124 www.postepybiochemii.pl

Jacek Zbigniew Kubiak1,*

Maria Anna Ciemerych2,*

1CNRS, UMR 6290, University Rennes 1, Institute of Genetics and Development of Rennes (IGDR), Cell Cycle Team, UEB, IFR 140, Faculty of Medicine, Rennes, France 2Zakład Cytologii, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa

*CNRS, UMR 6290, University Rennes 1, Institute of Genetics and Development of Rennes (IGDR), Cell Cycle Team, UEB, IFR 140, Faculty of Medicine, F-35043 Rennes, France; tel.: (33) 223 23 46 98, e-mail: jacek.kubiak@univ-rennes1.fr (prof. Jacek Z. Kubiak) lub Zakład Cytologii, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Ilji Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel.: (22) 5542216, e-mail: ciemerych@biol.uw.edu.pl (prof. Maria A. Ciemierych)

Artykuł otrzymano 5 marca 2013 r.Artykuł zaakceptowano 5 kwietnia 2013 r.

Słowa kluczowe: rozwój zarodkowy, klono-wanie płazów i ssaków, różnicowanie, komór-ki ES, komórki iPS

Wykaz skrótów: komórki EC (ang. embryonic carcinoma) — komórki raka zarodkowego; ko-mórki ES (ang. embryonic stem) — zarodkowe komórki macierzyste; komórki iPS (ang. indu-ced pluripotent stem) — indukowane pluripo-tencjalne komórki macierzyste

Od Gurdona do Yamanaki, czyli krótka historia reprogramowania komórek

STRESZCZENIE

Artykuł przedstawia genezę odkryć, które doprowadziły do uzyskania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiągnięcie to zostało nagrodzone w

roku 2012 nagrodą Nobla w dziedzinie Fizjologii lub Medycyny, którą otrzymali John B. Gurdon i Shinya Yamanaka. Werdykt Komitetu Noblowskiego brzmiał następująco: „za odkrycie, że dojrzałe, zróżnicowane komórki mogą być reprogramowane w ten sposób, że odzyskują stan pluripotencji typowy dla komórek macierzystych”. Podstawy do tego odkrycia stworzył Gurdon w latach 60. XX wieku, choć nie był pionierem w swej dzie-dzinie badań. Kropkę nad i postawił zaś Yamanaka na początku XXI wieku. Japończyk przyszedł na świat pięćdziesiąt lat temu, czyli dokładnie w roku, w którym Gurdon do-konał swych najważniejszych odkryć. Mimo tak dużej różnicy wieku obu naukowców ich badania doskonale się uzupełniają, a dokonane przez nich odkrycia znalazły liczne zastosowania w projektach dotyczących biologii komórki i rozwoju zwierząt, a także dają nadzieję na ich wykorzystanie w medycynie regeneracyjnej.

WPROWADZENIE — POcZątKI REPROGRAMOWANIA

Długa droga prowadząca do Nagrody Nobla dla Gurdona i Yamanaki za-częła się od postawienia pytania czy komórki zarodkowe mające potencjał tworzenia wszystkich komórek i tkanek organizmu tracą te zdolności raz na zawsze w trakcie rozwoju osobniczego, czy też tylko blokują informację genetyczną w sposób odwracalny. Patrząc na ten problem z drugiej strony pytanie to przeformułowano tak: czy komórki w procesie różnicowania tracą informację niezbędną do ich funkcjonowania w stanie niezróżnicowanym, stanie pluripotencji. Po raz pierwszy sposób na rozwiązanie tej zagadki za-proponował niemiecki laureat Nagrody Nobla z roku 1935 i odkrywca in-dukcji zarodkowej, Hans Spemann. Wymyślił on „fantastisch Experiment”, czyli „fantastyczne doświadczenie”, które miało polegać na przeniesieniu jądra zróżnicowanej komórki płaza do pobudzonego do rozwoju oocytu i obserwacji czy tak zrekonstruowany zarodek będzie w stanie przeprowadzić po raz drugi cały proces rozwojowy. Spemann określał swoje hipotetyczne doświadczenie mianem „fantastisch Experiment”, gdyż po prostu sądził, że jest ono technicznie niewykonalne.

Wielki embriolog jednak się mylił. Postęp nauki sprawił bowiem, że wy-konanie „fantastycznego doświadczenia” okazało się w zasięgu ręki. Pod ko-niec lat 40. XX wieku dwaj amerykańscy embriolodzy Robert Briggs i Thomas King, przymierzając się do podjęcia spemannowskiej próby złożyli propozy-cję grantu w National Cancer Institute. Ich pomysł został jednak odrzucony jako “pozbawiony sensu”. Dopiero po powtórnym zgłoszeniu grantu udało im się przełamać lody i uzyskać finansowanie na swoje badania.

Pierwszy „fantastisch Experiment” Briggs i King wykonali w roku 1952 (Ryc. 1) [1]. Za pomocą szklanych pipet wprowadzali jądra komórkowe izo-lowane z komórek zarodków żaby Rana pipiens do oocytów pozbawionych ich własnej chromatyny. Następnie pobudzali tak zrekonstruowane oocyty żaby do rozwoju zarodkowego. Wyniki tych doświadczeń były bardzo za-chęcające. Okazało się bowiem, że pod wpływem cytoplazmy oocytu jądra komórek zarodkowych żaby, były w stanie w stanie ponownie uruchomić już raz zrealizowany program rozwojowy. Briggs i King obserwowali w niektó-rych przypadkach rozwój tak sklonowanych zarodków aż do stadium kijan-ki. Częstość z jaką uzyskiwali tak zaawansowany rozwój była jednak niska. Kiedy jednak użyli do podobnych doświadczeń jąder komórek już zróżnico-wanych, rozwoju zarodkowego nie obserwowali. Wysnuli więc wniosek, że różnicowanie jest procesem zmieniającym informację genetyczną w sposób nieodwracalny [2].

Postępy Biochemii 59 (2) 2013 125

Nieco później John Gurdon prowadził podobne do-świadczenia na innym płazie bezogoniastym, Xenopus la-evis [3-5]. Badania takie były również realizowane przez Kobla i współpracowników [6], rozszerzone znów przez Gurdona [7,8], a także Wabla [9] i Di Berardino [10-12]. Okazało się, że przeszczepienie jądra komórkowego po-chodzącego nawet z bardzo wyspecjalizowanych komó-rek, np. naskórka [8], limfocytu [9], erytrocytu lub ery-troblastu [11,12] do oocytu płaza, który uprzednio został pozbawiony własnego materiału genetycznego, może do-prowadzić do zakończonego sukcesem rozwoju zarodko-wego. Wykazano więc, że komórki dorosłego organizmu zachowują całą informację umożliwiającą przeprowadze-nie rozwoju zarodkowego.

RóżNIcOWANIE KOMóREK SSAKóW tEż JESt „ODWRAcAlNE”

Wczesne próby powtórzenia u ssaków opisanych wy-żej doświadczeń prowadzonych na płazach przyniosły jednak rozczarowanie. Podejrzewano, że „odwracal-ność” procesu różnicowania mogła dotyczyć wyłącznie niższych kręgowców, a nie ssaków. Do takiego wniosku doszli McGrath i Solter obserwując rozwój zarodków mysich, uzyskiwanych przez transplantacje jąder komór-kowych blastomerów, do zygot pozbawionych własnego materiału genetycznego [13]. Uzyskali oni pełen rozwój zarodkowy wyłącznie gdy do doświadczeń użyli jąder komórkowych pochodzących z blastomerów zarodków dwukomórkowych. Wskazywało to, że choć jądra zróż-

nicowanych komórek płazów były w stanie pokierować rozwojem zarodka powstałego po ich przeszczepieniu do oocytów, to ssacze jądra komórkowe wydawały się ulegać nieodwracalnym zmianom już w trakcie rozwoju przedimplantacyjnego.

Podobne badania prowadzone były także w Zakładzie Embriologii Uniwersytetu Warszawskiego. Zespół kiero-wany przez Andrzeja K. Tarkowskiego analizował zmia-ny jakim podlegają jądra komórek somatycznych wpro-wadzonych do oocytów myszy. Zakładano, że kluczem do sukcesu polegającego na sklonowaniu ssaka jest od-powiednie przemodelowanie jądra komórki somatycznej umożliwiające jego reaktywację, a dzięki temu rekapitu-lację rozwoju zarodkowego. Analizowano wprowadzane do oocytów jądra tymocytów — komórek izolowanych z grasic mysich noworodków i otaczających oocyty komórek folikularnych [14-22], ale także jądra komórek pochodzą-cych z blastomerów budujących przedimplantacyjny za-rodek myszy [23,24]. Dzięki tym pracom uzyskano wiele cennych danych na temat reorganizacji chromatyny jąder wprowadzonych do oocytów myszy. Nie doprowadziły one jednak do opracowania metod pozwalających na uzy-skanie rozwijających się zarodków. Pomimo, że badania Tarkowskiego nie zakończyły się sukcesem to zarówno on jak i współautor tej pracy przeglądowej (J.Z.K.) mają skromny wkład w klonowanie zwierząt. Obaj opracowali bowiem technikę elektrofuzji komórek zarodkowych [25], wykorzystaną później w doświadczeniach, które dopro-wadziły do klonowania owcy Dolly.

Rycina 1. Historia badań, które doprowadziły do uzyskania pierwszych sklonowanych zwierząt oraz linii pluripotencjalnych komórek macierzystych — ES i iPS.

126 www.postepybiochemii.pl

Dopiero kolejne próby klonowania, w których do oocy-tów przeszczepiano jądra komórek somatycznych izolo-wanych z zarodków owiec dały pozytywne wyniki [26]. Następnie powtórzono te doświadczenia na komórkach krowy [27]. Jednak przełomowe okazały się doświadcze-nia Iana Wilmuta, Keitha Campbella i ich współpracow-ników, którym udało się sklonować owcę Dolly. Przepro-wadzone przez nich doświadczenie polegało na przenie-sieniu jądra zróżnicowanej komórki nabłonkowej gruczo-łu mlekowego dorosłej owcy do oocytu pozbawionego własnego jądra (Ryc. 2) [28]. Wkrótce potem sklonowano pierwsze myszy [29,30]. Osiągnięcia te były doskonałym dopełnieniem badań Briggsa, Kinga i Gurdona.

ZARODKOWE KOMóRKI MAcIERZYStE MOGą SłużYć JAKO NARZęDZIE W BADANIAch RóżNIcOWANIA

Równocześnie z pracami Kinga, Briggsa czy Gurdona, prowadzono badania, których uwieńczeniem również była Nagroda Nobla w dziedzinie Fizjologii lub Medycy-ny. Prace te dotyczyły komórek pluripotencjalnych (Ryc. 3), a więc takich które mogą różnicować się we wszyst-kie tkanki budujące organizm. Pierwsze prace, w których zwrócono uwagę na to, że nie tylko komórki przedim-plantacyjnych zarodków ssaków są pluripotencjalne doty-czyły analiz guzów powstających w jądrach lub jajnikach myszy — potworniaków (teratom, od gr. teratos). Już w 1941 stwierdzono, że mogą one zawierać komórki zdolne

do różnicowania we wszystkie tkanki budujące organizm [31]. Kolejne analizy potwierdziły te obserwacje (praca przeglądowa [32]) i w efekcie doprowadziły do uzyskania pierwszej linii komórek pluripotencjalnych, tzw. komórek raka zarodkowego (ECC, ang. embryonic carcinoma cells) [33,34]. Wyniki doświadczeń, w których badano zdolności do różnicowania się komórek uzyskanych z potwornia-ków oraz stwierdzenie, że potworniaki powstają z komó-rek rozrodczych zainicjowały prace, które doprowadziły do uzyskania pierwszych linii mysich zarodkowych ko-mórek macierzystych (ES, ang. embryonic stem). Komórki te otrzymali niezależnie od siebie Gail Martin [35] oraz Mar-tin Evans i Matthew Kaufman [36]. Martin Evans został za swoje odkrycie uhonorowany Nagrodą Nobla w 2007 roku. W 1998 uzyskano zaś pierwsze ludzkie [37,38], a w 2008 szczurze linie komórek ES [39].

Od momentu uzyskania mysich komórek ES prowa-dzone były liczne prace mające na celu określenie podło-ża molekularnego ich pluripotencji, samoodnawiania ich populacji oraz nieograniczonych zdolności różnicowania we wszystkie rodzaje komórek budujących organizm. Badania te doprowadziły do identyfikacji wielu szlaków przekazywania sygnałów, jak również czynników od-powiedzialnych za specyficzny charakter komórek ES. Wśród nich są powszechnie dziś uważane za markery pluripotencji czynniki transkrypcyjne Oct3/4, Nanog czy Sox2 (prace przeglądowe [40,41]). Ta gromadzona przez lata badań wiedza została następnie twórczo wykorzysta-na w badaniach, które zainicjował Shinya Yamanaka.

Rycina 2. Schemat doświadczeń prowadzących do uzyskania sklonowanych zwierząt lub pluripotencjalnych komórek macierzystych – ES lub iPS. Pierwszym etapem klonowania jest usunięcie chromosomów z owulowanych oocytów. Następnie do cytoplazmy takiego oocytu wprowadzane jest jądro komórki somatycznej, np. fibrobla-stu, a oocyt pobudzany jest do rozwoju bodźcem partenogenetycznym. Takim bodźcem może być np. impuls prądu elektrycznego o określonym napięciu i częstotliwości. Po aktywacji rozwija się zarodek, który osiąga stadium blastocysty. Blastocystę można przeszczepić do dróg rodnych samicy biorczyni i uzyskać sklonowany organizm. W ten sposób uzyskano np. owcę Dolly. Alternatywnie, z blastocysty można uzyskać linię komórek ES. Komórki takie określane są jako ntES, od ang. nuclear transfer ES. Fibroblasty mogą zostać reprogramowane dzięki nadekspresji genów kluczowych dla utrzymania pluripotencji, np. Oct3/4, Sox2, Klf4. Zabieg taki prowadzi do uzyskania linii komórek iPS.

Postępy Biochemii 59 (2) 2013 127

REPROGRAMOWANIE KOMóREK JESt MOżlIWE POPRZEZ MANIPulAcJE GENEtYcZNE

Zakończone sukcesem badania Gurdona, Wilmuta i wielu innych badaczy udowodniły, że możliwe jest klo-nowanie zwierząt. A więc reprogramowanie jądra komó-rek somatycznych przez cytoplazmę oocytu. Czy jednak taki proces byłby możliwy bez uciekania się do transplan-tacji jądra komórki zróżnicowanej do oocytu? Do dziś nie wiadomo w jaki dokładnie sposób cytoplazma oocytu, do którego wprowadzono jądro zróżnicowanej komórki, powoduje jego reprogramowanie. Jest jednak oczywiste, że istotą tego procesu są zmiany w ekspresji określonych genów. Podczas rozwoju w różnicujących się komórkach wyciszeniu ulegają geny warunkujące pluripotencję, ta-kie jak np. Oct3/4 czy Nanog. Dochodzi też wtedy do ak-tywacji genów charakterystycznych dla różnicujących się komórek i powstających tkanek. W pełni zróżnicowana komórka charakteryzuje się więc ekspresją unikalnego zestawu genów. Shinya Yamanaka skoncentrował swo-je badania na czynnikach, które zidentyfikowano pod-czas wieloletnich badań komórek ES. Wybrał te czynni-ki, które zaangażowane są w utrzymanie pluripotencji [42-45]. Wcześniejsze badania prowadzone przez Tadę i współpracowników dokumentowały, że cytoplazma ko-mórek ES miała zdolność indukowania ekspresji Oct4 w komórkach hybrydowych uzyskanych przez ich fuzję z dojrzałymi tymocytami [45]. Na podstawie tej obserwacji Yamanaka sformułował hipotezę, że pluripotencja takich hybrydowych komórek zależy od czynników transkryp-cyjnych obecnych w jądrach komórek macierzystych, przenikających po fuzji do jąder komórki somatycznej. Przyszły noblista postanowił zbadać czy możliwa była-

by indukcja stanu pluripotencji bez uciekania się do fu-zji komórkowej, a poprzez indukcję ekspresji wybranych czynników transkrypcyjnych. Yamanaka wybrał 24 geny, o których wiedział, że w komórkach ES regulują samood-nawianie, pluripotencje (np. Oct3/4., Sox2), ale także są odpowiedzialne za podtrzymanie proliferacji (np. onko-gen c-Myc). Przeprowadzone przez niego doświadczenia polegało najpierw na transfekcji mysich fibroblastów wi-rusami kodującymi pojedyncze geny. Niestety, nie przy-niosło to oczekiwanych skutków. Dopiero jednoczesna ekspresja wszystkich 24 genów doprowadziła do repro-gramowania fibroblastów, które przekształciły się w ko-lonie komórek do złudzenia przypominających komórki ES.

Kluczowym było pytanie o to jakie czynniki są nie-zbędne potrzebne do reprogramowania fibroblastów. Ponadto, jasne było, że indukcja pluripotencji za pomocą jednoczesnej nadekspresji aż 24 genów jest zadaniem kar-kołomnym. Yamanka postanowił więc zbadać, czy możli-we jest ograniczenie liczby czynników. Okazało się, że do reprogramowania mysich fibroblastów wystarczy użycie jedynie czterech genów. Były to odpowiedzialne za utrzy-manie pluripotencji czynniki Oct3/4 i Sox2, a także Klf4 warunkujący syntezę białka Nanog, oraz onkogen c-Myc (Ryc. 2) [46]. Komórki uzyskane przez ekipę Yamanaki nazwano indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPS, ang. induced pluripotent stem). Szybko okazało się, że mogą one różnicować się zarówno in vitro jak i in vivo, tworząc wszystkie tkanki w chimerowych myszach. Myszy takie uzyskuje się przez wprowadzenie komórek pluripotencjalnych (np. ES lub iPS) do blasto-cyst, a więc zarodków przedimplantacyjnych. Następnie

Rycina 3. Komórki macierzyste charakteryzują odmienne zdolności do różnicowania.

128 www.postepybiochemii.pl

zarodki takie przeszczepia się do dróg rodnych samicy biorczyni. Jeżeli w rozwijającym się zarodku i myszy, która w efekcie przyjdzie na świat z testowanych komó-rek powstaną wszystkie rodzaje komórek, łącznie z płcio-wymi, będzie to świadczyło, że są one pluripotencjalne.

W tym miejscu należałoby dodać, że pierwsze chime-rowe myszy uzyskał Andrzej K. Tarkowski. W 1961 roku opublikował on wyniki swoich pionierskich doświad-czeń, podczas których łączył ze sobą zarodki pochodzące od różnych myszy i po raz pierwszy uzyskał ekspery-mentalnie organizm zbudowany z komórek pochodzą-cych od dwóch różnych dawców [47]. Technika uzyski-wania myszy chimerowych jest do dziś stosowana nie tylko w doświadczeniach mających na celu testowanie pluripotencji komórek macierzystych (Ryc. 4), ale także tych prowadzących do uzyskania myszy zmodyfikowa-nych genetycznie, np. typu knock-out [48].

W roku 2007, grupy badawcze Shinyi Yamanaki i Ja-mesa Thomsona uzyskały niezależnie od siebie po raz pierwszy ludzkie komórki iPS [19,20,49]. W przypadku zróżnicowanych komórek ludzkich efekt przywracania

pluripotencji uzyskać można było stosując nieco inny ze-staw czynników trakskrypcyjnych niż w przypadku ko-mórek mysich. Yamanaka użył kombinacji genów Myc, Oct4, Sox2 i Klf4, podobnie jak w przypadku fibroblastow mysich. Ale grupa Thomsona zastosowała ekspresję ze-stawu innych genów: Lin28, Nanog, Oct4 i Sox2. Kolejne badania wykazały, że reprogramować można nie tylko fibroblasty, ale także inne rodzaje komórek (praca prze-glądowa [50]). Udokumentowano także, że procedurę tę można przeprowadzić z pominięciem onkogenu c-Myc, którego ciągła aktywność prowadziła do rozwoju no-wotworów u myszy uzyskanych z pierwszych komórek iPS. Doskonalone są także techniki reprogramowania, a główny nacisk położony jest na opracowanie metod, które opierałyby się na wektorach innych niż wirusowe. Idealny wektor dostarczający do komórki aktywne geny pluripotencji nie powinien integrować do DNA komór-ki, a aktywność wprowadzanych genów powinna być regulowana w odpowiedni sposób. Prowadzone są także próby reprogramowania nie wektorami kodującymi dane białka ale samymi białkami. Należy jednak pamiętać, że w każdym przypadku wydajność uzyskiwania komórek iPS jest bardzo niska.

Rycina 4. Metody pozwalające na stwierdzenie, czy komórki macierzyste są pluripotencjalne. A. Otrzymywanie chimer. Testowane komórki zwierzęce, np. mysie, wpro-wadzane są do jamy blastocysty, a następnie zarodek przeszczepiany jest do dróg rodnych samicy myszy. Jeżeli z komórek macierzystych powstaną wszystkie tkanki i narządy będzie to świadczyło o tym, że są one pluripotencjalne. W wyniku takiego doświadczenia powstanie zwierzę chimerowe. B. Tetraploidalna komplementacja. Tetraploidalną blastocystę uzyskuje się w wyniku fuzji blastomerów zarodka dwukomórkowego, a następnie jego hodowli in vitro. Komórki macierzyste wprowadzane są do jamy takiej blastocysty. Ponieważ komórki tetraploidalne mogą tworzyć jedynie struktury pozazarodkowe - błony płodowe, ciało zarodka powstanie jedynie z di-ploidalnych komórek macierzystych. W wyniku tetraploidalnej komplementacji uzyskuje się więc organizm zbudowany wyłącznie z tkanek powstałych z analizowanych komórek macierzystych, pod warunkiem że są one pluripotencjalne. c. Uzyskiwanie potworniaków. Komórki wprowadzone pod skórę myszy różnicują spontanicznie tworząc guzy, potworniaki (teratomy). Jeżeli guzy zbudowane są z tkanek wywodzących się z ekto-, endo- i mezodermy możemy uznać, że testowane komórki są pluripo-tencjalne. D. Różnicowanie in vitro. Przesłanką za tym, że testowane komórki są pluripotencjalne może być także ich zdolność do różnicowania in vitro w różnego rodzaju komórki. Jednak jedynie różnicowanie in vivo (tworzenie chimer, potworniaków), prowadzące do uzyskania funkcjonalnych tkanek, może stanowić niepodważalny i ostateczny dowód pluripotencji.

Postępy Biochemii 59 (2) 2013 129

KOMóRKI IPS — NADZIEJA MEDYcYNY REGENERAcYJNEJ?

Uzyskanie komórek iPS może mieć przełomowe zna-czenie dla rozwoju medycyny regeneracyjnej. Może bo-wiem umożliwić uzyskanie określonego rodzaju tkanki w wyniku reprogramowania komórek pochodzących od indywidualnego pacjenta. Przykładowo fibroblasty po-chodzące ze skóry pacjenta można przekształcić w ko-mórki iPS, a następnie zaindukować je do różnicowania, np. w neurony lub komórki trzustki. Następnym kro-kiem byłoby przeszczepienie tak uzyskanych komórek w miejsce tych degenerujących, bez obaw o odrzucenie przeszczepu. Wykorzystanie komórek iPS nie budzi tak-że wątpliwości etycznych związanych z uzyskiwaniem i zastosowaniem ludzkich komórek ES, czy tzw. klonowa-niem reprodukcyjnym, podczas którego jądro uzyskane z komórek pacjenta przeszczepiane byłoby do ludzkiego oocytu, pozbawionego uprzednio własnego materiału ge-netycznego. Komórki ES uzyskane z tak zrekonstruowa-nego zarodka byłyby również identyczne z komórkami pacjenta. Ich uzyskanie wymagałoby jednak zniszczenia ludzkiej blastocysty (Ryc. 2). Wyniki opisujące udane klo-nowanie ludzkiej blastocysty, a następnie analizę uzyska-nych z niej komórek ntES zostały opublikowane w maju 2013 [51]. Dostępność komórek iPS usuwa jednak w cień tego rodzaju eksperymenty.

Hodowla komórek iPS w laboratorium umożliwia tak-że ich genetyczną modyfikację, np. usunięcie z ich geno-mu mutacji powodującej daną chorobę. Techniki modyfi-kacji genetycznych komórek pluripotentnych opracowali Cappecchi i Smithies, którzy razem z Evansem zostali na-grodzeni Nagroda Nobla w 2007 roku. Takie właśnie za-stosowanie komórki iPS mogłyby znaleźć w przypadku wielu chorób degeneracyjnych o podłożu genetycznym. Możliwość hodowania tych komórek w laboratorium otwiera również perspektywy szybszego i łatwiejszego poznawania przyczyn chorób genetycznych, testowania farmaceutyków i wiele innych zastosowań. Myśląc jed-nak o przyszłości komórek iPS nie należy zapominać, że decyzja o ich wykorzystaniu w terapii ciągle zależy od perfekcyjnego opanowania metod różnicowania in vitro. Pomimo wielu lat badań poświęconych różnicowaniu komórek pluripotencjalnych perfekcji tej jeszcze nie osią-gnięto.

Obecny numer Postępów Biochemii ma przybliżyć nie tylko pluripotencjalne komórki macierzyste ES i iPS, a więc te które mogą różnicować we wszystkie rodzaje komórek budujących organizm. Przedstawione zostaną także komórki obecne w tkankach płodowych, np. we krwi pępowinowej, a także w tkankach dorosłych orga-nizmów. O ile bowiem komórki ES i iPS pozwalają badać mechanizmy pluripotencji i różnicowania, dają nadzieję na rozwój medycyny regeneracyjnej, to komórki macie-rzyste „naturalnie” obecne w tkankach organizmu gwa-rantują jego prawidłowe funkcjonowanie.

PIŚMIENNIctWO1. Briggs R, King TJ (1952) Transplantation of living nuclei from blastula

cells into enucleated frogs eggs. Proc Natl Acad Sci USA 38: 455-463

2. King TJ, Briggs R (1956) Serial Transplantation of Embryonic Nuclei. Cold Spring Harbor Symposia Quant Biol 21: 271-290

3. Gurdon JB (1962) Multiple genetically identical frogs. J Heredity 53: 5-9

4. Gurdon JB (1962) Developmental capacity of nuclei taken from inte-stinal epithelium cells of feeding tadpoles. J Embryol Exp Morph 10: 622-640

5. Gurdon JB (1962) Adult frogs derived from nuclei of single somatic cells. Develop Biol 4: 256-273

6. Kobel HR, Brun RB, Fischber.M (1973) Nuclear transplantation with melanophores, ciliated epidermal cells, and established cell-line a-8 in Xenopus Laevis. J Embryol Exp Morph 29: 539-547

7. Gurdon JB, Uehlinger V (1966) Fertile” intestine nuclei. Nature 210: 1240-1241

8. Gurdon JB, Laskey RA, Reeves OR (1975) Developmental capacity of nuclei transplanted from keratinized skin cells of adult frogs. J Embry-ol Exp Morph 34: 93-112

9. Wabl MR, Brun RB, Dupasquier L (1975) Lymphocytes of toad Xeno-pus Laevis have gene set for promoting tadpole development. Science 190: 1310-1312

10. Di Berardino MA, Mizell M, Hoffner NJ, Friesendorf DG (1983) Frog larvae cloned from nuclei of pronephric adenocarcinoma. Differentia-tion 23: 213-217

11. Di Berardino MA, Hoffner NJ (1983) Gene reactivation in erythrocy-tes - nuclear transplantation in oocytes and eggs of Rana. Science 219: 862-864

12. Di Berardino MA, Orr NH (1992) Genomic potential of erythroid and leukocytic cells of Rana-Pipiens analyzed by nuclear transfer into di-plotene and maturing oocytes. Differentiation 50: 1-13

13. Mcgrath J, Solter D (1984) Inability of mouse blastomere nuclei trans-ferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science 226: 1317-1319

14. Tarkowski AK, Balakier H (1980) Nucleo-cytoplasmic interactions in cell hybrids between mouse oocytes, blastomeres and somatic cells. J Embryol Exp Morphol 55: 319-330

15. Szollosi D, Czolowska R, Soltynska MS, Tarkowski AK (1986) Remo-delling of thymocyte nuclei in activated mouse oocytes: an ultrastruc-tural study. Eur J Cell Biol 42: 140-151

16. Szollosi D, Czolowska R, Soltynska MS, Tarkowski AK (1986) Ultra-structure of cell fusion and premature chromosome condensation (PCC) of thymocyte nuclei in metaphase II mouse oocytes. Biol Cell 56: 239-249

17. Szollosi D, Czolowska R, Szollosi MS, Tarkowski AK (1988) Remode-ling of mouse thymocyte nuclei depends on the time of their transfer into activated, homologous oocytes. J Cell Sci 91: 603-613

18. Szollosi D, Czolowska R, Borsuk E, Szollosi MS, Debey P (1998) Nuc-lear envelope removal/maintenance determines the structural and functional remodelling of embryonic red blood cell nuclei in activated mouse oocytes. Zygote 6: 65-73

19. Czolowska R, Modlinski JA, Tarkowski AK (1984) Behaviour of thy-mocyte nuclei in non-activated and activated mouse oocytes. J Cell Sci 69: 19-34

20. Czolowska R, Szollosi D, Szollosi MS (1992) Changes in Embryonic 8-Cell Nuclei Transferred by Means of Cell-Fusion to Mouse Eggs. Int J Develop Biol 36: 543-553

21. Borsuk E, Szollosi MS, Besomebes D, Debey P (1996) Fusion with acti-vated mouse oocytes modulates the transcriptional activity of introdu-ced somatic cell nuclei. Exp Cell Res 225: 93-101

22. Borsuk E, Maleszewski M (2002) DNA replication and RNA synthesis in thymocyte nuclei microinjected into the cytoplasm of artificially ac-tivated mouse eggs. Zygote 10: 229-238

23. Czolowska R, Waksmundzka M, Kubiak JZ, Tarkowski AK (1986) Chromosome condensation activity in ovulated metaphase II mouse oocytes assayed by fusion with interphase blastomeres. J Cell Sci 84: 129-138

24. Modlinski JA (1978) Transfer of embryonic nuclei to fertilized mouse eggs and development of tetraploid blastocysts. Nature 273: 466-467

130 www.postepybiochemii.pl

From Gurdon to Yamanaka — a brief history of cell reprogrammingJacek Z. Kubiak1,*, Maria Anna Ciemerych2,*

1CNRS, UMR 6290, University Rennes 1, Institute of Genetics and Development of Rennes (IGDR), Cell Cycle Team, UEB, IFR 140, Faculty of Medicine, F-35043 Rennes, France 2Department of Cytology, Institute of Zoology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Ilji Miecznikowa St., 02-096 Warsaw, Poland*e-mail: ciemerych@biol.uw.edu.pl or e-mail: jacek.kubiak@univ-rennes1.fr

Key words: embryonic development, animal cloning, differentiation, ES cells, iPS cells

ABStRActthis paper describes the genesis of discoveries that have allowed cell reprogramming and derivation of induced pluripotent stem cells. this achievement has been distinguished by the 2012 Nobel Prize in Physiology or Medicine awarded to John B. Gurdon and Shinya Yamanaka. the verdict of the Nobel committee was as follows: „for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent”. the basis for the discovery was done by Gurdon in the 60s of the twentieth century, although he was not a pioneer in his field of research. the last word was pronounced, however, by Yamanaka at the beginning of the twenty-first century. the Japanese was born fifty years ago, that is exactly the year when Gurdon made his most important discoveries. Despite such a large difference in age of the two scientists their studies complement each other perfectly and promise numerous applications in regenerative medicine.

25. Kubiak JZ, Tarkowski AK (1985) Electrofusion of mouse blastomeres. Exp Cell Res 157: 561-566

26. Willadsen SM (1986) Nuclear transplantation in sheep embryos. Na-ture 320: 63-65

27. Prather RS, Barnes FL, Sims MM, Robl JM, Eyestone WH, First NL (1987) Nuclear Transplantation in the Bovine Embryo - Assessment of Donor Nuclei and Recipient Oocyte. Biol Reprod 37: 859-866

28. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KHS (1997) Via-ble offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813

29. Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R (1998) Full-term development of mice from enucleated oocytes injec-ted with cumulus cell nuclei. Nature 394: 369-374

30. Wakayama T, Yanagimachi R (1998) The first polar body can be used for the production of normal offspring in mice. Biol Reprod 59: 100-104

31. Jackson EB, Brues AM (1941) Studies on transplantable embryoma of the mouse. Cancer Res 1: 494-498

32. Ciemerych MA, Archacka K, Polanski Z, Kubiak JZ, Cell cycle modi-fications during oocyte maturation and early development of LT/Sv mice: Normal development or teratoma formation?, in Cell Cycle and Development in Vertebrates, JZ Kubiak, MA Ciemerych, L Richard--Parpaillon, red. 2009, Research Signpost: Kerala. str. 181-202

33. Evans MJ (1972) The isolation and properties of a clonal tissue culture strain of pluripotent mouse teratoma cells. J Embryol Exp Morphol 28: 163-176

34. Martin GR, Evans MJ (1974) The morphology and growth of a pluri-potent teratocarcinoma cell line and its derivatives in tissue culture. Cell 2: 163-172

35. Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634-7638

36. Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripo-tential cells from mouse embryos. Nature 292: 154-156

37. Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD (1998) Derivation of plu-ripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13726-13731

38. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145-1147

39. Li P, Tong C, Mehrian-Shai R, Jia L, Wu N, Yan Y, Maxson RE, Schulze EN, Song H, Hsieh CL, Pera MF, Ying QL (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell 135: 1299-1310

40. Evans M (2011) Discovering pluripotency: 30 years of mouse embry-onic stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 680-686

41. Suwinska A, Ciemerych MA (2011) Factors regulating pluripotency and differentiation in early mammalian embryos and embryo-derived stem cells. Vitamins Hormones 87: 1-38

42. Takahashi K, Mitsui K, Yamanaka S (2003) Role of ERas in promoting tumour-like properties in mouse embryonic stem cells. Nature 423: 541-545

43. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S (2003) The homeoprotein Na-nog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 113: 631-642

44. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A (2003) Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency su-staining factor in embryonic stem cells. Cell 113: 643-655

45. Tada M, Takahama Y, Abe K, Nakatsuji N, Tada T (2001) Nuclear re-programming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Current Biology 11: 1553-1558

46. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined fac-tors. Cell 126: 663-676

47. Tarkowski AK (1961) Mouse chimaeras developed from fused eggs. Naturwissenschaften 190: 857-860

48. Ciemerych MA (2008) Zarodkowe komórki macierzyste – w poszuki-waniu pluripotencji. Post Biol Kom 35: 183-205

49. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult hu-man fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872

50. Archacka K, Grabowska I, Ciemerych MA (2010) Indukowane komór-ki pluripotentne — nadzieje, obawy i perspektywy. Post Biol Kom 37: 41-62

51. Tachibana M, Amato P, Sparman M, Gutierrez NM, Tippner-Hedges R, Ma H, Kang E, Fulati A, Lee HS, Sritanaudomchai H, Masterson K, Larson J, Eaton E, Sadler-Fredd, K, Battaglia D, Lee D, Wu D, Jensen J, Patton P, Gokhale S, Stouffer RL, Wolf D, Mitalipov S (2013) Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.006