ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ (Lubert Stryer)

οι απλουστερες

• Τα ένζυμα είναι βιομόρια που καταλύουν χημικές αντιδράσεις

• Κύρια χαρακτηριστικά τους είναι η καταλυτική ισχύς και ηεξειδίκευση

• Πλέον θα τα ταυτίζουμε με πρωτεΐνες, αν και άλλα βιομόριαλειτουργούν καταλυτικά, π.χ. τα ριβοένζυμα

• Οι πρωτεΐνες‐ένζυμα δεσμεύουν με σχετικά μεγάλη εξειδίκευσηαντιδρώντα μόρια (τα υποστρώματα), τα φέρνουν σε κατάλληληεπαφή και τα οδηγούν σε χημική μετατροπή ευνοώντας καισταθεροποιώντας τις μεταβατικές καταστάσεις της αντίδρασης

• Μπορεί τελικά να επιταχύνουν τις αντιδράσεις που καταλύουνκατά ένα εκατομμύριο φορές ή και περισσότερο

Ένζυμα: Βασικές Αρχές και Κινητική

Τα ένζυμα είναι ισχυροί και σε μεγάλο βαθμό εξειδικευμένοι καταλύτες

Ανθρακική ανυδράση

Ακόμη και οι απλούστερεςαντιδράσεις απαιτούν τη δράση των ενζύμων ώστε να προσαρμοστούν στις απαιτήσεις των βιολογικών 

συστημάτωνακριβεια

Το κάθε ένζυμο έχει διαφορετικό βαθμό  εξειδίκευσης για την/τις αντιδράση/σεις που 

καταλύει

Γ. DNA Πολυμεράση Ι

• Το ένζυμο DNA πολυμεράση προσθέτει νουκλεοτίδιασε μια επιμηκυνόμενη αλυσίδα DNA, με βάση την ακολουθία νουκλεοτιδίων της αλυσίδας‐εκμαγείο

• Κάνει λάθος περίπου μια φορά σε κάθε ένα εκατομμύριο  προσθήκες

• Η ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΟΦΕΙΛΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΤΗΣ  ΔΟΜΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΕΝΖΥΜΟΥ‐ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ

πρωτεάσες

Τα Πρωτεολυτικά ένζυμα υδρολύουν πεπτιδικούς δεσμούςin vivo,

αλλά μπορούν να υδρολύσουν και εστερικό δεσμό in vitro.

Θρυψινη 

Α. Θρυψίνη

Β. Θρομβίνη

συμπαραγοντες

Βαθμός εξειδίκευσης πρωτεολυτικών ενζύμων

Πολλά ένζυμα χρειάζονται συμπαράγοντες για την καταλυτική τους λειτουργία 

• Η καταλυτική δράση πολλών ενζύμων εξαρτάται πολλές φορές καιαπό μικρά μόρια που ονομάζονται συμπαράγοντες.

Αποένζυμο + συμπαράγοντας = ολοένζυμο

• Οι συμπαράγοντες μπορεί να είναι είτε μέταλλα, είτε σχετικάμικρά οργανικά μόρια που ονομάζονται συνένζυμα και συχνάπαράγονται από απαραίτητες βιταμίνες !

• Τα συνένζυμα κατα κανόνα προσδένονται στην πρωτεινική δομήμε «χαλαρούς» μη ομοιοπολικούς δεσμούς. Συμπαράγοντες πουσυνδέονται ομοιπολικά ονομάζονταιπροσθετικές ομάδεςπ.χ αίμη.

Ανθρ. Ανυδράση Zn2+

Ανθρακική ανυδράση

Η δραστικότητά του ενζύμου ανθρακική ανυδράση εξαρτάται απο την ύπαρξη ιόντος Zn2+ στην πρωτεινική δομή  (καταλυτικό κέντρο)

Φωσφ γλυκογονου 

Το ένζυμο φωσφορυλάση του γλυκογόνου χρησιμοποιεί ως συνένζυμο το μικρό οργανικό μόριο φωσφορική 

πυριδοξάλη (PLP, βιταμίνη B6)

Λιστα συνενζυμων

Πολλά ένζυμα χρειάζονται συμπαράγοντες για την καταλυτική τους λειτουργία 

ενεργεια

Τα ένζυμα μπορεί να μετασχηματίζουν ενέργεια από μια μορφή σε άλλη

Σε πολλές αντιδράσεις πραγματοποιείται μετατροπή 

ενέργειας από μια μορφή σε μια άλλη. 

• Φωτοσύνθεση• Μιτοχόνδρια• Μυοσίνη• Μεμβρανικές αντλίες

ATPάση Ca2+

ταξινομηση

Τα ένζυμα ταξινομούνται με βάση τον τύπο της αντίδρασης που καταλύουν

Dat  base

Τα ένζυμα ταξινομούνται με βάση τον τύπο της αντίδρασης που καταλύουν

http://enzyme.expasy.orgενεργεια

ΚΑΤΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΑΠΟ ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

• Τα έμβια όντα δημιουργούν και συντηρούν τάξη μέσα σ’ένα σύμπαν που πάντοτε τείνει προς μεγαλύτερη αταξία (εντροπία).

• Οι χημικές αντιδράσεις που επιτελούνται σε ένα κύτταρο κανονικά θα συνέβαιναν μόνο σε θερμοκρασίες πολύ μεγαλύτερες από αυτές που επικρατούν στο εσωτερικό των κυττάρων.

• Στην πορεία των καταλυόμενων χημικών αντιδράσεων που δημιουργούν τάξη, μέρος της ενέργειας που χρησιμοποιεί το κύτταρο μετατρέπεται σε θερμότητα, που αυξάνει την συνολική εντροπία. 

• Η βιολογική τάξη επιτυγχάνεται με την έκλυση θερμικής ενέργειας από τα κύτταρα

Λιστα συνενζυμων

Η βιολογική τάξη επιτυγχάνεται με την έκλυση θερμικής ενέργειας από τα κύτταρα

• Το ποσοτικό μέτρο της αταξίας ενός συστήματος αποκαλείται εντροπία.

• Όσο μεγαλύτερη είναι η αταξία, τόσο μεγαλύτερη θα είναι η εντροπία του συστήματος.

• Τά συστήματα μεταβάλλονται αυθόρμητα προς καταστάσεις με τη μεγαλύτερη εντροπία.

• Στην πορεία των χημικών αντιδράσεων που δημιουργούν τάξη, μέρος της ενέργειας που χρησιμοποιεί το κύτταρο μετατρέπεται σε θερμότητα.

• Η θερμότητα είναι ενέργεια στην πιο αποδιοργανωμένη μορφή.

Λιστα συνενζυμων

ΕΝΤΡΟΠΙΑ

“Όταν το υδρογόνο και το οξυγόνο ενώνονται για το σχηματισμό νερού, η εντροπία του συστήματος μειώνεται, 

ενώ η εντροπία του σύμπαντος αυξάνεται λόγω της απελευθέρωσης θερμότητας στο περιβάλλον.”

DG

8.2  Ελεύθερη ενέργεια Gibbs.  Μια χρήσιμη θερμοδυναμική  παράμετρος για την κατανόηση της 

ενζυμικής κατάλυσης 

Η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας (ΔG)  είναι η διαφορά της ελεύθερης ενέργειας  μεταξύ των προϊόντων και των αντιδρώντων μιας αντίδρασης, που καθορίζει αν μια αντίδραση θα γίνει αυθόρμητα ή όχι.

H μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας δίνει πληροφορίες για το αυθόρμητο μιας αντίδρασης αλλά όχι για την ταχύτητά της.

DG

• Αν η ΔG είναι αρνητική η αντίδραση θα να γίνει αυθόρμητα (εξώεργη αντίδραση)

• Αν η ΔG είναι θετική η αντίδραση δεν θα να γίνει αυθόρμητα (ενδόεργη αντίδραση, η εξέλιξη της αντίδρασης χρειάζεται ενέργεια)

• Αν η ΔG είναι μηδέν η αντίδραση εχει φτάσει σε ισορροπία και οι συγκεντρώσεις αντιδρώντων και προιόντων δεν μεταβάλλονται με το χρόνο.

Ελεύθερη ενέργεια Gibbs

DG

• Η ΔG είναι ανάλογη των τελικών και αρχικών ενεργειών, ανεξάρτητα από το μοριακό μηχανισμό και την πορεία της αντίδρασης

• Η ΔG ΔΕΝ σχετίζεται με την ταχύτητα με την οποία γίνεται η αντίδραση

• Η ενέργεια ενεργοποίησης είναι η ενέργεια που απαιτείται για να αρχίσει η μετατροπή των αντιδρώντων σε προϊόντα και προσδιορίζει την ταχύτητα της αντίδρασης. 

• Τα ένζυμα επηρεάζουν την ενεργεια ενεργοποίησης και επομένως μόνο την ταχύτητα της αντίδρασης.

Ελεύθερη ενέργεια Gibbs

Ταχ. ισορροπια

Τα ένζυμα επηρεάζουν μόνο την ταχύτητα της αντίδρασης

• Τα ένζυμα επιταχύνουν την αντίδραση προς τις δύο κατευθύνσεις

• Τα ένζυμα δεν μεταβάλλουν τη θέση της χημικής ισορροπίας

ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΕΠΙΤΑΧΥΝΟΥΝ, ΔΕΝ ΜΕΤΑΒΑΛΛΟΥΝ ΤΗ ΘΕΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ

(ΔGο)  ‐σταθερά ισορροπία

Σε κατάσταση  ισορροπίας:

(ΔG=0) ΔG = ΔGο’ + RT ln = 0      άρα

ΔGο’ = ‐ RT ln

Η σταθερά ισορροπίας Κ’eq κάτω από πρότυπες συνθήκες ισούται:

Κ’eq =                     άρα

ΔGο’ = ‐ RT ln Κ’eq ΔGο’ = ‐ 2.303RT log10 Κ’eq

Κ’eq = 10 ‐ΔGο’/(2.303RT) K’eq = 10 –ΔGο’ /1.36 

[Γ][Δ][Α][Β]

[Γ][Δ][Α][Β]

[Γ][Δ][Α][Β]

Σχέση μεταβολής πρότυπης ελεύθερης ενέργειας (ΔGο) και σταθεράς ισορροπίας

(ΔGο)  ‐σταθερά ισορροπία

Για κάθε αλλαγή της σταθεράς ισορροπίας κατά 10 φορές, η ΔGο’αλλάζει κατά ‐1.36 kcal mol‐1

K’eq = 10 –ΔGο’ /1.36

x10

x1.36

Yπολογισμός ΔG°′ και της ΔG της αντίδρασης ισομερείωσης της φωσφ. διυδροξυακετόνης σε 3‐φωσφ. γλυκεραλδεΰδη

Σε κατάσταση ισορροπίας, ο λόγος της 3‐φωσφ. γλυκεραλδεΰδης προς τη φωσφ. διυδροξυακετόνη είναι 0,0475.  Έτσι, K′eq = 0,0475, δηλ. [φωσφ. διυδροξυακετόνη]  = 21 Χ  [3‐φωσφ. γλυκεραλδεΰδη]

ΔG°′ = – RTln K′eq = –8,315 × 10–3 × 298 × ln (0,0475) = + 7,53 kJ mol–1 (+1,80 kcal mol–1).   

Αυτη είναι η ΔG της αντίδρασης  αν οι αρχικές συγκεντρώσεις και των δυο ήταν 1Μ.  Θετική τιμή, δηλ. με αυτές τις αρχ. συγκεντρώσεις η αντίδραση δεν μπορεί να προχωρήσει αυθόρμητα.

Yπολογισμός ΔG°′ και της ΔG της αντίδρασης ισομερείωσης της φωσφ. διυδροξυακετόνης σε 3‐φωσφ. γλυκεραλδεΰδη

Ας υπολογίσουμε την ΔG αυτής της αντίδρασης όταν –ΕΣΤΩ‐ η αρχική συγκέντρωση φωσφ.  διυδροξυακετόνης είναι 2 × 10–4 M και η αρχική συγκέντρωση 3‐φωσφ. γλυκεραλδεΰδης ειναι3 × 10–6 M. 

ΔG= ΔGο’ + RT ln Κ’eq = 7,53 kJ mol–1 + RT ln (3 ×10–6 M/2 × 10–4 M)== – 2,89 kJ mol–1 (–0,69 kcal mol–1).

Αρνητική τιμή,  η αντίδραση προχωρεί αυθόρμητα με αυτές τις αρχικές συγκεντρώσεις

Η ισομερείωση της φωσφ. διυδροξυακετόνης σε 3‐φωσφ. γλυκεραλδεΰδη είναι εξώεργη και μπορεί να γίνει αυθόρμητα, όταν οι ενώσεις αυτές βρίσκονται στις συγκεντρώσεις που καθορίστηκαν παραπάνω. 

Επισημαίνεται ότι η ΔG της αντίδρασης αυτής είναι αρνητική αν και η ΔG°′ είναι θετική.

Tο κριτήριο του αυθόρμητου μιας αντίδρασης είναι η ΔG και όχι η ΔG°′. 

Eάν η ΔG μιας αντίδρασης θα είναι μεγαλύτερη, μικρότερη ή ίδια με τη ΔG°′, εξαρτάται από τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων και των προϊόντων. 

Αντιδράσεις που δεν είναι αυθόρμητες με βάση τη ΔG°′ μπορούν να γίνουν αυθόρμητες ρυθμίζοντας κατάλληλα τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων και των προϊόντων.  ταχυτητα  ‐σταθερά 

ισορροπία

Τα ένζυμα μεταβάλλουν μόνο την ταχύτητα και όχιτη θέση ισορροπίας της αντίδρασης

S               P

SubstrateProduct

S  to P

Ένζυμο  επιταχύνει αμφίδρομη αντίδραση και προς τις δύο κατευθύνσεις, έστω με σταθερές ταχύτητας αντίδρασης  kfκαι  kr, αντίστοιχα  (forward and reverse).

S P H ταχύτητα  Vf= kf [S], ενώ η  Vr=kr [P]

Σε ισοροπία  Vf = Vr , ετσι                        = Κ, οπου Κ η 

σταθερά ισορροπίας της αντίδρασης =100

Αρα η συγκέντρωση ισορροπίας του P είναι 100 φορές μεγαλύτερη από εκείνη του S, ανεξαρτήτως εάν το ένζυμο 

είναι παρόν ή όχι.

Κf 10‐4 s‐1

Kr 10‐6 s‐1

ΔG

[S][P] ΚF

ΚR=

Τα ένζυμα επιταχύνουν την επίτευξη της ισορροπίας αλλά δεν μεταβάλλουν τη θέση της.

Η θέση ισορροπίας είναι συνάρτηση μόνο της διαφοράς της ελεύθερης ενέργειας μεταξύ των αντιδρώντων και των 

προϊόντων.

ΔG = ΔGο’ + RT ln K

Μεταβατικη κατασταση

S               P

SubstrateProduct

8.3 Τα ένζυμα επιταχύνουν τις αντιδράσεις διευκολύνοντας το σχηματισμό της μεταβατικής κατάστασης

Μια χημική αντίδραση μετατροπής υποστρώματος S σε προϊόν P γίνεται μέσω μεταβατικής κατάστασης S‡ των αντιδρώντων, η οποία διαθέτει υψηλότερη ενέργεια από τα S και P

ΔG‡ = GS‡ ‐ GS

S               S‡ P

Ενεργεια ενεργοποιησης

Η διαφορά Gs‡ και Gsονομάζεται ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης και σε αυτή παρεμβαίνουν τα ένζυμα, διευκολύνοντας το σχηματισμό της μεταβατικής κατάστασης

ΔG‡ = GS‡ ‐ GS

S               S‡ P

Ελαττωση ενεργειας ενεργοποίησης

Χαμηλότερη ενέργεια ενεργοποίησης σημαίνει ότι περισσότεραμόρια έχουν την απαιτούμενη ενέργεια να φθάσουν στη μεταβατική 

κατάσταση

H ουσία της κατάλυσης είναι η ελάττωση της απαιτούμενης ενέργειας ενεργοποίησης με την διευκόλυνση του 

σχηματισμού της μεταβατικής κατάστασης

ES

Ο σχηματισμός του συμπλόκου ενζύμου‐υποστρώματος είναι το πρώτο βήμα στην ενζυμική κατάλυση

Το πρώτο βήμα στην κατάλυση είναι ο σχηματισμός ενός συμπλόκου ενζύμου‐υποστρώματος (ES). 

Τα ένζυμα προσδένονται στο υπόστρωμα και μεταβάλλουν τη δομή του για να προαγάγουν τον σχηματισμό της μεταβατικής κατάστασης.

Tα υποστρώματα προσδένονται σε μια ειδική περιοχή του ενζύμου που ονομάζεται ενεργό κέντρο. 

Tα περισσότερα ένζυμα είναι πολύ επιλεκτικά με τα υποστρώματα που προσδένουν.  Η καταλυτική εξειδίκευση των ενζύμων εξαρτάται από την εξειδίκευση αυτής της πρόσδεσης.

Why ES

Ποια στοιχεία υποδεικνύουν την ύπαρξη συμπλόκων ES  ??

1. Η ταχύτητα αυξάνει όταν αυξάνεται η συγκέντρωση του υποστρώματος, με σταθερή την ποσότητα του ενζύμου

2. Κρυσταλλογραφία (δίνει εικόνες ενζύμων με υποστρώματα)

3. Φασματοσκοπία. Τα χαρακτηριστικά μεταβάλλονται όταν σχηματίζονται τα σύμπλοκα, ιδιαίτερα όταν τα ένζυμα έχουν έγχρωμες προσθετικές ομάδες

Αυξηση υποστρ.

1. Η ταχύτητα αυξάνει όταν αυξάνεται η συγκέντρωση του υποστρώματος, με σταθερή την ποσότητα του ενζύμου

Αντιθέτα με μη καταλυόμενες αντιδράσεις , η ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης, σε σταθερή συγκέντρωση ενζύμου, αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος μέχρις ότου επιτευχθεί μια μέγιστη ταχύτητα.

Η μέγιστη ταχύτητα υποδηλώνει τον πλήρη σχηματισμό συμπλόκου ES.  

κορεσμος

Σε υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος, οι καταλυτικές περιοχές του ενζύμου  (ενεργά κέντρα) είναι κατειλημμένες  (κορεσμένες) και έτσι η ταχύτητα της αντίδρασης δεν μπορεί πλέον  να αυξηθεί με επιπλέον αύξηση του υποστρώματος.

Χ

Η μέγιστη ταχύτητα υποδηλώνει τον πλήρη σχηματισμό του συμπλόκου ES.  

Το ένζυμο κυτόχρωμα Ρ450 προσδεμένο στο υπόστρωμά του (καμφορά). Το υπόστρωμα περιβάλλεται από αμινοξέα του ενεργού κέντρου. Επισημαίνεται η παρουσία του συμπαράγοντα αίμης.

2. Κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ.  Δίνει εικόνες ενζύμων συζευγμένα με υποστρώματα.

Κυτόχρωμα P450

φασμα

3. Φασματοσκοπία. Τα χαρακτηριστικά μεταβάλλονται όταν σχηματίζονται τα σύμπλοκα, ιδιαίτερα όταν τα ένζυμα έχουν έγχρωμες προσθετικές ομάδες

Ένζυμο: Συνθετάση της τρυπτοφάνης

Προσθετική ομάδα:φωσφορική πυριδοξάλη (PLP)

Ενργα κεντρα

Τα ενεργά κέντρα των ενζύμων έχουν κοινά χαρακτηριστικά

• Το ενεργό κέντρο είναι μια τρισδιάστατη εσοχή την οποία συγκροτούν αμινοξέα από διαφορετικές περιοχές της πρωτεινικής αλληλουχίας.

• Στο ενεργό κέντρο προσδένεται το υπόστρωμακαι ο συμπαράγοντας (εαν υπάρχει). 

Λυσοζύμη

Καταλυτικες ομαδες

Τα ενεργά κέντρα των ενζύμων έχουν κοινά χαρακτηριστικά

Οι πλευρικές ομάδες των αμινοξέων του ενεργού κέντρου συμμετέχουν στη δημιουργία ή τη διάσπαση χημικών δεσμών και ονομάζονται καταλυτικές ομάδες.Λυσοζύμη

Αν και τα περισσότερα από τα αμινοξέα του ενζύμου δεν έρχονται σε επαφή με το υπόστρωμα, οι συνεργειακές κινήσεις ολόκληρου του ενζύμου τοποθετούν σωστά τα καταλυτικά αμινοξέα στο ενεργό κέντρο. Ασθενεις δεσμοι 

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΕΡΓΩΝ ΚΕΝΤΡΩΝ 

Τα υποστρώματα προσδένονται με ασθενείς έλξεις στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Πρόκειται για μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις: ηλεκτροστατικούς δεσμούς, δεσμούς υδρογόνου, υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και δεσμούς van der Waals.

Εξιδικευση 

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΕΡΓΩΝ ΚΕΝΤΡΩΝ 

Δεσμοί υδρογόνου μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος  συχνάεπιβάλλουν υψηλό βαθμό  εξειδίκευσης,  πχ  στη ριβονουκλεάση, που αποικοδομεί RNA . 

Το υπόστρωμα και το ένζυμο θα πρέπει να έχουν συμπληρωματικά σχήματα. Καλή αρχικά περιγραφή η σχέση κλειδιού‐κλειδαριάς, αργότερα η επαγόμενη προσαρμογή

συμπληρωματικοτητα

Μοντέλο κλειδιού‐κλειδαριάς: Το ενεργό κέντρο έχει συμπληρωματικό σχήμα προς το υπόστρωμα

Επαγ. προσαρμογη

Μοντέλο επαγόμενης προσαρμογής: Το ένζυμο αλλάζει σχήμα κατά την πρόσδεση του υποστρώματος και το ενεργό 

κέντρο γίνεται συμπληρωματικό προς το υπόστρωμα

Κινητικη 

ΕΝΖΥΜΙΚΗ  ΚΙΝΗΤΙΚΗ

Κινητικη 

Κινητική είναι η μελέτη της ταχύτητας των χημικών αντιδράσεων 

Η ταχύτητα V είναι η ποσότητα του Α που εξαφανίζεται στη μονάδα χρόνου, ίση με την ταχύτητα εμφάνισης του Ρ.

Η ταχύτητα της αντίδρασης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του Α με μια σταθερά, k, που ονομάζεται σταθερά ταχύτητας (αντιδράσεις πρώτης τάξης).

Πολλές βιοχημικές αντιδράσεις περιλαμβάνουν δύο αντιδρώντα (διμοριακές) 

και οι εξισώσεις ταχύτητας  παίρνουν τη μορφή :

ή

ή

ΔΡ/Δτ

Ο απλούστερος τρόπος μελέτης της ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι η παρακολούθηση της αύξησης 

του προϊόντος της σε συνάρτηση με τον χρόνο

Η ποσότητα προϊόντος που προκύπτει, συναρτήσει του χρόνου, αυξάνει ενόσω αυξάνεται η συγκέντρωση υποστρώματος. 

Η αρχική ταχύτητα (V0) για κάθε [S] jπροσδιορίζεται από την κλίση της καμπύλης στην αρχή της αντίδρασης, όταν η αντίστροφη αντίδρασηείναι ασήμαντη.

μοντελο

Tο κρίσιμο χαρακτηριστικό στη συμπεριφορά των ενζύμων είναι ότι το σύμπλοκο ES είναι το αναγκαίο

ενδιάμεσο στην κατάλυση

Tο μοντέλο που προτάθηκε είναι:

Ε + S          ES            E + PK1

K‐1

K2K‐2

Απλοποιώντας, θεωρούμε την ταχύτητα της αντίδρασης σε χρόνους κοντά στο μηδέν (V0), όπου υπάρχει αμελητέος σχηματισμός προϊόντος, και έτσι ΔΕΝ  γίνεται η αντίστροφη αντίδραση(δηλ.  k–2[Ε][Ρ] ≈ 0).

Ε + S           ES            E + PK1K‐1

K2

V0 [E]  [S] 

Αναζητώντας τη σχέση που συνδέει την ταχύτητα της κατάλυσης με τις συγκεντρώσεις του υποστρώματος και 

του ενζύμου και με τις ταχύτητες των επιμέρους βημάτων 

Στο σημείο εκκίνησης η ταχύτητα κατάλυσης είναι ίση με το γινόμενο της συγκέντρωσης του συμπλόκου [ES] επί την k2,Δηλ.   V0 = k2[ES] 

Oι ταχύτητες σχηματισμού και διάσπασης του ES δίνονται από:

Tαχύτητα σχηματισμού του   ES = k1[E][S]Tαχύτητα διάσπασης του ES = (k–1 + k2)[ES]

Ε + S           ES            E + PK1K‐1

K2

Steady state 

Η παραδοχή της σταθερής κατάστασης (Steady state) στο σημείο εκκίνησης της αντίδρασης

Στη σταθερή κατάσταση η συγκέντρωση του ES, παραμένει σταθερή γιατί οι ταχύτητες σχηματισμού και διάσπασης του συμπλόκου ES είναι ίσες.

Ετσι,  k1[E][S] = (k–1 + k2)[ES]  και   [E][S]/[ES] = (k–1 + k2)/k1 

H εξίσωση απλοποιειται με τον ορισμό μιας νέας σταθεράς, της KMπου ονομάζεται σταθερά Michaelis: (k‐1 +k2) / k1 = ΚΜ

Η σταθερά Michaelis ΚΜ εκφράζεται σε μονάδες συγκέντρωσης (mM)

Ε + S           ES            E + PK1K‐1

K2

Michaelis‐Menten

Οταν  [S] << KΜ τότε η ταχύτητα V0   είναι ευθέως ανάλογη της [S] .

Όταν [S] >> KΜ, τότε V0= Vmax , δηλαδή η ταχύτητα είναι η μέγιστη, ανεξαρτήτως της [S].

Vo[S]=KM ‐> Vo =Vmax/2

Το μοντέλο Michaelis‐Menten περιγράφει τις κινητικές ιδιότητες πολλών ενζύμων

Vo =  Vmax[S]

[S] + KM

Όταν [S] = KΜ τότε V0= Vmax /2.   Δηλ.  KΜ είναι η [S] όπου η ταχύτητα της αντίδρασης είναι ίση με το ήμισυ της μέγιστης τιμής.

Kcat 

Το μοντέλο Michaelis‐Menten περιγράφει τις κινητικές ιδιότητες πολλών ενζύμων

H Κ2 ονομάζεται και Kcat. H μέγιστη ταχύτητα Vmaxεπιτυγχάνεται όταν οι καταλυτικές περιοχές του ενζύμου είναι κορεσμένες με υπόστρωμα, δηλαδή όταν  [ΕS] = [Ε]Total

Ε + S           ES            E + PK1K‐1

K2

Vo[S]=KM ‐> Vo =Vmax/2

Vo =  Vmax[S]

[S] + KM

Έτσι,  Vmax = kcat [ES]Total = kcat [E]TotalKΜ 

Η KΜ είναι έναι σημαντική  ενζυμική παράμετρος για πολλές βιολογικές της λειτουργίες 

Παράδειγμα:  Αιθανόλη και Αφυδρογονάση της Aκεταλδεΰδης

Ατομα με ευαισθησία στην αιθανόλη = τοξικά συμπτώματα. 

H mετατροπή αιθανόλης σε ακεταλδεΰδη στο ήπαρ καταλύεται από την  αλκοολική αφυδρογονάση. 

Η ακεταλδεΰδη (τοξική) μετατρέπεται σε οξικό από την Αφυδρογονάση της Aκεταλδεΰδης

KΜ 

Δύο ισομορφές αφυδρογονάσης της αλδεΰδης, μια μιτοχονδριακή με χαμηλό KΜ και μια δεύτερη κυτταροπλασματική  με υψηλό KΜ. 

Σε μεταλλαγμένα άτομα, το μιτοχονδρ. ένζυμο είναι ανενεργό, και έτσι την ακεταλδεΰδη μετατρέπει μόνο το κυτταροπλ. ενζυμο.    

Επειδή το κυτταροπλ. ενζυμο έχει υψηλή KΜ, καταλύει με υψηλή ταχύτητα μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις ακεταλδεΰδης. Συνεπώς, λιγότερη ακεταλδεΰδη μετατρέπεται σε οξικό και η περίσσεια ακεταλδεΰδης περνά στο αίμα, πράγμα που εξηγεί τα τοξικά συμπτώματα.

Η KΜ είναι έναι σημαντική  ενζυμική παράμετρος για πολλές βιολογικές της λειτουργίες 

KΜ 

Η τιμή KMποικίλει σημαντικά  (από 10‐1 έως 10‐7M) 

Vo =  Vmax[S]

[S] + KM Kcat

Ο μέγιστος αριθμός μετατροπής των ενζύμων 

ποικίλει σημαντικά

Vmax = kcat [E]Total

kcat/KΜ 

Ένζυμα τα οποία έχουν τον λόγο kcat/KΜ στο ανώτατο όριο, έχουν επιτύχει την κινητική τελειότητα

KM και Vmax πειραματικά

Οι τιμές KM και Vmax προσδιορίζονται πειραματικά

Η εξίσωση Michaelis‐Menten μπορεί να αντιστραφεί δίνοντας την 1/V0 ως γραμμική συνάρτηση της 1/S

Η γραφική παράσταση του 1/V0 συναρτήσει του 1/[S]  είναι ευθεία με τεταγμένη επί της  αρχής 1/Vmax,  τετμημένη επί της αρχής –1/KΜκαι κλίση KΜ/Vmax.  .

Πολλα υποστρωματα

Οι περισσότερες βιοχημικές αντιδράσεις περιλαμβάνουν πολλαπλά υποστρώματα

Οι πιο πολλές αντιδράσεις έχουν συνήθως δύο υποστρώματα (ή/και 

συνένζυμα) και δύο προϊόντα,      Α + Β            P + Q

Μεταφέρουν μια λειτουργική ομάδα πχ μια φωσφο‐ομάδα  ή μια αμινο‐ομάδα από το το ένα υπόστρωμα στο άλλο, ή μεταφέρουν ηλεκτρόνια μεταξύ των υποστρωμάτων (αντιδράσεις οξειδοαναγωγής).

Αντιδράσεις πολλαπλών υποστρωμάτων μπορούν να διαιρεθούν σε δύο κατηγορίες: τις διαδοχικές αντιδράσεις και τις αντιδράσεις διπλής εκτόπισης.

διαδοχικες

Διαδοχική αντίδραση: Ολα τα υποστρώματα προσδένονται διαδοχικάστο ένζυμο προτού απελευθερωθεί προϊόν.  Σχηματίζεται τριμερές σύμπλοκο ενζύμου και των δύο υποστρωμάτων ή του υποστρώματος και του συνενζύμου,   πχ: 

Η γαλακτική αφυδρογονάση ανάγει το πυροσταφυλικό σε γαλακτικό ενώ οξειδώνει το NADH σε NAD+.

Το συνένζυμο προσδένεται πρώτο και μετά το πυροσταφυλικό, ενώ πρώτα απελευθερώνεται το γαλακτικό και μετά το συνένζυμο. 

Γαλακτική αφυδρογονάση

Πινγκ πονγκ

Αντιδράσεις διπλής εκτόπισης ή πινγκ‐πονγκ: 

Ασπαραγινική αμινοτρανσφεράση

1ο υπόστρωμα 1ο προϊόν 2ο υπόστρωμα 2ο προϊόν

Απελευθερώνονται προϊόντα προτού προσδεθούν όλα τα υποστρώματα στο ένζυμο.    Προσωρινά  τροποποιημένο ένζυμο .

Πχ η αμινομεταφοράση του ασπαραγινικού που καταλύει τη μεταφορά μιας αμινικής ομάδας από το ασπαραγινικό στο α‐κετογλουταρικό.

αναστολη

Τα ένζυμα είναι δυνατόν να ανασταλούν από ειδικά μόρια

Η ενζυμική αναστολή αποτελεί μηχανισμό ελέγχου της καταλυτικής ενεργότητας in vivo και έχει ποικίλες πρακτικές εφαρμογές(πχ  φάρμακα).

Η αναστολή μπορεί να είναι μη αντιστρεπτή ή αντιστρεπτή.

Ο μη αντιστρεπτός αναστολέας συνδέεται πολύ ισχυρά με το ένζυμο (συνήθως ομοιοπολικά) και διαχωρίζεται πολύ αργά και δύσκολα από το ένζυμο. 

Ο αντιστρεπτός αναστολέας συνδέεται χαλαρά και χαρακτηρίζεται από ταχύ διαχωρισμό του συμπλόκου ενζύμου‐αναστολέα. Μμπορεί να αναστέλλει την καταλυτική λειτουργία του ενζύμου είτε συναγωνιστικά ή μη συναγωνιστικά. 

Μη αντιστρεπτος

• Η ασπιρίνη δρα τροποποιώντας ομοιοπολικά το ένζυμο  κυκλοξυγονάση (σύνθεση προσταγλανδινών), ελαττώνοντας τη σύνθεση των φλεγμονωδών σημάτων.

• Η πενικιλίνη δρα στο ένζυμο τρανσπεπτιδάση και εμποδίζει τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων.

Ο μη αντιστρεπτός αναστολέας μπορεί να τροποποιεί χημικά την πρωτεινική δομή του ενζύμου

αντιστρεπτος

Αντιστρεπτοί  συναγωνιστοί  αναστολείςΤο ένζυμο προσδένει στο ενεργό κέντρο τον αναστολέα (EI), που συχνά μοιάζει δομικά με το υπόστρωμα, ή το υπόστρωμα (ES), αλλά όχι και τα δύο, έτσι το υπόστρωμα εμποδίζεται να προσδεθεί στο ενεργό κέντρο.

Ο συναγ. αναστολέας ελαττώνει την ταχύτητα αντίδρασης ελαττώνοντας τον αριθμό μορίων ενζύμου που προσδένουν υπόστρωμα.

Η συναγωνιστική αναστολή αίρεται με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος.

Το αντικαρκινικό μεθοτρεξάτη προσδένεται στην αναγω‐γάση του διυδροφυλλικού  (δομικό ανάλογο του υποστρώματος της) 1.000 φορές ιχυρότερα απ’ ό,τι το διυδροφυλλικό και αναστέλλει τη σύνθεση νουκλεοτιδίων

Μη συναγωνιστικος

Αντιστρεπτοί  μη συναγωνιστοί  αναστολείς

Ο  μη συναγωνιστικός αναστολέας και το υπόστρωμα μπορούν να προσδένονται ταυτόχρονα σε ένα μόριο ενζύμου, όμως σε διαφορετικές περιοχές πρόσδεσης.

Μπορεί να προσδένεται στο ελεύθερο ένζυμο ή στο σύμπλοκο ενζύμου‐υποστρώματος.

Ελαττώνει τη συγκέντρωση του λειτουργικού ενζύμου και όχι τον αριθμό μορίων του ενζύμου που είναι προσδεμένα στο υπόστρωμα, ελαττώνοντας τον αριθμό μετατροπής. 

H μη συναγωνιστική αναστολή δεν μπορεί να ξεπεραστεί με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος. 

κινητικη

Η συναγωνιστική και η μη συναγωνιστική αναστολή είναι κινητικά διακριτές

Κινητική  Συν. αναστολής Κινητική  Μη‐Συν. αναστολής

Αύξηση συγκέντρωσης του συναγωνιστικού αναστολέα απαιτεί υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώματος για να αποκατασταθεί η ενζυμική ταχύτητα

Η ταχύτητα δεν μπορεί να φτάσει τη μέγιστη τιμή της ακόμα και σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος

αλλοστερικα

Τα αλλοστερικά ένζυμα δεν υπακούουν στην κινητική Michaelis‐Menten

Τα αλλοστερικά ένζυμα έχουν πολλές υπομονάδες και πολλαπλά ενεργά κέντρα.  Αυτά περιγράφονται από σιγμοειδείς καμπύλες

Η πρόσδεση του υποστρώματος σε ένα 

ενεργό κέντρο μπορεί να επηρεάσει τις ιδιότητες των άλλων ενεργών κέντρων στο 

ίδιο μόριο (συνέργεια)

Η δραστικότητα των αλλοστερικών ενζύμων μπορεί να μεταβληθεί από ρυθμιστικά μόρια που προσδένονται αντιστρεπτά σε ειδικές περιοχές, διαφορετικές από τα καταλυτικά κέντρα

Ορθογώνια υπερβολή

Σιγμοειδής

Χαρτογραφηση ΕΚ

Μη‐αντιστρεπτοί αναστολείς μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη χαρτογράφηση του ενεργού κέντρου

• Στη μη αντιστρεπτή αναστολή αξιοποιούμε την ομοιοπολική πρόσδεση για να κατανοήσουμε στοιχεία της λειτουργίας των ενζύμων.

• Διαιρούμε τους μη αντιστρεπτούς αναστολείς σε τρεις κατηγορίες:

α. Αντιδραστήρια με εξειδίκευση ομάδας, β. Ανάλογα υποστρωμάτων γ. Αναστολείς αυτοκτονίας

3

• Α.  Αναστολείς με εξειδίκευση ομάδας: Αντιδρούν με   πλευρικές ομάδες των αμινοξέων του ενζύμου. 

• Στη χυμοτρυψίνη αλλάζει μόνο μια από τις 28 Ser= ΕΝΕΡΓΗ (άρα στο ενεργό κέντρο). Επίσης ενεργή σερίνη στην ακετυλοχολινεστεράση!!!

3

• Α.  Αναστολείς με εξειδίκευση ομάδας: Αντιδρούν με πλευρικές ομάδες των αμινοξέων του ενζύμου. 

• Το ιωδοακεταμίδιο αντιδρά με ενεργές κυστεϊνες

3

Β.  Ιχνηθέτες συγγένειας: είναι μικρά μόρια δομικά παρόμοια με το υπόστρωμα του ενζύμου, τα οποία τροποποιούν ομοιοπολικά τα κατάλοιπα του ενεργού κέντρου.

3

Γ. Αναστολείς αυτοκτονίας ή μηχανισμού: Μόρια τροποποιημένου υποστρώματος, που προσδένονται στο ένζυμο και υφίστανται επεξεργασία όπως το υπόστρωμα. Κάποιο ενδιάμεσο που παράγεται απενεργοποιεί το ένζυμο μέσω ομοιοπολικής τροποποίησης.

Αναστολεις αυτοκτονιας