB2 (HER2). Eksperymenty in vitrowykaza³y silne w³aciwoci przeciwnowotworowew stosunku do komórek raka piersi, raka jajnika,SSCHN i raka prostaty. Na modelach zwierzêcychzaobserwowano zahamowanie wzrostu przeszczepio-nych ludzkich nowotworów oraz nowotworów mysichi szczurzych transfekowanych ludzkim c-erbB2. Za-równo bezporednie nastrzykniêcie raka, jak i do¿ylnepodanie immunotoksyny efektywnie usunê³o podskór-nie rosn¹ce nowotwory. Ze wzglêdu na dobre wynikiw testach przedklinicznych, scFv(FRP5)-ETA zosta³odopuszczone do testów klinicznych [7, 14, 95].

    Inna niemiecka grupa badawcza skonstruowa³ai przeprowadzi³a badania nad A5-PE40, immunotok-syn¹ opart¹ o jedno ³añcuchow¹ czêæ zmienn¹ prze-ciwcia³a monoklonalnego skierowanego przeciwkoPSMA. Jest to specyficzny dla komórek prostaty an-tygen wystêpuj¹cy równie¿ w naczyniach krwiono-nych wiêkszoci innych guzów litych. W badaniachin vitro na hodowlach komórkowych, w których eks-presji ulega PSMA wykazano wysok¹ skutecznoæcytotoksyczn¹ badanej immunotoksyny. Ponadto testyna myszach nios¹cych ksenografty wykaza³y znacz¹cezahamowanie wzrostu nowotworów [57, 95].

    5.1.2. Immunotoksyny oparte o DT

    DT388GMCSF jest immunotoksyn¹ zawieraj¹c¹toksynê b³onicz¹ pozbawion¹ domeny wi¹¿¹cej. Wyka-

    zano, ¿e zabija ona wiêkszoæ z³oliwych CFC (colonyforming cell komórka tworz¹ca kolonie) oraz czêæLTC-IC (long-term culture-initiating cells komórkainicjuj¹ca d³ugoterminow¹ hodowlê) ostrej bia³aczkiszpikowej (AML). Jednak¿e w póniejszych bada-niach, pomimo pocz¹tkowego zmniejszenia siê ilocikomórek bia³aczki w szpiku kostnym myszy, zaobser-wowano wzrost z³oliwych komórek, które nie odpo-wiada³y na ponowne podanie preparatu [81, 96].

    Kolejn¹ immunotoksyn¹ skonstruowan¹ przez tensam zespó³ jest DT388-IL-3 skierowana przeciwko ko-mórkom posiadaj¹cym na swojej powierzchni IL-3R.Komórki ostrej bia³aczki szpikowej wykazuj¹ wy-sok¹ ekspresjê podjednostki " IL-3R. Podczas badañin vitro zaobserwowano siln¹ cytotoksycznoæ wobeckomórek AML. Ponadto w hodowlach potraktowa-nych DT388-IL-3 wykazano ponowny wzrost komórekLTC-IC i SC-IC, co mo¿e sugerowaæ, ¿e ta immuno-toksyna jest specyficzna wobec komórek progenitoro-wych bia³aczki [81, 87].

    5.2. Testy kliniczne

    Wiêkszoæ z opisywanych immunotoksyn bêd¹cychna etapie badañ klinicznych przedstawiona jest rów-nie¿ w tabeli II.

    5.2.1. Immunotoksyny oparte o PE

    BL22 jest immunotoksyn¹, w sk³ad której wchodziPE38 po³¹czone mostkiem dwusiarczkowym z czêci¹zmienn¹ przeciwcia³a anty-CD22 (RFB4). BL22 skie-rowany jest przeciwko bia³aczkom i ch³oniakom.Pierwsz¹ fazê testów klinicznych przeprowadzano napacjentach choruj¹cych na ró¿ne typy bia³aczki, wobecktórych standardowe metody okaza³y siê nieskutecznei którzy nie mieli wczeniej wytworzonych przeciw-cia³ anty-PE38. Zaobserwowano wysok¹ skutecznoæw przypadku stosowania tego preparatu wobec HCL(hairy cell leukemia bia³aczka w³ochatokomórkowa).Po kilkukrotnym podaniu immunotoksyny poziomprzeciwcia³ wytworzonych przeciwko preparatowi by³na niskim poziomie. Niestety u dwóch pacjentów cho-ruj¹cych na HCL po podaniu BL22 wyst¹pi³ zespó³hemolityczno-mocznicowy. Ponadto wród pacjentówz HCL efektem ubocznym ograniczaj¹cym wielkoæstosowanych dawek by³ zespó³ uwolnienia cytokin.BL22 jest pierwszym preparatem od momentu odkry-cia analogów purynowych, który spowodowa³ u du¿ejczêci pacjentów z HCL poddanych badaniu ca³kowit¹remisjê nowotworu. Sukces odniesiony wród pacjen-tów z HCL opornym na chemioterapiê jest zwi¹zanyz wysokim poziomem i konserwatywnoci¹ CD22na komórkach HCL. Druga faza testów klinicznychna wiêkszej grupie pacjentów potwierdzi³a wyniki

  • 249IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    otrzymane w pierwszej fazie. Czêstoæ wystêpowaniaHUS i immunogennoæ by³a obni¿ona, natomiast iloæca³kowitych remisji i pozosta³ych pozytywnych od-powiedzi na podanie BL22 by³a znacznie wy¿sza[7, 8, 15, 4143, 61, 95].

    LMB-2 (anty-Tac(Fv)-PE38KDEL) w pierwszejfazie testów klinicznych zosta³ podany 35 pacjentomchoruj¹cym na bia³aczki, ch³oniaki lub HD, które by³yoporne na standardow¹ chemioterapiê. U wszystkich

    pacjentów z HCL zaobserwowano odpowied w³¹czniez jednym przypadkiem ca³kowitej remisji. Pacjenciz CLL (przewlek³a bia³aczka limfocytowa/chronic lym-phocytic leukemia), ATL (bia³aczka doros³ych limfo-cytow T/adult T-cell leukemia), CTCL (ch³oniak skóryz komórek T/cutaneous T-cell lymphoma) oraz HDodpowiedzieli czêciow¹ remisj¹. Najczêstszymi skut-kami ubocznymi by³o podwy¿szenie poziomu transami-naz, co by³o zwi¹zane z gor¹czk¹, która by³a wywo³ana

    Chemiczne konigaty

    RFT5-dgA CD25 mAb dgA Rycyna HD [74]

    RFB4-dgA CD22 mAb dgA Rycyna B-NHL, CLL [71]

    RFB4-Fab-dgA CD22 Fab dgA Rycyna B-NHL [25]

    HD37-dgA CD19 mAb dgA Rycyna B-NHL [82]

    Anti-CD7-dgA CD7 mAb dgA Rycyna T-NHL [23]

    Ki-4.dgA CD30 mAb dgA Rycyna HD [73]

    LMB-1 Ley mAb Lys-PE38 PE Ró¿ne nowotwory [58]

    TF-CRM107 TFR Tf CRM107 DT Glejak [49]

    B43-PAP CD19 mAb PAP PAP ALL [85]

    Anti-B4-bRicin CD19 mAb bR Rycyna B-NHL [52]

    Ber-H2-Sap6 CD30 mAb Sap6 Saporyna HD [92]

    Anti-My9-bRicin CD33 mAb bR Rycyna AML [53]

    454A12-rRA TFR mAb rRA Rycyna CSF [48]

    N901-bR CD56 mAb bR Rycyna SCLC [53]

    Toksyny rekombinowane

    Ontak IL2R IL-2 DAB389

    DT CTCL, CLL, NHL [16]

    BL22 CD22 dsFv PE38 PE HCL, CLL, NHL [44]

    LMB-2 CD25 scFv PE38 PE NHL, bia³aczki [45]

    DT388-GM-CSF GM-CSF GM-CSF DT388 DT AML [22]

    B3(Fv)-PE38 Ley scFv PE38 PE Ró¿ne nowotwory [60]

    B3(dsFv)-PE38 Ley dsFv PE38 PE Ró¿ne nowotwory [6]

    TP40 EGFR TGF" PE404a PE Rak pêcherza, CIS [26]TP38 EGFR TGF" PE38 PE Glejak [70]BR96(scFv)-PE40 Ley scFv PE40 PE Ró¿ne nowotwory [63]

    erb38 erbB2 dsFv PE38 PE Rak piersi [59]

    NBI-3001 IL4R IL-4(38-37) PE38KDEL PE Glejak [89]

    IL13-PE38QQR IL13R IL-13 PE38QQR PE Nowotwór nerek [46]

    SSI(dsFv)-PE38 Mezotelina dsFv PE38 PE Miêdzyb³onniak [10]

    DAB389

    EGF EGFR EGF DAB389

    DT Ró¿ne nowotwory [17]

    * Wród wymienionych toksyn znajduje siê rekombinowany ³añcuch A rycyny (rRA), zablokowana rycyna (bR), deglikozylowa-ny ³añcuch A rycyny (dgA), przeciwwirusowe bia³ko rolin rodzaju Phytolacca (PAP), skrócona toksyna b³onicza (DT388 lubDAB

    389), skrócona egzotoksyna A P. aeruginosa (PE38 lub PE40) i zmutowana toksyna b³onicza (CRM107). Cz¹steczkami noni-

    kowymi poza przeciwcia³ami monoklonalnymi (mAb) s¹ interleukina-2, -4 i -13 (IL-2, IL-4 i IL-13); czynnik stymuluj¹cy tworze-nie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF); naskórkowy czynnik wzrostu (EGF); transformuj¹cy czynnik wzrostu (TGF-") i transferryna (Tf). PE404A jest to PE40 z alaninami w pozycji 265, 287, 372 i 379 zamienionymi na cysteiny. PE38QQR jest toPE38 z dwoma glutaminami i jedn¹ arginin¹ zamienionymi na 3 lizyny w pozycjach 590, 606 i 613. Wród chorób znajduj¹ siêch³oniak nieziarniczy (NHL), ch³oniak skóry z komórek T (CTCL), choroba Hodgkina (HD), przewlek³a bia³aczka limfocytowa(CLL), rak ródnab³onkowy (CIS), ostra bia³aczka szpikowa (AML), nowotwory przerzutowe takie jak nowotwór mózgowo-rdze-niowy (CSF), nowotwór nerek, drobnokomórkowy rak p³uc (SCLC), ostra bia³aczka limfoblastyczna (ALL) i bia³aczka w³ochato-komórkowa (HCL) [wg 15, zmienione].

    Tabela IIImmunotoksyny poddane testom klinicznym w ostatnich latach*

    Immunotoksyna AntygenCz¹steczkanonikowa

    Skróconatoksyna

    Wyjciowatoksyna

    ChorobaPimien-nictwo

  • 250 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    przez wysoki poziom cytokin. Tylko u niewielkiej gru-py pacjentów przerwano terapiê ze wzglêdu na poja-wienie siê neutralizuj¹cych przeciwcia³. W przypadkupacjentów z CLL po 16 cyklach podawania prepara-tu nie zaobserwowano odpowiedzi immunologicznejw postaci przeciwcia³. Obecnie LMB-2 przechodzidrug¹ fazê testów klinicznych [7, 8, 4143, 95].

    NBI-3001, immunotoksyna wspomniana w poprzed-nim rozdziale, ze wzglêdu na wysok¹ toksycznoæw stosunku do w¹troby przy niskich dawkach postano-wiono wykorzystaæ do terapii miejscowej wieloposta-ciowych glejaków. W przypadku jednego z pacjentówpoddanych terapii wyst¹pi³a rozleg³a nekroza glejaka,która po wielu miesi¹cach zaowocowa³a ca³kowit¹remisj¹. Skutkami ubocznymi by³y obrzêki. Wródkilku pacjentów wymagaj¹cych ponownej operacji,toksyczne efekty w stosunku do zdrowych komórekmózgu zosta³y wykluczone. W pierwszej i drugiejfazie testów klinicznych sporód wszystkich pacjentówu 71% zaobserwowano nekrozê glejaka. NBI-3001przetestowano równie¿ wród chorych na nowotwórnerek oraz niedrobnokomórkowy nowotwór p³uc(NSCLC). Niestety, nie zaobserwowano remisji u ¿ad-nego z badanych, jedynie u czêci z nich rozwój cho-roby zahamowano [42, 95].

    W pierwszej fazie testów klinicznych scFv(FRP5)-ETA podano miejscowo pacjentom z nowotworami,w których ekspresji ulega ErbB2. Grupa ta liczy³a11 osób chorych na raka piersi lub jelita grubegoz przerzutami. Terapia trwa³a od 710 dni. U 60%pacjentów nast¹pi³o znaczne zmniejszenie siê nowo-tworu. Ca³kowity zanik guzów nastrzykniêtych pre-paratem wyst¹pi³ u 40% pacjentów, a u 20% zaobser-wowano czêciowe zmniejszenie. Brak odpowiedziwyst¹pi³ u osób z nowotworami charakteryzuj¹cy-mi siê rednim poziomem ekspresji ErbB2, natomiastczêciowa redukcja lub ca³kowity zanik nowotworuu osób z wysok¹ nadekspresj¹. U dwóch z trzech pa-cjentów przebadanych dok³adnie pod k¹tem przeciw-cia³ skierowanych przeciw immunotoksynie wykrytoich obecnoæ. Objawami niepo¿¹danymi wywo³anymipodaniem scFv(FRP5)-ETA by³ przejciowy ból i sta-ny zapalne w miejscu zastrzyku. Wysoka skutecznoæmiejscowej terapii z u¿yciem scFv(FRP5)-ETA orazniewiele przypadków wyst¹pienia skutków ubocznychsugeruj¹, ¿e podawanie do¿ylne mo¿e równie¿ okazaæsiê skuteczne [14].

    5.2.2. Immunotoksyny oparte o DT

    DAB389IL-2 zwany równie¿ denileukin diftitox lubOntak zosta³ poddany testom klinicznym. W pierwszejfazie wród 35 pacjentów chorych na CTCL zaobser-wowano 5 ca³kowitych remisji i 8 czêciowych. W dru-giej grupie badanych cierpi¹cych na NHL wyst¹pi³a

    jedna ca³kowita remisja i dwie czêciowe. Najczêst-szymi skutkami ubocznymi by³ wzrost poziomu trans-aminaz, spadek stê¿enia albumin krwi, wysypki orazniedocinienie. W trzeciej fazie wród badanych za-obserwowano zarówno czêciowe, jak i ca³kowiteremisje oraz znaczn¹ poprawê stanu skóry. VLS, spo-wodowany uwolnieniem cytokin wskutek zabicialimfocytów T w warstwie oko³onaczyniowej skóryw³aciwej, przebiega³ w wiêkszoci przypadków bezobrzêku p³uc, a profilaktyczne podanie steroidów zapo-biega³o jego wyst¹pieniu. Immunogennoæ po pierw-szym cyklu wzros³a z 32% do 100%, jednak¿e w nie-których przypadkach ponowne podanie by³o skuteczne,co wiadczy ¿e przeciwcia³a anty-DAB389IL-2 nie s¹w pe³ni skuteczne. Denileukin diftitox zosta³ zatwier-dzony przez FDA do leczenia zaawansowanych formCTCL. Wykaza³ równie¿ skutecznoæ wobec innychtypów nowotworów, takich jak ch³oniak T-komór-kowy tkanki podskórnej, CLL, B-NHL. Denileukindiftitox jest jak na razie jedyn¹ immunotoksyn¹ do-puszczon¹ do u¿ycia. Okaza³ siê skuteczny równie¿w stosunku do kilku rodzajów nowotworów hemato-logicznych [42, 43, 95, 96].

    DT388GM-CSF (DTGM) jest immunotoksyn¹ skie-rowan¹ przeciwko komórkowym AML, w którychekspresji ulega GM-CSFR. Badania przeprowadzonona grupie 31 osób chorych na nawracaj¹cy i opornyna chemioterapiê AML. Wyst¹pi³a jedna ca³kowitaremisja oraz dwie czêciowe. Typowym skutkiemubocznym by³ zespó³ uwolnienia cytokin, w celu jegounikniêcia zamieniono GM-CSF na IL3, która w prze-ciwieñstwie do GM-CSF nie wi¹¿e siê do monocytówi makrofagów. Wród 14 z 20 pacjentów posiadaj¹cychwczeniej wytworzone przeciwcia³a anty-DT zaobser-wowano DTGM w osoczu w stê¿eniach wystarczaj¹-cych do wyst¹pienia cytotoksycznoci [42, 43, 96].

    W przypadku preparatu o nazwie DAB389EGFw pierwszej fazie testów klinicznych podano go pa-cjentom z nowotworami prostaty, g³owy, szyi, piersi,p³uc, nerek lub ¿o³¹dkowo-jelitowymi. Odpowied naleczenie by³a niestety ograniczona poprzez wyst¹pie-nie kwasicy kanalikowo-nerkowej oraz odpowiedziimmunologicznej na DAB389EGF. Obecnie pracuje siênad wykorzystaniem tej immunotoksyny do terapiiosób z nowotworami mózgu lub trzustki [42].

    6. Podsumowanie

    W ci¹gu ostatnich czterech dekad wiele immunotok-syn przebadano pod wzglêdem skutecznego leczeniaró¿nego rodzaju nowotworów. Badania prowadzoneby³y zarówno na hodowlach komórkowych, jak rów-nie¿ na modelach zwierzêcych oraz pacjentach. Z ba-dañ tych wynika, ¿e najwiêksz¹ skutecznoæ posiadaj¹

  • 251IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    te preparaty, które oparte s¹ o immunotoksyny o sto-sunkowo ma³ych cz¹steczkach oraz zawieraj¹ce czyn-niki wzrostu lub czêæ zmienn¹ przeciwcia³ jako cz¹s-teczkê nonikow¹. Najbardziej wra¿liwymi okaza³ysiê nowotwory hematologiczne, ze wzglêdu na du¿ydostêp preparatu do docelowych komórek.

    Jednak¿e istnieje wiele typów chorób, wobec którychimmunotoksyny bêd¹ wymaga³y zastosowania ³¹czonejterapii. Ich czasy rozpadu po³owicznego s¹ zbyt ma³e,przez co penetracja guzów litych jest ma³o efektywna.Prawdopodobnie lepsze wyniki mo¿e daæ po³¹czeniestosowania immunotoksyn z innymi rodzajami terapii.Jednym ze sposobów zwiêkszenia skutecznoci mo-g³oby byæ zastosowanie chemioterapii w celu usuniêciaznajduj¹cych siê w tkance nowotworowej niezwi¹za-nych z b³on¹ receptorów dla przeciwcia³ lub ich frag-mentów wykorzystanych w konstrukcji immunotoksyn.Kolejn¹ mo¿liwoci¹ jest zredukowanie nowotworunp. za pomoc¹ chirurgii, radioterapii czy chemioterapii,a nastêpnie potraktowanie mikroskopijnych pozosta-³oci immunotoksynami.

    Wci¹¿ poszerzaj¹ca siê wiedza na temat mechaniz-mów dzia³ania toksyn, dostêpnoæ nowych przeciw-cia³ skierowanych przeciwko ró¿norodnym, coraz bar-dziej specyficznym antygenom nowotworowym orazcoraz szybszy postêp w badaniach powiêkszaj¹cy wie-dzê na temat mechanizmów rz¹dz¹cych powstawa-niem nowotworów mo¿e spowodowaæ, i¿ dalsze ba-dania nad immunotoksynami zaowocuj¹ stworzeniempierwszej skutecznej celowanej terapii antynowotwo-rowej. Olbrzymia rzesza ludzi oczekuje na to z nadzie-j¹, gdy¿ zachorowalnoæ na raka stale ronie.

    Pimiennictwo

    1. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., McKay D.B.: Structureof exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0-Angstromresolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 13201324 (1986)

    2. Andersson Y., Juell S., Fodstad Ø.: Downregulation of theantiapoptotic MCL-1 protein and apoptosis in MA-11 breastcancer cells induced by an anti-epidermal growth factor recep-tor-Pseudomonas exotoxin a immunotoxin. Int. J. Cancer.112, 475483 (2004)

    3. Barth S., Huhn M., Wels W., Diehl V., Engert A.: Construc-tion and in vitro evaluation of RFT5(scFv)-ETA, a newrecombinant single-chain immunotoxin with specific cyto-toxicity toward CD25+ Hodgkin-derived cell lines. Int.J. Mol. Med. 1, 249256 (1998)

    4. Beers R., Chowdhury P., Bigner D., Pastan I.: Immunotoxinswith increased activity against epidermal growth factorreceptor vIII-expressing cells produced by antibody phagedisplay. Clin. Cancer. Res. 6, 28352843 (2000)

    5. Benhar I., Pastan I.: Characterization of B1(Fv)PE38 andB1(dsFv)PE38: single-chain and disulfide-stabilized Fvimmunotoxins with increased activity that cause completeremissions of established human carcinoma xenografts innude mice. Clin. Cancer. Res. 1, 10231029 (1995)

    6. Benhar I., Pastan I.: Identification of residues that stabilizethe single-chain Fv of monoclonal antibodies B3. J. Biol.Chem. 270, 2337323380 (1995)

    7. Brumlik M.J., Daniel B.J., Waehler R., Curiel D.T., Giles F.J.,Curie T.J.: Trends in immunoconjugate and ligand-receptorbased targeting development for cancer therapy. Expert. Opin.Drug. Deliv. 5, 87103 (2008)

    8. Buzzi S., Rubboli D., Buzzi G., Buzzi A.M., Morisi C.,Pironi F.: CRM197 (nontoxic diphtheria toxin): effects onadvanced cancer patients. Cancer Immunol. Immunother. 53,10411048 (2004)

    9. Chiu C.C., Chen H.H., Chuang H.L., Chung T.C., Chen S.D.,Huang Y.T.: Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-inducedhepatotoxicity: an animal model in rats. J. Vet. Med. Sci. 71,18 (2008)

    10. Chowdhury P.S., Vasmatzis G., Beers R., Lee B., Pastan I.:Improved stability and yield of a Fv-toxin fusion protein bycomputer design and protein engineering of the Fv. J. Mol.Biol. 281, 917928 (1998)

    11. Cohen K.A., Liu T.F., Cline J.M., Wagner J.D., Hall P.D.,Frankel A.E.: Safety evaluation of DT

    388IL3, a diphtheria

    toxin/interleukin 3 fusion protein, in the cynomolgus mon-key. Cancer Immunol. Immunother. 54, 799806 (2005)

    12. Di Paolo C., Willuda J., Kubetzko S., Lauffer I., Tschudi D.,Waibel R., Plückthun A., Stahel R.A., Zangemeister-WittkeU.: A recombinant immunotoxin derived from a humanizedepithelial cell adhesion molecule-specific single-chain anti-body fragment has potent and selective antitumor activity.Clin. Cancer Res. 9, 28372848 (2003)

    13. Endo Y., Tsurugi K.: RNA N-glycosidase activity of ricinA-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin oneukaryotic ribosomes. J. Biol. Chem. 262, 81288130 (1987)

    14. Feuring-Buske M., Frankel A.E., Alexander R.L., Gerhard B.,Hogge D.E.: A diphtheria toxin-interleukin 3 fusion proteinis cytotoxic to primitive Acute Myeloid Leukemia pro-genitors but spares normal progenitors. Cancer Res. 62,17301736 (2002)

    15. FitzGerald D.J., Kreitman R., Wilsonb W., Squires D.,Pastan I.: Recombinant immunotoxins for treating cancer.Int. J. Med. Microbiol. 293, 577582 (2004)

    16. Foss F.M., Bacha P., Osann K.E., Demierre M.F., Bell T.,Kuzel T.: Biological correlates of acute hypersensitivityevents with DAB(389)IL-2 (denileukin diftitox, ONTAK)in cutaneous T-cell lymphoma: decreased frequency andseverity with steroid premedication. Clin. Lymphoma, 1,298302 (2001)

    17. Foss F.M., Saleh M.N., Krueger J.G., Nichols J.C., Murphy J.R.:Diphtheria toxin fusion proteins. Curr. Top. Microbiol. Im-munol. 234, 6381 (1998)

    18. Fracasso G., Bellisola G., Castelletti D., Tridente G., Colom-batti M.: Immunotoxins and other conjugates: preparation andgeneral characteristics. Mini. Rev. Med. Chem. 4, 545562(2004)

    19. Francisco J.A., Schreiber G.J., Comereski C.R., Mezza L.E.,Warner G.L., Davidson T.J., Ledbetter J.A., Siegall C.B.:In vivo efficacy and toxicity of a single-chain immunotoxintargeted to CD40. Blood, 89, 44934500 (1997)

    20. Francisco J.A., Schreiber G.J., Comereski C.R., Mezza L.E.,Warner G.L., Davidson T.J., Ledbetter J.A., Siegall C.B.:In vivo efficacy and toxicity of a single-chain immunotoxintargeted to CD40. Blood, 89, 44934500 (1997)

    21. Frankel A.E., Rossi P., Kuzel T.M., Foss F.: Diphtheriafusion protein therapy of chemoresistant malignancies. Curr.Cancer Drug. Targets. 2, 1936 (2002)

  • 252 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    22. Frankel A.E., Powell B.L., Hall P.D., Case L.D., Kreit-man R.J.: Phase I trial of a novel diphtheria toxin/granulo-cyte macrophage colony-stimulating factor fusion protein(DT388GMCSF) for refractory or relapsed acute myeloidleukemia. Clin. Cancer. Res. 8, 100413 (2002)

    23. Frankel A.E., Laver J.H., Willingham M.C., Burns L.J.,Kersey J.H., Vallera D.A.: Therapy of patients with T-celllymphomas and leukemias using an anti-CD7 monoclonalantibody-ricin A chain immunotoxin. Leuk. Lymphoma, 26,28798 (1997)

    24. Friedman P.N., McAndrew S.J., Gawlak S.L., Chace D.,Trail P.A., Brown J.P., Siegall C.B.: BR96 sFv-PE40, a potentsingle-chain immunotoxin that selectively kills carcinomacells. Cancer Res. 53, 3349 (1993)

    25. Ghetie M.A., Richardson J., Tucker T., Jones D., Uhr J.W.,Vitetta E.S.: Antitumor activity of Fab and IgG-anti-CD22immunotoxins in disseminated human B lymphoma grownin mice with severe combined immunodeficiency disease:effect on tumor cells in extranodal sites. Cancer Res. 51,587680 (1991)

    26. Goldberg M.R. i wsp.: Phase I clinical study of the recombi-nant oncotoxin TP40 in superficial bladder cancer. Clin.Cancer Res. 1, 5761 (1995) (praca jest dzie³em 13 autorów)

    27. Hall P.D., Sinha D., Frankel A.E.: Fresh frozen plasma andplatelet concetrates may increase plasma anti-diphtheria toxinIgG cocnentrations: implications for diphtheria fusion protintherapy. Cancer Immunol. Immunother. 55, 928932 (2006)

    28. Hassan R., Lerner M.R., Benbrook D., Lightfoot S.A.,Brackett D.J., Wang Q.C., Pastan I.: Antitumor activityof SS(dsFv)PE38 and SS1(dsFv)PE38, recombinant anti-mesothelin immunotoxins against human gynecologic cancersgrown in organotypic culture in vitro. Clin. Cancer Res. 8,35203526 (2002)

    29. Hinman C.L, Tang H.: A membrane-litic immunoconjugateselective for human tumor T-lymphocytes. Int. J. Immuno-pharmacol. 20, 467478 (1998)

    30. Hjortland G.O., Garman-Vik S.S., Juell S., Olsen O.E.,Hirschberg H., Fodstad O., Engebraaten O.: Immunotoxintreatment targeted to the high-molecular-weight melanoma-associated antigen prolonging the survival of immunodeficient rats with invasive intracranial human glioblastomamultiforme. J. Neurosurg. 100, 3207 (2004)

    31. Jørgensen R., Merrill A.R., Yates S.P., Marquez V.E.,Schwan A.L., Boesen T., Andersen G.R.: Exotoxin A-eEF2complex structure indicates ADP ribosylation by ribosomemimicry. Nature, 436, 979984 (2006)

    32. Joshi B.H., Leland P., Asher A., Prayson R.A., Varricchio F.,Puri R.K.: In situ expression of interleukin-4 (IL-4) recep-tors in human brain tumors and cytotoxicity of a recombi-nant IL-4 cytotoxin in primary glioblastoma cell cultures.Cancer Res. 61, 805861 (2001)

    33. Kawakami K., Kawakami M., Joshi B.H., Puri R.K.: Inter-leukin-13 receptor-targeted cancer therapy in an immuno-deficient animal model of human head and neck cancer. Can-cer Res. 61, 6194200 (2001)

    34. Kelley V.E., Bacha P., Pankewycz O., Nichols J.C., MurphyJ.R., Strom T.B.: Interleukin 2-diphtheria toxin fusion proteincan abolish cell-mediated immunity in vivo. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 85, 39803984 (1988)

    35. Klimka A. i wsp.: An anti-CD30 single-chain Fv selectedby phage display and fused to Pseudomonas exotoxin A(Ki-4(scFv)-ETA) is a potent immunotoxin against a Hodgkin-derived cell line. Br. J. Cancer, 80, 12141222 (1999) (pracajest dzie³em 10 autorów)

    36. Koopmann J.O., Albring J., Hüter E., Bulbuc N., Spee P.,Neefjes J., Hämmerling G.J., Momburg F.: Export of anti-genic peptides from the endoplasmic reticulum intersectswith retrograde protein translocation through the Sec61pchannel. Immunity, 13, 117127 (2000)

    37. Kounnas M.Z., Morris R.E., Thompson M.R., FitzGeraldD.J., Strickland D.K., Saelinger C.B.: The alpha 2-macro-globulin receptor/low density lipoprotein receptor-relatedprotein binds and internalizes Pseudomonas exotoxin A.J. Biol. Chem. 267, 1242012423 (1992)

    38. Kreitman R.J., Chaudhary V.K., Kozak R.W., FitzGerald D.J.,Waldman T.A., Pastan I.: Recombinant toxins containing thevariable domains of the anti-Tac monoclonal antibody to theinterleukin-2 receptor kill malignant cells from patients withchronic lymphocytic leukemia. Blood, 80, 23442352 (1992)

    39. Kreitman R.J., Margulies I., Stetler-Stevenson M., Wang Q.C.,FitzGerald D.J., Pastan I.: Cytotoxic activity of disulfide-stabilized recombinant immunotoxin RFB4(dsFv)-PE38(BL22) toward fresh malignant cells from patients withB-cell leukemias. Clin. Cancer Res. 6, 14761487 (2000)

    40. Kreitman R.J., Pastan I.: Importance of the glutamate resi-due of KDEL in increasing the cytotoxicity of Pseudomonasexotoxin derivatives and for increased binding to the KDELreceptor. Biochem. J. 307, 2937 (1995)

    41. Kreitman R.J., Pastan I.: Immunotoxins in the treatment ofhematologic malignancies. Curr. Drug. Targets, 7, 13011311(2006)

    42. Kreitman R.J.: Immunotoxins for trageted cancer therapy.The AAPS J. 8, 532551 (2006)

    43. Kreitman R.J.: Recombinant immunotoxins containing trun-cated bacterial toxins for the treatment of hematologic mali-gnancies. BioDrugs, 23, 113 (2009)

    44. Kreitman R.J., Wilson W.H., Bergeron K., Raggio M., Stetler-Stevenson M., FitzGerald D.J., Pastan I.: Efficacy of the anti-CD22 recombinant immunotoxin BL22 in chemotherapy-resistant hairy-cell leukemia. N. Engl. J. Med. 26, 241247(2001)

    45. Kreitman R.J., Wilson W.H., White J.D., Stetler-StevensonM., Jaffe E.S., Giardina S., Waldmann T.A., Pastan I.: PhaseI trial of recombinant immunotoxin anti-Tac(Fv)-PE38(LMB-2) in patients with hematologic malignancies. J. Clin.Oncol. 18, 162236 (2000)

    46. Kunwar S.: Convection enhanced delivery of IL13-PE38QQRfor treatment of recurrent malignant glioma: presentation ofinterim findings from ongoing phase 1 studies. Acta Neuro-chir. Suppl. 88, 105111 (2003)

    47. Kunwar S., Pai L.H., Pastan I.: Cytotoxicity and antitumoreffects of growth factor-toxin fusion proteins on human glio-blastoma multiforme cells. J. Neurosurg. 79, 596576 (1993)

    48. Laske DW i wsp.: Intraventricular immunotoxin therapyfor leptomeningeal neoplasia. Neurosurgery, 41, 10491051(1997) (praca jest dzie³em 14 autorów)

    49. Laske DW, Youle RJ, Oldfield EH.: Tumor regressionwith regional distribution of the targeted toxin TF-CRM107in patients with malignant brain tumors. Nat. Med. 3,13621368 (1997)

    50. Li M., Dyda F., Benhar I., Pastan I., Davies D.R.: Crystalstructure of the catalytic domain of Pseudomonas exotoxin Acomplexed with a nicotinamide adenine dinucleotide analog:implications for the activation process and for ADP ribosy-lation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 69026906 (1996)

    51. Mathew M., Verma R.S.: Humanized immunotoxins: A newgeneration of immunotoxins for targeted cancer therapy.Cancer Sci. 100,13591365 (2009)

  • 253IMMUNOTOKSYNY CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE

    52. McKee M.L., FitzGerald D.J.: Reduction of furin-nickedPseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry,38, 1650716513 (1999)

    53. OToole J.E., Esseltine D., Lynch T.J., Lambert J.M., Gross-bard M.L.: Clinical trials with blocked ricin immunotoxins.Curr. Top. Microbiol. Immunol. 234, 3556 (1998)

    54. Ogata M., Chaudhary V.K., FitzGerald D.J., Pastan I.: Cyto-toxic activity of a recombinant fusion protein between inter-leukin 4 and Pseudomonas exotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 86, 42154219 (1989)

    55. Onda M., Olafsen T., Tsutsumi Y., Bruland O.S., Pastan I.:Cytotoxicity of Antiosteosarcoma Recombinant Immuno-toxins Composed of TP-3 Fv Fragments and a TruncatedPseudomonas Exotoxin A. J. Immunother. 24, 144150 (2001)

    56. Onda M., Wang Q.C., Guo H.F., Cheung N.K., Pastan I.:In vitro and in vivo cytotoxic activities of recombinant im-munotoxin 8H9(Fv)-PE38 against breast cancer, osteosarco-ma, and neuroblastoma. Cancer Res. 64, 14191424 (2004)

    57. Onda M., Beers R., Xiang L., Nagata S., Wang Q.C., Pastan I.:An immunotoxin with greatly reduced immunogencity byidentfication and removal of B cell epitopes. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 105, 1131111316 (2008)

    58. Pai L.H., Wittes R., Setser A., Willingham M.C., Pastan I.:Treatment of advanced solid tumors with immunotoxinLMB-1: an antibody linked to Pseudomonas exotoxin. Nat.Med. 2, 350353 (1996)

    59. Pai-Scherf L.H., Villa J., Pearson D., Watson T., Liu E.,Willingham M.C., Pastan I.: Hepatotoxicity in cancer patientsreceiving erb-38, a recombinant immunotoxin that targets theerbB2 receptor. Clin. Cancer Res. 5, 23115 (1999)

    60. Pai-Scherf L.H. i wsp.: Imaging and phase I study of111In- and 90Y-labeled anti-LewisY monoclonal antibodyB3. Clin. Cancer Res. 6, 17201730 (2000) (praca jest dzie-³em 12 autorów)

    61. Pastan I.: Immunotoxins containing Pseudomonas exotoxin A:a short history. Cancer Immunol. Immunother. 52, 338341(2003)

    62. Peipp M., Küpers H., Saul D., Schlierf B., Greil J., ZuninoS.J., Gramatzki M., Fey G.H.: A recombinant CD7-specificsingle-chain immunotoxin is a potent inducer of apoptosis inacute leukemic T cells. Cancer Res. 62, 28482855 (2002)

    63. Posey J.A. i wsp.: A phase I trial of the single-chain immu-notoxin SGN-10 (BR96 sFv-PE40) in patients with advancedsolid tumors. Clin. Cancer Res. 8, 30929 (2002) (praca jestdzie³em 12 autorów)

    64. Potala S., Sahoo S.K., Verma R.S.: Targeted therapy of cancerusing diphtheria toxin-derived immunotoxins. Drug. Discov.Today, 13, 807815 (2008)

    65. Rathore D., Batra J.K.: Generation of active immunotoxinscontaining recombinant restrictocin. Biochem. Biophys. Res.Commun. 222, 5863 (1996)

    66. Reiter Y., Wright A.F., Tonge D.W., Pastan I.: Recombinantsingle-chain and disulfide-stabilized Fv-immunotoxins thatcause complete regression of a human colon cancer xeno-graft in nude mice. Int. J. Cancer. 67, 11323 (1996)

    67. Reiter Y., Kreitman R.J., Brinkmann U., Pastan I.: Cytotoxicand antitumor activity of a recombinant immunotoxincomposed of disulfide-stabilized anti-Tac Fv fragment andtruncated Pseudomonas exotoxin. Int. J. Cancer. 58, 142149,(1994)

    68. Ren J., Kachel K., Kim H., Malenbaum S.E., Collier R.J.,London E.: Interaction of diphtheria toxin T domain withmolten globule-like proteins and its implications for trans-location. Science, 284, 955957 (1999)

    69. Roscoe D.M., Pai L.H., Pastan I.: Identification of epitopeson a mutant form of Pseudomonas exotoxin using serumfrom humans treated with Pseudomonas exotoxin containingimmunotoxins. Eur. J. Immunol. 27, 145968 (1997)

    70. Sampson JH i wsp.: Progress report of a Phase I study ofthe intracerebral microinfusion of a recombinant chimericprotein composed of transforming growth factor (TGF)-alpha and a mutated form of the Pseudomonas exotoxin termed PE-38 (TP-38) for the treatment of malignant braintumors. J. Neurooncol. 65, 2735 (2003) (praca jest dzie³em25 autorów)

    71. Sausville E.A. i wsp.: Continuous infusion of the anti-CD22immunotoxin IgG-RFB4-SMPT-dgA in patients with B-celllymphoma: a phase I study. Blood, 85, 34573465 (1995)(praca jest dzie³em 10 autorów)

    72. Schmidt M., McWatters A., White R.A., Groner B., Wels W.,Fan Z., Bast R.C. Jr.: Synergistic interaction between ananti-p185HER-2 pseudomonas exotoxin fusion protein[scFv(FRP5)-ETA] and ionizing radiation for inhibitinggrowth of ovarian cancer cells that overexpress HER-2.Gynecol. Oncol. 80, 145155 (2001)

    73. Schnell R. i wsp.: A Phase I study with an anti-CD30 ricinA-chain immunotoxin (Ki-4.dgA) in patients with refractoryCD30+ Hodgkins and non-Hodgkins lymphoma. Clin. Can-cer Res. 8, 17791786 (2002) (praca jest dzie³em 11 autorów)

    74. Schnell R. i wsp.: Treatment of refractory Hodgkins lym-phoma patients with an anti-CD25 ricin A-chain immuno-toxin. Leukemia, 14, 129135 (2000) (praca jest dzie³em10 autorów)

    75. Schwemmlein M. i wsp.: A CD19-specific single-chain im-munotoxin mediates potent apoptosis of B-lineage leukemiccells. Leukemia, 21, 14051412 (2007) (praca jest dzie³em11 autorów)

    76. Shinohara H., Fan D., Ozawa S., Yano S., Van Arsdell M.,Viner J.L., Beers R., Pastan I., Fidler I.J.: Site-specificexpression of transferrin receptor by human colon cancercells directly correlates with eradication by antitransferrinrecombinant immunotoxin. Int. J. Oncol. 17, 643651 (2000)

    77. Singh R., Samant U., Hyland S., Chaudhari P.R., Wels W.S.,Bandyopadhyay D.: Target-specific cytotoxic activity ofrecombinant immunotoxin scFv(MUC1)-ETA on breast car-cinoma cells and primary breast tumors. Mol. Cancer Ther.6, 562569 (2007)

    78. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J.: Recent trends in targetedanticancer prodrug and conjugate design. Curr. Med. Chem.15, 18021826 (2008)

    79. Skrepnik N., Araya J.C., Qian Z., Xu H., Hamide J., Mera R.,Hunt J.D.: Effects of anti-erbB-2 (HER-2/neu) recombinantoncotoxin AR209 on human non-small cell lung carcinomagrown orthotopically in athymic nude mice. Clin. Cancer Res.2, 18511857 (1996)

    80. Skrepnik N., Zieske A.W., Bravo J.C., Gillespie A.T.,Hunt J.D.: Recombinant oncotoxin AR209 (anti-P185erbB-2)diminishes human prostate carcinoma xenografts. J. Urol.161, 984989 (1999)

    81. Smith D.C., Spooner R.A., Watson P.D., Murray J.L., HodgeT.W., Amessou M., Johannes L., Lord J.M., Roberts L.M.:Internalized Pseudomonas exotoxin A can exploit multiplepathways to reach the endoplasmic reticulum. Traffic, 7,379393 (2006)

    82. Stone M.J. i wsp.: A phase I study of bolus versus continuousinfusion of the anti-CD19 immunotoxin, IgG-HD37-dgA, inpatients with B-cell lymphoma. Blood, 88, 11881197 (1996)(praca jest dzie³em 16 autorów)

  • 254 MICHA£ KAMIÑSKI, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

    83. Thorpe P.E., Ross W.C., Cumber A.J., Hinson C.A.,Edwards D.C, Davies A.J.: Toxicity of diphtheria toxinfor lymphoblastoid cells is increased by conjugation to anti-lymphocytic globulin. Nature, 271, 752755 (1978)

    84. Todhunter D.A., Hall W.A., Rustamzadeh E., Shu Y., Doum-bia S.O., Vallera D.A.: A bispecific immunotoxin (DTAT13)targeting human IL-13 receptor (IL-13R) and urokinase-typeplasminogen activator receptor (uPAR) in a mouse xenograftmodel. Protein Eng. Des. Sel. 17, 157164 (2004)

    85. Uckun F.M., Myers D.E., Irvin J.D., Kuebelbeck V.M.,Finnegan D., Chelstrom L.M., Houston L.L.: Effects of theintermolecular toxin-monoclonal antibody linkage on thein vivo stability, immunogenicity and anti-leukemic activityof B43 (anti-CD19) pokeweed antiviral protein immuno-toxin. Leuk. Lymphoma. 9, 459476 (1993)

    86. Van Ness B.G., Howard J.B., Bodley J.W.: ADP-ribosyla-tion of elongation factor 2 by diphtheria toxin. Isolation andproperties of the novel ribosyl-amino acid and its hydrolysisproducts. J. Biol. Chem. 255, 1071710720 (1980)

    87. Vitetta E.S.: Immunotoxins and vascular leak syndrome.Cancer J. 6, S218224 (2000)

    88. Wang H., Song S., Kou G., Li B., Zhang D., Hou S., Qian W.,Dai J., Tian L., Zhao J., Guo Y.: Treatment of hepatocellularcarcinoma in a mouse xenograft model with an immunotoxinwhich is engineered to eliminate vascular leak syndrome.Cancer Immunol. Immunother. 56, 17751783 (2007)

    89. Weber F i wsp.: Safety, tolerability, and tumor response ofIL4-Pseudomonas exotoxin (NBI-3001) in patients with recur-

    rent malignant glioma. J. Neurooncol. 64, 125137 (2003)(praca jest dzie³em 17 autorów)

    90. Wels W., Biburger M., Müller T., Dälken B., Giesübel U.,Tonn T., Uherek C.: Recombinant immunotoxins and retar-geted killer cells: employing engineered antibody fragmentsfor tumor-specyfic targeting of cytotoxic effectors. CancerImmunol. Immunother. 53, 217226 (2004)

    91. Willingham MC, FitzGerald DJ, Pastan I.: Pseudomonas exo-toxin coupled to a monoclonal antibody against ovarian cancerinhibits the growth of human ovarian cancer cells in a mousemodel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 24742478 (1987)

    92. Winkler U., Barth S., Schnell R., Diehl V., Engert A.: Theemerging role of immunotoxins in leukemia and lymphoma.Ann Oncol. 8, 139146 (1997)

    93. Winter G., Milstein C.: Man-made antibodies. Nature, 349,293299 (1991)

    94. Wolf P., Alt K., Bühler P., Katzenwadel A., Wetterauer U.,Tacke M., Elsässer-Beile U.: Anti-PSMA immunotoxin asnovel treatment for prostate cancer? High and specific anti-tumor activity on human prostate xenograft tumors in SCIDmice. Prostate, 68, 129138 (2008)

    95. Wolf P., Elsässer-Beile U.: Pseudomonas exotoxin A: fromvirulence factor to anti-cancer agent. Int. J. Med. Microbiol.299, 161176 (2009)

    96. Wolf P., Gierschner D., Bühler P., Wetterauer U., Elsässer-Beile U.: A recombinant PSMA-specific single-chain immuno-toxin has potent and selective toxicity against prostate cancercells. Cancer Immunol. Immunother. 55, 13671373 (2006)


Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na … · 1 Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na Programie nauczania geografii w szkole podstawowej – Planeta

Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na … · 1 Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na Programie nauczania geografii w szkole podstawowej – Planeta

Metody ataku na algorytmy kryptograficzne oparte na informacjach z ulotu elektromagnetycznego

Metody ataku na algorytmy kryptograficzne oparte na informacjach z ulotu elektromagnetycznego

Esa Makinen - Data journalism: Jak dzięki szablonom każdy może zacząć opisywać historie oparte na danych

Esa Makinen - Data journalism: Jak dzięki szablonom każdy może zacząć opisywać historie oparte na danych

New Wymagania edukacyjne - oparte na przedmiotowym systemie … · 2016. 9. 6. · 1 Załącznik 6 Wymagania edukacyjne - oparte na przedmiotowym systemie oceniania do podręcznika

New Wymagania edukacyjne - oparte na przedmiotowym systemie … · 2016. 9. 6. · 1 Załącznik 6 Wymagania edukacyjne - oparte na przedmiotowym systemie oceniania do podręcznika

POST. MIKROBIOL., METODY WYKORZYSTYWANE W … · Powstawanie ścieków komunalnych na dro - dze fizykochemicznych lub biologicznych metod, wiąże się ze znacznymi kosztami. Związane

POST. MIKROBIOL., METODY WYKORZYSTYWANE W … · Powstawanie ścieków komunalnych na dro - dze fizykochemicznych lub biologicznych metod, wiąże się ze znacznymi kosztami. Związane

Post. Mikrobiol. 1-2014-druk - Kwartalnik "Postępy ... · ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski),

Post. Mikrobiol. 1-2014-druk - Kwartalnik "Postępy ... · ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski),

POST. MIKROBIOL., MECHANIZMY WIRULENCJI …pm.microbiology.pl/web/archiwum/vol5322014101.pdf · 2017. 7. 27. · MECHANIZMY WIRULENCJI PACIORKOWCÓW β-HEMOLIZUJĄCYCH 103 te ważne

POST. MIKROBIOL., MECHANIZMY WIRULENCJI …pm.microbiology.pl/web/archiwum/vol5322014101.pdf · 2017. 7. 27. · MECHANIZMY WIRULENCJI PACIORKOWCÓW β-HEMOLIZUJĄCYCH 103 te ważne

POST. MIKROBIOL., NADPRODUKCJA I OCZYSZCZANIE ... · NADPRODUKCJA I OCZYSZCZANIE REKOMBINOWANYCH, HETEROLOGICZNYCH BIA£EK 85 1.2. Wektor 1.2.1. Promotor Opisano bardzo wiele promotorów,

POST. MIKROBIOL., NADPRODUKCJA I OCZYSZCZANIE ... · NADPRODUKCJA I OCZYSZCZANIE REKOMBINOWANYCH, HETEROLOGICZNYCH BIA£EK 85 1.2. Wektor 1.2.1. Promotor Opisano bardzo wiele promotorów,

Versión: 5.2.2 Standard4a54f0271b66873b1ef4-ddc094ae70b29d259d46aa8a44a90623.r7.cf2.rackcdn.c…El soporte técnico habitual de Avigilon está disponible de lunes a viernes de 12:00

Versión: 5.2.2 Standard4a54f0271b66873b1ef4-ddc094ae70b29d259d46aa8a44a90623.r7.cf2.rackcdn.c…El soporte técnico habitual de Avigilon está disponible de lunes a viernes de 12:00

Prezentacja programu PowerPointtmm.pwr.edu.pl/fcp/YGBUKOQtTKlQhbx08SlkTVQJQX2o8... · mechatronicznych - produkty oparte na czysto mechanicznej zasadzie działania - pojawianie się

Prezentacja programu PowerPointtmm.pwr.edu.pl/fcp/YGBUKOQtTKlQhbx08SlkTVQJQX2o8... · mechatronicznych - produkty oparte na czysto mechanicznej zasadzie działania - pojawianie się

Postępy Mikrobiologii 2015 - pm.microbiology.pl · POST. MIKROBIOL., 2015, 54, 1, 3–4 W latach 1956–1959 byłem studentem Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Łódzkiego,

Postępy Mikrobiologii 2015 - pm.microbiology.pl · POST. MIKROBIOL., 2015, 54, 1, 3–4 W latach 1956–1959 byłem studentem Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Łódzkiego,

POST. MIKROBIOL., PATOGENEZA I LECZENIE ...dzonych w szpitalu) jest znacznie niższa niż w Stanach Zjednoczonych (2 epizody na 10.000 pacjento-dni), ale proporcje te w ostatnich latach

POST. MIKROBIOL., PATOGENEZA I LECZENIE ...dzonych w szpitalu) jest znacznie niższa niż w Stanach Zjednoczonych (2 epizody na 10.000 pacjento-dni), ale proporcje te w ostatnich latach

POST. MIKROBIOL., MIKROBIOLOGICZNA UTYLIZACJA … · powszechnym występowaniem wśród roślin, niską ceną uzyskiwania energii, kosztem pozyskiwania substratu, ... Zaakceptowano

POST. MIKROBIOL., MIKROBIOLOGICZNA UTYLIZACJA … · powszechnym występowaniem wśród roślin, niską ceną uzyskiwania energii, kosztem pozyskiwania substratu, ... Zaakceptowano

Oporność na antybiotyki jednym z największych zagrożeń dla ......Śr. 31,9% pts hospitalizowanych otrzymuje antybiotyk ... gdy brak własnego lab. mikrobiol. 1.Osoby, dla których

Oporność na antybiotyki jednym z największych zagrożeń dla ......Śr. 31,9% pts hospitalizowanych otrzymuje antybiotyk ... gdy brak własnego lab. mikrobiol. 1.Osoby, dla których

Urządzenia oparte na technice komputera

Urządzenia oparte na technice komputera

Gotowanie oparte na niemarnowaniu

Gotowanie oparte na niemarnowaniu

Niniejszy ebook zawiera fragment - darmowe-ebooki.com · Stopy oparte na zmienności (volatility stops) .....109 Podsumowanie.....111

Niniejszy ebook zawiera fragment - darmowe-ebooki.com · Stopy oparte na zmienności (volatility stops) .....109 Podsumowanie.....111

Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na … · 2019-01-10 · 1 Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na Programie nauczania geografii w szkole podstawowej

Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na … · 2019-01-10 · 1 Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 5 oparte na Programie nauczania geografii w szkole podstawowej

Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 7 oparte na …1).pdf · 2020-06-01 · Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 7 oparte na Programie nauczania geografii w szkole podstawowej

Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 7 oparte na …1).pdf · 2020-06-01 · Wymagania edukacyjne z geografii dla klasy 7 oparte na Programie nauczania geografii w szkole podstawowej

infoShare 2014: Michał Sierzputowski, Testy automatyczne aplikacji webowych oparte o Selenium - dobre praktyki.

infoShare 2014: Michał Sierzputowski, Testy automatyczne aplikacji webowych oparte o Selenium - dobre praktyki.